sử dụng dấu phân tử để phát hiện gen kháng rầy nâu trên một số giống lúa ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NC & PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHOA KHOA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SỬ DỤNG DẤU PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN
GEN KHÁNG RẦY NÂU TRÊN MỘT SỐ GIỐNG
LÚA Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

Cán Bộ Hướng Dẫn
Ts.Trần Nhân Dũng
Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học

Sinh Viên Thực Hiện
Nguyễn Thị Cẩm Nhung
Lớp Công nghệ Sinh học K.31
MSSV: 3052860

CẦN THƠ 2009


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu gạo lớn nhất trên thế giới mà Đồng bằng

Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm 53% diện tích trồng lúa của cả nước. Vì vậy, cây lúa
không chỉ giải quyết vấn đề lương thực hàng ngày cho con người mà còn là nguồn xuất
khẩu quan trọng trong thu nhập ngoại tệ, là nền tảng để xây dựng và phát triển các
ngành công nghiệp ở khu vực ĐBSCL.
Chính vai trò quan trọng của cây lương thực này đã thúc đẩy người dân trồng lúa 2 – 3
vụ/năm và canh tác nhiều năm liền để tăng sản lượng lúa, nhằm đáp ứng được nhu cầu
thị trường. Trước tình hình thâm canh tăng vụ như hiện nay đã tạo điều kiện thuận lợi
cho sâu bệnh phát triển và rất có khả năng bùng phát thành dịch. Bên cạnh đó, nước ta
là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới quanh năm ẩm ướt, là điều kiện thích
hợp cho rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) phát triển.
Ngoài hai nguyên nhân trên còn một nguyên nhân khác ảnh hưởng đến tốc độ phát
triển nhanh và mức độ nhiễm cao của rầy nâu trong sản xuất, đó là sự thiếu đa dạng
trong chủng loại giống lúa. Các giống lúa chủ lực trong sản xuất hầu hết đều là những
giống nhiễm rầy. Việc sử dụng giống kháng một mặt làm giảm thiệt hại năng suất, tiết
kiệm chi phí phòng trừ, mặt khác hạn chế được việc dùng thuốc hóa học gây ô nhiễm
môi trường và góp phần ổn định môi trường sinh thái.
Trong những năm gần đây, việc phát triển mạnh mẽ của Công nghệ Sinh học nói chung
và Sinh học Phân tử nói riêng đã góp phần giải quyết nhiều vấn đề cấp thiết liên quan
đến công tác chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu. Trong đó dấu phân tử STS là một trong
những dấu phân tử được sử dụng để phát hiện ra gen kháng rầy nâu trên lúa, đặc biệt là
gen Bph-10, gen kháng quần thể rầy nâu loại hình sinh học 2 và 3. Chính vì thế đề tài
”Sử dụng dấu phân tử để phát hiện gen kháng rầy nâu trên một số giống lúa ở Đồng

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

1

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Bằng Sông Cửu Long” sẽ góp phần giải quyết thêm nhiều vấn đề trong công tác chọn
giống để đạt hiệu quả kinh tế cao.
Mục tiêu đề tài: Xác định gen kháng rầy nâu Bph-10 trên một số giống lúa ở ĐBSCL.
Nội dung của đề tài: Sử dụng dấu phân tử STS để phát hiện gen kháng rầy nâu trên cây
lúa.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

2

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về cây lúa
2.1.1. Nguồn gốc
Từ xa xưa cây lúa đã hiện diện trong cuộc sống của con người. Gắn liền với lịch sử
phát triển của nhân loại cây lúa cũng trải qua một lịch sử tiến hóa phức tạp và lâu dài
với nhiều thay đổi rất lớn về đặc điểm hình thái, nông học, sinh lý và sinh thái. Hiểu
biết về nguồn gốc cây lúa giúp ta hình dung được quá trình tiến hóa và hiểu được điều
kiện môi trường cùng với những yêu cầu sinh thái tự nhiên mà cây lúa cần cho nhu cầu

sinh trưởng và phát triển đặc biệt của nó (Nguyễn Xuân Lý, 2005).
Theo Chowdhury và Ghosh thì những hạt lúa hóa thạch cổ nhất của thế giới đã được
tìm thấy ở Hasthinapur (Bang Uttar Pradesh – Ấn Độ) vào khoảng năm 1000 – 750
trước công nguyên. Sampath và Kao thì cho rằng sự hiện diện của nhiều loại lúa hoang
ở Ấn Độ và Đông Nam Á chứng tỏ rằng Ấn Độ, Miến Điện hay Đông Dương là nơi
xuất xứ của lúa trồng (Nguyễn Ngọc Đệ, 1994).
2.1.2. Phân loại
Tên khoa học của cây lúa là Oryza sativa L. Tiêu biểu cho nhóm lúa trồng ở Châu Á có
tổ tiên trực tiếp là Oryza nivara, một loại lúa hoang hàng niên và Oryza glaberrima
Steud cũng tiến hóa từ một lúa hoang hàng niên khác. Hiện nay, có nhiều cách phân
nhóm cây lúa: phân nhóm theo vùng địa lý, theo đáp ứng với quang kỳ, phân nhóm
theo thời gian sinh trưởng… (Nguyễn Xuân Lý, 2005).
2.2. Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
2.2.1. Rầy nâu và các loại hình sinh học
Rầy nâu có tên khoa học là Nilaparvata lugens Stal. Hiện nay có các loại hình sinh
học: Loại hình sinh học 1 phân bố rộng ở Đông và Đông Nam Á, loại hình sinh học 2

