Nghiên cứu biến động di truyền của một số dòng lúa trong quần thể f3 của cặp lai giữa CR203 và bắc thơm số 7

Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Lúa gạo là nguồn lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế
giới. Ở nước ta lúa gạo không chỉ là nguồn lương thực tiêu dùng trong
nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, có ý nghĩa kinh tế và xã
hội cao. Vì vậy, cây lúa luôn là đối tượng được tập trung nghiên cứu và cải
tạo để không ngừng tăng năng suất và chất lượng hạt.
Hiện nay, các nhà chọn giống lúa đang cố gắng tập trung cải thiện
chất lượng gạo, và chọn lúa chất lượng là một trong những mục đích quan
trọng của chương trình phát triển giống lúa ở Việt Nam cũng như trên thế
giới.
Chất lượng gạo ảnh hưởng rất lớn đến giá trị thương mại của hạt lúa,
đây cũng là một đặc điểm rất phức tạp, được xác định bởi bốn thành phần:
chất lượng xay xát (milling quanlity), dáng vẻ bề ngoài (appearance
quanlity), chất lượng nấu và ăn (nutrition quanlity). Trong đó chất lượng
nấu, chất lượng ăn, và vẻ bề ngoài của hạt tạo thành yếu tố kinh tế quan
trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất lúa của nhiều vùng trên thế giới. Vẻ bề
ngoài của hạt chủ yếu được xác định bởi các tính trạng như độ dài, độ rộng,
tỉ lệ dài/rộng và độ đục của nội nhũ. Tuy nhiên, sở thích về hình dạng hạt
thay đổi trong các nhóm khách hàng khác nhau, ví dụ: Giống có hạt thon
dài được ưa thích ở Mỹ, Tây Âu và hầu hết các nước Asian bao gồm Trung
Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan; ngược lại người Nhật Bản, Hàn Quốc
thích hạt ngắn và tròn. Vì vậy, chọn giống có hình thái hạt cho những mục
đích đặc biệt, cần được lưu ý trong những hoàn cảnh của thị trường. Thêm

vào đó độ rộng và độ dài hạt có ảnh hưởng rất lớn đến những tính trạng
chất lượng quan trọng khác của lúa như độ đục của hạt, hiệu quả xay xát,
chất lượng nấu và ăn. Đồng thời độ rộng và hình dạng hạt cũng đóng vai
trò quan trọng trong xác định năng suất hạt.
Với sự phát triển của sinh học phân tử, việc chọn tạo giống có thể
tiến hành nhanh chóng và chuẩn xác nhờ áp dụng các chỉ thị phân tử. Nhiều
gen quý ở cây lúa được phát hiện bởi các chỉ thị phân tử, có hơn 49 vị trí
các chỉ thị phân tử đã được biết có liên kết chặt chẽ với các gen kháng đạo
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

1

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

ôn, gen kháng bệnh bạc lá, gen quy định tính bất dục nhạy cảm quang chu
kỳ [8]. Muốn xác định các chỉ thị phân tử cho chọn tạo giống, cần xác định
được sự liên kết của chỉ thị phân tử với các tính trạng hình thái. Để làm
việc này, việc nghiên cứu sự biến động của các chỉ thị phân tử trong một
quần thể phân ly đặc biệt là rất cần thiết, với những tính trạng số lượng có
hệ số di truyền thấp và rất khó xác định trên đồng ruộng theo phương pháp
chọn lọc truyền thống như tính trạng hình thái hạt. Vì vậy, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu biến động di truyền của một số dòng
lúa trong quần thể F3 của cặp lai giữa CR203 và Bắc thơm số 7”, góp phần

vào phát triển các chỉ thị phân tử liên kết có thể ứng dụng trong chọn tạo
giống lúa chất lượng cao.
1.2 Mục tiêu, ý nghĩa, yêu cầu của đề tài nghiên cứu.
1.2.1 Mục tiêu.
Nghiên cứu biến động di truyền của một số dòng lúa của quần thể F 3
bằng chỉ thị phân tử SSR, làm cơ sở cho việc xác định chỉ thị SSR liên kết
với một số tính trạng hình thái hạt của lúa (dài hạt, rộng hạt, …).
1.2.2 Ý nghĩa.
1.2.2.1 Ý nghĩa khoa học.
Góp phần nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống
lúa.
1.2.2.2 Ý nghĩa thực tiễn
Giúp cho sinh viên củng cố lý thuyết, bổ sung một số kiến thức thực
tế, tiếp xúc được vấn đề nghiên cứu để phục vụ cho công tác sau này.
Góp phần tạo cơ sở cho việc tạo giống lúa chất lượng cao, rút ngắn
thời gian và nâng cao hiệu quả chọn lọc.
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Sử dụng một số dòng lúa trong quần thể F3 của cặp lai giữa CR203
và Bắc thơm số 7.
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ gen của một số dòng
lúa .

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

2

B¸o c¸o tèt nghiÖp

Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

Địa điểm: Nghiên cứu tại Phòng Di truyền Tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu: Từ 29/03/2010 đến 04/06/2010.
1.4 Xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng.

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

3

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cây lúa
Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae, trước đây là họ Gramineae)

thân bụi, lá mềm. Lúa trồng thuộc chi Oryza với nhiều loài khác nhau. Hai
loài được quan tâm nhiền hơn cả là Oryza sativa L và Oryza glaberrima L
có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khu vực đông nam Châu Á
và Châu Phi. Hai loài này cung cấp hơn 1/5 toàn bộ lượng lương thực tiêu
thụ bởi con người.
Lúa là cây lương thực ngắn ngày, có thể cao đến 1 – 1,8 m, đôi khi
cao hơn, với các lá mỏng hẹp bản (2 - 2,5 m) và dài 50 - 100 cm. Lúa tiến
hóa theo hướng thích nghi cao với thụ phấn nhờ gió, vì thế hoa nhỏ, xấu xí,
bao hoa tiêu giảm, cách đính của chỉ nhị làm cho bao phấn dễ dàng lắc lư
trước gió tạo điều kiện thuận lợi cho sự tung phấn, đầu nhuỵ có chùm lông
rất phát triển để dễ dàng bắt phấn. Hạt là quả thóc (hạt nhỏ, cứng của các
loại ngũ cốc) dài 5 - 12 mm và dày 2 - 3 mm.

