NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BIẾN ĐỔI GEN TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

BỘ Y TẾ

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BIẾN ĐỔI GEN
TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS.TS. Nguyễn Nghiêm Luật

9209

Năm 2012
1


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
TỔNG QUAN................................................................................................. 3
1.1. Đa polyp tuyến gia đình (FAP) ......................................................... 4
1.2. Cấu trúc và chức năng của gen APC.................................................. 5
1.2.1. Cấu trúc của gen APC và protein APC ....................................... 6
1.2.2. Các chức năng của gen APC và protein APC ........................... 11
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen APC ............. 15
1.3.1. Kỹ thuật PCR.............................................................................. 16
1.3.2. PCR đơn mồi ............................................................................. 17
1.3.3. PCR đa mồi................................................................................ 17
1.3.4. PCR sao chép ngược ................................................................. 18

1.3.5. Real-time PCR........................................................................... 18
1.3.6. Kỹ thuật MLPA ........................................................................ 19
1.3.7. Kỹ thuật giải trình tự gen.......................................................... 19
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 20
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu ................................ 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu………………………………………...23
3. KẾT QUẢ ............................................................................................... 34
3.1. Các kết quả giải trình tự DNA trên exon 15................................. 35
3.2. Kết quả xác định đột biến gen APC ở các gia đình bệnh nhân …39
3.3. Kết quả phân tích gen APC ở các thành viên................................ 49
3.4. Kết quả phân tích gen APC của nhóm đối chứng ......................... 50
4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 52
4.1. Về kết quả xác định đột biến gen APC ở các gia đình ................. 52
4.2. Về kết quả phân tích gen APC ở các thân nhân......................... 58
4.3. Về kết quả phân tích gen APC ở nhóm đối chứng ................... 59
KẾT LUẬN ................................................................................................. 60
KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CÁC PHỤ LỤC
CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC
DANH SÁCH BỆNH NHÂN


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Acef

Một yếu tố trao đổi guanin của Rac, thuộc gia đình Rho của
các GTPase.

AFAP

Attenuated familial adenomatous polyposis: đa polyp tuyến
gia đình thể nhẹ.

APC

Adenomatous polyposis coli: đa polyp tuyến

CHRPE

Congenital hypertrophy of the retinal pigment epithelium:
chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng mạc.

CIN

Chromosome instability: sự bất ổn định của nhiễm sắc thể

CLIP170

Một protein có chức năng làm ổn định vi ống trong tế bào

CtBP

C-terminal-binding protein: protein gắn C tận

dAPC

Drosophila APC: APC của ruồi giấm

DNA

Desoxyribonucleic acid

EB1

End binding 1: protein điều hòa bộ khung tế bào bằng cách
gắn vào các vi ống và kiểm sốt sự sinh sơi của chúng.

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EphB

Một trong các gen đích của con đường tín hiệu Wnt

FAP

Familial adenomatous polyposis: đa polyp tuyến gia đình

GEF

Guanine nucleotide exchange factor: một yếu tố trao đổi
guanin của Rac, thuộc gia đình Rho của các GTPase.

GSK3β

Glycogen synthase kinase 3-beta

IQGAP1

IQ-motif-containing GTPase activation protein 1: protein 1
hoạt hóa GTPase chứa IQ.

LEF

Lymphoid enhancer factor: yếu tố tăng cường lympho

MCR

Mutation cluster region: vùng bó đột biến

MLPA

Multiplex ligation-dependent probe amplification

mRNA

Messenger ribonucleic acid: ribonucleic acid thơng tin

MYC

Tên của một trong các gen đích của con đường tín hiệu Wnt

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Revers transcriptase-PCR

Rac1

Một protein trong gia đình Rho của GTPase.

TCF

T-cell factor: yếu tố tế bào T


MỞ ĐẦU

Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer), có thể gồm các khối ung thư ở
đại tràng, trực tràng và ruột thừa. Ung thư đại trực tràng gây nên khoảng
655.000 người chết trên thế giới mỗi năm nên được cho là một bệnh lý ác tính
phổ biến. Trong số người bị ung thư, số người bị ung thư đại trực tràng đứng
thứ ba tại Mỹ, đứng thứ hai ở Canada và Tây Âu, đứng trung bình ở các nước
Đơng Âu và các nước công nghiệp mới. Tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng thấp
nhất ở Châu Phi, Châu Á và một phần Mỹ La tinh. Tỷ lệ mắc ung thư đại trực
tràng ở nam nhiều hơn nữ. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng là
7,5/100.000 dân, đứng hàng thứ 5 ở cả hai giới sau ung thư phế quản, dạ dày,
gan và vú; ở nam giới, ung thư đại trực tràng đứng hàng thứ hai sau ung thư
phổi [1, 3, 4, 5].
Hầu hết ung thư đại trực tràng có liên quan đến các yếu tố ngoại sinh, chỉ
một số rất ít do di truyền [2, 4, 6, 7]. Ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến
gia đình là một ung thư bắt nguồn từ bệnh đa polyp tuyến gia đình (familial
adenomatous polyposis: FAP) [24, 64, 74, 75], là một bệnh di truyền trội với
hàng trăm, hàng ngàn các polyp trong đại trực tràng. Các polyp này ban đầu là

lành tính nhưng về sau có thể trở thành ác tính nếu khơng được điều trị. Bệnh
sinh của ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình được cho là do đột
biến của gen APC (adenomatous polyposis coli), một gen áp chế ung thư đa
chức năng (multi-functionality tumor suppressor gene) [31, 36, 44] . Tuy chỉ
chiếm tỷ lệ khoảng 1% ung thư đại trực tràng nói chung nhưng ung thư đại trực
tràng thể đa polyp tuyến gia đình có ý nghĩa quan trọng vì đây là bệnh có khả
năng di truyền cao [24, 27, 36] . Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay chưa có đề
tài nghiên cứu nào về các đột biến gen trong ung thư đại trực tràng được cơng
bố. Vì vậy, để có thể đánh giá nguy cơ của ung thư đại trực tràng thể đa polyp
tuyến gia đình ở những người thân trong gia đình bệnh nhân ung thư đại trực
tràng thể đa polyp tuyến gia đình (FAP) để có biện pháp theo dõi và sử lý sớm
1


trước khi ung thư xuất hiện, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện
biến đổi gen trong ung thư đại trực tràng”, trong đó tập trung vào nghiên cứu
các đột biến dòng mầm của gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa
polyp tuyến gia đình” nhằm 2 mục tiêu sau đây:
1. Phát hiện các đột biến trên exon 15 của gen APC ở các bệnh nhân ung
thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.
2. Đánh giá các đột biến trên exon 15 của gen APC ở những người thân
trong gia đình các bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình.