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

3

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

có nguồn gốc ở Philipin phát sinh sau khi sử dụng rộng rãi các giống có gen Bph-1,
loại hình sinh học 3 phát sinh tại các phòng thí nghiệm ở Nhật Bản và Philipin, loại

hình sinh học 4 chỉ thấy ở vùng Nam Á. Theo công bố mới đây của Jena và ctv. (2006)
tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc Tế (IRRI) đã phát hiện ra gen kháng rầy Bph-18 trên
giống lúa dại Oryza australiensis.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
Thành trùng: Có 2 dạng hình thái
Dạng cánh dài: Con cái dài (kể cả cánh) 4,5 mm – 5 mm. Mặt bụng màu nâu vàng,
đỉnh đầu nhô ra phía trước. Mắt kép màu nâu nhạt, mắt đơn màu nâu đỏ, phần gốc râu
có hai đốt phình to, nhiều đốm, bụng rộng, phía cuối dạng rãnh. Con đực dài (kể cả
cánh) 3,6 mm – 4 mm. Đa số có màu nâu tối, kích cỡ nhỏ, gầy hơn con cái, cuối bụng
dạng loa kèn (Bùi Bá Bổng và ctv.,2006).

Hình 2.1. Rầy nâu trưởng thành dạng cánh dài

( />Dạng cánh ngắn: Con cái dài 3,5 mm – 4 mm, thô, kích cỡ lớn. Cánh trước kéo dài đến
giữa đốt bụng thứ 6 bằng một nửa chiều dài cánh trước của dạng cánh dài. Con đực dài
2 mm – 2,5 mm, gầy, đa số màu nâu đen, cánh trước kéo dài tới 2/3 chiều dài của bụng
(Bùi Bá Bổng và ctv.,2006).

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

4

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Hình 2.2. Rầy nâu trưởng thành dạng cánh ngắn

( />Ấu trùng: Ấu trùng có năm tuổi qua bốn lần lột xác, con mới nở thường được gọi là
gọi là rầy cám. Kích thước của ấu trùng lớn dần từ 0,5 – 4,4 mm, màu sắc thay đổi từ
trắng ngà đến vàng nâu. Bụng có màu trắng sữa, mầm cánh kéo dài đến đốt bụng thứ tư
(Bùi Bá Bổng và ctv.,2006).

.

Hình 2.3. Ấu trùng của rầy nâu

( />Trứng: Trứng hình bầu dục dài, hơi cong, đuôi nhỏ thon, ổ trứng có hình nải chuối,
nằm trong nhu mô của bẹ lá (Bùi Bá Bổng và ctv.,2006).

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

5

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Hình 2.4. Trứng rầy nâu

( />Vòng đời: Vòng đời trung bình khoảng 20 – 25 ngày (nhiệt độ thích hợp là 27 – 300C),
trong thời gian đó trứng 5 – 7 ngày, rầy non 12 – 15 ngày, rầy trưởng thành 3 – 5 ngày
đẻ trứng và có thể sống 2 tuần lễ.
Rầy cám: mới nở, lột

xác 5 lần (5 tuổi) từ
12 – 15 ngày.

Trứng: đẻ bên
trong bẹ, nở sau 5
– 7 ngày.

Rầy trưởng
trưởng thành
thành
Rầy
cánh ngắn
ngắn:: sống 77-–
cánh
14 ngày
ngày.(đẻ trứng sớm
14
hơn)

Rầy trưởng thành
cánh dài: sống 7 – 14
ngày.

Hình 2.5. Vòng đời của rầy nâu

( />
CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

6

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

2.2.3. Tập quán sinh sống và cách gây hại
Thành trùng cái bắt đầu đẻ trứng bằng cách rạch bẹ lá hoặc gân chính của phiến lá ở
gần cổ lá. Các vết đẻ trên bẹ lúa có màu nâu do nấm bệnh xâm nhập vào thường dài
khoảng 8 – 10 mm chạy dọc theo bẹ lá.
Rầy cái tập trung đẻ trứng ở gốc cây lúa, cách mặt nước từ 10 – 15 cm. Rầy trưởng
thành bị thu hút nhiều bởi ánh sáng đèn nhất là vào lúc trăng tròn và thường bay vào
đèn nhiều nhất vào khoảng 8 – 11 giờ đêm.
Cả thành trùng và ấu trùng rầy nâu đều thích sống dưới gốc cây lúa và có tập quán
nhảy xuống nước, lên tán lá hoặc bò quanh thân cây lúa khi bị khuấy động. Rầy nâu
thích tấn công cây lúa còn nhỏ nhưng vẫn có khả năng gây hại mọi giai đoạn tăng
trưởng của cây lúa và gây nên hiện tượng cháy rầy.
Ngoài ảnh hưởng trực tiếp nêu trên, rầy nâu còn gây hại gián tiếp cho cây lúa như: ảnh
hưởng đến sự phát triển của cây lúa, gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá (VLLXL) cho cây
lúa.