Hình 1: Các bộ phận của cây lúa (Oryza Sativa).
Loài Oryza sativa L. có ba loài phụ là Indica, Japonica, Javanica.
Trong đó Indica là loài lúa được trồng ở các vùng nhiệt đới, Japonica được
trồng ở những vùng ôn đới, còn loại hình trung gian Javanica là Japonica
nhiệt đới. Loài Oryza sativa L có số nhiễm sắc thể đơn bội n = 12. Tám
trong 23 loài lúa có bộ gen tứ bội, đại đa số các loài lúa dại lúa trồng hiện
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

4

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

nay có bộ gen lưỡng bội (2n). Hiện nay 83.000 mẫu lúa được lưu trữ ở
Ngân hàng gen quốc tế tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI), ngân hàng
gen quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam…Trong
đó có khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu hạn, úng, nóng,
lạnh, sâu bệnh.
Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L.) còn được gọi là lúa Châu Á vì
nó được thuần hóa từ lúa dại từ ba trung tâm đầu tiên ở Châu Á. Theo đặc
điểm lúa trồng Việt Nam thì chủ yếu là các giống Indica (Bùi Huy Đáp,
1999).
2.2 Cơ sở khoa học
Công nghệ sinh học được coi là phương tiện duy nhất để giải quyết
các vấn đề khó khăn mà công tác chọn tạo giống cổ truyền không thể thực
hiện được. Công nghệ sinh học góp phần tăng năng suất và nâng cao chất
lượng cây trồng [2].
Trong công tác chọn giống cây trồng, các tính trạng được khảo
nghiệm là những tính trạng liên quan đến năng suất, phẩm chất của sản
phẩm và chủ yếu liên quan đến việc tăng cường tính chống chịu đối với sâu
bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Những đặc điểm mong muốn về hình
thái luôn luôn bị ảnh huởng của điều kiện môi trường hoặc không biểu hiện
khi điều kiện ngoại cảnh không phù hợp. Vì vậy, việc chọn lọc theo kinh
nghiệm sẽ kém hiệu quả và tốn thời gian. Chúng ta không thể trực tiếp
chọn lọc các gen quan tâm mà phải chọn lọc gián tiếp thông qua các chỉ thị
liên kết với gen đó [2].
Các đặc điểm có thể là đặc điểm về hình thái liên kết chặt chẽ với
các gen quan tâm (chỉ thị hình thái). Tuy nhiên, chỉ thị này rất hạn chế do
đặc điểm về hình thái là rất ít. Chỉ thị cũng có thể là một đặc điểm thể hiện
khía cạnh hóa học (chỉ thị izozym), hay cấu trúc phân tử được truyền cho
thế hệ sau, giống như các nhân tố di truyền của Mendel, nhưng lại có thể

định lượng được (chỉ thị phân tử ADN).
Một chỉ thị di truyền cần phải có hai yêu cầu cơ bản: có sự khác biệt
giữa cơ thể bố và cơ thể mẹ và nó cũng phải di truyền chính xác cho thế hệ
sau. Khác với hai loại chỉ thị hình thái và chỉ thị izozym, các loại chỉ thị
ADN rất phong phú do tính đa dạng của ADN, tính ổn định và không lệ
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

5

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

thuộc vào các yếu tố môi trường. Cùng với sự tiến bộ của công nghệ sinh
học hiện đại đã phát hiện ra các chỉ thị về ADN đã trở thành cộng cụ đắc
lực giúp các nhà di truyền chọn giống nghiên cứu một cách có hiệu quả về
biến đổi di truyền trong quần thể tự nhiên, xác định mối quan hệ giữa các
cá thể trong cùng một loài, và là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát
hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài [6] và những nghiên cứu
chi tiết hơn phát hiện những thay đổi trong genom mà các kỹ thuật izozym
không giải quyết được [4], [12]. Các chỉ thị phân tử ADN hay kỹ thuật dấu
chuẩn phân tử (Molecular Marker) bao gồm:
- Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai ADN hay chỉ thị RFLP
- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR như AFLP,
RAPD, STS, SSR….

2.2.1 Chỉ thị ADN.
Chỉ thị ADN (chỉ thị phân tử) có thể là các gen hoặc một đoạn trình
tự nucleotide đặc hiệu trong hệ gen của sinh vật (bao gồm ADN nhân,
ADN tế bào chất). Có thể hiểu đơn giản chúng như những “cột mốc” trong
hệ gen. Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng
phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống, loài trong một quần thể,
sinh vật có khả năng nhân bản ADN của chúng với độ chính xác cao nhưng
có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm thay đổi cấu trúc ADN, đơn giản như sự
thay đổi bắt cặp hoặc phức tạp hơn như sự đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc
mất đoạn… Nhờ vậy, có sự biến động rất lớn về ADN trong một quần thể
sinh vật. Chỉ thị phân tử được xem là công cụ rất hiệu quả để đánh giá đa
dạng sinh học phục vụ công tác chọn giống cây trồng [7].
Nhờ chỉ thị phân tử cho phép xác định được các đặc điểm trực tiếp
của kiểu gen thông qua việc xác định trình tự nhất định của gen hoặc của
trình tự liên kết chặt với các gen mang tính trạng mong muốn. Bằng việc sử
dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen trên, con người đã đi thẳng
vào bản chất di truyền của các tình trạng, khắc phục ảnh hưởng của các yếu
tố môi trường, qua các thế hệ ngay cả khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình.
Vì vậy, chỉ thị phân tử được coi là chỉ thị phản ảnh chân thật bản chất di
truyền [7].
2.2.2 Các kỹ thuật chỉ thị ADN
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

6

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

2.2.2.1 Đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP)
Cơ sở kỹ thuật này là sử dụng các loại enzyme giới hạn (RE) cắt
phân tử ADN tại những địa điểm đặc hiệu chứa một trật tự đặc thù trong
ADN. Vì vậy, một đoạn lớn ADN sau khi được xử lý bởi enyme giới hạn sẽ
thu được nhiều đoạn có kích thước khác nhau, số lượng và kích thước của
chúng sẽ phản ánh sự phân bố của những vị trí cắt trong phân tử ADN, sự
hiện diện của các đoạn cắt này mang tính đặc trưng cho từng tổ hợp
ADN /enzyme từ đó sử dụng những mảnh cắt này như các “dấu vân tay”
đặc trưng đối với từng phân tử ADN hoặc đối với các cá thể chứa phân tử
ADN đó. Những phân đoạn như vậy có thể được phát hiện ra bằng cách
chạy điện di trên gel agarose [5], [9].
RFLP được ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, sự phân
hóa di truyền huyết thống, lập bản đồ liên kết gen. Tuy nhiên, phương pháp
này cũng có nhược điểm là cần một lượng ADN lớn, quá trình phức tạp
công trình, khó tự động hóa, tốn kém và phải sử dụng chất đồng vì phóng
xạ nguy hiểm cho con người [3], [5], [11].
2.2.2.2 Đa dạng về chiều dài các đoạn ADN được nhân bản chọn lọc
(AFLP)
Zabeau và Vos (1993), Vos và cộng sự (1995) đã đưa ra và mô tả
một kỹ thuật mới về in dấu vân ADN. Đó là kỹ thuật khuếch đại chọn lọc
các đoạn ADN đa hình (AFLP – Technology). Đây là kỹ thuật phối hợp
của RFLP và PCR. Nguyên tắc của kỹ thuật này là dùng enzyme giới hạn
để cắt ADN genome thành các phân đoạn kích thước khác nhau, trong số
đó sẽ có một phân đoạn mang các điểm mút giống nhau và khi sử dụng một
đoạn nối adaptor như nhau có thể gắn thêm một hoặc một số oligonucleotid
được trọn trước định hướng cho việc gắn các cặp mồi PCR. Tất cả những

đoạn ADN có đầu mút giống nhau sẽ được nhân bản, khi thay đổi số lượng
và trật tự các oligonucleotide ở các đầu mối, ta có thể nhận được những
đoạn ADN được nhân bản khác nhau, sản phẩm PCR được điện di trên gel
polyacrylamide và sự đa hình được xác định bởi sự khác nhau của các đoạn
cắt được nhân [10], [11], [15].
Kỹ thuật này phức tạp hơn RFLP nhưng hiện nay là một kỹ thuật có
sức mạnh lớn và đầy tiềm năng về in dấu vân ADN. Nó tạo ra một cách
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

7

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

nhanh chóng nhất, hiệu quả nhất một bản đồ di truyền dày đặc các chỉ thị
phân tử nhằm chọn lọc các tính trạng mong muốn thông qua chọn giống
nhờ các chỉ thị phân tử đồng thời là một công cụ lí tưởng đối với việc xác
định và đánh giá cây trồng ở mức độ phân tử ADN; có hiệu quả trong việc
xác định tính đa hình ở cây trồng [3], [11]. Các nhân tố AFLP là những chỉ
thị phân tử, nhanh chóng được áp dụng vào việc nghiên cứu biến động di
truyền, lập bản đồ gene, dán nhãn gene quan trọng ở nhiều loài thực vật
khác nhau như: khoai tây, lúa mạch. Đối với lúa chỉ thị AFLP ứng dụng
trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo lúa đã đem được một số kết
quả. Trên cơ sở dữ liệu nhận được về độ đa hình các chỉ thị AFLP của một

số giông lúa nương, kết quả bước đầu cho thấy 12 giống lúa nương được
nghiên cứu có sự khác nhau lớn ở mức độ phân tử, đó là những nguyên liệu
rất tốt cho nghiên cứu di truyền và chọn giống ở lúa. Trong việc lập bản đồ
và định vị gen ở lúa nhờ chỉ thị AFLP đã thu được kết quả như ứng dụng
đa dạng chỉ thị phân tử AFLP để lập bản đồ di truyền ở lúa (Mackell và cs,
1996). Bằng phương pháp phân tích AFLP đã xác định vị trí gen kháng đạo
ôn P1-44 (t) ở cuối nhiễm sắc thể 11.
2.2.2.3 ADN đa hình được nhân ngẫu nhiên (RAPD)
Kĩ thuật nhân ngẫu nhiên sự đa hình của ADN là bước phát triển mới
dựa trên kĩ thuật PCR đã được phát hiện bởi William và cs (1990). Nguyên
tắc kĩ thuật này là sử dụng những mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trật
tự được tổng hợp ngẫu nhiên. Do độ dài của mồi tương đối ngắn nên khả
năng tìm và bắt cặp của chúng trên ADN khuôn là không mấy khó khăn.
Trong phản ứng này mồi đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn
đối diện. Nếu khoảng cách của mỗi nằm trong khoảng cách có thể nhân bản
được (thường 200-2000 nucleotide) thì đoạn ADN sẽ được nhân lên, kết
quả sản phẩm của RAPD là hàng ngàn đoạn ADN khác nhau về độ dài,
trình tự và sự có mặt của sản phẩm này chứng tỏ có sự tương đồng hoàn
toàn hay một phần giữa ADN genome với các nguồn oligonucleotide. Để
kiểm tra sự đa hình thì sản phẩm sẽ điện di trên gel agarose [8], [11].
Kĩ thuật này được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng sinh
học và có khả năng phân tích mối quan hệ di truyền giữa các loài và các
nhóm loài, các cá thể trong cùng một loài [14] Ví dụ: Mackill (1995) cũng
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

8

B¸o c¸o tèt nghiÖp

Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

bằng kỹ thuật này đã xác định sự đa dạng di truyền của 143 giống lúa có
nguồn gốc khác nhau và chỉ ra rằng sự biến dị di truyền của các nhân tố
RAPD là rất quan trọng bổ sung thêm cho việc lập bản đồ gene và in dấu
vân ADN.
Kĩ thuật RAPD còn được ứng dụng trong chọn giống. Việc xác định
các chỉ thị RAPD đặc trưng, làm cơ sở cho chọn giống gián tiếp. Căn cứ
vào sản phẩm điện di RAPD người ta có thể thiết lập bảng thống kê sự có
mặt các phân đoạn ADN được nhân (số 1: có mặt đoạn ADN; số 0: Đoạn
ADN không được nhân). Trên cơ sở đó xác định được hệ số đồng dạng di
truyền giữa các đối tượng nghiên cứu, lập sơ đồ phả hệ. Từ kết quả đó sẽ
xác định được sự sai khác về bộ gene của các đối tượng nghiên cứu.
2.2.2.4 Điểm trật tự được đánh dấu (STS)
STS là một kiểu chỉ thị của di truyền hiện đang được sử dụng rất phổ
biến trong việc lập bản đồ genom là điểm trật tự được đánh dấu (Sequence
Tagget Site = STS), còn là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60-1000 bp
và có thể phát hiện bằng kĩ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí
được dánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide biết trước của
ADN chỉ thị. STS được tạo ra đầu tiên bởi Olsen và cs. STS dựa vào những
locus đã biết (gene, cADN, hoặc gene tách dòng) và nhân trực tiếp bởi mồi
PCR được thiết kế từ trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này
[Olsen và cs, 1989]. STS không đòi hỏi sự phân lập nhưng đòi hỏi trình tự.
Các đoạn mỗi STS thường lớn khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu
cao với PCR được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một chỉ thị
chuẩn trong hệ gen.