2


1. TỔNG QUAN

Ung thư đại trực tràng là bệnh lý ác tính phổ biến (đứng thứ ba tại Mỹ).
Hơn 95% ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô tuyến (adenocarcinoma).

Các bệnh lý ác tính cịn lại bao gồm carcinoid, lymphoma và sarcoma, …. Tỷ lệ
mắc ung thư đại trực tràng đứng thứ hai ở Canada, Tây Âu. Tỷ lệ mắc trung
bình ở Đơng Âu và các nước cơng nghiệp mới. Tỷ lệ mắc thấp nhất ở Châu Phi,
Châu Á và một phần Mỹ La tinh. Nam mắc nhiều hơn nữ. Tại Việt nam tỷ lệ
mắc ung thư đại trực tràng theo tuổi là 7,5/100.000 dân, đứng hàng thứ 5 ở cả
hai giới, sau ung thư phế quản, dạ dày, gan, vú [ 9].
Một điều quan trọng là hầu hết ung thư đại trực tràng (93%) xuất phát từ
một polyp tuyến của đại tràng. Thời gian chuyển từ một polyp lành tính sang ác
tính trung bình khoảng 3-5 năm. Đối với người bị ung thư đại trực tràng, nam
giới có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn nữ giới. Độ tuổi bị ung thư đại trực tràng phổ
biến nhất là 70-80. Hầu hết ung thư đại trực tràng có liên quan đến các yếu tố
ngoại sinh, chỉ một số rất ít do di truyền. Ung thư đại tràng xích ma và trực
tràng chiếm 50% các trường hợp ung thư đại trực tràng. Ung thư đại tràng
xuống có tỉ lệ thấp nhất [3, 8].
Về nguyên nhân, 85% ung thư đai trực tràng là do các yếu tố ngẫu nhiên,
khoảng 15% có tính chất gia đình, trong đó đa polyp tuyến gia đình (familial
adenomatous polyposis: FAP) chiếm tỷ lệ khoảng dưới 1% [24]. Tỷ lệ mắc FAP
ở Hoa Kỳ là 1/ 5000 và ở Nhật là 1/17.000 dân [52].
Ung thư đại trực tràng là một trong số ít bệnh lý ác tính có tiên lượng khá
tốt. Khoảng 50% bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng có thể được phẫu thuật triệt
căn. Bệnh có thể sàng lọc phát hiện sớm và điều trị có hiệu quả.

3


1.1.Đa polyp tuyến gia đình (FAP):
Đa polyp tuyến gia đình là bệnh di truyền trội có đặc điểm là sự phát triển
của hàng trăm đến hàng nghìn u tuyến ở đại tràng và trực tràng . Tỷ lệ mắc FAP
ở Hoa Kỳ là 1/ 5000 và ở Nhật là 1/17.000 dân [52], ở Châu Âu tỷ lệ mắc là
1/11.300- 37.600 dân. FAP phân bố đều ở cả hai giới. Ở Việt Nam hiện chưa

có thống kê cụ thể về FAP. Nguyên nhân của bệnh FAP là do có sự đột biến ở
gen APC, một loại gen ức chế khối u, có vai trị ức chế sự hình thành của khối u
mới sinh ở đại tràng. Độ tuổi xuất hiện triệu chứng của FAP là 16. Bệnh nhân
được chẩn đoán FAP ở độ tuổi trung bình là 36. Hầu hết bệnh nhân FAP sẽ phát
triển thành ung thư nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp ở giai đoạn sớm
của bệnh [75]. Trên thế giới, 85% ung thư đai trực tràng là do ngẫu nhiên, khoảng
15% có tính chất gia đình trong đó FAP chiếm tỷ lệ khoảng 1% [24].

Hình 1. Hình ảnh đa polyp tuyến gia đình đại trực tràng

Bệnh polyp gia đình (FAP), yếu tố di truyền thể hiện rất rõ: tần số truyền
bệnh cho con ở các gia đình này đến 50%.
Biểu hiện lâm sàng của FAP thường là phân lẫn máu, phân lỏng, đau
bụng, đôi khi xuất hiện polyp, nhất là loại có cuống ở thấp, gần hậu mơn có thể
bị lịi ra. Tuy nhiên, có trường hợp bệnh nhân hồn tồn khơng thấy triệu chứng

4


lâm sàng nhưng vẫn có thể có polyp đại trực tràng. Vì vậy, phải chú ý những
trường hợp có tiền sử gia đình, đặc biệt ở nam giới trên tuổi 45.
FAP được chẩn đốn bằng cách tìm hồng cầu (soi phân bằng kính hiển
vi) hoặc hemoglobin trong phân (xét nghiệm Weber Meyer), siêu âm qua nội soi
đại trực tràng, siêu âm bụng, chụp x quang, chụp cắt lớp vi tính, định lượng
kháng nguyên ung thư phôi trong huyết tương CEA (carcinoembryonic
antigen), sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử (xác định các đột biến trên gen
APC), ...
1.2.Cấu trúc và chức năng của gen APC
Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u
đa chức năng, gồm 8972 cặp base (bp) nằm trên nhiễm sắc thể 5q21. Sản phẩm

của gen APC là một protein gồm 2.843 gốc acid amin, có khả năng gắn với
nhiều loại protein khác nhau như β-catechin, actin, CtBP, Asef, IQGAP1, EB1
và với nhiều vi cấu trúc hình ống. Các đột biến dịng mầm ở gen APC có thể
gây bệnh đa polyp tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis: FAP) với
đặc điểm là có hàng trăm đến hàng nghìn polyp ở đại trực tràng (Groden và
cộng sự 1991 [29], Kinzler và cộng sự, 1991 [43]). Các đột biến ở gen APC
được tìm thấy trong khoảng 60-80% ung thư biểu mô đại-trực tràng và ung thư
đại-trực tràng thể ngẫu nhiên (Powel và cộng sự, 1992 [61]. Các nghiên cứu di
truyền sử dụng chuột bị gây đột biến và tế bào ung thư nuôi cấy đã chứng minh
rằng các đột biến ở gen APC liên quan đến quá trình ung thư hóa ruột. Gen APC
có vai trị ngăn chặn con đường tín hiệu Wnt kinh điển - con đường cần thiết
cho sự hình thành khối u, protein APC cịn có vai trị đối với sự phát triển và sự
hằng định nội môi (homeostasis) của nhiều loại tế bào, như các tế bào biểu mô
và các tế bào lympho. Các nghiên cứu cũng cho thấy gen APC có vai trị trong
một số q trình cơ bản khác của tế bào như quá trình gắn kết và di cư của tế
bào, cấu tạo mạng lưới actin và các vi ống, tạo thoi vô cực và sự phân chia
nhiễm sắc thể. Sự rối loạn của các quá trình này bởi các đột biến ở gen APC là
nguyên nhân khởi phát và phát triển của ung thư đại trực tràng.
5


1.2.1. Cấu trúc của gen APC và protein APC
Gen APC nằm ở vùng 5q21 của nhiễm sắc thể thứ 5. Việc xác định một
bệnh nhân bị đa polyp tuyến gia đình (FAP) đại trực tràng gắn liền với sự chậm
phát triển tâm thần và các bất thường khác là đầu mối đầu tiên để xác định vị trí
của APC, người ta thấy có sự xóa đoạn của nhiễm sắc thể 5q21 (Kinzler và
cộng sự, 1991 [43]). Phân tích sự liên quan của các gia đình với FAP đã dẫn đến
việc lập bản đồ gen của gen APC ở nhiễm sắc thể 5q21. Sau đó, gen APC đã
được người ta dịng hố, nhận biết và xác định đặc tính (Bodmer và cộng sự,
1987 [23], van Es và cộng sự, 2001 [73]).

Gen APC ở dạng phổ biến nhất gồm 8972 cặp base nitơ (bp) trải dài trên
21 exon và mã hóa cho một protein gồm 2.843 acid amin. Exon 10A nằm ở
phần cuối của exon 10, là đối tượng của sự thay thế và bổ sung 18 acid amin ở
protein APC khi sao chép.
Exon 15 chiếm trên 75% chuỗi mã hóa (coding sequence) của gen APC và
là đối tượng hay gặp nhất của cả các đột biến dòng mầm (germline mutations)
và của cả các đột biến dòng thân (somatic mutations) .
Gen adenomatous polyposis coli (APC) là một gen áp chế khối u quan
trọng. Các đột biến ở gen APC đã được tìm thấy không chỉ ở phần lớn các ung
thư đại tràng mà cịn ở một số ung thư khác, ví dụ như ở ung thư gan.
Các đột biến dòng mầm của gen APC thường dẫn đến bệnh đa polyp tuyến
gia đình (familial adenomatous polyposis: FAP), được đặc trưng bởi hàng trăm
đến hàng ngàn khối u (polyps) trong đại tràng (Groden và cộng sự, 1991 [29]).
Các đột biến ở gen APC đã được phát hiện ở khoảng 60% các ung thư đại tràng
thể đa polyp tuyến gia đình cũng như ung thư đại tràng thể ngẫu nhiên (sporadic
carcinomas) (Powell và cộng sự, 1992 [61]). Các nghiên cứu di truyền sử dụng
mơ hình chuột nhắt đột biến đã chứng minh rằng các đột biến ở gen APC có vai
trị trong bệnh sinh khối u ở đường ruột (intestinal tumorigenesis). Các đột biến
đồng hợp tử (homzygous APC mutations) của gen APC ở chuột nhắt dẫn đến sự
chết phơi và sự xóa có điều kiện (conditional deletion) của gen này ở chuột nhắt
6


trưởng thành đã phá vỡ sự hằng định nội môi (homeostasis) khơng chỉ ở ruột mà
cịn ở các mơ khác. Những bằng chứng này đã chứng tỏ rằng gen APC cần thiết
cho sự phát triển và sự hằng định nội mơi của tế bào và rằng bất hoạt của nó tạo
điều kiện cho sự hình thành khối u (tumorigenesis).
Sản phẩm của gen APC là một protein có tên là protein APC, với 2.843 gốc
acid amin, có khối lượng phân tử 312 kDa, gồm nhiều vùng (domains) liên kết
với các protein khác, như các protein β-catenin, axin, CtBP, Asefs, IQGAP1,

EB1 và các vi ống (microtubules), thực hiện nhiều chức năng khác nhau, nhằm
ức chế khối u (Hình 2).
Vùng Armadillo
Vùng lặp lại 15 acid
amin

Vùng lặp lại 20 acid
amin
Vùng cơ bản

Vùng gắn EB1

Vùng gắn axin

Số codon

Hình 2: Cấu trúc của protein APC. Protein APC gồm 6 vùng chức năng chính là: vùng
Armadillo, vùng lặp lại 15 aa, vùng lặp lại 20 aa, vùng cơ bản, vùng gắn EB1 và vùng gắn
axin (Fearnhead NS và cộng sự [26]).