Hình 2.7. Rầy tập trung ở gốc lúa

Hình 2.6. Lúa bị bệnh VLLXL

()

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

()

7

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

2.2.4. Đặc điểm gây hại
Rầy nâu xâm nhập vào ruộng lúa ngay từ khi mới cấy và hại cả trên mạ. Rầy nâu phát
sinh với mật độ cao và gây hại nặng vào giai đoạn trước khi lúa trổ bông, ngậm sữa và
bắt đầu chín.
Rầy nâu vừa có phản ứng kháng, vừa có phản ứng nhiễm với các giống lúa rất rõ, nó có
khả năng hình thành các loại hình sinh học mới khi có sức ép chọn lọc của môi trường.
Rầy có khả năng di cư đám đông rất xa và kháng thuốc cao.
Rầy nâu còn là vật chủ trung gian truyền những virus gây bệnh. Nguy hiểm hơn cả là
virus VLLXL. Bệnh này làm cho lá chuyển sang màu vàng nhạt hoặc vàng da cam và
cây lúa không phát triển được. Phân rầy nâu chứa nhiều dưỡng chất hấp dẫn nhiều nấm
hoại sinh như bồ hóng làm gốc lúa bị đen dẫn đến quang hợp giảm,… Thiệt hại của
loại bệnh này là rất nghiêm trọng.
( />2.2.5. Tình hình gây hại
Theo Cục Bảo vệ Thực vật (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), hiện nay có trên
140.000 ha lúa đông xuân ở các tỉnh phía Nam đang bị nhiễm rầy nâu. Trong số đó, rầy
nâu đang phá hại 91.115 ha. Hiện tượng nhiễm rầy nhiều nhất là tại vùng ĐBSCL, tập
trung tại các tỉnh Hậu Giang, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Long An với mật số rầy
phổ biến từ 750 – 3.000 con/m2. Lúa ở những địa phương nhiễm rầy nặng như Hậu
Giang, Vĩnh Long, Bạc Liêu... mật số rầy lên tới 6.000 – 8.000 con/m2. Tại Vĩnh Long,

Hậu Giang, Sóc Trăng đã có hàng chục ha bị cháy rầy. Riêng bệnh VLLXL đã tăng vọt
với mức độ đáng lo ngại ().
Lúa hè thu bị nhiễm rầy nâu 11.621 ha, phổ biến là rầy cám ở tuổi từ 1 – 5. Mật độ rầy
phổ biến từ 750 – 1500 con/m2, một số nơi lên tới 3.500 con/m2. Riêng diện tích lúa
nhiễm bệnh VLLXL hiện là 2.215 ha, tập trung tại tỉnh Đồng Tháp với 1.294 ha, Vĩnh
Long 686 ha, Bạc Liêu 90 ha ().

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

8

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

2.3. Lúa kháng rầy
2.3.1. Một số giống lúa kháng rầy
Các giống lúa kháng rầy nâu có nguồn gốc từ IRRI đã được đưa vào thử nghiệm ở phía
Nam Việt Nam từ năm 1973, sau đó nhiều giống đã được gieo trồng rộng rãi trong sản
xuất như IR2151, IR2153, IR26, IR28, IR30, TN73-2… hầu hết các giống này đều
mang gen Bph-1. Cùng với sự xuất hiện của rầy nâu loại hình sinh học 2 vào năm
1977, những giống này đã trở nên nhiễm rầy và được thay thế bằng các giống mang
gen bph-2 như: IR36, IR38, IR42, IR2797 (NN3B), IR13240 (NN9A), IR17494…
(Nguyễn Văn Luật, 2002).
Theo Khush và Nguyễn Hoàng Nghĩa (1994), những giống lúa mang gen bph-2 như:
IR36, IR38, IR42, IR2797 (NN3B), IR13240 (NN9A), IR17494 … cũng lại bị nhiễm
rầy và được thay bằng các giống lúa mới như: IR50401, IR50404, MTL98, MTL99,

MTL119. Những giống này thừa kế nguồn di truyền kháng rầy nâu từ Ptb33 và giống
lúa dại Oryza officinalis (Nguyễn Văn Luật, 2002).
Một số giống lúa lai tạo tại Viện Lúa ĐBSCL như: OMCS97, OM1632, OM1633,
OM1589-5k-1, OM1271, OM1889, OM2053, OM1643, OM1723-62, IR50404-2-3K,
OMCS97-2K, OM1723-62-9K, OMCS97-2K-1, AS1007-1K, IR59656-5K-2, MTL998K-3,…cũng cho phản ứng kháng với quần thể rầy nâu ở ĐBSCL (Phạm Thị Mùi và
Bùi Bá Bổng, 1999). Các gen kháng rầy nâu đang được sử dụng trong chương trình lai
tạo giống mới tại ĐBSCL. Hiện nay ở phía Nam có thể sử dụng các giống lúa IR50401,
IR50404, MTL98, MTL99, MTL119, IR72, OM269, OMCS97, OM1643, OM2031,
NCM16-27, NCM84 … các giống này có khả năng kháng trung bình với quần thể rầy
nâu mới ở ĐBSCL.
Một số giống lúa kháng rầy nâu ở ĐBSCL trong đó có những giống lúa cao sản như
OMCS97, IR62065T, OM1632, IR59656-5…; những giống lúa mùa địa phương như
Tây Liêu, Nàng Keo, Di Cư, Đốc Phụng Lung, Canh Nông Mỹ Tho và những giống lúa