Ứng dụng của STS là dựa trên kết quả phân tích về chỉ thị STS,
RAPD người ta có thể xây dựng được bản đồ di truyền liên kết ở một giống
cây trồng nào đó. Nhờ vậy, việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan
chặt chẽ đến tính trạng di truyền nào đó có thể tiến hành một cách dễ dàng
[3].
Không được ứng dụng rộng như chỉ thị SSR nhưng cũng có nhiều
kết quả về việc ứng dụng chỉ thị STS cho chọn giống cây trồng. Đã có công
bố về chọn giống chịu bệnh sử dụng chỉ thị STS liên kết với gen quy định

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

9

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

màu sắc bột bột mỳ [Langridge và cs, 2004]; gen kháng bệnh bạc lá ở lúa
[Ramalingam và cs, 2004].
2.2.2.5 Sự lặp lại trình tự ADN đơn giản (SSR)
Các chuỗi lặp lại đơn giản (SSR) hay còn gọi là tiểu vệ tinh
(Microsatellite), là những đoạn ADN ngắn gồm một số nucleotide lặp lại
liên tiếp, mỗi đơn vị có chiều dài từ 4 đến 6 cặp bazơ số lượng đơn vị lặp
lại thay đổi từ 1 đến 40 đơn vị. Những đoạn SSR phân bố ở đầu và cuối
tâm động NST có tác dụng bảo vệ và liên quan đến sự di truyền của NST.

SSR được nghiên cứu lần đầu tiên ở người, ở đây họ đã tìm ra các SSR tồn
tại và phân bố trong genome và sau này còn được tìm thấy rất nhiều trong
cơ thể sinh vật nhân thực khác. Tuy nhiên, tùy vào từng loại mà số lượng
nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và
số đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục ngàn lần [6].
Kĩ thuật SSR dựa trên nguyên lý PCR dùng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các đoạn trình tự SSR. Sự khác nhau trong các cấu trúc đơn vị lặp lại
dẫn đến sự thay đổi độ dài đoạn lặp lại nhân lên và được xác định khi chạy
điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide.
Cho đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về các chỉ thị SSR cho hàng
loạt các đặc điểm về năng suất, chất lượng như các công bố về chỉ thị SSR
liên kết với gen Waxy ở lúa [Ramalingam và cs, 2004], hoặc để đánh giá
sự khác biệt di truyền ở lúa [Dongling và cs, 2009]. Vì vậy, mà hiện nay kĩ
thuật này đang được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực di truyền phân tử như
đánh dấu gen, xác định giống, chuẩn đoán bệnh di truyền. Sở dĩ kĩ thuật
SSR được ứng dụng rộng rãi vì nó không dùng đồng vị phóng xạ, chỉ cần
một lượng ADN nhỏ, thời gian quay vòng nhanh và phát hiện ADN chính
xác. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có mặt hạn chế là tốn kém về tiền
của và công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa
hình.
Việc phát hiện và ứng dụng kỹ thuật phân tích SSR đã được dùng để
nghiên cứu trên nhiều đối tượng động vật, thực vật khác nhau. Một số bản
đồ di truyền đã được sử dụng thành công ở lúa như: phân nhóm di truyền
lúa địa phương, xây dựng bản đồ gen rầy nâu, xây dựng bản đồ gen kháng
mặn trên lúa (Nguyễn Thị Lang, 2002).
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

10

B¸o c¸o tèt nghiÖp

Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

2.2.3 Kĩ thuật PCR
Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polymerase (polymerase
Chair Reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên được Mullis và
cộng sự mô tả năm 1986 và cũng chính do sự phát minh này Mullis đã
xứng đáng nhận giải thưởng Nobel về y học và sinh học năm 1993. Phản
ứng chuỗi polymerase (PCR) được xem là một trong số các phát minh có
tính đột phá lớn nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học
hiện đại. Cho đến nay kĩ thuật này đã được sử dụng phổ biến nhất trong các
nghiên cứu sinh học phân tử.
Kỹ thuật PCR cho phép tạo ra một lượng lớn những đoạn ADN có
trình tự đặc hiệu trong một thời gian ngắn. Kỹ thuật này không đòi hỏi độ
tinh sạch của ADN cao. Các thành phần phản ứng của PCR bao gồm: ADN
khuôn, mồi, dNTP, MgCl2, đệm PCR và enzyme ADN polymerase. Các
thành phần này được trộn theo tỷ lệ nhất định. Để ADN được nhân lên
nhiều lần ta phải tiến hành chu trình biến tính- bắt cặp mồi- tổng hợp chuỗi
ADN. Ở nhiệt độ cao các enzyme ADN polymerase tách từ E. coli không
bền với nhiệt. Nên thường bị mất hoạt tính do đó phản ứng tổng hợp ADN
chỉ sảy ra một chu kỳ là chấm dứt. Sau khi tách được enzyme ADN
polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Taq) sống ở suối nước nóng
900C - 1000C. Taq được sử dụng rộng dãi nhất vì nó có ưu điểm là chịu
nhiệt tốt. Ngoài Taq ADN polymerase, người ta còn sử dụng một số
enzyme chịu nhiệt khác như Pfu, Tth, Vent, Amplitap…

Việc sử dụng enzyme ADN polymerase chịu nhiệt đã làm cho phản
ứng tổng hợp ADN có thể diễn ra từ chu kỳ này đến chu kỳ khác, trong đó
ADN được nhân theo cấp số nhân theo công thức N=2 n-1 (N là tổng số
ADN được tổng hợp (mới) sau n chu kỳ). Các mồi dùng trong phẩn ứng
PCR có độ dài khoảng 20-30 bazơ nitơ.
+ Diễn biến phản ứng
Biến tính ban đầu ở nhiệt độ 93 0 C- 980C, thời gian từ 1 phút đến 3
phút, ADN khuôn (sợi đôi) được biến tính. Khi đó các liên kết hydro giữa 2
mạch đơn sẽ bị phá vỡ và mạch đơn tách nhau ra. Nếu tỷ lệ G +C >A + T
hoặc khuôn ADN khá dài thì nhiệt độ biến tính càng cao hoặc thời gian
biến tính càng phải lâu.
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