Các nghiên cứu sử dụng chuột nhắt đột biến và các tế bào nuôi cấy đã
chứng minh rằng protein APC có vai trị ngăn chặn tín hiệu Wnt kinh điển - con
đường cần thiết cho sự hình thành khối u (tumorigenesis), protein APC cũng có
vai trị đối với sự phát triển và sự hằng định nội môi (homeostasis) của nhiều
loại tế bào, chẳng hạn như các tế bào biểu mô và các tế bào lympho. Các nghiên
cứu sâu hơn đã chỉ ra rằng protein APC cịn đóng các vai trị trong một số các
qúa trình cơ bản của tế bào. Các quá trình này bao gồm sự kết dính và di trú của
tế bào, sự tổ chức mạng lưới actin và các vi ống, sự hình thành trục chính
(spindle) và sự phân chia nhiễm sắc thể. Sự mất điều hịa các q trình này gây
7

nên bởi các đột biến ở gen APC có liên quan đến việc khởi đầu và lan rộng của
ung thư đại tràng.
Protein APC gồm 6 vùng chức năng chính là: vùng Armadillo, vùng lặp
lại 15 aa, vùng lặp lại 20 aa, vùng cơ bản, vùng gắn EB1 và vùng gắn axin
(Hình 2).
- Vùng Armadillo: Vùng Armadillo ở protein APC là vị trí gắn của β-catenin,
GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự phosphoryl hóa và sự
thối hóa của β-catenin, giải phóng β-catein khỏi nhân tế bào, giữ cho β-catein
khơng tương tác với TCF, kiểm sốt sự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào/
bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ E-cadherin ở màng bào
tương và hoạt hóa Asef1, Asef2 và Cdc42, kìm hãm sự sao chép theo con đường
Wnt kinh điển, kích thích sự kết dính và sự di cư của tế bào (Aoki K và Taketo
MM, 2007 [18]).
- Vùng lặp lại 15 acid amin: Vùng lặp lại 15 acid amin ở protein APC là vị trí
gắn của β-catenin, GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự
phosphoryl hóa và sự thối hóa của β-catein, giải phóng β-catenin khỏi nhân tế
bào, giữ cho β-catein không tương tác với TCF, kiểm soát sự phân bố của βcatein giữa nhân tế bào/ bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ
E-cadherin ở màng bào tương. Vùng lặp lại 15 acid amin ở protein APC cũng là
vị trí gắn CtBP, tạo nên phức hợp kìm hãm sự sao chép theo con đường Wnt
kinh điển, kích thích bám dính của tế bào (Aoki K và Taketo MM, 2007 [18]).
- Vùng lặp lại 20 acid amin: Vùng lặp lại 20 acid amin ở protein APC là vị trí
gắn của β-catenin, GSK3β và axin, sự gắn này có tác dụng kích thích sự
phosphoryl hóa và sự thối hóa của β-catenin, giải phóng β-catenin khỏi nhân tế
bào, giữ cho β-catenin khơng tương tác với TCF, kiểm soát sự phân bố của βcatenin giữa nhân tế bào/ bào tương tế bào và màng bào tương, làm tăng mức độ
E-cadherin ở màng bào tương, kích thích sự kết dính của tế bào [15, 16, 28].
- Vùng cơ bản: vùng cơ bản ở protein APC là vị trí gắn của các vi ống. Sự gắn
của các vi ống vào protein APC có tác dụng điều hòa các chức năng của
8

kinetochore - một cấu trúc protein trên nhiễm sắc thể - là nơi các sợi trục chính
(the spindle fibers) đính vào trong quá trình phân chia tế bào để đẩy các nhiễm
sắc thể xa ra (Aoki K và Taketo MM, 2007 [18]).
- Vùng gắn EB1: việc gắn EB1 vào protein APC tạo điều kiện dễ dàng cho hoạt
đông của Rho và mDia [47], làm ổn định và polymer hóa các vi ống, giúp cho
việc phân chia nhiễm sắc thể chính xác (Aoki K và Taketo MM, 2007 [18]).
- Vùng gắn axin: Axin gắn với APC giữa các vị trí chứa 20 acid amin
lặp đi lặp lại thứ ba và thứ tư, thứ tư và thứ năm và sau đoạn thứ bảy. Axin
cùng với β-catenin đã gắn vào protein APC tạo thành một phức hợp có tác
dụng ức chế sự sao chép của β-catenin/TCF, điều này hoạt hóa Myc và
cyclin D1, có tác dụng kiểm sốt sự sinh sơi và biệt hóa của tế bào [31].

FAP
FAP nặng
nặng (1249-1330)
(1249-1330)

Bình
Bình thường
thường (1-2843)
(1-2843)

FAP
FAP nhẹ
nhẹ (1860-1987)
(1860-1987)
FAP
FAP nhẹ

nhẹ (1860-1987)
(1860-1987)
CHRPE
CHRPE(463-1387)
(463-1387)

Liên
Liên quan
quan đến
đến các
các khối
khối uu cứng
cứng (1445-1578
(1445-1578
Liên
Liên quan
quan đến
đến uu nguyên
nguyên bào
bào gan
gan (457-1309)
(457-1309)

Số
Số codon
codon

Hình 3: Sự liên quan giữa kiểu đột biến gen APC và kiểu hình của đa polyp tuyến gia đình
(FAP). CHRPE: chứng phì đại bẩm sinh biểu mô sắc tố võng mạc (Fearnhead NS và

cộng sự [26]).

9


Một trong những vấn đề quan trọng nhất trong nghiên cứu về APC là xác
định các con đường của tế bào chịu trách nhiệm về bệnh sinh khối u
(tumorigenesis) khi nó bị đột biến. APC là một protein đa miền (multi-domain
protein) chứa các vị trí gắn cho nhiều protein, bao gồm các vi ống
(microtubules), các thành phần của con đường Wnt / Wg, β-catenin và axin, các
yếu tố điều hòa bộ khung tế bào (cytoskeletal regulators) EB1 và IQGAP1 và
yếu tố trao đổi nucleotid guanin Rac (guanine-nucleotide-exchange factor:
GEF) Asef1. Phần lớn (60%) các đột biến của gen APC có liên quan đến ung
thư xảy ra ở một vùng được gọi là vùng cụm đột biến (mutation cluster region:
MCR) và dẫn đến sự cắt ngắn chuỗi polypeptid đầu C tận của protein APC
(Beroud và Soussi, 1996 [20]). Bởi vì những protein bị cắt ngắn này gây nên sự
mất các vùng cần thiết cho sự gắn vào β-catenin và vào các vi ống
(microtubules) nên sự tương tác của protein APC với β-catenin hoặc với các vi
ống (vốn được coi là cần thiết cho hoạt động ức chế khối u của protein APC) bị
mất tác dụng. β-Catenin có một vai trị kép trong các tế bào, có cả chức năng kết
dính tế bào tại các nút giao kết dính và cả chức năng như là chất dẫn truyền tín
hiệu (a signal transducer) đến nhân tế bào để đáp ứng đối với tín hiệu Wnt. Sự
gắn của protein APC với các vi ống có vai trị rất quan trong cho sự hình thành
bộ khung tế bào.
Có sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình trong đột biến trên gen APC ở
bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP) (Fearnhead NS và cộng sự, 2001 [26]). Nếu
các đột biến nằm trong vùng codon 1249-1330, bệnh nhân sẽ bị đa polyp tuyến
gia đình thể nặng. Nếu các đột biến nằm ở một trong hai vùng codon 1-163 và
vùng codon 1860-1987, bệnh nhân sẽ bị đa polyp tuyến gia đình thể nhẹ. Nếu
các đột biến nằm trong vùng codon 463-1387, khoảng 60% bệnh nhân FAP sẽ