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

9

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

hoang như O. rufipogon accessions: 021, 060, 063, 069, 070, 071, 085, 089, 091, 093,
094, O. officinalis accessions: 127, 133, 131, 154, O. nivara: 163, 155, 156, 160 (Phạm
Thị Mùi và Bùi Bá Bổng, 1999).
2.3.2. Đặc tính kháng rầy của lúa
Một số giống lúa được coi là kháng rầy nâu khi rầy nâu không thể ăn, ở, đẻ trứng và

phát triển trên giống đó (Nguyễn Văn Huỳnh và Nguyễn Thị Nghiêm, 1997). Các
giống này có thể mang một, hai hoặc ba cơ chế sau:
+ Không thích hợp: Rầy không thích ăn, ở hay đẻ trứng.
+ Kháng sinh: Giống ảnh hưởng bất lợi đến sinh lý của rầy khi chúng ăn phải.
+ Chịu đựng: Giống có khả năng chịu được sự tấn công của rầy mà thiệt hại không
đáng kể.
Cơ chế chịu đựng được cho là có liên hệ nhiều với tính kháng trung bình đối với sự tấn
công của rầy nâu. Cơ chế này có tính kháng không ổn định vì nó phụ thuộc vào sinh
thái nên tính kháng thay đổi theo từng địa phương, canh tác, mùa vụ… Ngược lại, cơ
chế không thích hợp và cơ chế kháng sinh thì tính kháng đòi hỏi phải có sự hiện diện
của một số đặc tính kháng rầy nâu trong lúa, đồng thời phản ứng của rầy nâu đối với
giống cũng không được thuận lợi. Tính kháng sinh mà hiện nay đa số các giống kháng
rầy đều có là do ảnh hưởng bất lợi của giống lúa trên rầy nâu khi chúng ăn phải.
Đối với các giống rầy mang cơ chế kháng sinh có đặc điểm như sau:
– Trứng rầy không nở được hay nở rất ít khi chúng đẻ trên những giống lúa này.
– Ấu trùng rầy nâu chết ngay từ tuổi một.
– Con cái có tuổi thọ giảm sút và đẻ trứng ít hay không đẻ trứng được do trứng không
phát triển hoặc phát triển không đủ.
– Thời gian tăng trưởng của ấu trùng kéo dài ra một cách bất thường.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

10

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

– Sinh lý và tập quán của thành trùng bị xáo trộn.
Các giống kháng rầy nâu hiện nay, tính kháng chỉ điều khiển bởi một gen được gọi là
tính kháng dọc kháng rất mạnh nhưng chỉ kháng đối với một loại hình sinh học. Nếu
được điều khiển bởi nhiều gen thì tính kháng sẽ không kháng mạnh nhưng có thể
kháng đối với nhiều loại hình sinh học khác nhau. Cây có tính kháng đa gen sẽ hạn chế
tối đa sự phát triển của các loại hình sinh học rầy nâu.
Các phản ứng trên quyết định số lượng rầy nâu tồn tại trong một giai đoạn nhất định.
Giống kháng rầy nâu có hàm lượng Aparagin thấp hơn bình thường, nồng độ Phenolic
glycoside thường ở giống kháng cao hơn giống nhiễm (Sogawa và Pathak, 1970).
Giống TN1 (Taichung Native 1), có nguồn gốc Đài Loan, từ cặp lai DEE GEO
WOOGEN/TSAI-YIAN-CHAN, là giống chuẩn nhiễm rầy nâu, rầy lưng trắng, không
có gen kháng.
Công tác sử dụng giống kháng được coi là biện pháp hàng đầu trong chương trình
phòng trừ tổng hợp rầy nâu hiện nay, chỉ có việc canh tác giống kháng mới có thể làm
giảm đồng loạt mật số của rầy nâu xuống ngưỡng kinh tế, từ đó các biện pháp khác
mới phát huy được hiệu quả cùng phối hợp để đi đến việc khống chế rầy nâu (Nguyễn
Văn Huỳnh, 1979).
2.4. Gen kháng rầy nâu trong cây lúa
Theo Ikeda và Vaughan (2006) về vấn đề xếp hạng các nhóm gen kháng (theo phân
loại của Nhật và Philipin) gồm 4 nhóm sau:
Nhóm Bph1 thì kháng với loại hình sinh học 1 và 3, nhiễm với loại hình sinh học 2,
gen chủ lực là Bph-1.
Nhóm Bph2 thì kháng với loại hình sinh học 1 và 2, nhiễm với loại hình sinh học 3,
gen chủ lực là Bph-2.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

11

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Nhóm Bph3 thì kháng với tất cả các loại hình sinh học, gen chủ lực là Bph-3, Bph-4,
Bph-8, và Bph-9.
Nhóm khác thì kháng với loại hình sinh học 4, có các gen chủ lực là Bph-5, Bph-6,
Bph-7.
Theo thuyết gen chống gen, mỗi gen điều khiển độc tính của ký sinh đều có gen kháng
tương ứng của ký chủ nhằm vô hiệu hoá hoạt động gây hại của ký sinh. Dựa vào học
thuyết gen chống gen các nhà chọn giống sẽ áp dụng thường xuyên vào công tác tạo
giống cải tiến.
Trong 50 năm gần đây, người ta đã phát hiện nhiều kỹ thuật thanh lọc ngân hàng gen
đối với tính trạng chống chịu côn trùng gây hại cây trồng, xác định nguồn cung cấp gen
kháng. Số gen được dùng trong các giống lúa sản xuất đại trà hiện nay vẫn còn rất ít so
với nguồn dự trữ trong ngân hàng gen lúa bản địa và lúa hoang. Do đó, chúng ta có
nhiều cơ hội rất lớn trong khai thác nguồn biến dị này trên đồng ruộng, nhằm khám phá
ra những biến dị có ích. Việc sử dụng các mồi DNA tương ứng với gen kháng mong
muốn đã tạo ra khả năng tìm kiếm được nhiều gen kháng hơn trong ngân hàng gen (Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).
Cây trồng thể hiện tính kháng đối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các đặc tính
phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gen kháng
mà ký sinh không có gen tương ứng để phá vỡ. Hiện tượng từ kháng trở thành nhiễm
của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh là do số lượng khác nhau của gen kháng hiện
diện ở mỗi giống cây và ảnh hưởng của gen kháng đối với ký sinh (Bùi Chí Bửu,
2002).
Một gen kháng bệnh mới có thể bảo vệ cho cây từ nhiều tháng thậm chí đến vài năm.

Do áp lực thâm canh, giống lúa càng bị nhiễm nhanh hơn. Một gen mới được chuyển
vào cây trồng trên đồng ruộng, đồng thời sẽ có một quần thể sinh học có gen độc mới
lại xuất hiện để tấn công gen kháng mới. Gen kháng mới thường được biểu hiện không

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

12

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

tương hợp đối với sự xâm nhập của ký sinh ngoại trừ ở một ít cá thể. Theo thời gian,
dần dần quần thể ký sinh được nhân lên cho đến một lúc nào đó đủ để phá vỡ cả một
quần thể ký chủ mang gen kháng mới.
Ngày nay, trong 17 gen kháng rầy nâu được phân lập trên thế giới hiện nay, có 8 gen
lặn và 9 gen trội (Bùi Chí Bửu, 1997). Những nghiên cứu được thực hiện bởi Athwal et
al (1971) đã chứng minh rằng gen trội Bph-1 chi phối tính kháng ở giống Mudgo,
MTU15, CO22, và MGL2 kháng với rầy nâu loại hình sinh học 1, trong khi đó một gen
lặn bph-2 điều khiển tính kháng ở giống ASD7 và Ptb18 kháng đối với rầy nâu loại
hình sinh học 2. Hai gen này liên kết chặt nhau và không tái tổ hợp giữa chúng.
Theo Lakshminarayana và Khush (1977), giống Rathu Heenati của Sri Lankan có
mang một gen kháng trội và độc lập với gen trội Bph-1 và đã được xác định rõ là gen
Bph-3 kháng với rầy nâu loại hình sinh học 3. Một giống khác ở Sri Lankan là
Babawee mang một gen kháng lặn (Lakshminarayana và Khush, 1977). Gen này độc
lập với gen bph-2 và được xác định là mang gen bph-4 kháng với rầy nâu loại hình sinh
học 4. Hai gen bph-3 và bph-4 liên kết với nhau rất chặt chẽ.

Theo Kabir và Khush (1988) gen bph-5 có trong giống ARC10550, gen lặn bph-5 điều
khiển tính kháng với rầy nâu loại hình sinh học 4, phân ly độc lập với các gen Bph-1,
bph-2, Bph-3. Một gen trội Bph-6 phân ly độc lập đối với các gen bph-5 ở giống
Swarnalatha và bph-7 ở T12, kháng trung bình với những loại hình sinh học từ
Bangladesh. Nemamoto et al (1989) đã xác định một gen lặn mới là gen bph-8 có ở
giống Thai Col.5, Thai Col.11 và Chin Saba và một gen trội mới là Bph-9, ở những
giống được trồng ở khu vực Sri Lankan là Pokkali, Balamavee, và Kaharamana.
Gen lặn bph-8 không tương tác với bph-2 và bph-4 và, gen trội Bph-9 không tương tác
alen với Bph-1, Bph-3.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

13

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Hai gen kháng rầy nâu bph-1 và bph-10 được tìm thấy liên kết rất chặt chẽ với dấu
phân tử RFLP, C185 và RG457 trên nhiễm sắc thể số 12. Quần thể lúa hoang Oryza
australiensis được phát hiện có mang gen Bph-10.
Những loài Oryza hoang dại tiềm ẩn những nguồn gen kháng mới đối với các loại hình
sinh học. Ước lượng khoảng 11.000 quần thể lúa hoang dại là phương tiện để nghiên
cứu gen kháng với loại hình sinh học 1, 2 và 3, IRRI đã phát hiện được 19 nhóm thuộc
bốn loài lúa hoang là kháng hay kháng vừa phải với cả ba loại hình sinh học trên (Wu
et al., 1986).
Các gen kháng rầy nâu đang được sử dụng trong chương trình lai tạo giống mới tại

ĐBSCL: Các gen Bph-1, bph-2, bph-9, bph-10 và bph-18 nằm trên nhiễm sắc thể 12;
Các gen Bph-3, bph-12 và bph-15 nằm trên nhiễm sắc thể 4, gen Bph-4 nằm trên nhiễm
sắc thể 6; Gen Bph-6 nằm trên nhiễm sắc thể 11; Các gen Bph-11, bph-13, bph-14 nằm
trên nhiễm sắc thể 3 (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).
2.5. Phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được tiếp thu hoàn thiện
thông qua việc phát hiện và sản xuất được enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi
khuẩn Thermophilus aquaticus và một số vi khuẩn khác. Máy PCR ngày càng hoàn
thiện cho phép thay đổi nhanh chóng, chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng
nhân bản DNA. Phản ứng PCR diễn ra qua ba giai đoạn cho mỗi chu kỳ dựa trên tính
chất biến tính, lai cặp, tổng hợp đoạn DNA đích (Trịnh Đình Đạt, 2006).
Giai đoạn biến tính: Xử lý nhiệt độ để tách DNA mạch kép thành mạch đơn dùng làm
khuôn để tổng hợp mạch mới. Nhiệt độ thường là 94 – 950C, trong thời gian 2 – 5 phút.
Giai đoạn gắn mồi: Phụ thuộc vào đoạn mồi sử dụng, thường nhiệt độ gắn mồi từ 30 –
650C trong khoảng 20 giây đến 2 phút. Các đoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo
nguyên tắc bổ sung. Đây là giai đoạn quan trọng. Nhiệt độ gắn mồi phải bảo đảm đúng
để khả năng gắn tốt nhất, tránh hiện tượng gắn không đặc hiệu.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