11

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

+ Phản ứng tiếp diễn theo chu kỳ, thường là 20- 40 chu kỳ
Mỗi chu kỳ gồm có ba bước: Bước 1 biến tính ở nhiệt độ độ 93 0C
-980C, thời gian 30’’ đến 1’. Bước 2 gắn mồi ở nhiệt độ 370C - 650C, thời
gian từ 30’’ đến 3’. Đoạn mồi gắn vào khuôn ADN theo nguyên tắc bổ trợ
giữa các bazơ nitơ. Bước 3 tổng hợp ở nhệt độ 70 0C - 750C, thời gian từ 1’
đến 5’, enzyme Taq ADN polymerase hoạt động và sự tổng hợp ADN diễn

ra trên những đoạn có mồi gắn vào. Ở nhiệt độ này Taq polymerase hoạt
động chính xác với tốc độ cao. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào
độ dài của ADN cần tổng hợp.
+ Tổng hợp nốt ở nhiệt độ 700C - 750C, thời gian từ 5’ đến 10’. Các đoạn
ADN ở chu kỳ trước nếu chưa được tổng hợp song sẽ được tổng hợp tiếp.
+ Chấm dứt phản ứng và cất giữ ở nhiệt độ lạnh.
Hiện nay, đã có nhiều phiên bản của PCR như RT-PCR, RAPD,
AFLP…PCR và các kĩ thuật cải tiến từ PCR có nhiều ứng dụng trong thực
tiễn như sản xuất mẫu dò, khuếch đại số lượng các đoạn ADN và ARN,
nhận dạng sinh vật, tạo dòng gen,….
Tuy nhiên, kĩ thuật PCR cũng có hạn chế đó là phải có trình tự ADN
nhất định mà từ đó người thiết kế và tổng hợp các đoạn mồi (đoạn khởi đầu
cho tổng hợp ADN). Tuy vậy, sau này các nhà sinh học phân tử đã cải tiến
kĩ thuật này mà không cần phải biết trước trình tự chuỗi ADN.
2.2.4 Một số chỉ thị liên quan đến chất lượng gạo
Các tiêu chí về chất lượng gạo tùy theo thị yếu của từng vùng, tuy
nhiên thông thường là dựa trên các đặc tính lý, hóa quyết định các tính chất
chất lượng của gạo như: độ mềm dẻo của cơm (một đặc tính quan trọng
được quyết định bởi hàm lượng Amylose và Amylopectin, độ bền gel và
nhiệ độ hóa hồ), mùi thơm, kích thước và hình dáng hạt. Trong những năm
gần đây, việc nghiên cứu các chỉ thị phân tử cho chọn tạo và đánh giá các
tính trạng chất lượng gạo đã được các nhà nghiên cứu rất quan tâm.
Các tính trạng như hàm lượng Amylose, độ bền gel, nhiệt độ hóa hồ,
và mùi thơm là những tính trạng quan trọng. Hiện nay đã xác định được
một số gen và chỉ thị phân tử liên kết với các gen mã hóa cho các tính trạng
trên như các gen wx tham gia tổng hợp Amylose, chỉ thị RG28 liên kết với
gen thơm frg và chỉ thị SSR RM223 liên quan đến tính trạng thơm; nghiên
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

12

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

cứu về sự liên kết của chỉ thị RG28 và chỉ thị microsatellite, các tác giả đã
thiết kế được cặp mồi dựa trên trình tự của chỉ thị RG28 để nhân bản ADN
liên kết với tính trạng thơm. Ngoài ra, một số chỉ thị SSR như RM16,
RM72, RM234, RM238, RM252, RM350 cũng đã được một số tác giả sử
dụng để phân biệt một số giống lúa thơm. Một số tính trạng liên kết với
trạng độ bền của gel như Wx, RM204, RG171 và RG243 và chỉ thị cho
nhiệt độ hóa hồ PssII-2, GP11 cũng đã được xác định. Các chỉ thị R2425 và
R2284 được xác định liên kết với tính trạng chiều dài hạt. Đây là những cơ
sở khoa học quan trọng cho việc ứng dụng MAS trong chọn lọc và đánh giá
giống lúa chất lượng.
2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.3.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Các chuỗi lặp lại là chỉ thị ADN quan trọng vì nó rất phổ biến ở hệ
gen động vật cũng như thực vật và độ dài các chuỗi dao động rất lớn. Ngoài
ra các chuỗi lặp lại dơn giản (SSR) được phân bố đều trong hệ gen. Các
nhà chọn giống đang cố gắng chọn giống có năng suất và chất lượng với
việc ứng dụng chỉ thị phân tử vào nghiên cứu tính trạng chất lượng. Một số
công trình đã được công bố về nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen và môi
trường lên hàm lượng amylose ảnh hưởng đến độ dẻo của cơm, tác giả Bao
và cs (2002, 2006) đã sử dụng mồi SSR để nhân các đoạn lặp lại có trong

gen Wx (mã hóa cho enzym tổng hợp amylase), và gen SBE (mã hóa cho
enzym tổng hợp amylopectin) và gen SSS (mã hóa cho enzym tổng hợp
tinh bột hòa tan trong nội nhũ hạt). Việc xác định tính trạng số lượng của
các tính trạng hình thái hạt, độ dài hạt, chất lượng hạt, tính thơm… cũng
được tiến hành. Tuy nhiên, việc nghiên cưú ảnh hưởng của đa gen lên tính
trạng chất lượng vô cùng phức tạp đòi hỏi có nhiều hơn các nghiên cứu sâu
hơn đặc biệt là nghiên cứu các gen quý của những giống lúa trong nước
phát huy ưu thế của giống này trong sản xuất.

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

13

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây, do nhu cầu cuộc sống ngày càng cao.
Bên cạnh những giống lúa năng suất cao đáp ứng đủ nhu cầu về lương
thực, thì các giống lúa chất lượng cao như lúa thơm, cơm dẻo…đang được
các nhà chọn giống quan tâm. Đặc biệt với một nước xuất khẩu gạo như
nước ta thì vấn đề này càng trở nên cấp thiết.
Việc chọn tạo các giống lúa chất lượng cao đã và đang được tiến
hành theo phương pháp truyền thống. Một số giống tám thơm đã được chọn

tạo bằng đột biến nhằm rút ngắn thời gian sinh trưởng cũng như cải tạo một
số đặc điểm bất lợi của giống lúa tám như cao cây và tính cảm quang. Quá
trình chọn lọc này cũng đem lại kết quả nhưng đòi hỏi thời gian chọn lọc
dài.
Cùng với sư phát triển của sinh học phân tử, những năm gần đây
nước ta đã có những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá sự
đa dạng di truyền của nguồn gen nhưng chưa đưa và ứng dụng trong chọn
tạo giống cây trồng nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lan, 1999; Nguyễn Đức Thành và cs, 1999; Phan Thị Bảy và
cs, 2000). Việc sử dụng chỉ thị phân tử vào công việc nghiên cứu tính trạng
về chất lượng và phát triển chỉ thị phân tử mới liên kết chặt với tính trạng
này sẽ góp phần rút ngắn thời gian chọn lọc.