bị chứng phì đại bẩm sinh biểu mơ sắc tố võng mạc (congenital hypertropy of
the retinal pigment epithelium CHRPE). Nếu các đột biến nằm trong vùng từ
codon 1445-1578, bệnh nhân sẽ bị các u xơ cứng (desmoid tumours). Nếu các
đột biến nằm trong vùng từ codon 457-1039, bệnh nhân sẽ bị u nguyên bào gan
(hepatoblastoma) (Hình 3).
10


1.2.2. Các chức năng của gen APC và protein APC
Chức năng của gen APC được thể hiện qua chức năng của sản phẩm sao
chép và sinh tổng hợp của nó là protein APC. Protein APC là một protein áp chế
ung thư đa chức năng. Các vùng chức năng đa dạng của protein APC và các đột
biến cắt ngắn của nó gây nên sự mất chức năng của nó, dẫn đến sự tạo thành các
polyp và ung thư đại trực tràng được thể hiện ở hình 4.
Protein APC là một protein đa chức năng, gồm 6 chức năng chính:
- Protein APC kìm hãm con đường tín hiệu Wnt kinh điển
Con đường tín hiệu Wnt kinh điển gồm một loạt các sự kiện xảy ra khi các
protein Wnt gắn vào các thụ thể bề mặt tế bào của một số protein đặc hiệu, cuối
cùng dẫn đến sự thay đổi về số lượng β-catenin đi vào nhân tế bào. Các protein
đặc hiệu này là thành phần then chốt của một phức hợp của thụ thể Wnt liên
quan đến màng tế bào mà khi được hoạt hóa, sự gắn của Wnt sẽ ức chế một
phức hợp thứ hai của các protein gồm axin, GSK-3 và protein APC. Bình
thường, phức hợp axin/GSK-3/APC thúc đẩy sự thối hóa phân tử tín hiệu nội
bào β-catenin. Sau đó, "phức hợp phân hủy β-catenin" này bị ức chế, β-catenin
trong bào tương tế bào được ổn định và một số β-catenin có thể đi vào nhân tế
bào và tương tác với các yếu tố sao chép TCF/LEF để thúc đẩy sự biểu hiện gen
đặc hiệu.
Các protein đặc hiệu bề mặt tế bào thường tương tác với một protein vận
chuyển qua màng gọi là LRP. LRP gắn vào các protein đặc hiệu, vào Wnt và
axin có thể làm ổn định phức hợp Wnt / Frizzled / LRP / protein đặc hiệu/ axin /

ở bề mặt tế bào tạo thành "phức hợp thụ thể ".
Ở động vật có xương sống, một số protein đặc hiệu có thể điều hịa con
đường tín hiệu Wnt bằng cách gắn vào các Wnt hoặc gắn vào một

11


Các loại protein APC ở
người, chuột và ruồi giấm

Protein APC với độ dài
đầy đủ

Kích thích sự di cư của tế bào

Kích thích sự bám dính tế
bào

Kích thích sự phân chia
nhiễm sắc thể

Kích thích sự ổn định của
các vi ống

Kiểm sốt sự sinh sơi và sự
bám dính của tế bào
Protein APC
bị cắt ngắn ở đầu tận C

Hoạt hóa Asef

Hoạt hóa sự sao
chép β-catenin/TCF

Cảm ứng sự sinh sôi
và ức chế sự biệt hóa

Cảm ứng sự phá hủy cấu
trúc của trục chính
Cảm ứng sự mất ổn định
nhiễm sắc thể

Kích thích mạnh
sự di cư của tế bào

Hình 4. Các vùng chức năng đa dạng của protein APC và các đột biến cắt ngắn gây nên sự
mất chức năng của nó, dẫn đến sự tạo thành các polyp và ung thư đại trực tràng.
(A) Các protein APC1 và APC2 ở ruồi dấm, chuột và người. Hai gen APC của ruồi giấm
không giống hai gen của động vật có vú.
(B) Sơ đồ các miền ở tồn bộ chiều dài của protein APC và chức năng của chúng. APC kích
thích sự di cư của tế bào qua tương tác với ASEF, IQGAP1 hoặc với mDia. APC có liên quan
đến sự kết dính tế bào thơng qua kiểm soát sự phân bố của β-catenin giữa nhân tế bào / bào
tương (cytoplasm) và màng bào tương của tế bào. APC ức chế sự sao chép (transcription) của
β-catenin/ TCF thông qua những tương tác với β-catenin hoặc với CtBP. APC điều hịa sự
phân chia nhiễm sắc thể thơng qua sự gắn kinetochore và qua sự áp chế tín hiệu Wnt kinh
điển. Mũi tên màu đỏ và màu xanh cho biết sự “kích hoạt” và “ức chế”, tương ứng.
(C) Sơ đồ của một trong những protein APC bị cắt ngắn ở đầu tận C và vai trị của nó trong
bệnh sinh khối u (tumorigenesis). Protein APC bị cắt ngắn kích thích di cư của tế bào mạnh
mẽ hơn so với protein APC có chiều dài đầy đủ, trái lại, sự mất các vùng ở đầu tận của C của
protein APC kích hoạt con đường tín hiệu Wnt và cảm ứng sự bất ổn định nhiễm sắc thể.