14

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Giai đoạn kéo dài: Các dNTP được lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung

với mạch DNA khuôn bắt đầu từ mồi. Nhiệt độ giai đoạn này thường được thiết kế từ
68 – 720C, thời gian kéo dài tùy thuộc vào chiều dài của đoạn DNA cần nhân lên,
thường thời gian khoảng 20 giây đối với đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 500 nucleotide
(nu), 40 giây đối với đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 1200 nucleotide. Thường thì thời gian
kéo dài 2 – 5 phút.
2.6. Dấu phân tử STS
2.6.1. Kỹ thuật STS
STS được phát triển bởi Olson và ctv. (1989) khi nghiên cứu về bộ gen người và STS
được xem như là các dấu phân tử dự trữ điện tử. STS dựa vào PCR để nhân lên trình tự
đã biết trên cơ sở chuỗi dấu phân tử (RFLP, RAPD, AFLP) trong bản đồ phân tử đã
được thiết lập. Các mồi trong STS có từ 18 – 20 bp được thiết kế dựa vào trình tự đã
biết nằm ở đầu cuối của các vị trí đặc trưng. Sự đa hình nói chung được thể hiện qua sự
khác nhau về kích thước của sản phẩm PCR trên gel Agarose hay Polyacrylamide.
Việc đọc kết quả tương đối dễ dàng trong hầu hết các trường hợp và thường là đồng
trội. Dấu phân tử STS cho phép phân biệt các thể dị hợp tử từ 2 đồng hợp tử
(o/forum/showthread.php?t=1809).
2.6.2. Một số nghiên cứu sử dụng dấu phân tử
Bùi Chí Bửu và ctv. (1997) đã công bố kết quả phân tích di truyền tính kháng rầy nâu
của giống lúa hoang nhờ dấu phân tử và đã xác định được gen kháng rầy nâu loại hình
sinh học 4 có liên kết chặt chẽ với dấu phân tử RM18, định vị trên nhiễm sắc thể số 7,
khoảng cách di truyền là 1,3 cM, và liên kết với dấu phân tử RM168, định vị trên
nhiễm sắc thể số 3, khoảng cách di truyền 1,9 cM.
Nguyễn Thị Lang (1999) đã sử dụng dấu phân tử STS để chọn lọc dòng kháng rầy nâu
trong quần thể đang phân ly. Từ RG457 (dấu phân tử RFLP) đã thiết kế thành dấu phân
tử STS thành hai cặp mồi tương ứng là RF457FL, RG457RL, và RG457FB,

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

15

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

RG457RB. Dấu phân tử này có giá trị liên kết với gen kháng rầy Bph-10 là 1,7 cM.
Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu này là hai quần thể F2 và F3 của cặp bố mẹ
IR54742 (kháng)/IR31917-45-3-2 (nhiễm).
Mitshuhiro Kawaguchi và ctv. (2001) đã sử dụng dấu phân tử RFLP và SSR để xác
định gen kháng rầy nâu bph-4 nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6.
Lưu Thị Ngọc Huyền và ctv. (2003) đã định vị các gen kháng rầy nâu bph-4 và Bph-6
trên nhiễm sắc thể lúa bằng phương pháp SSR.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2003) đã nghiên cứu và thiết lập bản đồ di truyền
và bản đồ vật lý của gen Bph-10.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2004) đã sử dụng dấu phân tử STS và dấu phân tử
SSR để thiết lập bản đồ gen rầy nâu trên quần thể F2 của cây lúa (Oryza sativa). Vật
liệu bao gồm các giống lúa địa phương cổ truyền, giống lúa cải tiến trong chương trình
lai, với giống đối chứng kháng của quốc tế là Ptb33 giống chuẩn nhiễm là TN1. Quần
thể F2 của tổ hợp lai IR54742/IR31917, Ptb33/TN1 được phân tích kiểu gen với dấu
phân tử STS và quần thể F2 của IR64/Hoa Lài được phân tích với dấu phân tử SSR. Đa
hình được ghi nhận trong cặp mồi RG457FL/RL, với kiểu gen kháng có kích thước 300
bp, 250 bp, 200 bp, và kiểu gen nhiễm là 500 bp, 200 bp. Trong cặp mồi
RG457FL/RB, kiểu gen kháng có kích thước 500 bp, 300 bp, và kiểu gen nhiễm là 550
bp, 200 bp. Hai chỉ thị RG457RB/RL và RG457FL/RL được khuyến cáo để chọn lọc
dòng lai kháng rầy nâu (loại hình sinh học 2 và 3).
Nguyễn Thị Lang và ctv. (2006) đã ứng dụng dấu phân tử STS và SSR để đánh giá tính
chống chịu rầy nâu trên cây lúa Oryza sativa L., việc sử dụng phương pháp dấu phân tử
SSR và dấu phân tử STS với RM227, RM260 và RG457FL/RL để phát hiện gen kháng

và nhiễm rầy nâu trên các giống lúa khác nhau cho thấy dấu phân tử này tách biệt đa
hình giữa các giống lúa có tỷ lệ đa hình tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định các cá
thể đồng hợp tử và dị hợp tử một cách chính xác.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

