Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nồng độ trong quy trình nhân nhanh giống khoai tây củ siêu bi nhằm tạo giống sạch bệnh

Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

PHầN 1: Mở đầu
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Trên thế giới, khoai tây (solanum tuberosum L.) đợc coi là nguồn lơng
thực quan trọng, có giá trị dinh dỡng và giá trị kinh tế cao, chiếm vị trí không
nhỏ trong nền kinh tế quốc dân của nhiều nớc trên thế giới. Hiện nay khoai
tây đựơc xếp là cây lơng thực đứng hàng thứ t sau lúa mì, lúa nớc và ngô. Đây
là cây lơng thực quan trọng trong cơ cấu cây trồng vụ đông do có các u điểm
nh thời gian sinh trởng ngắn (80 - 100 ngày), cho năng suất cao (15 - 30
tấn/ha), củ giàu dinh dỡng (protein; đờng; lipít; các loại vitamin B1; B2; B3;
các loại khoáng quan trọng (kali, canxi, magie) và nhiều nhất là vitamin C (20
50mg%) (Tạ Thu Cúc, 2000) [2]. Khoai tây là loại rau có nhiều năng lợng,
cứ 1 kg khoai tây cho 848 kcal. Cây khoai tây vốn là một cây a lạnh có nguồn
gốc ở vùng cao nhiệt đới (từ 1000 m trở lên). Trải qua quá trình chọn lọc và
thuần hoá, nó đợc trồng ở các vùng khí hậu khác nhau bao gồm các vùng ôn
đới, á nhiệt đới và nhiệt đới với các điều kiện sinh thái khác nhau từ vùng
đồng bằng đến vùng núi cao.
ở Việt Nam, khoai tây đợc coi là nhóm cây lơng thực có tầm quan
trọng đứng thứ ba sau lúa và ngô. Trong quá trình phát triển kinh tế xã hội,
nhu cầu tiêu thụ khoai tây của thị trờng nói chung, đặc biệt là các đô thị, khu
công nghiệp, khu du lịch, sẽ ngày càng tăng. Việt Nam có khả năng phát triển
mạnh khoai tây, đây là cây trồng vụ Đông lý tởng cho đồng bằng Bắc Bộ,
miền núi phía Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. ở miền Bắc nớc ta, khoai
tây đợc trồng sau hai vụ lúa, đã góp phần cải tạo và nâng cao độ phì nhiêu cho
đất, hạn chế lây lan của sâu bệnh. Đồng thời, việc luân canh nh vậy mang lại
hiệu quả kinh tế cao cho ngời nông dân. Tuy nhiên, khoai tây cha đợc phát

triển đúng với tiềm năng của nó. Diện tích trồng khoai tây ở Việt Nam còn rất
khiêm tốn, dao động quanh 33000 ha (2003). Năng suất bình quân còn thấp
12,5 tấn/ha. Năng suất khoai tây ở các nớc nh Pháp, Đức, Hà Lan đều xấp xỉ
40 tấn. Nguyên nhân chính của hiện tợng này là do trồng khoai tây bằng củ
giống truyền thống qua nhiều năm đã thoái hoá không có chất lợng, làm yếu
dần tính chống chịu của khoai tây qua sinh sản vô tính, làm tăng tỷ lệ nhiễm
bệnh đặc biệt là virus, làm giảm năng suất của khoai tây. Dẫn đến chi phí cai
trong sản xuất và không chủ động. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tạo củ giống
mini sạch bệnh trong sản xuất giống khoai tây ở Việt Nam là rất bức thiết.
Bởi vậy, vấn đề đặt ra là cần phải cung cấp đủ nguồn nguyên liệu đáp
ứng cả về số lợng và chất lợng cho việc sản xuất giống khoai tây siêu bi cung
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

1

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

cấp đầy đủ cho bà con nông dân. Do đó, trong những năm qua các nhà khoa
học đã và đang tìm kiếm phơng pháp thích hợp nhất với việc ứng dụng các
thành tựu khoa học trong nhân giống cây khoai tây nhập nội. Một trong các
phơng pháp đó là nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Đây là
phơng pháp thể hiện tính u việt trong việc nhân nhanh một dòng chọn lọc, có
phẩm chất tốt, hàm lợng thành phần hoá học có tác dụng dợc lý cao, tạo

nguồn cây giống đồng đều, sạch bệnh, giữ đợc các đặc tính quý của nguyên
liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với phơng pháp nhân
giống truyền thống. Xuất phát từ ý nghĩa khoa học trên, chúng tôi đã tiến hành
đề tài : Nghiên cứu ảnh hởng của một số nồng độ trong quy trình nhân
nhanh giống khoai tây củ siêu bi nhằm tạo giống sạch bệnh.
1.2. Mục tiêu, ý nghĩa
1.2.1. Mục tiêu
Xác định đợc nồng độ tối u của - NAA, HgCl2, BAP tới khả năng
sống của mầm không bị nhiễm, khả năng sinh trởng chồi và khả năng tạo củ
bi trong nuôi cấy invitro của hai giống khoai tây: Solara, Diamant.
1.2.2. ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- ý nghĩa thực tiễn: kết quả nghiên cứu thành công sẽ ứng dụng trong
việc sản xuất giống khoai tây củ bi bằng phơng pháp invitro tạo đợc những
cây sạch bệnh, năng suất cao, giảm giá thành củ giống cho ngời sản xuất.
- ý nghĩa khoa học: xác định đợc nồng độ tối u của - NAA, HgCl2,
BAP bổ sung vào môi trờng nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây
invitro. Đồng thời nhằm đáp ứng nhu cầu về giống khoai tây củ siêu bi sạch
bệnh cho nghiên cứu.
1.2.3. Đối tợng và phạm vi nghiên cứu
1.2.3.1. Đối tợng nghiên cứu
Đề tài đợc nghiên cứu trên hai giống khoai tây nhập nội:
- Giống Solara.
- Giống Diamant.
1.2.3.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hởng của thời gian khử trùng, nồng độ HgCl2 đến khả
năng sống của mầm và ảnh hởng của - NAA đến khả năng sinh trởng chồi
của các giống khoai tây, ảnh hởng nồng độ BAP tới khả năng tạo củ trong ống
nghiệm.
1.2.3.2.1. Địa điểm nghiên cứu

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

2

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật của Trung tâm Thông Tin
và ứng dụng tiến bộ Khoa học công nghệ thuộc sở Khoa học công nghệ Bắc
Ninh.
1.2.3.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ 29 / 03 / 2010 đến 04 / 06 / 2010.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