12


protein thụ thể của Wnt. Ví dụ, Sclerostin có thể gắn vào LRP và ức chế con
đường tín hiệu Wnt.
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [28, 34, 42, 70], người ta cho rằng
protein APC kìm hãm con đường Wnt kinh điển bằng cách gắn với β-catenin,
GSK3β và Axin để kích thích sự phosphoryl hóa và sự thối hóa của β-catenin,
gắn với β-catenin tại các vùng lặp lại Armadillo, vùng lặp lại 15 hoặc 20 acid
amin, để giải phóng β-catenin khỏi nhân tế bào, làm β-catenin không tương tác
với TCF và gắn với CtBP tại vùng lặp lại 15 acid amin để sắp xếp lại phức hợp
kìm hãm đối ví bộ máy sao chép.
- Protein APC kích thích sự bám dính tế bào
Sự bất hoạt protein APC cũng được cho là thúc đẩy sự sinh khối u
(tumorigenesis) qua việc làm mất độ bám dính của tế bào (Bienz, 2002 [21],
Bienz và Hamada, 2004 [22]). Protein APC được tìm thấy ở màng bào tương
của các tế bào biểu mô động vật có vú cả trong cơ thể (in vivo) và cả trong nuôi
cấy (Miyashiro và cộng sự, 1995 [51]). Protein APC tương tác với β-catenin,
phức hợp này làm E-cadherin gắn với α-catenin và gắn với bộ khung actin của
tế bào (Kemler 1993 [41]).
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [21, 22, 41, 51], người ta cho rằng
protein APC kích thích sự bám dính tế bào bằng cách gắn β-catenin tại các vùng
lặp lại Armadillo, các vùng lặp lại 15 hoặc 20 acid amin, để kiểm soát sự phân
bố của β-catenin giữa nhân tế bào/ bào tương tế bào và màng bào tương của tế
bào, đồng thời làm tăng mứcđộ E-cadherin ở màng bào tương của tế bào.
- Protein APC kích thích sự phân cực và di cư của tế bào
Protein APC điều hòa sự phân cực và sự di cư của tế bào thơng qua sự
kiểm sốt của bộ khung actin (actin cytoskeleton) (Akiyama và Kawasaki, 2006
[16]).

13


Từ những kết quả nghiên cứu thu được [16, 26, 40, 48, 60, 76], người ta
cho rằng protein APC kích thích sự di cư của tế bào bằng cách gắn vào Acef1
và Acef2 các vùng lặp lại Armadillo để hoạt hóa chúng và hoạt hóa Cdc42; gắn
vào IQGAP1 tại các vùng lặp lại Armadillo để thu thập IQGAP1 và CLIP170,
tạo nên một phức hợp với IQGAP1, CLIP170, Rac1 và Cdc42 đã được hoạt
hóa, tạo nên mạng lưới actin; gắn với EB1 tại vùng gắn EB1 tạo điều kiện dễ
dàng cho hoạt đông của Rho và mDia, làm ổn định và polymer hóa các vi ống,
giúp cho việc phân chia nhiễm sắc thể chính xác.
- Protein APC làm ổn định mạng lưới các vi ống
APC được tìm thấy ở cuối của các vi ống (microtubules), nó có thể bám
vào và ổn định các vi ống. Các kết quả này chỉ ra rằng APC điều hịa mạng lưới
vi ống và có thể đóng vai trị trong các q trình trung gian của các vi ống như
sự di cư tế bào và sự hình thành trục chính của con thoi (spindle) (Nathke, 2006
[59]).
Các kết quả nghiên cứu thu được gần đây [35, 45, 57, 58, 59, 69] cho thấy APC
và EB1 làm giảm chức năng của Rho và protein gia đình formin mDia protein
trong sự ổn định các vi ống. Vì APC có thể tạo thành một phức hợp với EB1 và
mDia ở đoạn cuối các vi ống ổn định nên sự tham gia của APC vào sự di cư
của tế bào có thể bao gồm sự kết hợp với mDia. Do đó, APC kích thích sự di cư
tế bào qua một vài con đường khác nhau.
- Protein APC giúp sự phân chia nhiễm sắc thể chính xác
Sự mất ổn định nhiễm sắc thể (chromosome instability: CIN) được xem là
một trong những động lực kích thích sự tạo thành khối u (tumorigenesis). Một
số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự mất APC cảm ứng sự phân chia sai lệch (missegregation) của nhiễm sắc thể (Aoki và cộng sự, 2007 [18]).
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [18, 33, 71], người ta cho rằng
protein APC giúp sự phân chia nhiễm sắc thể chính xác bằng cách gắn vào các
vi ống tại vùng cơ bản (basic domain) để điều hòa các chức năng của