16

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

2.7. Enzyme giới hạn
2.7.1. Khái niệm
Enzyme giới hạn là enzyme có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA nhất định
và cắt DNA ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Tùy theo phương thức cắt và nguồn
gốc của enzyme giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các enzyme giới hạn
(Trần Đình Đạt, 2006).
2.7.2. Phân loại và cách gọi tên enzyme giới hạn
Có ba loại enzyme giới hạn
Loại I: Khi enzyme nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA cách đó
1000 – 5000 nu và giải phóng độ vài chục nu.
Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt DNA ngay vị trí đó.
Loại III: Enzyme nhận biết trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó 20 nu.
Cách gọi tên của enzyme giới hạn tuân theo nguyên tắc như sau:
Chữ đầu tên enzyme là chữ đầu tên của giống vi sinh vật từ đó enzyme được tách chiết.
Chữ này phải được viết hoa. Hai chữ tiếp theo không viết hoa bắt nguồn từ tên loài vi

sinh vật. Cả ba chữ đầu tiên đều in nghiêng. Tiếp theo có thể là một chữ viết hoa nữa
để chỉ chủng vi sinh vật đã sử dụng. Cuối cùng thường là chữ số la mã chỉ thứ tự
enzyme được phát hiện từ loài vi sinh đó (do một loài vi sinh vật có nhiều loại enzyme
giới hạn). Ví dụ, EcoRI và EcoRII là các enzyme giới hạn tách chiết đầu tiên (I) và thứ
hai (II) từ vi khuẩn Escherichia coli Ry 13 (Võ Thị Thương Lan, 2006).
Enzyme giới hạn nhận biết và cắt trình tự đặc hiệu gồm 4 – 8 nu. Đặc điểm của các
trình tự này là đối xứng, tức là trình tự nu tại vị trí cắt trên hai sợi đơn đều giống nhau
theo cùng một chiều (5’ –> 3’ hoặc 3’ –> 5’). Enzyme có thể cắt hai sợi đơn DNA tại
cùng một điểm tạo ra hai đầu cắt bằng phẳng. Những enzyme đó được gọi là enzyme
cắt đầu tà. Bên cạnh đó, tại vị trí nhận biết, enzyme giới hạn có thể cắt hai sợi đơn

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

17

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

DNA lệch nhau vài nu tạo ra hai đầu có các sợi đơn so le nhau. Những enzyme này
được gọi là enzyme cắt đầu dính (Võ Thị Thương Lan, 2006).
Xác suất phân bố các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn sẽ giảm tỷ lệ nghịch với số
nu ở vị trí nhận biết. DNA chứa bốn loại nu A, T, C, G khác nhau. Xác suất để bốn nu
sắp xếp theo một trật tự sẽ là (1/4)4 = 1/256. Như vậy, trung bình một đoạn DNA dài
256 nu sẽ có một vị trí của enzyme giới hạn nhận biết bốn nu sắp xếp theo một trật tự
xác định. Xác suất này giảm xuống 1/4000 khi vị trí gồm 6 nu. Như vậy, khi phân cắt
một bộ gen có kích thước xác định, số lượng và chiều dài của các đoạn tạo thành phụ

thuộc vào việc lựa chọn số nu ở vị trí nhận biết của enzyme giới hạn. Enzyme HinfI có
trình tự cắt là G/ANTC. Nó là enzyme giới hạn được tách ra từ vi khuẩn Haemophilus
influenzae (Võ Thị Thương Lan, 2006).
HinfI

5' . . . GvA N T C . . . 3'
3' . . . C T N A^G . . . 5'

( />2.7.3. Nghiên cứu sử dụng enzyme HinfI
Nguyễn Thị Lang (1999) đã sử dụng enzyme HinfI để xác định mức độ đa hình giữa
các giống lúa. Nhằm xác định được thể đồng hợp kháng, di hợp mang gen kháng và
đồng hợp nhiễm rầy.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

18

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện
3.1.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009.
Địa điểm: Phòng Sinh học Phân tử – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh

học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Máy ly tâm eppendorf 5417C, máy nghiền Retsch MM200, máy hút chân không, máy
đo OD Backman Coulter, máy PCR Perkin Elmer 9700, máy chụp gel BIORAD UV
2000, máy vortex, cân điện tử, các loại ống tuýp, bộ điện di, tủ lạnh – 200 C,
microwave, tủ cấy, nồi khử trùng, tủ ủ, tủ hút, bộ micropipette,…
3.1.3. Hóa chất
Hóa chất dùng để trích DNA: Nitơ lỏng, Extraction buffer, dung dịch SDS,
Isopropanol, dung dịch TE, CTAB, Cloroform, Isoamylalcolhol, Ethanol 70% và 96%.
Hóa chất dùng để kiểm tra sự hiện diện của DNA: Agarose, dung dịch TE 1 X,
Ethidium Bromide, Loading buffer.
Hóa chất PCR: Taq polymerase, mồi, BiH2O, MgCl2, dNTPs, buffer.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Thu thập mẫu
Ba mươi giống lúa được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Phát triển Đồng bằng Sông Cửu
Long và Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

19

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Bảng 3.1. Danh sách giống lúa

Số thứ

Tên giống

Kí hiệu Số thứ

tự

Tên giống

Kí hiệu

tự

1

OMCS2000 (ĐCA1)

1a,1b

16

504/66

16a,16b

2

OM6561-12 (A0)

2a,2b

17

547/74

17a,17b

3

OM4218 (A1)

3a,3b

18

466/53

18a,18b

4

OM5199 (A1)