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

14

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Nguyên liệu thực vật

Sử dụng các dòng lúa trong quần thể F3 của cặp lai giữa CR203 và
Bắc thơm số 7, nhận được từ phòng Di truyền Tế bào thực vật – Viện Công
nghệ sinh học.
Bảng 1: Tên các dòng lúa trong quần thể F3 của cặp lai CR203
và Bắc thơm số 7 (49 dòng và 2 dòng đối chứng CR203 – BTS 7) dùng
trong nghiên cứu.
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

24
25

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

Tên dòng
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
120
121
122
123
124
125
127
128
130
131
132
133
134
135

136

STT
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
15

Tên dòng
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
152
153
154
155
156
157
158
160
161
162
CR203
BTS 7
B¸o c¸o tèt nghiÖp

Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

3.1.2 Hóa chất và thiết bị.
Thiết bị máy móc:
- Cân phân tích (Meller, Thụy sĩ).
- Máy đo quang phổ Diode Arrey Spectrophotometer 845 2A (Hewlett
Parkard, Mỹ).
- Máy điện di và bộ nguồn Power pac 300 (Bio-Rad, Mỹ).
- Máy chụp ảnh gel Cls-Microdoc (Cleaver Scientific Ltd, Mỹ).
Các cặp mồi SSR và hóa chất: được đặt mua của hãng Alpha ADN
(Montreal, Quebec, Canada) Sigma và Fermenfas.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tách chiết ADN tổng số
Tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Saghai
Maroof và cs, 1984.
Nguyên liệu để tách ADN tổng số là mô lá của các con lai trong quần
thể F3 của cặp lai CR203 và Bắc thơm số 7. Phương pháp CTAB để tách
chiết ADN tổng số gồm các hóa chất và các bước tiến hành sau:
Các hóa chất tách chiết ADN tổng số:
- Đệm CTAB ( Cetytrimethyl ammonium bromide).
+ 1% CTAB.
+ 0,14 M ß-Mercapto ethanol.
+0,01 M EDTA, pH 8,0 (Ethylenediamine tetraacetate).
- Đệm TE, pH =8,0.
+ 10 mM Tris – HCl pH=8,0.

+ 1 mM EDTA pH=8,0.
- ARNase (10 mg/ml).
- Isopropanol.
- Hỗn hợp phenol/chloroform/Isoamyalcohol (25:24:1).
- Cồn 70%.
- Hỗn hợp chloroform/Isoamyalcohol (24:1).
Các bước tiến hành:
Bước 1: Cắt khoảng 1g các lá của cây trưởng thành nghiền nhỏ thành bột
mịn trong nitơ lỏng.

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

16

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ sinh học

Bc 2: Chuyn cỏc bt mn ny vo trong cỏc ng ly tõm 15ml ó kh
trựng, cho thờm 7 ml dung dch CTAB 1% ó lm m 60 0c trong 90
phỳt. Trong thi gian c 10-15 phỳt li lc nh mt ln, vic tỏch cú
hiu qu.
Bc 3: Ly cỏc ng ly tõm ra v ngui nhit phũng trong 5 phỳt,
sau ú cho thờm 5ml dung dch chloroform/Isoamyalcohol (24:1) vo ng
cha mu v lc nh nhng nhng dt khoỏt trong 5-10 phỳt, em ly tõm

3000 vũng/trong 15 phỳt nhit phũng.
Bc 4: Sau khi ly tõm song dựng pitpet rng ming hỳt ly phn dch bờn
trờn sang cỏc ng sch v b sung thờm 5ml dung dch
chloroform/Isoamyalcohol (24:1) xoay v lc nh nhng trong 5-10 phỳt,
em ly tõm 3000 vũng/phỳt trong 15phỳt nhit phũng.
Bc 5: Dựng pitpet hỳt phn dch trờn cựng sang ng ly tõm mi cú b
sung thờm mt lng cn gp ụi lng hin cú hoc 1/6 th tớch
Isopropanol lc nh nhng, lỳc ny cú th quan sỏt thy ADN kt ta trong
dung dch v em ly tõm 3000 vũng/phỳt, trong 10 phỳt nhit phũng.
Bc 6: Sau khi ly tõm ly phn kt ta, thi tht khụ, sau ú hũa vi 0,5ml
TE, lc nh nhng ri trong t lnh 40c qua ờm.
Bc 7: Chuyn dung dch ADN sang ng eppendorf 1,5 ml mi. Thờm
ARNase v 370c trong 60 phỳt, ly ra v cho thờm 0,5 ml
phenol/chloroform/Isoamyalcohol (25:24:1) lc nh nhng ri em ly tõm
3000 vũng/phỳt trong 10 phỳt nhit phũng.
Bc 8: Hỳt cỏc phn m trờn cho vo cỏc ng eppendorf mi lm sch
ln na bng cỏch thay phenol/chloroform/Isoanylacohol bng chloroform/
Isoamyalcohol (24:1) v kt ta bng cỏch cho thờm 5àl dung dch 5M
NaCl v 2 ln th tớch cn tuyt i, lc nh ri ly tõm 13000 vũng/phỳt
trong 10 phỳt. Ra ta bng cn 70% sau ú thi khụ v ho trong TE in
di trờn gel agarose 1% kim tra cht lng ADN.
Sau ú, bn gel c nhum vi Ethidium Bromicle (EtBr) 0,1%, soi
gel trờn Mini Transilluminator v chp nh.
3.2.2 Phn ng PCR vi cỏc cp mi SSR
Phn ng SSR chy trờn mỏy PCR RTC 100 (MJ Research Inc,
USA). Hn hp phn ng PCR gm :
Nguyễn Thị Thoa 8K

17

Báo cáo tốt nghiệp




Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m

+ H2 0
+ Buffer 10×PCR
+ d NTP(1Mm)
+ Mồi xuôi (50mg/µl)
+ Mồi ngược (50mg/µl)
+ Taq pdymerase
(5UI/µl)
+ ADN (25 mg / µl )
Σ

:
:
:
:
:
:
:

Khoa C«ng nghÖ sinh häc

14.5 µl
3,0 µl
2,5 µl

0,5 µl
0,5 µl
0,5 µl
1 µl
20 µl

:

(10 × PCR buffer: 10 mM tris – HCl, pH = 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM
MgCl2; 0,01% Gelatin)
Chương trình chạy PCR như sau:
1. 940C trong 5 phút
2. 940Ctrong 1 phút
3. 550C trong 1phút
4. 720C trong 2 phút
5. 35 chu kỳ (2+3+4)
6. 720C trong 5 phút
Sản phẩm PCR với các mồi SSR được chạy điện di trên gel agarose 2% và
gel polyacrylamide có độ phân giải cao, sử dụng nhuộm bạc để phát hiện
băng.
Điện di trên gel agarose
Hóa chất :
- Agarose.
- Đệm 10 × TBE : 54 g Trisbase ; 7,5 g Boric acid; 20 ml EDTA 0,5 M;
pH= 8,0 thêm nước cất tới 500 ml.
- Đệm tra mẫu (loading buffer): 2,5 mg Bromphenol blue; 2,5 mg
xylene cyanol FF; 0,4 g sucrose; thêm nước cất đến 1 ml.
- Ethidiumbromide : 10 mg/ml.
Cách tiến hành:

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

18

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ sinh học

- Chun b gel agarose 2%: cõn 1,2 g thch cho vo 60 ml dung dch
m 1ìTBE. un trong lũ vi súng khong 2 phỳt cho agarose tan hon ton
trong dung dch (lng agarose v dung dch TBE tựy thuc vo th tớch
thay in di. ngui cũn 50-60 0C, vo khay in di ó ci sn lc
i khong 45-60 phỳt cho gel ụng li. t khay vo b in di sau ú
dung dch 1x TBE ngp gel khong 0,5 cm, rỳt lc khi gel.
- Tra mu ADN : ly 4àl mu ADN trn vi 2 àl loading tra vo cỏi ging
v tra thờm ADN maker 1kb xỏc nh di ca cỏi bng ADN. in di
80v trong vũng 30 phỳt (thi gian v hiu in th in di tựy thuc vo khong
cỏch gia 2 in cc v mc ớch ca ngi nghiờn cu). ADN s di chuyn t
cc õm sang cc dng ca in trng. Da vo v trớ ca vch mu dng
quỏ trỡnh in li.
- Nhum gel: in li song bn gel c ngõm trong dung dch Ethidium
bromide nng 30 àl/l trờn mỏy lc trong 15 20 phỳt, sau ú ra bn gel
v ngõm nc ct 15 phỳt .
- Soi gel v chp nh: gel c soi di ỏnh sỏng tia t ngoi bc súng
254 260 nm ca mỏy soi ADN. Sau ú c chp nh bng mỏy chuyờn

dng Polaroid .
3.2.3 Phõn tớch SSR
Phõn tớch SSR theo phng phỏp Panaud v cs, 1996.
in di trờn gel Polyacrylamide.
- Chun b bn gel Polyacrylamide (cỏc bn kớnh phi c ra tht
sch). Bn gel cú kớch thc 19ì50 cm gm 2 tm kớnh di c gn bn gel,
ra sch hai tm kớnh trờn 3 ln bng nc ct 2 ln. Sau ú lau khụ bng giy
la mm, lau i lau li bng giy kimwipe cho khụ v sch bi.

Nguyễn Thị Thoa 8K

19

Báo cáo tốt nghiệp


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ sinh học

+ Trờn tm kớnh ngn s dng dch bụi trn l Rain ì thm trờn giy kim
wipe, ch 15 20 phỳt cho khụ.
+ Trờn tm kớnh di s dng dung dch dớnh gm 1ml hn hp (95% cn
tuyt i, 0,5% acetic acid v 3 àl bind silance), t 15 20 phỳt cho khụ.
(lu ý: trỏnh dung dch bỏm dớnh dy sang kớnh ngn, phi chun b kớnh
ngn trc. Nu chun b kớnh di trc thỡ phi thay gng tay trc khi chun
b kớnh ngn).
hai tm Spacer vo hai mộp kớnh ri ghộp hai tm li vi nhau to khuụn

gel, khi ú khuụn ỳc cú dy ỳng bng dy ca thanh Spacer.
- Chun b dung dch gel polyacrylamide chy in di:
Dựng ng ong ly 55 ml polyacrylamide, b sung thờm 55 àl TEMED v 165
àl APS 10% (amonium persulfate) lc cho u trc khi cho gel v bn gel
chy in di.
Dựng xilanh 140cc hỳt dung dch gel polyacrylamid ó trn trờn v bm t t
vo khong trng gia hai tm kớnh qua mt l ỏy ca h thng bn gel.
Khi thy gel chy ra gn mộp ngoi, lp lc, ch 2-3 gi cho gel ụng li .
Trong trng hp gi gel qua ờm nhit phũng cn bt u cú lc bng
mng plastic.
- Tin hnh in di.
Sau khi gel ụng, dng ng bn gel lp vo h thng chy in di, dung
dch m TBE buffer ì0,5(m TBE gm: 0,5 ml m TBE ì0,5; 1 lớt nc)
ó chun b trc cho chy thụng gel trc khi tra mu khong 20 30 phỳt
cụng sut 75w
- Tra mu:

Nguyễn Thị Thoa 8K

20

Báo cáo tốt nghiệp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

+ Chạy biến tính : Sản phẩm SSR thu được thêm 7µl loading (loading gồm 2,5
mg brom phenol blue; 2,5 mg xylen cyanlo FF: 0,4 g sucrose thêm nước cất vừ
đủ 1ml.) trộn đều cho vào máy, đậy nắp, bật máy biến tính trong 10 phút. Lấy
ra cho vào đá lạnh ngay.
+ Lấy 5µl hỗn hợp đã biến tính lần lượt tra vào giếng. Thường tra maker
100 đầu tiên hoặc cuối cùng với lượng khoảng 4 µl đóng lắp, ấn Exit cho máy
trở lại màn hình ban đầu, chọn Manual, chọn consant 75w, ấn run cho chạy. Để
gel chạy xuống tận bản gel mới tiến hành quy trình nhuộm gel. Để tăng hiệu
quả sử dụng cả bản gel, có thể tra mẫu nhiều lần, mỗi bản gel có thể tra từ 2- 4
lần.
+ Sau khi tra mẫu và maker công suất chạy gel là 75w, sau 1 – 2 giờ tắt
máy, gỡ bản gel ra khỏi máy, tách bản kính không dính ra rồi tiến hành nhuộm
bạc.
- Chuẩn bị nhuộm:
+ Dung dịch cố định (11) bao gồm: 125ml CH3COOH, 1lít nước cất,
dung dịch này dùng được hai lần.
+ Dung dịch nhuộm (11) bao gồm: 1 gam AgNO3, 1,5ml HCHO, thêm
nước cất vừa đủ 1 lít dung dịch này được dùng hai lần.
+ Dung dịch hiện bao gồm: 15g sodium cacbonat, 0,75ml Formandehyd
(HCHO); 0,2 ml Thiosunfat, thêm nước cất vừa đủ 1 lít. Bao báo để tủ lạnh ít
nhất 30 phút mới đem dùng, thuốc này dùng được 1 lần.
- Tiến hành nhuộm gel bằng bạc:
+ Sau khi điện di, tách các bản kính ra, gel phải được dính vào kính dài
đưa gel vào dung dịch cố định đặt lên máy lắc trong 30 phút, đến khi không còn
vạch nhuộm nữa.
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

