Tóm tắt luận văn nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ chủng Bacillus subtilis và ứng dụng khử protein nang mực trong quá trình sản xuất chitin

CẤU TRÚC LUẬN VĂN
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU (4 trang)
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (22 trang)
CHƯƠNG 3: NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (18 trang )
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN (13 trang)
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ (1 trang)
TÀI LIỆU THAM KHẢO (2 trang)
PHỤ LỤC (2 trang)
Luận văn được trình bày trong 68 trang, trong luận văn có sử dụng 12 bảng và
10 biểu đồ để trình bày kết quả nghiên cứu.Luận văn sử dụng 15 tài liệu tham khảo,
trong đó có 10 tài liệu tiếng Việt và 5 tài liệu tham khảo từ internet.

1


NỘI DUNG LUẬN VĂN
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
Đặt vấn đê

1.1.

Chitin và chitosan hiện nay được ứng dụng trong nhiều các lĩnh vực như nông
nghiệp, xử lý nước thải và y dược… Quá trình sản xuất chitin cần trải qua hai quá
trình khử khoáng và protein. Hiện nay, quá trình khử protein trong nguyên liệu chu
yếu sử dụng bazơ mạnh là NaOH để khử, phương pháp này có nhược điểm gây ô
nhiễm môi trường vì vậy cần có biện pháp thay thế. Biện pháp thay thế hiện nay đa
và đang nghiên cứu là sử dụng phương pháp sinh học, trong đó sử dụng enzyme
protease được sử dụng. Bằng phương pháp sinh học sẽ giải quyết được vấn đề ô
nhiễm môi trường. Enzyme protease thu từ nguồn là thực vật, động vật và vi sinh
vật, trong đó vi sinh vật là nguồn thu enzyme nhanh và ổn định. Trong các visinh

vật sinh enzyme protease thì Bacillus subtilis là một trong những chung sinh
protease mạnh và an toàn. Từ đó em tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu thu
nhận enzyme protease từ chủng Bacillus subtilis và ứng dụng khử protein nang
mực trong quá trình sản xuất chitin”.
-

Mục tiêu đê tài
Xác định điều kiện nuôi Bacillus subtilis C7 để thu enzyme protease cao.
Xác định điều kiện khử protein trong nang mực trong quá trình sản xuất

-

chitin
Nội dung nghiên cứu
Kiểm tra tính thuần cua các chung Bacillus subtilis C7.
Xác định điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis C7 để sinh enzyme protease cao

1.2.

1.3.

nhất
Xác định môi trường nuôi cấy
Xác định điều kiện nuôi cấy
Thử nghiệm thay thế NaOH bằng enzyme protease để khử protein nang mực
+
+

-

trong quá trình sản xuất chitin
Ý nghĩa đê tài
Ý nghĩa khoa học: từ chung Bacillus subtilis C7 thương mại, xác định các điều
1.4.
-

kiện thích hợp nuôi cấy chung Bacillus subtilis C7 có hoạt tính enzyme protease
cao. Từ đó thu nhận enzyme protease để khử protein trong nang mực nhằm thay thế

2


NaOH để giảm thiểu chi phí sản xuất chitin. Biết và hiểu rõ các thao tác kỹ thuật
-

trong quá trình làm đề tài.
Ý nghĩa thực tiễn: Thu nhận chế phẩm enzyme từ chung Bacillus subtilis C7 và
tiến hành thay thế NaOH trong sản xuất chitin nhằm giảm giá thành và giảm thiểu ô
nhiễm môi trường.

CHƯƠNG 2 TỐNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan vê enzyme
2.2 Tổng quan vê enzyme protease
2.3 Tổng quan vê Bacillus subtilis
2.4. Tổng quan vê chitin

3


2.5. Tổng quan vê phế liệu nang mực

CHƯƠNG 3 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nguyên liệu và đối tượng

4


-

-

Đối tượng nghiên cứu: chung Bacillus subtilis C7 ( cung cấp bởi viện CNSH

-

Trường Đại học Nha Trang)
Vật liệu : Nang mực khô ( Kiên Giang)
Môi trường sử dụng

Môi trường kiểm tra tính thuần chung Bacillus subtilis TSA (Trypticase soya
agar Tryptone 1,5%, Peptone 0,3%, NaCl 0,5%, Agar 1,5%, nước cất vừa đu
1000ml) hấp khử trùng ở 121oC, thời gian 15 phút.

-

Môi trường khảo sát điều kiện nuôi cấy : TSB ( Trypticase soya Broth
Tryptone 1,7%, Peptone 0,3%, NaCl 0,5%, KH 2PO4 0,25%, Glucose 0,25%, Nước
cất vừa đu 1000ml) hấp khử trùng ở 121oC, thời gian 15 phút.
3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh
3.2.3. Bố trí thí nghiệm
3.2.3.1.

Kiểm tra tính thuần khiết

3.2.3.2.

Khảo sát môi trường nuôi cấy

3.2.3.3.

Khảo sát nồng độ glucose vào môi trường nuôi cấy

3.2.3.4.

Khảo sát bổ sung peptone vào môi trường nuôi cấy

3.2.3.5.

Khảo sát bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy

3.2.3.6.

Khảo sát thời gian nuôi cấy

3.2.3.7.

Khảo sát pH nuôi cấy

5


3.2.3.8.

Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

3.2.3.9.

Khảo sát nhiệt độ hoạt động của enzyme protease

từ Bacillus sutilis C7
3.2.3.10.

Khảo sát pH hoạt động thích hợp enzyme protease từ

Bacillus sutilis C7
3.2.3.11.

Khảo sát tỷ lệ và thời gian thủy phân protein Nang mực

bằng enzyme protease chủng Bacillus subtilis C7
Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Anson
Xác định đạm acid amin theo phương pháp chuẩn độ Formol
Phương pháp định lượng protein phản ứng Biuret
3.3.
-

Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS
(viết tắt cua Statistical Package for the Social Sciences)

6


CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
4.1 Kiểm tra tính thuần khiết
Sau khi cấy ria trên thạch đĩa môi trường TSA u 24 giờ nhiệt độ 37 oC thì kiểm
tra khuẩn lạc. Trên môi trường TSA khuẩn lạc đồng nhất, không tạp nhiễm vi sinh
vật khác. Nhuộm gram Bacillus subtilis bắt màu gram + không có sự xuất hiện vi
khuẩn tạp nhiễm. Kết luận ống giống thuần khiết. Tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
4.2. Khảo sát môi trường nuôi cấy
4.2.1. Khảo sát loại môi trường nuôi cấy
Tiến hành cấy chung Bacillus subtilis C7 vào 3 môi trường TSB, TSB +
Casein 0,25%, TSB + (CaCl2, MgSO4, KH2PO4 0,25%). Thu enzyme và xác định
hoạt độ enzyme bằng phương pháp Anson. Kết quả thể hiện qua sơ đồ hình
4.2.1.
Hình 4.2.1 Hoạt độ enzyme ở các môi trường
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy 3 loại môi trường có ảnh hưởng đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme và hoạt độ enzyme. Enzyme protease có hoạt độ cao nhất ở
môi trường TSB + Khoáng 0,25%. Ở môi trường TSB và môi trường TSB + Casein
0,5% , hoạt độ enzyme protease thấp hơn môi trường TSB + Khoáng 0,25%. Theo
nhiều nghiên cứu, các ion Ca2+, Mg2+, K+ ... có ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme
protease. Khi bổ sung các ion khoáng vào môi trường làm tăng hoạt độ enzyme
protease. Môi trường TSB + Casein 0,5%, nguyên nhân hoạt độ enzyme không cao
có thể do nồng độ casein cao tạo áp suất thẩm thấu lớn gay ức chế sinh sinh trưởng
cua vi khuẩn dẫn đến hoạt độ enzyme thu được thấp.
Vì vậy ta chọn môi trường TSB + Khoáng (CaCl 2, MgSO4, KH2PO4 0,25% ) để
khảo sát các yếu tố tiếp theo.

4.2.2 Khảo sát nồng độ peptone bổ sung
Tiến hành cấy chung Bacillus subtilis C7 vào môi trường có bổ sung peptone
nồng độ từ 0,25% - 1,5%. Thu enzyme và xác định hoạt độ enzyme bằng phương
pháp Anson. Kết quả thể hiện qua sơ đồ hình 4.2.2.

7


Hình 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng cua nồng độ peptone đến hoạt độ
enzyme protease chung Bacillus subtilis C7
Từ nghiên cứu cho thấy, nồng độ peptone bổ sung ít có ảnh hưởng đến
hoạt độ enzyme protease cua chung Bacillus subtilis C7. Ở nồng độ 0,5% hoạt
độ enzyme đạt giá trị cao nhất 65,1 ± 1,596*10-3UI/ml, khi tăng nồng độ peptone
lên hoạt độ enzyme giảm, thấp nhất ở nồng độ 1,25% hoạt độ 57,29 ± 1,769*103

UI/ml. Vậy ta chọn nồng độ peptone 0,5% để thực hiện các nghiên cứu sau.

4.2.3.

Khảo sát nồng độ glucose bổ sung

Tiến hành cấy chung Bacillus subtilis C7 vào môi trường có bổ sung glucose
nồng độ từ 0,25% - 2%. Thu enzyme và xác định hoạt độ enzyme bằng phương
pháp Anson. Kết quả thể hiện qua sơ đồ hình 4.2.3
Hình 4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng cua nồng độ glucose đến hoạt độ
enzyme protease chung Bacillus subtilis C7
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ glucose bổ sung vảo môi trường
nuôi cấy có ảnh hưởng tới sự phát triển cua Bacillus subtilis C7 và hoạt độ
enzyme protease. Hoạt độ cua enzyme tăng khi tăng nồng độ glucose từ 0,25% 0,75%, khi tiếp tục tăng nồng độ glucose đến 1,25% thì hoạt độ enzyme giảm. Ở
nồng độ 1,5% hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất 73,937 ± 3,81*10-3UI/ml. Khi

tiếp tục tăng nồng độ glucose, hoạt độ enzyme giảm nhanh xuống thấp nhất ở
nồng độ 2% còn 43,571 ± 2,78*10-3UI/ml. Như vậy khi tăng nồng độ glucose
quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu làm giảm khả năng sinh trưởng và phát
triển cua vi khuẩn và ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme. Ở nồng độ thấp, glucose
không đu đáp ứng nhu cầu cua vi khuẩn nên hoạt tính enzyme thu được thấp
hơn. Vậy ta chọn nồng độ glucose 1,5% để thực hiện các nghiên cứu sau.
4.2.4. Khảo sát nồng độ khoáng bổ sung
Tiến hành bổ sung môi trường ba loại khoáng, nuôi cấy thu enzyme ở nhiệt
độ phòng, pH =7, thời gian 24 giờ, chế độ lắc 160 vòng/ phút. Sau thời gian nuôi

8


cấy, thu dịch môi trường và xác định hoạt độ enzyme. Kết quả được thể hiện
trong Hình 4.2.4.
Hình 4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng cua khoáng đến hoạt độ
enzyme protease chung Bacillus subtilis C7
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung khoáng vào môi trường nuôi cấy có
ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme thu được. Khi tăng CaCl2 từ 0,25 – 0,75% thì hoạt
độ enzyme thu được tắng theo đạt cao nhất 66 *10-3 UI/ml. Khi bổ sung thêm
MgSO4 thì hoạt độ enzyme không có sự khác biệt giữa mức 0,25 và 0,75%, ở mức
0,5% hoạt độ enzyme thu được thấp hơn hai nồng độ còn lại. Khi bổ sung KH2PO4
là nguồn cung cấp kali và cũng là chất đệm giúp ổn định pH môi trường nuôi cấy.
Hoạt độ enzyme thu được đạt giá trị cao nhất 76,5*10-3 UI/ml ở nồng độ 0,5%.
Từ các kết quả trên, ta chọn nồng độ CaCl2 bổ sung là 0,75%, MgSO4 là 0,25%,
KH2PO4 là 0,5% để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất và tiến hành các thí
nghiệm sau.
4.3. Khảo sát điêu kiện nuôi cấy
4.3.1. Khảo sát thời gian nuôi cấy
Ta tiến hành nuôi cấy với các điều kiện đa chọn ở trên, nuôi cấy lắc 160

vòng/phút. Tiến hành đo hoạt độ enzyme ở các mức thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72
giờ, 96 giờ. Kết quả được thể hiện qua Hình 4.3.1
Hình 4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng cua thời gian nuôi cấy tới hoạt độ
enzyme protease chung Bacillus subtilis C7
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng tới hoạt độ
enzyme protease thu được. Ở mức thời gian 24 – 48 giờ dinh dưỡng còn nhiều, vi
khuẩn sinh trưởng mạnh tang sinh khối. Khi tang thời gian nuôi cấy, dinh dưỡng
moi trường giảm dần và vi khuẩn sinh trưởng chậm và enzyme thu được hoạt độ
thấp hơn. Vì vậy ta chọn mức thời gian nuôi cấy là 48 giờ để tiến hảnh nghiên cứu
sau.

4.3.2. Khảo sát pH môi trường nuôi cấy

9


Tiến hành nuôi cấy trên môi trường đa điều chỉnh pH từ 6 – 9 theo phương
pháp nuôi cấy chìm. Dịch nuôi cấy sau 24 giờ đem xác định hoạt độ enzyme
bằng phương pháp Anson. Kết quả được thể hiện trong hình 4.3.2 :
Hình 4.3.2 1 Khảo sát ảnh hưởng cua pH nuôi cấy tới hoạt độ enzyme
protease chung Bacillus subtilis C7
Kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis C7 có pH sinh trưởng tương đối
rộng từ 6 -9 . Khi thay đổi pH hoạt độ enzyme không thay đổi nhiều. Hoạt độ
enzyme protease đạt giá trị cao nhất tại pH 7,5 , ở giá trị pH 6 – 7 hoạt độ enzyme
thay đổi không nhiều. Khi pH tăng lên , hoạt độ enzyme có xu hướng giảm dần và
đạt giá trị thấp nhất 50,33*10-3UI/ml. Vì vậy ta chọn giá trị pH = 7,5 để tiến hành
các thí nghiệm sau.
4.3.3. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy
Ta tiến hành nuôi cấy ở các điều kiện đa nghiên cứu ở trên, thời gian 24 giờ, chế
độ, ở nhiệt độ phòng. Kết quả nghiên cứu thể hiện trong Hình 4.3.3

Hình 4.3.3 Ảnh hưởng cua nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ
enzyme protease chung Bacillus subtilis C7
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis C7 sinh trưởng và phát triển
mạnh ở nhiệt độ 37oC giống như các chung Bacillus khác. Khi nhiệt độ tăng lên
50oC, hoạt độ enzyme giảm dần do nhiệt độ tang cao giảm khả năng sinh trưởng
phát triển vi khuẩn do đó làm giảm hoạt độ enzyme thu được. Hoạt độ enzyme đạt
giá trị thấp nhất ở nhiệt độ 30oC. Vì vậy ta chọn chế độ nhiệt 37 oC để nuôi cấy
chung Bacillus subtilis C7 để thu được enzyme có hoạt tính cao.
4.4. Khảo sát điêu kiện thủy phân
4.4 Khảo sát điêu kiện thủy phân protein nang mực
4.4.1 Khảo sát nhiệt độ hoạt động của enzyme protease
Sau khi nuôi cấy, ta thu dịch enzyme và tiến hành khảo sát nhiệt độ hoạt độ
hoạt động tối ưu cho en zyme protease cua chung Bacillus subtilis C7. Chọn
nhiệt độ thích hợp cho enzyme protease hoạt động tốt nhất.

10


Hình 4.3.3 Ảnh hưởng cua nhiệt độ nuôi cấy tới hoạt độ
enzyme protease chung Bacillus subtilis C7
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt động cua
enzyme. Khi tăng nhiệt độ từ 30 – 45oC, lượng Nitơ giải phóng tăng chứng tỏ độ
hoạt động cua enzyme tăng. Khi nhiệt độ tăng lên tới 50 oC, độ hoạt động cua
enzyme bắt đầu giảm.Vì vậy ta chọn chế độ nhiệt 45 oC để enzyme protease cua
chung Bacillus subtilis C7 hoạt động tốt nhất.
4.4.2. Khảo sát pH Hoạt động của enzyme protease
pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng tới sự hoạt động cua enzyme. Ta tiến
hành thu enzyme protease, đem thuy phân với cơ chất casein ở pH từ 6 - 10 và xác
định lượng acid amin bằng chuẩn độ formol. Kết quả biểu hiện qua sơ đồ hìn 4.4.2.

Hình 4.4.2 Khảo sát pH hoạt động cua enzyme protease cua chung
Bacillus subtilis C7
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, pH có ảnh hưởng đến độ hoạt động cua
enzyme protease cua Bacillus subtilis C7. Ở pH =7 lượng nitơ giải phóng nhiếu
nhất 9,47μg, chứng tỏ ở pH = 7 enzyme protease cua Bacillus subtilis C7 hoạt động
mạnh nhất. Khi tăng giá trị pH lên 8,9,10 thì hoạt độ cua enzyme giảm dần và thấp
nhất ở pH 9 và 10. Vì vậy ta chọn pH = 7 để enzyme protease cua Bacillus subtilis
C7 hoạt động tốt nhất.
4.4.3 Khảo sát tỷ lệ enzyme và thời gian thủy phân
Tiến hành khảo sát bốn tỷ lệ enzyme và bốn mức thời gian, xác định lượng
protwin còn lại trong mẫu nang mực,chọn chế độ thuy phân thích hợp. Kết quả thể
hiện qua hình 4.4.3.
Hình 4.4.3 Khảo sát thời gian và tỷ lệ enzyme để thuy phân
protein nang mực bằng enzyme protease từ Bacillus subtilis C7

11


Hình 4.4.4 Hiệu suất khử protein nang mực bằng enzyme protease
chung Bacillus subtilis C7
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy khi tăng thời gian khử protein nang mực thì
lượng protein còn lại giảm dần theo các mức thời gian và hiệu suất khử protein
tăng. Tuy nhiên ở các mức từ 24 – 42 giờ thì lượng giảm không đáng kể.
Khi tang tỷ lệ enzyme, khả năng khử protein tăng theo và hiệu suất tăng theo. Ở
mức thời gian 24 giờ, khả năng khử protein đạt cao nhất ở mức 40/1 nhưng
không có khác biệt nhiều so với mức 30/1. Khi kéo dài thời gian thuy phân thì
lượng protein giảm không đáng kể vì vậy ta chọn thời gian thuy phân 24 giờ và
tỷ lệ enzyme/ nang mực là 30/1 để khư protein nang mực.

12

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Sau thời gian nghiên cứu để tài bước đầu đạt được những kết quả sau:
-

Xác định điều kiện nuôi thu enzyme protease từ Bacillus subtilis C7

+

Nồng độ peptone bổ sung nồng độ 0,5%

+

Nồng độ glucose bổ sung nồng độ 1,5%

+

Khoáng bổ sung là CaCl2 0,75%, MgSO4 0,25%, KH2PO4 0,5%

+

Thời gian nuôi cấy là 48 giờ

+

pH nuôi cấy là 7,5

Nhiệt độ nuôi cấy là 37oC

- Xác định điều kiện hoạt động cua enzyme protease từ Bacillus subtilis C7
+ Nhiệt độ thuy phân là 45oC
+ Độ pH thuy phân là 7
+ Tỷ lệ khử enzyme/nang mực là 30/1 và thời gian thuy phân là 24h
5.2.
Kiến nghi
+

-

Tăng thời gian khảo sát nuôi cấy lên 48 giờ

-

Tinh sạch chế phẩm enzyme protease

-

Kết hợp phương pháp sinh học và hóa học trong khử protein nang mực

-

Tiến hành sản xuất chitin từ nang mực bằng phương pháp sinh học.

13