14


kinetochore - một cấu trúc protein ở nhiễm sắc thể, nơi các sợi trục chính đính
kèm trong q trình phân chia tế bào - để đẩy các nhiễm sắc thể xa ra; gắn vào
β-catenin tại các vùng lặp lại 15 hoặc 20 acid amin, để ức chế sự chết tế bào
theo chương trình (apoptosis) của tế bào ở giai đoạn G2/M của chu trình tế bào
qua con đường tín hiệu kinh điển Wnt.
- Protein APC ức chế chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
Ở đại tràng người bình thường, sự tiếp xúc của các tế bào với các cytokin
đặc hiệu có tác dụng chống lại sự chết tế bào theo chương trình trong tế bào
biểu mơ đại tràng. Các tế bào biểu mô tuyến thể hiện những kiểu rối loạn của sự
chết tế bào theo chương trình thường nhạy cảm với các tín hiệu của sự chết tế
bào theo chương trình. Gen APC cũng có thể đóng vai trị gián tiếp trong việc
điều hòa sự chết tế bào theo chương trình, chẳng hạn như việc cảm ứng sự biểu
hiện gen APC typ dại ở các tế bào ung thư có đột biến gen APC làm tăng sự
chết tế bào qua sự chết tế bào theo chương trình (Morin và cộng sự, 1996 [54]).
Từ những kết quả nghiên cứu thu được [25], người ta cho rằng protein
APC ức chế sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của tế bào bằng cách
gắn vào β-catenin tại các vùng lặp lại Armadillo, các vùng lặp lại 15 hoặc 20
acid amin, để ức chế sự chết tế bào theo chương trình ở giai đoạn G2/M trong
chu trình tế bào qua con đường tín hiệu kinh điển Wnt, điều này cũng giúp cho
sự phân chia nhiễm sắc thể được chính xác hơn.
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng xác định đột biến gen APC.
Sự phát triển nhanh chóng của cơng nghệ sinh học phân tử trong những
năm gần đây đã thay đổi một cách rõ rệt những hiểu biết ở mức độ phân tử của
rất nhiều bệnh lý khác nhau. Các kỹ thuật chẩn đốn ngày càng hồn thiện và
giúp chẩn đốn bệnh lý di truyền nhanh, chính xác. Đặc biệt các kỹ thuật sinh
học phân tử hiện đại cũng đã được ứng dụng trong nghiên cứu bệnh ung thư đại
trực tràng thể đa polyp tuyến gia đình để góp phần tư vấn di truyền, sàng lọc

phát hiện sớm nguy cơ mắc bệnh để có hướng điều trị, tiên lượng mức độ bệnh.

15


1.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR được một nhà Hóa sinh học người Mỹ là Kary Mullis (sinh
năm 1944) phát minh vào năm 1985 (giải Nobel Hóa học 1993). Sự ra đời của
kỹ thuật PCR đóng một vai trị vơ cùng quan trọng trong Cơng nghệ Sinh học
phân tử, giúp các nhà Sinh học phân tử dễ dàng và nhanh chóng khuếch đại các
chuỗi DNA lên hàng tỷ lần trong một thời gian rất ngắn trong điều kiện in vitro.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR:
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, bắt cặp
của DNA và tổng hợp ADN nhờ enzym DNA polymerase. Với nguyên liệu là
bốn loại nucleotid (A, G, T, C), DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp một mạch
DNA mới từ mạch DNA khn. Kỹ thuật địi hỏi sự có mặt của những mồi xi
và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn.
Kỹ thuật PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba bước:
- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản
ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC 95oC trong vòng 30-60 giây.
- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho phép
các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tm của
các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq
polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm
16


cuối của kỹ thuật PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách
giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu
tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.
Số lượng chu kỳ trong PCR thường không vượt quá 40. Sau mỗi chu kỳ
sẽ làm tăng gấp đôi số chuỗi DNA. Như vậy, sau n chu kỳ số lượng sợi DNA là
2n. Nhờ vậy, đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di và có thể phát hiện
được sau khi nhuộm và để có thể tạo dịng hoặc giải trình tự. Trong quá trình
thực hiện kỹ thuật PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượng
mồi và dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate) tự do giảm, enzym DNA
polymerase hoạt động yếu dần. Do đó, cần tính tốn hàm lượng mồi, dNTP và
enzym để đảm bảo kỹ thuật PCR cho kết quả tốt nhất
1.3.2. PCR đơn mồi (monoplex PCR)
PCR đơn mồi là PCR kinh điển nhất, trong mỗi kỹ thuật PCR, chỉ sử
dụng duy nhất một cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu từ
phân tử DNA của tế bào [13].
Các tác giả đã sử dụng từng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại từng exon
của gen APC bằng kỹ thuật PCR, sau đó điện di trên gel agarose, mẫu bệnh
nhân được tiến hành song song với mẫu đối chứng. Nếu mẫu đối chứng xuất
hiện vạch DNA tương ứng với kích thước của exon được khuyếch đại exon
được khuyếch đại chính xác. Vạch điện di của sản phẩm PCR được cắt ra từ gel
agarose và được tinh sạch bằng Kit QIAGEN. Sản phẩm tinh sạch sẽ được tiến
hành giải trình tự trực tiếp.
1.3.3. PCR đa mồi (multiplex PCR)
PCR đa mồi là kỹ thuật PCR sử dụng đồng thời cùng một lúc nhiều cặp mồi đặc
hiệu khác nhau, để nhân các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử

DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Điều cần thiết là phải thiết kế các
cặp mồi có cùng nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, đồng thời các mồi này khơng

17


bắt cặp với nhau và quan trọng nhất là độ nhạy phát hiện bệnh không giảm mà
vẫn tương đương như độ nhạy của PCR đơn mồi [11, 13].
1.3.4. Kỹ thuật PCR sao chép ngược (Reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)
Kỹ thuật RT-PCR được sử dụng để tổng hợp mạch kép DNA bổ xung
mới (cDNA) từ mạch đơn mRNA. Do Taq polymerase không hoạt động trên
RNA nên người ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR.
Trước hết, mRNA được chuyển thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngược
(reverse transcriptase). Mồi được sử dụng có thể là oligonucleotide T (oligo-dT)
để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA, cũng có thể là các hexanucleotide
(gồm 6 nucleotide có trình tự ngẫu nhiên) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự
ngắn trên phân tử RNA. Phần cịn lại của sợi cDNA sau đó được tổng hợp với
sự có mặt của 4 loại desoxyribonucleosid triphosphat.
Sợi RNA trên phân tử lai RNA-DNA sau đó bị thuỷ phân trong mơi
trường kiềm, cịn sợi DNA khơng bị thủy phân trong mơi trường kiềm.
Đầu 3’ của DNA mới được tổng hợp tạo ra một hình trâm cài tóc và làm
mồi cho sự tổng hợp sợi DNA đối xứng nhờ enzym Taq polymerase. Trâm cài
tóc lại bị loại bởi nuclease S1 nhận diện những nucleotid khơng có liên quan để
tạo ra sợi DNA kép hồn chỉnh.
RT-PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, chỉ cần một lượng RNA thấp vẫn có
thể được phát hiện nhờ phản ứng khuếch đại. Đây là phương pháp thường được
sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh lý di truyền nói chung và bệnh lý KĐT
thể FAP nói riêng. Ngồi ra, RT-PCR cịn giúp chẩn đốn các giai đoạn của
bệnh. Với phân tích bán định lượng, có thể xác định được mức độ biểu hiện của
RNA ở tế bào và mô cũng như đánh giá được hoạt động của gen tương ứng.