3

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm

Khoa Công nghệ Sinh học

PHầN 2. tổng quan tài liệu
2.1. Khái quát về khoai tây
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố
2.1.1.1. Nguồn gốc
Khoai tây có nguồn gốc hơn 8000 năm trớc tại những khu vực nhiệt đới
cao của Peru nơi mà khoảng 5500 loài khoai tây đã đợc trồng bởi nhiều thế hệ
ngời dân tại vùng này. Theo Bucaxôp thì cây khoai tây đợc xác định có nguồn
gốc ở Nam Mỹ thuộc các nớc Chile, Peru, Bôlivia (Tạ Thu Cúc ; 2000) [2].
Theo các tài liệu cổ thì khoai tây hoang dại đợc ngời dân dãy Andess ở
Nam Peru và Bắc Bôlivia từ 3000 - 4000 năm trớc công nguyên. Sau khi thuần
hoá khoai tây đợc lan rộng khắp miền núi dãy Adess (Nguyễn Quang Thạch,
1993).
Khoai tây đợc du nhập vào Việt Nam từ 1890 và chủ yếu trồng ở Đồng
bằng Sông Hồng (Trơng Văn Hộ, Lê Thị Tuyết, Phạm Xuân Tùng, Vander
Zaag, 1988). Trớc năm 1970, diện tích khoai tây của nớc ta còn rất thấp, chỉ
khoảng 3000ha và chỉ đợc xem nh một loại rau (Trơng Văn Hộ, 1990) [8].
Nhờ cuộc cách mạng xanh ở miền Bắc, lúa xuân thay thế lúa chiêm, cùng với
sự ra đời của vụ đông mà cây khoai tây ở Việt Nam đợc chuyển vị trí từ một
cây rau sang một cây lơng thực quan trọng. Diện tích trồng khoai tây của nớc
ta đợc tăng lên nhanh chóng. Thậm chí, có giai đoạn (1987) Bộ Nông nghiệp
đã đánh giá cây khoai tây là cây lơng thực quan trọng thứ hai sau lúa, có vai
trò vừa là cây lơng thực vừa là cây thực phẩm, đồng thời là cây xuất khẩu có
giá trị kinh tế cao.
Sau một giai đoạn dài biến động thăng trầm, gần đây tình hình sản xuất
khoai tây ở Việt Nam có chiều hớng giảm sút nghiêm trọng cả về diện tích và
sản lợng. Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự giảm sút đó là do thiếu giống mới
có năng suất, chất lợng cao, sử dụng giống cũ đã thoái hoá nên năng suất thấp
(khoảng 10 tấn/ha) trong khi năng suất khoai tây ở Pháp là 35 tấn/ha, Hà Lan

45 tấn/ha, Mỹ 65 tấn/ha (Leviel, 1986). Để khắc phục hiện trạng này, giải
pháp đầu tiên và phù hợp nhất phải làm là thay thế giống khoai tây thoái hoá.
Cần phải thiết lập và hoàn thiện hệ thống sản xuất khoai tây giống gốc ở Việt
Nam có chất lợng cao, đáp ứng nhu cầu cho sản xuất khoai tây hiện nay.
2.1.1.2. Phân bố
Khoai tây là cây a khí hậu mát mẻ, hiện nay nó đợc trồng ở khắp các nớc trên thế giới. Vào thế kỷ 11 (khoảng năm 1570) ngời Tây Ban Nha chinh
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

4

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

phục Châu Mỹ từ đó đợc đa đến các vùng khác nhau trên thế giới. Khoai tây
đợc trồng ở Tây Ban Nha năm 1561, đợc nhập vào Ailen (1580 - 1658), vào
Anh (1590), vào Đức (1651), vào Pháp (1596), vào Nga (1700)...
ở Việt Nam, nhiều tài liệu cho rằng cây khoai tây đợc trồng từ năm
1890 do ngời Pháp mang đến. Năm 1901, khoai tây đợc trồng ở Tú Sơn - Hải
Phòng, năm 1907 đợc trồng ở Trà Lĩnh - Cao Bằng, năm 1917 đợc trồng ở Thờng Tín - Hà Tây. Hiện nay khoai tây đợc trồng ở khắp cả nớc, đặc biệt là các
tỉnh đồng bằng châu thổ sông Hồng, Đà Lạt Lâm Đồng. Diện tích trồng khoai
tây ngày càng phát triển phục vụ đủ nhu cầu trong và ngoài nớc.
2.1.2. Đặc điểm sinh học
2.1.2.1. Vị trí phân loại
Cây khoai tây thuộc chi gennus solanum sectio lenlota gồm 180 loại, có

khả năng cho củ. Cây khoai tây thuộc nhóm thân thảo, họ cà, thuộc loài
solanum tuberosum L. Theo tổng kết hiện nay có khoảng 20 loài khoai tây thơng phẩm ở thể tứ bội (2n = 4x = 48), có khả năng sinh trởng phát triển và cho
năng suất cao [4]. Và nó đợc phân loại theo bảng dới đây:
Khoai tây (Solanum tuberosum L) thuộc loài S. Tuberosum, chi
Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp
Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta.
2.1.2.2. Đặc điểm sinh thái
Cây khoai tây yêu cầu khí hậu mát mẻ, ôn hoà. Nhiệt độ là một yếu tố
quan trọng ảnh hởng trực tiếp đến sinh trởng và phát triển của khoai tây. Mỗi
thời kỳ sinh trởng và phát triển chúng yêu cầu nhiệt độ khác nhau. Nhiệt độ
thích hợp cho hạt nảy mầm là từ 18 - 20C, nhiệt độ thích hợp nhất cho thân lá
phát triển là 20 - 22 C. ở thời kỳ sinh trởng dinh dỡng nó có thể thích ứng với
biên độ nhiệt độ từ 10 - 25 C, rộng hơn so với giai đoạn sinh trởng sinh thực.
Lor (1960) đã chứng minh rằng nhiệt độ càng cao thì khối lợng thân, lá, củ
càng giảm.
Khoai tây là cây a sáng, cờng độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinh
trởng và cho năng suất cao là từ 40.000 - 60.000 lux. Thời kỳ từ cây non đến
giai đoạn hình thành củ khoai tây đòi hỏi ánh sáng ngày dài (trên 14h ánh
sáng/ngày đêm) để quang hợp và tích luỹ chất dinh dỡng, đồng thời ra hoa,
đậu quả. Thời kỳ sinh trởng sinh thực và khi củ bắt đầu hình thành, cây khoai
tây cần có thời gian chiếu sáng ngắn.
2.1.2.3.Đặc điểm hình thái
Rễ
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

5

Trơng Thị Phơng Chi

Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Khoai tây thuộc loại rễ chùm (nếu trồng từ củ), có rễ cọc (nếu trồng từ
hạt), từ rễ cọc sẽ phát triển thành nhiều rễ phụ khác. Phần lớn rễ tập trung ở độ
sâu 30 - 40 cm, rễ còn phát triển cả trên củ nhng ngắn và ít phân nhánh.
Rễ khoai tây phát triển mạnh ở thời kì ra hoa (ở dới mặt đất lúc này hình
thành củ và củ bắt đầu lớn)
Thân
Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo zich zắc, có 3 - 4 cạnh, cao
trung bình từ 40 - 70 cm đến 1 - 1,2 m, tuỳ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện
chăm sóc mà chiều cao cây có thể khác nhau.
Thân khoai tây thờng có màu xanh hoặc xanh nhạt hay xanh đậm, đôi khi
có màu phớt hồng hoặc tím tuỳ thuộc vào từng giống. Trên thân có lớp lông tơ
mềm (khi cây còn non), cứng dần và rụng theo thời gian sinh trởng.
Lá
Lá khoai tây tơng tự nh lá cà chua, nhng khác một số điểm là: thuộc lá
phức tạp, bản lá to, mọc cách xẻ lông chim, có 3 - 7 đôi mọc đối xứng qua
trục và một lá lẻ trên cùng (lá chét đỉnh).
Lá khoai tây dài khoảng 10 - 15 cm, mặt lá phẳng hoặc gợn sóng, bản lá
thờng to hơn lá cà chua. Màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện
chăm sóc mà có thể có màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt.
Hoa
Hoa khoai tây thờng mọc tập trung trên một chùm hoa. Nó thuộc hoa lỡng
tính, có cấu tạo 5:5:5, cuống ngắn.
Màu sắc hoa thờng trắng bạc hoặc phớt hồng phụ thuộc vào giống, mùi vị
dễ chịu.

Quả
Khoai tây thuộc loại quả mọng. Hình dạng quả tròn hoặc trái xoan. Khi
quả chín có màu trắng bạc phớt hồng, mùi vị rất dễ chịu. Quả có từ 2 - 3 ngăn,
bên trong có chứa nhiều hạt (30 - 300 hạt).
Củ khoai tây
Củ khoai tây là bộ phận thực phẩm cho con ngời. Củ khoai tây còn có tên
gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ đợc hình thành là do thân phát triển dới
đất, trong điều kiện bóng tối.
Hình dạng củ khoai tây có thể là tròn, elip, tròn dài, đôi khi hình vuông.
Màu sắc củ tuỳ thuộc vào từng giống, có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng,
vàng nhạt. Trên củ có nhiều mắt ngủ nhng phân bố không đều, số lợng mắt
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

6

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

ngủ nhiều hay ít tuỳ thuộc vào từng giống. Trên mắt ngủ có mi mắt và mắt: mi
mắt dài hay ngắn, mắt nông hay sâu là do đặc tính di truyền của giống trên
mỗi mắt thờng có 2 - 3 mầm ngủ và thờng tập trung nhiều trên đỉnh củ tuỳ
thuộc từng giống, thời vụ, đất trồng và điều kiện chăm sóc mà có trọng lợng
củ khác nhau [7].
2.1.3. Giá trị kinh tế và dinh dỡng

2.1.3.1. Giá trị dinh dỡng
Khoai tây vừa là cây lơng thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dỡng cao. Thành phần dinh dỡng chủ yếu trong củ khoai tây là tinh bột (16%)
và đờng (1.5%), ngoài ra còn có chất xơ ( 0.5 - 1.5%), protein (1.5 - 2.1%),
vitamin (20mg%), carotene (0.09%)... Hàm lợng protein của khoai tây cao
nhất (khoảng 2.1% trong tổng số hàm lợng tơi) trong các loại cây lấy rễ và củ.
Protein trong khoai tây thờng có chất lợng cao, hợp chất amino acid của loại
thực phẩm này phù hợp với nhu cầu của con ngời. Chúng cũng giàu vitamin C
- một củ khoai tây cỡ vừa có khoảng hơn một nửa lợng vitamin mà con ngời
cần trong một ngày. Theo Burton (1974) sử dụng 100g khoai tây có thể đảm
bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% nhu cầu năng lợng, 10% nhu cầu Fe, 10%
nhu cầu vita min B1, 20 - 50% nhu cầu vitamin C của ngời trong 1 ngày. Chính
vì vậy khoai tây vừa là cây lơng thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dỡng cao. Ngoài vai trò làm lơng thực, thực phẩm và thức ăn gia súc, khoai tây
còn là nguồn cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến.
2.1.3.2. Giá trị kinh tế
Theo FAO, sản lợng khoai tây thế giới hàng năm đạt khoảng 300 triệu
tấn chiếm 60 - 70% tổng sản lợng, lúa chiếm 50% tổng sản lợng cây củ
(FAO, 1995).
Về diện tích trồng khoai tây, đứng đầu là Cộng hoà Liên bang Nga
(3,5 triệu ha), Ba Lan (1,5 triệu ha), ấn Độ (1 triệu ha). Các quốc gia còn lại
đều có diện tích trồng khoai tây dới 1 triệu ha (FAO, 1996). Về sản lợng, đứng
đầu là Trung Quốc (trên 40 triệu tấn/năm), tiếp đến là Ba Lan (24 triệu
tấn/năm), Hoa Kỳ (20 triệu tấn/năm) và ấn Độ (17 triệu tấn/năm) (FAO,
1996) [21]. Hiện nay ở nhiều nớc nhiệt đới, khoai tây cha đợc coi là cây lơng
thực vì có nhiều khó khăn trong sản xuất và bảo quản. Vì vậy mà sản lợng
khoai tây của Châu á chỉ chiếm 7,5%, Châu Phi 0,7%, Châu Mỹ La tinh
2,6% tổng sản lợng khoai tây của thế giới. Sản lợng khoai tây của các nớc
công nghiệp hóa chiếm 70% tổng sản lợng khoai tây của thế giới (Tạ Thu Cúc,
2000).
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

7

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Theo Beukema, Varder Zaag (1979) thì cứ 1kg khoai tây cho 480 kalo.
Nếu sử dụng 100g khoai tây thì có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu về protein,
10% nhu cầu về vitamin C mỗi ngày. Tinh bột của khoai tây còn đợc dùng
trong công nghiệp dệt, sợi, gỗ ép và giấy. ở một số nớc phát triển, ngời ta còn
dùng khoai tây làm thức ăn gia súc, đặc biệt là trong công nghệ tạo acid hữu
cơ (lactic, citric), các dung môi hữu cơ (ethanol, butanol, axeton) (Grion,
1986, dẫn theo Nguyễn Quang Thạch, 1993) [10]. Gần đây ngời ta còn phát
hiện ra chất PPO (Poly phenol oxydase) trong vỏ khoai tây có tác dụng chống
bám dính làm cho vi khuẩn không xâm nhập vào trong tế bào gây bệnh. PPO
đợc coi là thứ vũ khí chống lại vi khuẩn trong đó có cả HIV (theo Thừa Thiên
Huế năm 2000). Khoai tây còn là cây cải tạo đất rất tốt trong các hệ thống
luân canh và đợc dùng làm thuốc. Thân lá khoai tây bào chế ra thuốc giảm
đau, an thần, chữa bệnh thần kinh. So sánh về năng suất chất khô trên một đơn
vị diện tích trồng trọt thì khoai tây cho năng suất cao hơn lúa mỳ 3,04 lần; lúa
nớc 1,33 lần và ngô 2,2 lần. Ngoài tiêu thụ trong nớc, khoai tây còn là mặt
hàng có giá trị xuất khẩu.
2.1.4. Tình hình nghiên cứu khoai tây trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.4.1. Tình hình nghiên cứu khoai tây trên thế giới
Thấy đợc tầm quan trọng của khoai tây với nền sản xuất lơng thực và

đời sống của con ngời, các nhà khoa học trên thế giới đã coi chúng là một
trong những đối tợng nghiên cứu chính. Từ những năm 90 của thế kỷ 20,
khoai tây là đối tợng ứng dụng công nghệ sinh học đứng thứ 2 sau cây thuốc
lá. Với nỗ lực không ngừng để tạo ra giống mới mang đặc tính chống chịu,
thích nghi cao với điều kiện ngoại cảnh, các giống mới kháng bệnh (do nấm,
virus gây ra), các giống kháng côn trùng....đồng thời không ngừng phục tráng,
cải lơng các giống khoai tây truyền thống, ngành sản xuất khoai tây đã thực sự
phát triển và bùng nổ khắp thế giới. Các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu,
ứng dụng hàng loạt các phơng pháp, kỹ thuật công nghệ hiện đại trên nhiều
đối tợng khoai tây nh : các kỹ thuật chọn lọc bằng chỉ thị phân tử, nuôi cấy
đỉnh sinh trởng, chuyển gen kháng virus, kháng các bệnh do vi khuẩn nấm
gây ra, dung hợp tế bào trần, nuôi cấy bao phấn... Trên thế giới, xu hớng rất đợc quan tâm là tạo đợc các cây khoai tây chuyển gen mang các tính trạng
mong muốn. Diện tích khoai tây chuyển gen không ngừng tăng lên, đứng đầu
là Mỹ. Cây khoai tây đợc chuyển các gen kháng virus X, Y..., gen kháng bệnh
do nấm gây ra, chuyển các gen kháng sâu, côn trùng... các gen làm tăng sản lợng protein, tinh bột..., đem lại hiệu quả kinh tế, tiềm năng xuất khẩu lớn trên
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