4a,4b

19

MTL604

19a,19b

5

OM4495 (ĐC)

5a,5b

20

567/7/1 (ĐC)

20a,20b

6

OM5199-2

6a,6b

21

MTL589

21a,21b

7

OMCS2000

7a,7b

22

542/4/3

22a,22b

8

OM4498

8a,8b

23

MTL555-8

23a,23b

9

OM2395

9a,9b

24

TRẮNG LÙN

24a,24b

10

OM5930

10a,10b

25

IR50404

25a,25b

11

OM4900

11a,11b

26

OM3526

26a,26b

12

OM5239 (A2)

12a,12b

27

MTL560

27a,27b

13

OM5637 (A2)

13a,13b

28

MTL500

28a,28b

14

AS996

14a,14b

29

MTL499

29a,29b

15

OM4088

15a,15b

30

TRẮNG TÉP

30a,30b

3.2.2. Trích DNA (qui trình CTAB)

 Quy trình trích DNA
Gieo lúa 1 – 2 tuần tuổi ở nhà lưới.
Thu lấy lá non.
Khử trùng bề mặt lá bằng cồn 70%, sau đó dùng kéo và kẹp (đã được khử trùng) cắt
lúa thành từng mảnh nhỏ rồi cho riêng vào các tuýp 2.2 ml (0.1 g), mỗi mẫu được lặp
lại 2 lần.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

20

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Cho một viên bi vào mỗi tuýp.
Ngâm các tuýp và dụng cụ nghiền mẫu vào nitơ lỏng trong 10 phút.
Cho mẫu vào máy nghiền, nghiền với tần số 27 lần/giây, nghiền 3 lần mỗi lần 30 giây.
Cho thêm vào mỗi tuýp 1 ml Extraction buffer (10 ml EB + 7 µl β-Mercaptoethanol).
Cho thêm 50 µl SDS 10% vào mỗi tuýp.
Ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút (5 phút đảo nhẹ các tuýp một lần).
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Lấy 800 µl dịch trong ở trên cho vào tuýp mới.
Cho 800 µl Isopropanol vào mỗi tuýp, lắc đều.
Ủ mẫu ở – 20oC trong 2 giờ.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ nước, lấy phần trầm hiện.
Cho thêm 400 µl TE 0,1 X và 400 µl CTAB vào, ủ mẫu ở 65oC trong 30 phút.
Cho 800 µl Chloroform/Isoamylalcolhol, đảo nhẹ. (Tỷ lệ 24 ml Chloroform : 1 ml
Isoamylalcolhol).
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Lấy 700 µl phần trong ở trên chuyển sang tuýp mới.
Cho 1,4 ml Ethanol 96% vào, đảo nhẹ, để 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ nước, giữ lại phần tủa.
Cho 700 µl Ethanol 70% vào, đảo nhẹ.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ nước, lấy phần trầm hiện.
Lặp lại lần nữa với Ethanol 70%, thấm miệng tuýp trên giấy.
Sấy chân không các tuýp ở 45oC trong 10 phút.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

21

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Cho 200 µl TE 0,1 X vào mỗi tuýp, trữ ở trong tủ lạnh – 20oC.

(a)

(b)

(c)

(B)

(C)

(d)

(e)
Hình 3.1. Một số thiết bị được dùng trong quá trình trích DNA
(a) Máy nghiền mẫu Retsch MM 200
(b) Micropipet
(c) Máy ủ cách thủy

(d) Máy ly tâm Eppendorf 5417
(e) Máy sấy chân không 5301

 Kiểm tra DNA
Điện di trên gel Agarose 0,8%
Cân 0,32 g Agarose, thêm vào 50 ml TE 1 X (trừ 10 ml bốc hơi), nấu trong lò vi sóng
với thời gian 3 phút.
Để nguội khoảng 50 – 60oC, cho Ethidium Bromide (0,8 µl), đảo đều, đổ vào khuôn đã
chuẩn bị trước.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

22

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Để gel nguội.
DNA (10 µl) trộn với Loading buffer (3µl) bơm vào giếng.
Điện di ở 100 V trong 15 phút.
Chụp hình gel.

(a)
(a)

(b)
(b)
Hình 3.2. Một số thiết bị dùng để kiểm tra DNA

(a) Bộ điện di Run One
(b) Máy chụp hình gel BIORAD UV 2000

3.2.3. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR với cặp mồi RG457FL/RL.
Trình tự

Mồi
RG457FL

5’GCAGTGGCAGATGGGATCGT 3’

RG457RL

5’GCTCCGAAATCCCAAGCGAT 3’

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

23

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Năm học: 2008 – 2009

Bảng 3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng PCR

Hoá chất

Nồng độ

BiH2O

Công thức (µl)
17

Buffer IV

1X

3

dNTPs

200µM

1

MgCl2

2,5mM

1

Taq polymerase

0,5U/µl

1

RG457 FL

100ρmol/µl

RG457 RL

100ρmol/µl

0,25

DNA

50ng/µl

1,5

Thực hiện phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer 9700 (Hình 3.3).

Hình 3.3. Máy PCR Perkin Elmer 9700

 Hiệu chỉnh phản ứng PCR
Tiến hành phản ứng với cặp mồi RG457FL/RL theo công thức của Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ (Bảng 3.2). Sau đó ta hiệu
chỉnh từng thông số trong phản ứng PCR nhằm mục đích tạo ra một vạch chuyên biệt
trên gel.

CBHD: Ts. Trần Nhân Dũng

24

SVTH: Nguyễn Thị Cẩm Nhung