RT-PCR còn được sử dụng khi tiến hành phản ứng Northern blot để xác định
đột biến của phân tử RNA.
1.3.5. Real-time PCR

18


Đặc trưng của Real-time PCR là sản phẩm khuếch đại được xác định
ngay trong quá trình phản ứng nhờ sự phát huỳnh quang của các probe sau
khi gắn với sản phẩm khuyếch đại. Như vậy, độ phát quang tương ứng với
sản phẩm khuyếch đại được tao ra, hơn nữa từ kết quả nhận được ta có thể
tính được lượng bản sao (DNA hoặc RNA) ban đầu có trong phản ứng. Chính
vì vậy, Real-time PCR cịn được gọi là PCR định lượng [14].
1.3.6. Kỹ thuật MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)
Hiện nay, kỹ thuật MLPA được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh
lý di truyền, nó cho phép phát hiện các tổn thương gen một cách nhanh chóng
[65]. Trong kỹ thuật MLPA, vấn đế thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các
đoạn DNA đích đóng vai trị cực kỳ quan trọng. Thơng thường, mỗi probe chứa
hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau.
1.3.7. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp
xếp của các nuceotid trong phân tử DNA.
Máy giải trình tự gen tự động hồn tồn được thiết kế trên nguyên tắc sử
dụng ddNTP do F. Sanger và cộng sự phát minh. Với các máy thế hệ mới sau
này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP.
Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ
cần điện di trên một hàng mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây,
hệ thống điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi
qua, phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu
huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính

phân tích. Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện được là nucleotid nào,
từ đó biết được trình tự của DNA đích [11, 12, 13].
Kỹ thuật giải trình tự của DNA đích đã được ứng dụng trong nhiều
nghiên cứu để xác định các đột biến mất nucleotid, thay thế nucleotid, thêm
nucleotid trên gen APC ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể FAP...
19


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Nhóm chứng: mười lăm người khỏe mạnh, bản thân và gia đình khơng bị
hội chứng FAP hoặc ung thư đại trực tràng.
- Nhóm nghiên cứu:
Mười lăm gia đình bệnh nhân bị hội chứng đa polyp tuyến gia đình (FAP)
khám bệnh hoặc điều trị tại Bệnh viện K từ 2006-2010, tổng cộng 47 người,
bao gồm:
+ Hai mươi hai bệnh nhân bị bệnh ung thư đại trực tràng thể đa polyp
tuyến gia đình tuổi từ 18-63, tuổi trung bình là 37, gồm 16 nam và 6 nữ.
+ Hai mươi lăm thành viên có quan hệ huyết thống bậc 1 với bệnh nhân
bị ung thư đại trực tràng thể FAP trong 15 gia đình bệnh nhân, trong đó 3 người
đã biểu hiện bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP) và 22 thân nhân chưa biểu
hiện FAP.
Gia đình bệnh nhân ung thư đại trực tràng thể FAP và bệnh nhân đa polyp
tuyến gia đình được chọn trong nghiên cứu này phải có các điều kiện sau:
- Trong gia đình có ít nhất hai người bị bệnh FAP trở lên.
- Bệnh nhân có > 100 polyp trong đại trực tràng.
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ
-

Typ lấy máu chống đông EDTA.

-

Pipet, đầu côn các loại.

-

Ống Eppendorf 1,5 mL, ống Falcon.

-

Máy khuếch đại gen Gene Amp PCR System 9700 (Hoa Kỳ).
20


- Tủ lạnh sâu -30°C và -80°C (SANYO, Nhật).
- Máy điện di Mupid (Nhật).
- Máy soi gel và chụp ảnh tự động Chemidoc EQ-Bio-Rad (Hoa Kỳ).
- Máy ly tâm lạnh Beckman (Hoa Kỳ) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức).
- Lị vi sóng (Samsung).
- Tủ ni cấy có chế độ lắc.
- Máy đọc trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ).
- Tủ ấm.
2.2.2. Hố chất
* Hóa chất dùng để tách chiết DNA:
- Dung dịch lysis buffer
- Dung dịch K
- Dung dịch SDS 10%

- Proteinase K (10mg/mL)
- Dung dịch phenol: chloroform : isoamyl với tỷ lệ 25 : 24 : 1
- Dung dịch chloroform : isoamyl với tỷ lệ 24 : 1
- Ethanol 100% và ethanol 70%
- Sodium acetate 3M, pH=5,2
- Dung dịch hòa tan DNA để bảo quản DNA sau khi tách:
Dung dịch Lysis buffer
Hố chất

Nồng độ

Thể tích (mL)

Sucrose

0,3 M

51,3

Tribase HCL (pH=7,5)

0,01M

0,785

MgCl2

0,005 M

0,2375

21


Trixton X-100

1% (v/v)

5

Chỉnh pH=7,5 bằng HCl, hoàn thành bằng nước cất hai lần vừa đủ 500 mL.

Dung dịch K
Hoá chất

Nồng độ

Thể tích (mL)

NaCl

0,075 M

0,8775 g

EDTA

0,024M

1,7868 g

Chỉnh pH=8,0 bằng NaOH, hồn thành bằng nước cất hai lần vừa đủ 200
mL.
* Hoá chất để thực hiện Kỹ thuật PCR (Invitrogen):
+ 10x buffer
+ dNTP 10mM
+ Taq polymerase
+ Các cặp mồi (xuôi và ngược)
* Hoá chất để điện di sản phẩm PCR trên gel agarose:
+ Agarose
+ Dung dịch TBE 10x (Tris; acid boric; EDTA):
+ Loading buffer 10x
+ Ethidium bromide.
* Hoá chất để tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose (QIAGEN):
+ Dung dịch QC.
+ Dụng dịch Sodium acetate.
+ Dung dịch Isopropanol.
+ Dung dịch QG.
22