8

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

thế giới. Sự tổ hợp các nghiên cứu, các kỹ thuật tiên tiến đã không ngừng tạo
ra các giống khoai tây mới sạch bệnh, chất lợng cao, đồng thời tăng năng suất,

sản lợng khoai tây trên toàn thế giới.
Việc sử dụng củ nhỏ đã đợc quan tâm từ lâu vì nó cho hệ số nhân giống
cao. Gregory (1956) là ngời đầu tiên nghiên cứu về chất kích thích tạo củ
khoai tây kích thớc nhỏ bằng kỹ thuật in vitro. Tuy nhiên, việc sản xuất theo
các phơng pháp trên gặp một số khó khăn là thờng chỉ sản xuất đợc một vụ
trong năm và rất phụ thuộc vào nguồn cây in vitro.
Gần đây, hãng American Ag - Tec áp dụng công nghệ Quantum tuber
cho phép sản xuất hàng triệu củ nhỏ cho một năm, rút ngắn đợc thời gian tạo
củ nhỏ cho một năm, đặc biệt rút ngắn đợc thời gian tạo củ trong 40 - 50 ngày.
Theo ông Robert Britt, giám đốc công ty American Ag - Tec thì một công ty
có thể sản xuất đợc khoảng 10 - 20 triệu củ/năm. Điều này có nghĩa là chỉ cần
2 năm có thể nhân giống phổ biến cho diện tích khoai tây rộng lớn.
2.1.4.2. Tình hình nghiên cứu khoai tây ở Việt Nam
Bên cạnh những thành tựu và giá trị kinh tế của to lớn mà khoai tây mang
lại, có nhiều vấn đề phát sinh trong qua trình trồng và chăm sóc, đó là vấn đề
dịch bệnh, củ giống bị thoái hóa, năng suất thấp, kỹ thuật chăm sóc cha hoàn
thiện...Đây là những thách thức lớn của ngành nông nghiệp vì nó ảnh hởng lớn
tới chất lợng và sản lợng của cây trồng. Do đó nhiều công trình nghiên cứu
thực hiện nhằm mục đích tạo giống khoai tây sạch bệnh, ổn định cho sản lợng
cao, chất lợng tốt và đáp ứng nhu cầu giống cho bà con nông dân. Ngày nay,
những công trình nghiên cứu về khoai tây tập trung vào hoàn thiện kỹ thuật
canh tác, các vấn đề làm giảm năng suất khoai tây: dịch bệnh, chất lợng củ
giống....Việc nghiên cứu nhằm nâng cao chất lợng và sản lợng tạo củ giống
mini sạch bệnh trên khoai tây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô mới chỉ là bớc đầu
nghiên cứu. Có một số công trình nghiên cứu trên đối tợng khoai tây đã đợc
công bố.
Tác giả Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu cải lơng
giống khoai tây Arkersegen - một giống thích ứng với điều kiện nớc ta nhng
rất mẫn cảm với virus Y và nấm Phitoprola. Kết quả chọn lọc đợc giống mới
chống chịu PVY và mang các đặc tính mong muốn [9].

Tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh (2004) tiến hành nghiên cứu ảnh hởng của
một số nhân tố sử dụng trong nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh trởng của
cây khoai tây invitro bằng cách sử dụng các tác nhân: nhiệt độ thấp (6 oC) + đBáo cáo thực tập tốt nghiệp

9

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

ờng Saccaroza (5%) + đờng Glucoza (5%). Kết quả đều làm chậm khả năng
sinh trởng của cây khoai tây invitro của các giống nghiên cứu so với giống đối
chứng.
Các tác giả Dơng Tấn Nhựt, Phan Hoàng Anh, Trần Thị Ngọc Hơng, Phan
Xuân Hơng (2005) tập trung nghiên cứu sự hình thành củ khoai tây bi
(solanum tuberosum L) invitro trực tiếp từ đốt thân dới ảnh hởng của muối
nitrat và nồng độ đờng sucroze trong môi trờng. Kết quả nghiên cứu cho thấy:
hàm lợng nitrat và nồng độ đờng là hai yếu tố kích thích và tác động lên sự
hình thành củ khoai tây mini in vitro.
Tác giả Nguyễn Quang Thạch đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ khí
canh trong nhân giống khoai tây ở điều kiện chính và trái vụ. Nghiên cứu này
nhằm giải quyết vấn đề thiếu và thoái hóa giống khoai tây tại Việt Nam, đồng
thời giảm giá thành và cho tỉ lệ sống cao nhất của củ giống.
ảnh hởng của bình nuôi, thế hệ cây và thiosulphat bạc đến sinh tr ởng, hệ
số nhân và chất lợng khoai tây in vitro là nghiên cứu đã đợc tiến hành của

các tác giả Nguyễn Thị Hơng, Nguyễn Thị Sơn, Trần Thị Thanh Minh
(2005) [5].
Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đính (2006) về ảnh hởng của việc
phun bổ sung kali lên lá vào các giai đoạn sinh trởng khác nhau đến một số
chỉ tiêu sinh lý sinh hoá của giống khoai tây KT3 đã góp phần nâng cao

năng suất, phẩm chất của củ khoai tây
Các hớng nghiên cứu khác nhau đã và đang đợc tiến hành trên khoai
tây đặt cơ sở khoa học cho phép có thể thực hiện đợc các nghiên cứu nâng
cao chất lợng khoai tây giống, nhằm tạo giống khoai tây cho sản l ợng cao,
sạch bệnh.
2.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào (NCMTB) thực vật là phơng pháp sử dụng các điều
kiện nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào thực vật trong điều kiện in
vitro. Mục đích chung của NCMTB thực vật là sử dụng các điều kiện nh
ánh sáng, nhiệt độ, thành phần dinh dỡng, chất điều hoà sinh trởng... để
điều khiển quá trình sinh trởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo
mục tiêu đặt ra [14].
2.2.1. Vài nét về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

10

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm

Khoa Công nghệ Sinh học

NCMTB thực vật đã hình thành từ vài thập kỷ trớc mà cơ sở của nó đợc
bắt đầu từ những thí nghệm đầu tiên của Harberlandt (1898 - 1902) khi ông đa
các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm mọi cơ thể sinh
vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế bào đã
phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là
trứng sau khi thụ tinh và là đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ
thể [11]. Và Harberlandt là ngời đầu tiên đề xớng ra tính toàn năng của tế bào
(totipotency), nghĩa là bất kỳ một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có
khả năng tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện
thuận lợi. Tiếc thay, các thí nghiệm của ông đã không thành công
Năm 1922, Kotte và Robbins lập lại thí nghiệm của Harberlandt với đỉnh
sinh
trởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo. Trong môi trờng lỏng gồm muối
khoáng và glucose, đầu rễ phát triển mạnh tạo hệ rễ gồm cả rễ phụ. Nhng chỉ
sau một thời gian rễ phát triển chậm dần rồi ngừng hẳn mặc dù đã thay đổi
môi trờng [20]. Năm 1934, White đã duy trì đợc đỉnh sinh trởng của đầu rễ
cà chua (Lycopersicon esculentum) trong một thời gian khá dài trên môi trờng lỏng có chứa đờng, một số muối khoáng và dịch chiết nấm men. Sau đó
ít lâu, White chứng minh là có thể thay nớc chiết nấm men bằng hỗn hợp ba
loại vitamin nhóm B: Thiamin (B 1), Piridoxin (B6) và Nicotinic axit. Cùng
thời gian đó, Went và Thiamin tìm ra và tinh chế đợc chất kích thích sinh trởng đầu tiên là IAA. Năm 1939, Gautheret và Nebecout đã duy trì đợc sự
sinh trởng của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trong một thời gian dài trên
môi trờng thạch rắn [22]. Năm 1941, Overbeck chứng minh tác dụng của nớc
dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà (Datura). Trong thời gian này, nhiều chất
điều hoà sinh trởng thuộc nhóm auxin đã đợc tổng hợp thành công nh napthyl acetic axit (NAA) và chất 2,4 - Dichlorphenoxy acetic axit (2,4 - D)
[14].
Trong khoảng thời gian 1954 - 1959, kỹ thuật NCMTB đơn đã đợc phát
triển và hoàn thiện dần. Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thuỷ phân của

tinh dịch cá bẹ có tác dụng kích thích sinh trởng rất rõ rệt trong nuôi cấy
những mảnh mô thân cây thuốc lá. Ông cho rằng chất có hoạt tính là sản phẩm
phân giải, và một năm sau, chất đó đợc tổng hợp thành công, đợc Skoog gọi là
kinetin do có tác dụng kích thích sự phân bào. Việc phát hiện ra NAA, 2,4-D,
kinetin cùng với các loại vitamin và nớc dừa là những bớc tiến có ý nghĩa
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

11

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

trong giai đoạn thứ hai của NCMTB thực vật. Nickell (1956) đã duy trì đợc sự
sinh trởng liên tục huyền phù cây đậu trắng (Phaseolus vulgarisi). Melcher và
Beck đã nuôi các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ
sung chất dinh dỡng định kỳ. Khả năng nuôi cấy các tế bào thực vật và tái tạo
đợc cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới cho chọn dòng
đột biến, sản xuất các chất trao đổi thứ cấp [15]. Năm 1957, Skoog và Miller
đã chứng minh sự biệt hoá của rễ, chồi trong nghiên cứu nuôi cấy mô tuỷ
thuốc lá phụ thuộc nồng độ tơng đối của tỷ lệ auxin/cytokinin và từ đó đa ra
quan niệm điều khiển hoocmon trong quá trình hình thành cơ quan thực vật.
Trong giai đoạn mới từ năm 1960 trở lại đây, cùng với việc NCMTB đơn,
tế bào trần (protoplast), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn đợc phát triển
mạnh. Các kỹ thuật lai tế bào soma bằng dung hợp tế bào trần và các kỹ thuật

chuyển gen đợc phát triển và thu đợc những thành tựu đáng kể.
ở nớc ta, NCMTB phát triển từ những năm 1980 và đạt đợc những kết quả
khích lệ trong nhân giống in vitro các cây khoai tây, cây hoa Phong lan, Hồng,
Cúc...; một số cây công nghiệp nh Bạch đàn, Keo; cây dợc liệu nh Thông đỏ...
Đến nay, NCMTB thực vật trở thành một công cụ không thể thiếu của CNSH
hiện đại nhất là trong lĩnh vực ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, tạo giống
và nhân giống thực vật.
2.2.2. Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
NCMTB thực vật ngày càng đợc hoàn thiện với nhiều kỹ thuật. Tuỳ theo
mục đích và đối tợng thực vật mà sử dụng kỹ thuật NCMTB thực vật cho phù
hợp. Theo quan điểm hiện nay, NCMTB thực vật bao gồm sáu kỹ thuật sau :


Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời:

Phơng pháp này để nghiên cứu điều kiện sinh trởng đối với một bộ
phận hoặc một mô của cây in vitro, tạo thành mô sẹo phục vụ cho các
nghiên cứu cơ bản nh chọn dòng tế bào; đột biến xoma và ứng dụng phân
hoá tế bào, cơ quan.


Nuôi cấy mô phân sinh:

Đợc dùng trong các trờng hợp tạo những giống cây sạch bệnh và nhân
giống in vitro; tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicin và nghiên cứu quá
trình hình thành cơ quan.



Nuôi cấy mô sẹo

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

12

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Mô sẹo (Callus) là một khối các tế bào phát sinh vô tổ chức và có hình
dạng không nhất định. Nuôi cấy mô sẹo đợc ứng dụng trong nhân giống in
vitro ở những thực vật mà phơng pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trởng ít có
hiệu quả hoặc không thực hiện đợc; làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn;
thu nhận các chất có hoạt tính sinh học; nguyên liệu cho chọn tạo giống tế bào
đột biến, chọn dòng tế bào chịu mặn, chịu bệnh và nghiên cứu hình thành cơ
quan.


Nuôi cấy phôi:

Nuôi cấy phôi vô tính hiện nay đợc xem nh một kỹ thuật mang lại nhiều
hiệu quả. Phơng pháp này đợc dùng để phá trạng thái ngủ nghỉ của hạt, thử
sức sống của hạt, duy trì phôi yếu.

Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:

Phơng pháp này dùng để tạo dòng thuần, nghiên cứu sự biểu hiện của gen
lặn, chọn dòng đột biến.


Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Nhằm nghiên cứu cấu trúc tế bào, ảnh hởng của các điều kiện khác nhau
lên quá trình sinh trởng, phát triển và phân hoá tế bào. Phơng pháp này đợc sử
dụng trong việc chọn dòng tế bào.
2.2.3. Các yếu tố ảnh hởng tới nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sự sinh trởng và phát trởng của thực vật in vitro đợc quy định bởi một số
nhân tố phức tạp nh: các yếu tố trong môi trờng; những yếu tố vật lý và các
chất điều hoà sinh trởng, các vitamin...
2.2.3.1. ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy
Môi trờng NCMTB thực vật có nhiều loại khác nhau nh môi trờng MS
(Murashige và Skoog), môi trờng Knop, Gamborg Tuy nhiên, các môi trờng
đều bao gồm các thành phần chính sau:


Đờng

Đờng là thành phần quan trọng trong môi trờng dinh dỡng. Các mô tế
bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phơng thức dị dỡng mặc dù
ở nhiều trờng hợp chúng có thể sống bán dị dỡng nhờ điều kiện chiếu sáng
nhân tạo [1]. Đờng đợc sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lợng
trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi tr ờng [16]. Đờng thờng dùng là Sacarose hàm luợng 2% - 8% [20]. Nếu sử
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

13

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

dụng ở nồng độ cao hơn sẽ ức chế sự sinh trởng phát triển của mô nuôi cấy
[18]. Ngoài ra, các đờng khác nh Maltose, Glucose, Fructose... ít đợc sử
dụng.


Thành phần khoáng

Sau đờng, chất khoáng là nhóm dinh dỡng quan trọng không kém cho sự
phát triển in vitro. Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời
không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Cho đến nay rất
nhiều môi trờng dinh dỡng muối khoáng đợc tìm ra nh môi trờng MS
( Murashige và Skoog, 1962), môi trờng Knop (1974), Gamborg (1968)...
Trong đó, môi trờng MS đợc đánh giá là phù hợp nhất đối với đa số các loài
thực vật, nó chứa đủ thành phần khoáng đa lợng và vi lợng cho cây phát triển
[14]. Ngày nay, có nhiều môi trờng đợc cải tiến từ môi trờng MS.
Trong môi trờng nuôi cấy, nguồn Nitơ vô cơ đợc cung cấp dới dạng NO3và NH4+. Đồng thời có thể sử dụng các dạng nitơ hữu cơ nh axit amin. Một số
ít trờng hợp nitơ có thể đợc cung cấp dới dạng ure. Đối với photpho thì hai
dạng thờng dùng nhất là NaH3PO4.7H2O và KH2PO4. Nồng độ photpho trong
môi trờng biến thiên từ 0,15 - 4 mM. Nguyên tố Kali thờng đợc cung cấp cho

môi trờng nuôi cấy dới dạng muối KNO3, KCl, KH2PO4. Nồng độ K+ biến
thiên từ 2 - 2,5 mM. Canxi cũng đợc cung cấp dới dạng muối Ca(NO3).4H2O
hoặc CaCl2.6H2O hoặc CaCl2.2H2O. Nồng độ Ca2+ trong môi trờng từ 1 - 3,5
mM. Magiê đợc cung cấp dới dạng MgSO4.7H2O với nồng độ từ 0,5 - 3 mM.
Đối với các muối khoáng vi lợng nh Mn2+, Bo2+, Zn2+, Cu2+ đợc cung cấp với lợng nhỏ [11].


Nớc

Nớc là một thành phần quan trọng trong môi trờng nuôi cấy. Nó chiếm
95% trong môi trờng dinh dỡng. Nớc đợc sử dụng là nớc đợc trng cất hai
lần.


Agar

Agar là loại polysaccarit của tảo (chất dẫn xuất của Dong biển) đợc
thu nhận thành dạng viên nhỏ mà có thể đợc sử dụng nh là tác nhân làm
đông. ở 800C agar ngậm nớc chuyển sang dạng sol. Còn ở 40 0C agar ngậm
nớc chuyển sang trạng thái gel. Hàm lợng agar thờng đợc sử dụng là 0,6%
- 1%.
2.2.3.2. ảnh hởng của các yếu tố vật lý
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

14

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm

Khoa Công nghệ Sinh học

ánh sáng

ánh sáng có tác động mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy phụ thuộc vào chu kỳ, cờng độ,
thành phần quang phổ của ánh sáng [17]. Cờng độ ánh sáng thích hợp cho
nhiều loại mô trong giai đoạn tái sinh là 2000 - 3000 lux.


Nhiệt độ

Tuỳ thuộc vào loài thực vật mà nhiệt độ nuôi cấy là khác nhau nhng nhiệt
độ thích hợp là 25 20C. Nhiệt độ này có ảnh hởng tích cực tới quá trình sinh
trởng và phát triển của đa số các loài thực vật nuôi cấy. Trong một số trờng
hợp, nhiệt độ lạnh lại có ảnh hởng tốt hơn chẳng hạn xử lý bao phấn lúa ở 4 0C
thì hiệu suất tạo mô sẹo sẽ tăng [13]. Nhiệt độ cao còn ảnh hởng tới sinh trởng
của các mô nuôi cấy thông qua tác động lên cấu trúc của các chất điều hoà sinh trởng thực vật nh phân huỷ IAA và GA [20].



Độ pH

Độ pH ảnh hởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dỡng vào tế
bào. Giá trị pH thay đổi làm thay đổi chiều hớng và tốc độ của nhiều phản ứng
sinh hoá, quyết định hấp thụ cation và anion của tế bào, ảnh hởng đến áp suất

thẩm thấu của tế bào [12]. pH khoảng 5,5 - 6 là thích hợp với nhiều loại mô
nuôi cấy. Khi pH thấp sẽ hoạt hoá enzyme hydrolaza dẫn tới kìm hãm sự sinh
trởng và phát triển, đồng thời kích thích sự hoá già của tế bào [15].
2.2.3.3. ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởng và vitamin
Các chất điều hoà sinh trởng ở thực vật là những chất có bản chất hoá học
khác nhau nhng đều có tác dụng điều tiết quá trình sinh trởng, phát triển của
cây. Chúng bao gồm các phytohoocmon và các chất điều hoà sinh trởng tổng
hợp nhân tạo. Phytohoocmon là những hoocmon đợc tổng hợp trong thực vật
với liều lợng nhỏ ở các cơ quan và từ đó đợc vận chuyển tới các cơ quan khác.
Còn các chất điều hoà sinh trởng tổng hợp nhân tạo là các chất đợc tổng hợp
bằng con đờng hoá học, có hoạt tính sinh lý tơng tự nh các phytohoomon. Các
chất điều hoà sinh trởng có hai loại là chất kích thích sinh trởng và chất ức chế
sinh trởng. Trong nuôi cấy mô thờng dùng là chất kích thích sinh trởng nhân tạo
thuộc nhóm auxin và cytokinin.


ảnh hởng của auxin

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

15

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Auxin là hợp chất chứa nhân indol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro,
auxin có tác dụng kích thích sinh trởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trởng
của mẫu thông qua hoạt hoá sự phân chia và làm giãn tế bào, kích thích quá
trình tổng hợp và trao đổi chất, điều hoà sự phân chia rễ và chồi. Nồng độ
NAA thấp sẽ dẫn tới sự hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hình
thành mô sẹo. Tuy nhiên nếu quá cao sẽ ức chế sự phát triển của rễ. Các chất
thuộc nhóm auxin thờng dùng là IBA, NAA và 2,4-D.

ảnh hởng của Cytokinin



Cytokinin là chất điều hoà sinh trởng có tác dụng tăng sự phân chia tế
bào. Các cytokinin thờng gặp là BAP và kinetin. Trong đó kinetin là dẫn xuất
của bazơ nitơ adenin. BAP là cytokinin đợc tổng hợp nhân tạo. Chúng cũng có
tác dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào
phân sinh với sự phát triển chồi từ mô sẹo nuôi cấy. Nồng độ cytokinin thờng
đợc sử dụng là 0,5 - 2mg/l. Nếu nồng độ thấp hơn thì biểu hiện hiệu quả kích
thích kém, khả năng tạo chồi giảm. Ngợc lại, cytokinin ở nồng độ cao sẽ hoạt
hoá hình thành chồi bất định gây ra hiện tợng mọng nớc và kìm hãm quá trình
tạo rễ.
Trong nuôi cấy in vitro thì sự kết hợp giữa auxin và cytokinin có tác dụng
quyết định đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô nuôi cấy. Các tỷ lệ
auxin/cytokinin khác nhau sẽ có tác dụng không giống nhau đối với sự phân
hoá của mô nuôi cấy. Nếu tỷ lệ này cao thì thích hợp cho hình thành rễ, còn
thấp sẽ hình thành chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho
phát triển của mô sẹo.
Ngoài auxin và cytokinin còn có nhiều chất điều hoà sinh trởng khác nh
Giberellin, etylen, axit ascorbic. Giberellin có tác dụng kích thích kéo dài tế

bào nhất là thân và lá. Etylen và axit ascorbic là chất ức chế sinh trởng có tác dụng đối
với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật [11].


ảnh hởng của vitamin

Vitamin là chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng enzyme. Mặc dù
tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng
hợp đợc hầu hết các loại vitamin nhng thờng không đủ về số lợng do đó phải
bổ sung thêm vào môi trờng một số vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B nh
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

16

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6. Trong đó vitamin
B1 đợc coi là cần thiết nhất đối với sự sinh trởng và phát triển của tế bào thực
vật.
2.2.4. ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro
Qua lịch sử phát triển lâu dài, đến nay nuôi cấy mô tế bào thực vật có rất
nhiều ứng dụng thực tiễn. Trong đó, nhân giống in vitro đợc coi là phơng pháp
hữu hiệu nhất. Nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế

bào thực vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm. Với phơng pháp này
hoàn toàn có thể tạo ra một quần thể cây trồng đồng đều giữ nguyên đặc tính
của cây mẹ, có hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, không tốn diện tích
nhân giống. Hiện nay, đã có nhiều quy trình nhân giống in vitro của nhiều loài
thực vật. Nhìn chung, các quy trình gồm 5 giai đoạn [11], [18]:
Giai đoạn 1: Chọn mẫu
Lựa chọn đối tợng (có thể là thân, lá, củ) thích hợp để làm mẫu. Kết quả
của quy trình phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của mẫu. Quan trọng nhất vẫn
là đỉnh sinh trởng, chồi nách, sau đó là hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ... Mô chọn
để nuôi cấy thờng là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ đợc các
đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Cây đợc chọn để lấy mẫu thờng
là cây u việt, khoẻ, có giá trị kinh tế cao. Tuỳ mục đích nuôi cấy và đặc tính
của loài mà chọn mẫu phù hợp. Bên cạnh đó phải chú ý tới tuổi mẫu, thời gian
lấy mẫu, mùa vụ.
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
Mẫu phải đợc khử trùng trớc khi cấy vào môi trờng nuôi cấy. Việc khử
trùng mẫu trong điều kiện vô trùng sẽ làm giảm khả năng nhiễm bệnh của
mẫu nuôi cấy. Tuỳ theo sự tiếp xúc của mẫu với môi trờng mà lựa chọn hoá
chất, chế độ khử trùng cho phù hợp. Sau khi khử trùng, cấy mẫu vô trùng vào
môi trờng nhân tạo trong ống nghiệm hoặc trong bình nuôi. Các mẫu nếu
không bị nhiễm vi khuẩn, nấm hoặc virus sẽ đợc lu giữ trong phòng với nhiệt
độ, ánh sáng thích hợp, nếu là nuôi cấy mô sẹo thì đợc để trong tối. Sau một
thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào là mô
sẹo, hoặc cơ quan hoặc phôi vô tính có đặc điểm gần nh phôi hữu tính. Giai
đoạn này thờng kéo dài 2 - 12 tháng.


Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Thành phần và điều kiện môi trờng nuôi cấy phải đợc tối u hoá nhằm đạt

đợc mục đích nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

17

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

1 - 2 tháng tuỳ loài cây. Nhìn chung, giai đoạn 3 thờng đợc thực hiện trong 10
- 36 tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu.


Giai đoạn 4: Hình thành rễ

Khi đạt đến một kích thớc nhất định thì các chồi tái sinh đợc chuyển sang
môi trờng tạo rễ. Trong giai đoạn này, ngời ta thờng bổ sung vào môi trờng
nuôi cấy auxin có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Giai đoạn này thờng
diễn ra trong 2 - 8 tuần.


Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoạn cuối cùng của quy trình nhân giống in vitro. Cây con lấy

từ ống nghiệm ra phải đợc rửa sạch môi trờng bám vào rễ để tránh sự xâm
nhập của côn trùng và nấm mốc. Trong giai đoạn này, cần phải chăm sóc, bảo
vệ cây trớc những yếu tố bất lợi sau: Mất nớc nhanh làm cây bị héo, nhiễm vi
khuẩn và nấm, bị bệnh thối nhũn, cháy lá do nắng... Cần phải che phủ cây
bằng nilon, tới, phun sơng đảm bảo độ ẩm và làm mát. Giá thể trồng cây có
thể là đất, mùn ca và bọt biển. Giai đoạn này thờng đòi hỏi 4 - 16 tuần.
Với phơng pháp nhân giống in vitro, nuôi cấy mô thực vật đã góp một
phần rất lớn vào kết quả nghiên cứu của di truyền học, hoá sinh học, vi sinh
học, thể hiện tính u việt hơn so với phơng pháp nhân giống khác. Đồng thời đã
có những thành tựu mang ý nghĩa lớn không chỉ trong nghiên cứu mà còn có
ý nghĩa đối với cuộc sống của con ngời.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

18

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Phần 3: vật liệu - nội dung - phơng pháp nghiên
cứu
3.1. Vật liệu nghiên cứu
Củ các giống khoai tây nhập nội:
- Giống Diamant: là giống khoai tây nhập nội, chọn lọc từ tập đoàn

khoai tây Hà Lan, giống có thời gian sinh trởng 85 - 90 ngày. Chống chịu sâu
bệnh khá, kháng bệnh mốc sơng và virus. Ruột củ màu vàng, chất lợng khá,
đạt tiêu chuẩn chế biến. Năng suất từ 18 - 22 tấn/ha.
- Giống Solara: là giống của Đức,đợc công nhận cho sản xuất thử năm
2008. Giống có kích cỡ củ lớn, mắt củ nông, dạng củ đẹp, ruột củ màu vàng,
hàm lợng chất khô cao, từ 19,7 - 20,4%, không bị đổi màu sau khi rán, rất
thích hợp cho chế biến công nghiệp. Giống solara chống chịu khá với bệnh
mốc sơng, virus và héo xanh, tỷ lệ củ thơng phẩm cao từ 65 - 69%. Khả năng
thích ứng rộng, có tiềm năng cho năng suất cao. Năng suất biến động từ 20 33 tấn/ha.
Hai giống trên đợc trung tâm nghiên cứu cây có củ cung cấp, đảm bảo
có chất lợng tốt, không bị sâu bệnh.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nhân giống khoai tây củ siêu bi bằng phơng pháp in vitro.
+ Nghiên cứu ảnh hởng và thời gian của chất khử trùng HgCl 2 đến khả
năng sống của mầm.
+ ảnh hởng của nồng độ -NAA đến khả năng sinh trởng chồi của các
giống khoai tây.
+ ảnh hởng của nồng độ BAP tới khả năng tạo củ trong ống nghiệm.
3.3. Phơng pháp nghiên cứu
- Khử trùng mẫu: mầm từ củ có kích thớc đồng đều 1,5cm - 2,0cm hoặc
đoạn thân có kích thớc 2,0 - 3,0cm mang chồi nách đợc chọn làm vật liệu ban
đầu để khử trùng. Các mẫu đợc ngâm trong nớc xà phòng từ 10 - 15 phút, rửa
sạch nhiều lần dới vòi nớc chảy, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong thời gian
1 phút, tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 nồng độ từ 0,25% đến 1,50% trong
những khoảng thời gian khác nhau, sau đó rửa sạch nhiều lần bằng nớc cất vô
trùng. Mầm đợc khử trùng đợc cấy vào môi trờng MS cơ bản, bổ sung agar
1% và saccarose 2%. Đánh giá ảnh hởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử
trùng sau 1 tuần nuôi cấy.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

19

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

- Nhân chồi: Mẫu sạch thu đợc ở trên đợc cấy vào môi trờng MS cơ bản,
bổ sung agar 1%, saccarose 2% và -NAA riêng rẽ nồng độ từ 0,05mg/l đến
0,40mg/l. Các bình nuôi cấy đợc đặt trong phòng cấy với nhiệt độ 25oC 2oC ,
dới ánh sáng đèn huỳnh quang khoảng 3000 lux. Mỗi công thức 15 bình
(khoảng 100 cây) nhắc lại 3 lần. Đánh giá khả năng nhân chồi qua các khoảng
thời gian 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần nuôi cấy.
- Tạo củ: cây khoai tây invitro có chiều cao từ 4cm - 5cm với 5 lá - 6 lá
(sau khoảng 3 tuần) sẽ đợc sử dụng để tạo củ. Chất cảm ứng tạo củ là BAP ở
các nồng độ khác nhau 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 10,0; 10,5(mg/l). Sử dụng nền môi
trờng MS cơ bản (nh phần phụ lục), saccarose 2%, nớc dừa 15%. Các bình sau
khi bổ sung chất cảm ứng tạo củ đợc đặt trong buồng tối nhiệt độ 25 oC 2oC.
Các thí nghiệm nhắc lại 3 lần, mỗi công thức 15 bình (khoảng 100 cây).
Các thí nghiệm :
*) Thí nghiệm 1: ảnh hởng của thời gian chất khử trùng đến khả năng
sống của mầm không bị nhiễm (HgCl2 1%).
Thí nghiệm gồm 6 công thức:
+ Công thức 1: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 3 phút.
+ Công thức 2: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 4 phút.

+ Công thức 3: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 5 phút.
+ Công thức 4: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 6 phút.
+ Công thức 5: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 7 phút.
+ Công thức 6: cồn 70 trong 1 phút + HgCl2 1% trong 8 phút.

*) Thí nghiệm 2: ảnh hởng của nồng độ HgCl2 tới khả năng sống của
mầm không bị nhiễm.
Thí nghiệm gồm 5 công thức:
+ Công thức 1: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,25% HgCl2.
+ Công thức 2: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,50% HgCl2.
+ Công thức 3: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,75% HgCl2.
+ Công thức 4: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 1,00% HgCl2.
+ Công thức 5: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 1,50% HgCl2.
*) Thí nghiệm 3: ảnh hởng của khả năng nhân chồi qua các khoảng
thời gian 1 tuần - 2 tuần - 3 tuần
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

20

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

Thí nghiệm gồm 6 công thức:
+ Công thức đối chứng: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose.

