Ứng dụng chỉ thị phân tử Mas trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------------o0o -----------

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Đề tài

Chuyên ngành :

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60420114

Hƣớng dẫn
Học viên:

: TS. Lƣu Thị Ngọc Huyền
Phạm Thị Minh Hiền

Hà Nội – 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

1

/>

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa (Oryza sativa L.) là một cây lương thực quan trọng ở Việt Nam, đồng thời
cũng là nguồn thức ăn quan trọng nhất cho một nửa dân số thế giới. Việt Nam là nước
xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 trên thế giới sau Thái Lan. Lúa gạo là nguồn thu ngoại
tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Việt Nam và cũng là nguồn thức ăn chính
của 86 triệu dân số trong nước. Đồng bằng Sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long
có sản lượng gạo lần lượt là 17% và 50. Do vậy, vấn đề lương thực được đặt ra như
một mối đe dọa đến sự an ninh và ổn định của thế giới nói chung và nước ta nói riêng
trong tương lai. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu dân số thế giới
tiếp tục tăng trong vòng 20 năm tới thì sản lượng lúa gạo phải tăng 80% mới đáp ứng
đủ nhu cầu. Vì thế, năng suất lúa luôn là điều quan tâm hàng đầu.
Trong thực tế, việc trồng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, dịch bệnh như đạo ôn,
bạc lá, rầu nâu… Theo ước tính thì sản lượng lúa hiện nay chỉ bằng 53,6% sản lượng
có khả năng đạt được nếu không bị dịch bệnh.
Rầy nâu (Nilaparvata Lugens Stal) là một trong số các côn trùng gây hại trên lúa
làm giảm nghiêm trọng sản lượng lúa trồng ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới,
nhất là các nước nhiệt đới. Từ những năm 70 của thế kỷ XX, rầy nâu đã nổi lên như
một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở châu Á [14]. Những thiệt hại do rầy nâu
gây ra hàng năm làm giảm khoảng 10% sản lượng lúa, đôi khi tới 30% hoặc hơn nữa
tại vùng dịch [1], có khi “cháy rầy” làm mất trắng như ở Bắc Bộ năm 1986-1987,
1992-1993, năm 2000 hơn 2000 ha lúa bị nhiễm rầy. Ngoài tác hại trực tiếp rầy nâu
còn là môi giới truyền nhiễm bệnh siêu vi trùng cho lúa như bệnh vàng lùn và xoắn lá
[14].
Cho đến nay, biện pháp chủ yếu để ngăn chặn dịch rầy nâu là sử dụng thuốc
hoá học và kết hợp sử dụng giống kháng. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan các loại
thuốc trừ sâu hay sử dụng thuốc trừ sâu không đúng liều còn là nguyên nhân gây
bùng phát của loại côn trùng này như kết quả của sự thích nghi có chọn lọc [20].
Sự thay đổi độc tính của các quần thể rầy nâu diễn ra thường xuyên để thích
nghi với ký chủ mới, hoặc tạo ra các dạng “biotype mới” do sức ép chọn lọc từ việc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

2

/>

độc canh một giống lúa trồng. Sử dụng giống lúa kháng là biện pháp ưu việt, một mặt
giảm chi phí phòng trừ, hạn chế dùng thuốc hoá học gây ô nhiễm môi trường, mặt
khác góp phần ổn định môi trường sinh thái.
Trong công tác chọn giống lúa kháng rầy nâu thì việc sử dụng chỉ thị phân tử
liên kết với các gen kháng rầy nâu được coi là hiệu quả và ưu việt. Các phương pháp
chọn giống truyền thống thông thường để chọn thành công một giống lúa mới ít nhất
phải mất từ 4 - 5 năm. Hơn nữa, quá trình chọn lọc gặp nhiều khó khăn, tốn kém về
sức người, sức của. Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS - Marker
Assisted Seletion) sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn vừa
nâng cao hiệu quả chọn lọc, vừa rút ngắn thời gian chọn giống. Đến nay đã có hơn
10.000 chỉ thị phân tử SSR ở lúa được phát hiện và thiết kế, các nghiên cứu về tìm chỉ
thị phân tử liên kết với gen kháng rầy nâu đã được tiến hành ở một số phòng thí
nghiệm trên thế giới.
2. Mục tiêu của đề tài
Sử dụng công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử để tạo 1-2 dòng lúa thuần ưu việt
kháng ổn định với quần thể rầy nâu cho Đồng bằng sông Hồng
3. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài:
- Từ năm 2010 đến năm 2013
- Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Bảo vệ Thực vật
4. Ý nghĩa của đề tài:
Trong đề tài này đã qui tụ được 2 gen kháng rầy nâu vào 1 giống lúa, có sử
dụng chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng. Phối hợp với chọn giống truyền
thống đã chọn tạo dòng lúa kháng rầy nâu KR1-1. Điểm kháng rầy nâu trong nhà lưới
1-3 với quần thể rầy nâu của ĐBSH . Có thời gian sinh trưởng vụ mùa 105-112 ngày,
năng suất trung bình là 59-60tạ/ha.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

3

/>

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. RẦY NÂU VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG RẦY NÂU Ở LÚA
1.1. Đặc tính sinh học của rầy nâu
Rầy nâu (brown planthopper) là một loại côn trùng có tên khoa học là
Nilaparvata lugens Stal. Đây là loài côn trùng có vòng đời tương đối ngắn và khả
năng sinh sản của chúng tương đối cao, dễ phát triển thành các quần thể sinh học mới.
Rầy nâu gây hại trực tiếp bằng cách hút nhựa cây, dẫn đến cháy rầy. Ngoài ra rầy nâu
còn gây hại gián tiếp thông qua việc truyền các bệnh virút cho cây như bệnh vàng lùn
và lùn xoăn lá (Hồ Văn Chiến và cs, 2000) [29]. Loại côn trùng này đã làm giảm đáng
kể sản lượng lúa trên thế giới. Nạn dịch rầy nâu được coi là loại dịch côn trùng quan
trọng nhất trên cây lúa ở Malaysia sau sự bùng nổ và lan rộng của dịch rầy nâu năm
1977. Ngoài ra, dịch rầy còn phá hại nghiêm trọng mùa màng tại nhiều nước trồng lúa
khác như Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Bangladesh, Srilanka, Thái Lan v.v... Tại
Việt Nam, những thiệt hại do rầy nâu gây ra hàng năm làm mất khoảng 10% sản
lượng lúa, đôi khi tới 30% hoặc hơn nữa.
Rầy nâu không phải là đối tượng gây hại chính trên cây lúa, mật số rầy nâu luôn
bị khống chế bởi các loài thiên địch, ký sinh và ít khi xảy ra hiện tượng bộc phát trên
diện rộng. Nhưng kể từ cuộc cách mạng "xanh" cách mạng về giống lúa, các giống
lúa ngắn ngày được lai tạo để đáp ứng nhu cầu thâm canh tăng vụ, giải quyết nhu cầu
lương thực cho con người. Do thâm canh tăng vụ, bón nhiều phân hoá học, đặc biệt là
phân đạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho sâu bệnh phát sinh gây hại. Việc phòng trừ
sâu hại, đặc biệt là sâu ăn lá ở giai đoạn đầu của cây lúa (0 - 40 ngày sau sạ) đã giết
chết các loài thiên địch, ký sinh và rầy nâu đã trở thành đối tượng gây hại chính trên

cây lúa. Trong những thập niên gần đây, ở nước ta, rầy nâu đã bộc phát vào những
năm 1980, 1990.
Ikeda và Vaughan (2006) cho rằng rầy nâu hiện nay có 4 biotype: Biotype 1phân
bố rộng ở Ðông Á và Ðông Nam Á; Biotype 2 có nguồn gốc ở Philipine phát sinh sau
khi sử dụng rộng rãi các giống có gen Bph 1; Biotype 3 phát sinh tại các phòng thí
nghiệm ở Nhật Bản và Philipine, Biotype 4 chưa thấy ở vùng Nam Á. Theo công bố
mới đây của Jena và cs (2006) [58] tại IRRI đã phát hiện ra gen kháng rầy Bph18 trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

4

/>

giống lúa hoang Oryza australiensis. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, quần thể rầy
nâu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có thể là sự pha trộn giữa hai loại biotype 2 và 3.
1.1.1. Phân bố và ký chủ
Rầy nâu có mặt trên khắp các nước trồng lúa. Dịch rầy bùng phát mạnh từ năm
1977 đến nay gây thiệt hại trầm trọng tại Philippin, Thái Lan, Indonesia, Ấn Độ, Mã
Lai, Đài Loan, Trung Quốc, Srilanka và Việt Nam.
Ngoài cây lúa, rầy nâu còn tác hại trên các cây trồng khác ngô, lúa mì, lúa
mạch, kê, cỏ gấu, cỏ lồng vực.
1.1.2. Đặc điểm sinh học của rầy nâu
 Thành trùng
Có 2 dạng cánh dài và cánh ngắn.
Dạng cánh dài: con cái dài 4,5-5,0 mm, bụng màu nâu vàng, đỉnh đầu nhô ra phía
trước. Cánh trong suốt, giữa cạnh sau của mỗi cánh có một đốm đen, khi hai cánh này
xếp lại hai đốm chồng lên nhau tạo thành một đốm đen to trên lưng. Mắt kép màu nâu
nhạt, mắt đơn màu nâu đỏ. Gốc râu có hai đốt phình to, con đực dài 3,6-4,0 mm, màu
nâu đậm bé hơn con cái, cuối bụng dạng loa kèn.

Dạng cánh ngắn: con cái dài 3,5-4 mm, cánh trước kéo dài đến đốt thứ sáu. Con đực
dài 2,0-2,5 mm, mình nhỏ màu đen nâu, cánh trước kéo dài tới 2/3 chiều dài bụng.

(b)

(a)

(c)

(d)

Hình 1.1. Các giai đoạn sinh trưởng của rầy nâu: (a) trứng, (b) ấu trùng, (c) rầy cánh
dài, (d) rầy cánh ngắn
(Nguồn: www.khuyennongvn.gov.vn/anh/vllxl.pdf)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

5

/>

 Ấu trùng
Có 5 tuổi qua 4 lần lột xác, ấu trùng mới nở còn gọi là rầy cám, kích thước lớn dần
từ 0,5-4mm, màu sắc thay đổi từ trắng ngà đến vàng nâu, bụng có màu trắng sữa,
mầm cánh kéo dài đến đốt bụng thứ 4.
 Trứng
Hình bầu dục dài hơi cong, ổ trứng có hình nảy chuối, nằm trong nhu mô bẹ lá.
 Đặc điểm sinh lý, sinh thái
Rầy cái đẻ từ 300-715 trứng trong suốt một chu kỳ sống. Trứng được đẻ thành
từng đám gồm từ 4-10 trứng. Trứng nở sau 21 ngày ở nhiệt độ 20oC và sau 18 ngày ở
30oC. Trứng có thể ngủ nghỉ ở nhiệt độ 10-30oC. Rầy cái cánh dài có thể sống lâu hơn

rầy đực ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Rầy trưởng thành thường sống 10-20
ngày ở mùa hè và 30-50 ngày ở mùa thu vì thế rầy nâu thường phát triển ở vụ khô
hơn là vụ mưa.
Rầy có thể phổ biến ở vùng lúa nước tưới tiêu và lúa nước trời trong suốt chu kỳ
sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Thường có 3 lứa rầy trong một vụ lúa ngắn
ngày (100-110 ngày). Ở Đồng Bằng sông Cửu Long mỗi năm có từ 10-12 lứa rầy
nâu, cây lúa bị hại nặng vào tháng 1, 2 và tháng 6, 7, 8 dương lịch.
Trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, rầy nâu sống quanh năm và biến động mật số tuỳ
vào giống lúa, hệ thiên địch và điều kiện môi trường. Sau khi lúa gặt xong rầy nâu di
chuyển lên cỏ dại nhưng không sống tiềm sinh ở đó. Tuy nhiên chúng chỉ qua đông ở
dạng trứng và rầy non tuổi 5 trong vùng ôn đới như Nhật Bản. Sau khi lúa mới sạ hay
cấy, rầy nâu di chuyển từ cỏ dại sang ruộng lúa. Như vậy, sự xuất hiện theo mùa xảy
ra ở vùng có giai đoạn hưu miên và hoạt động quanh năm ở nơi không có miên kỳ
nhưng phát triển mạnh vào mùa khô từ tháng 9-10 và gối lứa liên tục.
Trong điều kiện dẫn thuỷ tốt, trồng lúa liên tục, thời vụ lai rai kéo dài, gieo sạ dày
với giống lúa nhiễm rầy lại bón nhiều phân đạm, phun thuốc trừ sâu bừa bãi thì rầy
nâu sẽ bùng phát mạnh do có tiểu khí hậu phù hợp ẩm độ cao, nhiệt độ tối hảo và
không khí êm mát.
 Tập tính sinh sống và qui luật phát sinh gây hại
Rầy trưởng thành thường tập trung thành từng đám ở trên thân cây lúa phía dưới
khóm để hút nhựa. Khi bị khua động thì lẩn trốn bằng cách bò ngang, nhảy sang cây
khác hoặc nhảy xuống nước hay bay xa đến chỗ khác. Ban ngày trưởng thành ít hoạt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

6

/>

động ở trên lá lúa, chiều tối bò lên phía trên thân lúa hoặc lá lúa. Khi lúa ở thời kỳ
chín phần dưới cây lúa đã cứng khô nên chúng tập trung phía trên cây lúa hoặc gần

chỗ non mềm của cuống bông để hút nhựa. Rầy trưởng thành có xu tính ánh sáng
mạnh (trừ rầy trưởng thành dạng cánh ngắn). Do đó, vào đêm tối trời, lặng gió, trời
bức chúng bay vào đèn nhiều nhất là khoảng 20-23 giờ.
Tỷ lệ rầy cái và đực biến động và phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và
trạng thái của cây lúa. Thời kỳ lúa đẻ nhánh-ngậm sữa, lúc dảnh lúa còn non mềm thì
tỷ lệ rầy cái 70-80%, khi thân lúa đã cứng (lúc lúa chín) thì tỷ lệ rầy cái và rầy đực
tương đương.
Sự xuất hiện rầy cánh dài và cánh ngắn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, ẩm
độ và dinh dưỡng. Nhiệt độ thấp, ẩm độ cao, thức ăn phong phú thì xuất hiện dạng
cánh ngắn nhiều. Rầy cánh ngắn có thời gian sống dài, tỷ lệ đực/cái cao, số lượng
trứng cao hơn loại cánh dài. Vì thế khi rầy cánh ngắn xuất hiện nhiều thì hiện tượng
“cháy rầy” dễ xảy ra.
Quá trình phát sinh của rầy như sau: đầu vụ dạng cánh dài di cư từ lúa chét, cỏ
dại, mạ bay vào ruộng lúa, đại đa số chúng là dạng cánh dài. Gặp lúa đẻ nhánh chúng
sinh ra rầy non mà đa số sau này hình thành rầy cánh ngắn. Sự thay đổi tỷ lệ hai loại
hình trong quá trình phát triển của cây lúa như sau: đầu vụ 90-100% cánh dài, bắt đầu
đẻ rộ 15-20% cánh ngắn, ngậm sữa 70-80% cánh ngắn và tới khi lúa chín tỷ lệ rầy
cánh ngắn chỉ còn 20-25%.
Thời gian phát dục các giai đoạn của rầy nâu biến động phụ thuộc vào các yếu
tố ngoại cảnh. Rầy nâu có vòng đời ngắn trung bình từ 20-30 ngày. Trong vụ xuân
vòng đời là 25-30 ngày, trong vụ mùa vòng đời là 20-25 ngày. Rầy trưởng thành có
thể sống từ 20-50 ngày. Trung bình thời gian phát dục các giai đoạn của rầy nâu biến
động như sau: trứng 6-8 ngày, rầy non từ 12-14 ngày (mỗi tuổi 2-3 ngày).
Rầy nâu phát sinh, gây hại đầu tiên thành từng vạt giữa ruộng, sau đó lan dần
ra quanh ruộng. Những ruộng trũng, đất tốt rầy thường phát sinh mạnh. Khi mật độ
rầy cao, trong ruộng thường xuất hiện “váng rầy” là váng mỏng lan toả trong ruộng.
Do rầy tiết ra chất đường mật nên nấm muội đen phát triển và bám vào thân lúa. Qui
luật phát sinh và mức độ gây hại liên quan đến nhiều yếu tố sinh cảnh. Thường khi
nhiệt độ không khí cao, ẩm độ cao, lượng mưa nhiều trong một thời gian, sau đó trời

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

7

/>

hửng nắng thì rầy nâu dễ phát sinh thành dịch. Thông thường nhiệt độ từ 20-30oC và
ẩm độ từ 80-85% là điều kiện thích hợp cho rầy nâu sinh sống và phát triển.

Hình 1.2. Vòng đời rầy nâu
(Nguồn: www.khuyennongvn.gov.vn/anh/vllxl.pdf)
1.1.3. Tình hình dịch rầy nâu và mức độ gây hại
a. Tình hình dịch rầy nâu hại lúa trong những năm gần đây tại Việt nam:
- Ở các tỉnh phía Bắc: dịch rầy nâu bùng phát trong các năm: 1981-1984, 19861987, 1992-1993. Đặc biệt năm 2000: hơn 200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy, 66 nghìn
hecta bị nhiễm nặng
- Ở các tỉnh phía Nam: dịch rầy nâu xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại
hơn. Dịch rầy xảy ra vào các năm 1977-1978, 1990-1991, 1996-1997, đặc biệt là năm
1977-1978 có tới 1 triệu hecta lúa bị nhiễm rầy; 1999-2000: 340 nghìn hecta, trong đó
có 190 nghìn hecta bị nhiễm nặng.
- Đặc biệt ở đồng bằng Sông Cửu Long, vụ hè thu 1998: dịch rầy nâu bùng phát
trên diện tích 150 nghìn hecta lúa (Bộ NN và PTNT, 1998) [1]; vụ đông xuân 20052006 hơn 200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy; vụ hè thu 2006 gần 100 nghìn hecta; vụ
thu đông 2006: gần 150 nghìn hecta.
b. Mức độ gây hại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

8

/>

* Cháy rầy (hopper burn)

- Rầy trưởng thành và rầy non dùng miệng chích vào thân cây lúa để hút dịch
cây. Vị trí gây hại và đẻ trứng của rầy nâu còn là cửa ngỏ cho nấm và vi khuẩn xâm
nhập. Rầy nâu tiết mật từ việc chích hút nhựa cây còn làm nấm mốc dễ phát triển.
- Bị hại nhẹ các lá dưới có thể bị héo. Bị hại nặng chúng gây nên hiện tượng
"cháy rầy", cháy rầy xảy ra khi có mật độ rầy cao, rầy hút nhựa làm cây lúa bị héo
vàng rồi chết, năng suất có thể giảm 50% thậm chí có thể bị mất trắng. Thông thường
khi bị hại nặng chúng tạo nên các vết hại màu nâu đậm. