HƯỚNG DẪN PHA CHẾ VÀ KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

HƯỚNG DẪN PHA CHẾ VÀ KIỂM SOÁT
CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
VI SINH VẬT

ISO/ST 11133 -1&2: Microbiology of food and
animal feeding stuffs – Guidelines on preparation
and production of culture madia


NỘI DUNG



Hướng dẫn pha chế và đảm bảo chất lượng
của môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Hướng dẫn thử nghiệm môi trường nuôi cấy
vi sinhvật

Part 1: General guidelines on quanlity assurance for preparartion of culture
madia in the laboratory
Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture madia


Hướng dẫn pha chế và đảm bảo chất
lượng môi trường nuôi cấy vi sinh
vật dùng cho phòng thí nghiệm


Các thuật ngữ


Lô môi trường: là đơn vị đồng nhất, có thể
truy nguyên đầy đủ số lượng từ nguyên liệu,
bán thành phẩm, thành phẩm mà sản phẩm
này được sản xuất trong điều kiện được
kiểm soát và đạt chất lượng


Thuật ngữ


Môi trường sẵn sàng sử dụng (ready to use)
–
–
–

Môi trường hoàn chỉnh sẵn sàng sử dụng
Môi trường hoàn chỉnh phải đun tan, đổ đĩa hay
phân phối vào đơn vị sử dụng
Đun tan, bổ sung các một vài thành phần khác


Thuật ngữ


Môi trường bột khô tổng hợp dạng
–
–



Đã tổng hợp hòan chỉnh: vd. PCA, XLD …
Chưa hoàn chỉnh:vd: Baird Parker agar, Fraser
broth …

Môi trường tổng hợp từ các thành phần theo
công thức


Kiểm soát chất lượng môi trường


Hồ sơ lưu trữ tại PTN
–

Hồ sơ từ nhà sản xuất








Tên và mã số, công thức thành phần và chất bổ sung
của nhà sản xuất
Số lô (batch No)
pH khi pha chế hoàn chỉnh
Điều kiện lưu trữ, hạn dùng
Chứng nhận chất lượng, chủng VSV kiểm soát
Kết quả kiểm tra của nhà sản xuất

Cảnh báo an toàn (nếu có)


Hồ sơ lưu trữ


Các thông tin cần kiểm soát khi nhận sản
phẩm
–
–
–
–

Mã số sản phẩm
Tính nguyên vện của bao gói
Ngày hết hạn của sản phẩm
Các hồ sơ kèm theo


Lưu trữ


Khi sử dụng môi trường thương mại phải
tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất
về
–
–
–

Điều kiện lưu trữ

Ngày hết hạn sử dụng
Hướng dẫn sử dụng


Môi trường tổng hợp dạng bột khô



Tuân thủ nguyên tắc “vào trước ra trước” (first in first out)
Kiểm tra trước khi mở hộp
–
–
–



Niêm phong
Ghi ngày mở đầu tiên lên chai
Đánh giá tình trạng môi trường bên trong

Sự biến đổi chất lượng sau khi mở hộp
–
–

Thay đổi do điều kiện lưu trữ
Biểu hiện thay đổi: kết cấu vật lý, màu sắc …


Bảo quản môi trường sau pha chế


Bảo quản tránh sự biến đổi chất lượng
–
–




Tránh ánh sáng
Bảo quản trong tủ mát 2-8oC

Môi trường có chất không bền: sử dung
trong ngày
Đánh giá thời hạn bảo quản thông qua việc
kiểm soát chất lượng


Pha chế môi trường tại PTN





Pha chế môi trường đúng là bước đầu quan trọng
trong việc cho kết quả phân tích chính xác
Tuân thủ theo hướng dẫn đảm bảo chất lượng của
PTN và của nhà sản xuất
Lưu hồ sơ tất cả các dữ liệu liên quan:khối
lượng/thể tích, pH, ngày, điều kiện thanh trùng
Môi trường pha chế từ các thành phần riêng lẻ: thực

hiện chính xác theo công thức, lưu HS tất cả các dữ
liệu liên quan, đánh số xác nhận


Pha chế tại PTN


Nước



Độ dẫn điện: ≤25µS/cm (≥0,4MΩcm)
Mật độ VSV: không quá 103CFU/ml, tốt hơn <102CFU/ml
Mật độ VSV được đếm ở 22oC/3 ngày



Cân




Chính xác
Tránh hít bụi
Tránh bị vón cục khi cho nước vào


Pha chế tại PTN


Hòa tan
Hòa tan càn nhanh càn tốt
– Môi trường agar: ngâm trước khi đun tan
–



Đo và chỉnh pH
Chỉnh pH trước khi thanh trùng
– Đo kiểm tra sau khi thanh trùng và hòan chỉnh môi trường
– Đo pH sau khi làm nguội đến 25oC
– Chỉnh pH bằng NaOH 1N (40g/lít); hoặc HCl 1N (36,5g/l)
–



Phân phối
–

Không chứa quá 80% thể bình chứa


Khử trùng môi trường


Hấp khử trùng
–
–
–

Hấp ở 121oC/15 phút
Nếu thể tích chứa càng lớn, khả năng quá nhiệt
càng cao
Hạ nhiệt độ ngay khi đủ thời gian khử trùng



Thể tích bình chứa > 1lít
Chứa các thành phần nhạy nhiệt


Các thành phần nạhy nhiệt


Không được hấp các môi trường có thành
phần nhạy nhiệt
–
–
–



Brilliant green
Muối mật
Muối sắt

Vd: XLD agar, TCBS agar, VRB/VRBD agar


Khử trùng môi trường



Lọc khử trùng



Dùng để khử trùng các chất/môi trường nhạy nhiệt
Thiết bị lọc có lỗ ≤ 0,2µm


Kiểm tra sau khi hoàn chỉnh


Môi trường sau khi pha chế hòan chỉnh phải
kiểm tra
–
–
–
–

pH
Màu
Độ vô trùng
Biểu hiện vật lý bên ngoài


Chuẩn bị chất bổ sung




Chất bổ sung thường là các chất có độc tính
cao
Còn họat tính khi trong hạn sử dụng
Không tái đông lạnh nhiều lần


Đun chảy môi trường






Đun chảy môi trường agar bằng cách đun
cách thủy
Ngừng đun ngay khi môi trường đã tan chảy
Làm nguội ngay trong bể điều nhiệt 45-50oC
Những môi trường đổ trực tiếp vào mẫu phải
được giữ ở 44-47oC
Không nên giữ môi trường quá 4h sau khi
tan chảy


Khử không khí trong môi trường



Đun cách thủy trong nước sôi khoảng 15
phút, nới lỏng nắp ống

Vặn chặt nắp và làm lạnh nhanh đến nhiệt độ
sử dụng


Thêm chất bổ sung




Chỉ thêm chất bổ sung khi môi trường nguội
đến 45-50oC
Chất bổ sung phải duy trì ở nhiệt độ phòng
trước khi cho vào môi trường
Thao tác nhanh để tránh MT agar vón cục


Chuẩn bị và bảo quản môi trường trên
đĩa Petri




Độ dày môi trường: ít nhất 3mm
Phải đổ dày hơn nếu đĩa được nuôi ủ ≥ 48h hay ≥
40oC
Dán nhãn và ghi tên MT, ngày pha chế/hết hạn
–

Trong quá trình ủ có thể làm thay đổi độ ẩm môi trường 
thành phần môi trường thay đổi, ảnh hưởng đến sự phát

triển của VSV. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ẩm môi
trường như: loại tủ ấm, độ ẩm không khí, áp suất trong tủ,
số lượng đĩa ủ …


Bảo quản đĩa môi trường





Bảo quản trong tủ mát 2-8oC
Tránh ánh sáng
Bảo quản trong các túi nylon sẽ lâu hơn
Không làm khô mặt đĩa trước khi bảo quản
trong tủ lạnh


Thời hạn bảo quản môi trường sau
pha chế



Tùy thuộc loại môi trường,thành phần các
họat chất trong môi trường
Thời hạn sử dung của từng môi trường phải
được đánh giá bằng các chủng VSV