+ Công thức 1: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,05 mg/l
- NAA.
+ Công thức 2: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,10 mg/l
- NAA.
+ Công thức 3: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,20 mg/l
- NAA.
+ Công thức 4: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,30 mg/l
- NAA.
+ Công thức 5: môi trờng MS + 1% agar + 2% saccarose + 0,40 mg/l
- NAA.
*) Thí nghiệm 4: ảnh hởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo củ
khoai tây siêu bi nuôi cấy trong ống nghiệm.
Thí nghiệm gồm 7 công thức:
+ Công thức đối chứng: môi trờng MS + 2% saccarose.
+ Công thức 1: môi trờng MS + 2% saccarose + 7,5 mg/l BAP.
+ Công thức 2: môi trờng MS + 2% saccarose + 8,0 mg/l BAP.
+ Công thức 3: môi trờng MS + 2% saccarose + 8,5 mg/l BAP.
+ Công thức 4: môi trờng MS + 2% saccarose + 9,0 mg/l BAP.
+ Công thức 5: môi trờng MS + 2% saccarose + 10,0 mg/l BAP.
+ Công thức 6: môi trờng MS + 2% saccarose + 10,5 mg/l BAP.
Mỗi công thức trong các thí nghiệm tiến hành với 15 bình, mỗi bình 5
mẫu, lặp lại 3 lần. Tiến hành theo dõi định kỳ 7 ngày 1 lần.
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đợc bố trí trên một giàn nuôi, các thí nghiệm đợc sắp xếp
ngẫu nhiên theo khoảng cách nhất định. Mỗi thí nghiệm đợc nhắc lại 3 lần,
mỗi lần nhắc gồm 15 bình.
3.4. Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/Tổng số mẫu cấy) x 100
Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100

Tỷ lệ tạo chồi (%) = (Số lõi củ tạo chồi/Tổng số lõi củ đa vào) x 100
- Lá/thân chính.
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

21

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

- Số chồi/cây.
- Chiều cao thân chính
- Thời gian xuất hiện củ.
- Số củ/cây.
3.5. Phơng pháp xử lý số liệu
Sử dụng phơng pháp thống kê sinh học để xử lý số liệu thí nghiệm
(IRRISTAT 4.0). Sử dụng phần mềm Exel để xử lý kết quả.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

22

Trơng Thị Phơng Chi

Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

PHầN 4: KếT QUả Và THảO LUậN
4.1. Kết quả nghiên cứu thời gian và nồng độ chất khử trùng
Trong kỹ thuật nuôi cấy mô, phơng pháp khử trùng là rất quan trọng, nó
quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Tuỳ theo sự tiếp
xúc của mẫu với môi trờng mà nó chứa nhiều hay ít mầm bệnh vi sinh vật nh
nấm, vi khuẩn Vì vậy cần phải có chế độ khử trùng hợp lý cho kết quả tốt
nhất. Phơng pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất là dùng các hoá chất có
khả năng tiêu diệt vi sinh vật nh: Canxi hypoclorit, Natri hypoclorit, Clorua
thuỷ ngân, nớc Javen, chất kháng sinh.... Hoá chất đợc sử dụng làm chất khử
trùng mẫu cần đảm bảo hai đặc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không
độc hoặc độc ở mức độ thấp với thực vật. Chế độ khử trùng tốt nhất cần đảm
bảo vô trùng, tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tỉ lệ mẫu sống cao, mẫu có khả năng phân
hoá sinh trởng và phát triển tốt. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ
thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các
kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy. Thông thờng ngời ta xử lý mô cấy bằng
cồn 70% trong vòng 30 giây sau đó mới xử lý diệt khuẩn.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành khử trùng mẫu các mầm
khoai tây khoẻ có kích thớc từ 1,5cm - 2,0cm bằng cồn 70% trong thời gian 1
phút, sau đó xử lý dung dịch HgCl 2 1%, trong các khoảng thời gian 3 phút đến
8 phút, tráng lại mầm bằng nớc cất vô trùng. Mầm đã khử trùng đợc cấy vào
môi trờng MS cơ bản, bổ sung agar 1% và saccarose 2%. Sau 1 tuần nuôi cấy,
chúng tôi đã thu đợc bảng kết quả sau:

Bảng 4.1. ảnh hởng của thời gian khử trùng đến khả năng sống của

mầm không bị nhiễm.
Thời gian khử trùng của
Tỷ lệ sống của mầm không bị bệnh (%)
HgCl2
(sau một tuần)
(phút)
Solara
Diamant
Báo cáo thực tập tốt nghiệp

23

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm
3
4
5
6
7
8


45,3
51,6
69,1
81,6
72,5
47,7

Khoa Công nghệ Sinh học
42,4
54,5
71,6
82,3
75,3
42,5

Kết quả trên đợc thể hiện ở hình 4.1

Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hởng của thời gian khử trùng đến khả năng
sống của mầm không bị nhiễm.

Kết quả cho thấy, thời gian khử trùng cho các giống khoai tây trong nuôi
cấy in vitro bằng HgCl2 1% khác nhau thì cho ra tỷ lệ sống của mầm không bị
bệnh khác biệt nhau rõ rệt.
Khi khử trùng mẫu ở công thức 1 (cồn 70 o trong 1 phút và HgCl2 1% trong
3 phút ) cho tỷ lệ sống của mầm không bị bệnh là thấp nhất: giống Solara là
45,3% và Diamant là 42,4%. Giữ nguyên thời gian khử trùng với cồn 70o trong
1 phút và tăng thời gian khử trùng với HgCl2 1% lên 6 phút (công thức 4) nuôi
cấy trên môi trờng MS cơ bản có bổ sung thêm agar 1% và saccarose 2% thì
thấy tỷ lệ sống của mầm không bị bệnh ở 2 giống đạt hiệu quả cao nhất:giống
Diamant là 82,3% và giống Solara là 81,6%.
Nh vậy, để thu đợc mầm
sống cao nhất đáp ứng điều kiện vô trùng trong nuôi cấy in vitro nên chọn khử
trùng mẫu bằng công thức 6 thời gian khử trùng với cồn 70 o trong 1 phút và

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

24

Trơng Thị Phơng Chi


Trờng Cao đẳng Nông Lâm



Khoa Công nghệ Sinh học

HgCl2 1% nuôi cấy trên môi trờng MS cơ bản có bổ sung agar 1% và
saccarose 2%.
Vỡ vy, cỏc ging khoai tõy c la chn kh trựng bng cồn 70o trong 1
phút và HgCl2 1% trong thi gian 6 phỳt cỏc thớ nghim tip theo.
Sau khi xỏc nh thi gian kh trựng mm cỏc ging khoai tõy thớch
hp trong khong thi gian 6 phỳt vi nng HgCl 2 1% và cồn 70o trong 1
phút, tụi tin hnh nghiờn cu s nh hng ca nng HgCl 2 cỏc nng
: 0,25%, 0,50%, 0,75%, 1,00%, 1,25%, 1,50% n hiu qu kh trựng
trong thi gian 6 phỳt. Kt qu c thng kờ bng thí nghiệm sau:

Bảng 4.2. ảnh hởng của nồng độ HgCl2 tới khả năng sống của mầm
không bị nhiễm
Nồng độ HgCl2
(%)
0,25
0,50
0,75

Tỷ lệ sống của mầm không bị nhiễm(%) sau 1

tuần
Solara
Diamant
5,00
4,25
10,83
11,25
34,81
33,62

1,00
1,50

81,33
40,09

83,18
36,27

Kết quả trên đợc thể hiện ở hình 4.2

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

25

Trơng Thị Phơng Chi