21

B¸o c¸o tèt nghiÖp

Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

+ Rửa bản gel 2 lần (mỗi lần 2 phút) bằng nước cất.
+ Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm ít nhất trong 30 phút trên máy lắc.
+ Rửa bản gel đã nhuộm bằng nước cất trong 10 giây nếu không bạc sẽ
rửa đi hết.
+ Cho bản gel đã rửa vào dung dịch hiện, đặt trên máy lắc 5-10 phút cho
đến khi nổi rõ băng điện di.
+ Cố định gel bằng dung dịch cố định trong 3 – 5 phút.
+ Tráng gel bằng nước cất và để cho gel khô ở nhiệt độ phòng.
3.2.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
Để nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền ta thường dựa vào ba công
thức hệ số di truyền đó là: hệ số Jaccard (1908), hệ số SM (Sokal và
Michener, 1958), hệ số Nei và Li (1979). Để phân tích các nhóm và so sánh
các ma trận tương đồng với nhau, người ta dùng một số phương pháp ma
trận như ma trận khác nhau UPMGA (Sokal và Michener, 1958), ma trận
giống nhau WPGMA (Sneath và Sokal, 1973). Việc chọn sử dụng phương
pháp tính toán nào là tùy thuộc vào từng đối tượng và mục đích nghiên
cứu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng hệ số tương đồng di truyền Jaccard và
phương pháp tính UPGMA cho nghiên cứu đa dạng di truyền là phù hợp
hơn cả. Nên trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng hệ số di truyền
Jaccard và phương pháp tính UPGMA để nghiên cứu mức độ biến động di
truyền giữa các mẫu lúa trong quần thể F3 giữa cặp lai CR203 và Bắc thơm
số 7.

Các phân đoạn ADN được ghi nhận dựa trên cơ sở có mặt hay vắng
mặt của chúng ở các giống nghiên cứu theo ADN chuẩn (ADN marker).
Nếu có thì kí hiệu là 1, không có thì kí hiệu là 0, còn không thu nhận được
sản phẩm thì kí hiệu là (-). Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương
trình NTYSYS – PC ( Rohlf F. J) để tính ma trận tương đồng giũa các đôi
mẫu. Việc tính toán ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Việc tính toán
ma trận tương đồng dựa trên công thức:
Jij = a / (n-d)
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

22

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

Với:
a: số phân đoạn ADN có ở hai dòng I và j
d: số phân đoạn ADN có ở dòng I hoặc dòng j
n: Tổng số phân đoạn thu được
Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng I và j
Sau đó các mẫu nghiên cứu được xử lý tiếp trong NTSYS –
SIMQUAL để phân nhóm và được biểu hiện trên biểu đồ giúp chúng ta có
thể đánh giá sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các đối tượng
nghiên cứu.

PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
Hầu hết các kĩ thuật Sinh học phân tử đều sử dụng ADN như là
nguyên liệu cơ bản ban đầu để nghiên cứu. Tách chiết ADN tổng số được
coi là khâu đầu tiên quyết định cho sự thành công của các nghiên cứu tiếp
theo trên ADN. ADN có chất lượng cao phải đảm bảo tính nguyên vẹn của
phân tử, không lẫn ARN, protein hay các tạp chất khác.
Hiện nay, có nhiều phương pháp tách chiết ADN tổng số rất hiệu quả
từ mô thực vật đã được nghiên cứu. Phương pháp tách chiết ADN chúng tôi
trình bày ở trên là phương pháp tách chiết ADN tổng số của Saghai Maroof
có cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

23

B¸o c¸o tèt nghiÖp


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ sinh học

Cỏc nghiờn cu c tin hnh trờn 50 dũng lỳa. ADN sau khi tỏch
chit c kim tra nng v tinh sch nh mỏy o UV bc súng
260 nm v 280 nm. Sau ú tin hnh in di trờn gel agarose 1%. Kt qu

thu c th hin trờn hỡnh 2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Hỡnh 2: Kt qu in di ADN tng s mt s dũng trong qun th F3

Trờn nh in di cho thy ADN tng s thu c cú mt bng rt
gn v khỏ rừ nột, ng thi khụng thy ng ging, kt hp vi kt qu t
l hp th o trờn mỏy UV gia A260/A280 trong khong t 1.8 2.0 tt
c cỏc mu. Chng t ADN tng s thu c cú tinh sch v nguyờn
vn khỏ cao. Cú th s dng cho cỏc phn ng tip theo.
Da trờn nng ADN tng s ca tng mu pha loóng ra nng

25 ng/àl s dng cho cỏc phn ng PCR.
4.2. Kt qu PCR t ADN tng s vi cỏc mi SSR
4.2.1. Kt qu PCR b v m vi cỏc mi SSR
Trc khi ỏnh giỏ s a hỡnh ca qun th F3 vi cỏc ch th SSR,
chỳng tụi tin hnh ỏnh giỏ s a hỡnh ca cỏc ch th trờn cp b m
chn ra cỏc cp mi cho s a hỡnh. Di õy l kt qu in di cỏc ch th
SSR vi b m.

Nguyễn Thị Thoa 8K

24

Báo cáo tốt nghiệp


Trêng Cao ®¼ng N«ng L©m



Khoa C«ng nghÖ sinh häc

Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với các mồi RM19, RM190,
RM169, RM102, RM153, RM229, RM311, marker.
Kết quả điện di trên hình 3 thu được các băng gọn và rõ nét. Chứng
tỏ kết quả chạy PCR với các mồi SSR là rất đặc hiệu. Có thể dùng sản
phẩm PCR kiểm tra trên gel polyacrylamide có khả năng phân tách kích
thước tốt hơn để tìm ra các chỉ thị cho sự đa hình giữa bố và mẹ.
Sau khi chạy điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide, chúng
tôi thu được các mồi RM19, RM190, RM169, RM102, RM153, RM229,
RM311 cho các băng đa hình giữa các cặp bố mẹ. Các mồi này sẽ được

dùng để kiểm tra sự đa hình trên quần thể lúa F3.
4.2.2. Kết quả PCR ADN tổng số của các dòng lúa với các mồi SSR.
Sau khi hoàn thành phản ứng PCR với các dòng trong quần thể, sản
phẩm được điện di trên gel agarose 2%, hoặc được điện di trên gel
polyacrylamide để phân tích đa hình ADN của các mẫu nghiên cứu. Các
băng ADN thu được, được phân tích dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của
chúng ở các mẫu nghiên cứu. Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký
hiệu là 0. Những băng mà có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu khác gọi là
băng đa hình. Dựa vào mức độ đa hình của các băng này chúng ta có thể
đánh giá mức độ khác nhau và giống nhau giữa các mẫu nghiên cứu.
Kết quả phân tích SSR của 49 dòng lúa với 7 mồi SSR được thể hiện
trong hình 4, hình 5, hình 6.
NguyÔn ThÞ Thoa – 8K

25

B¸o c¸o tèt nghiÖp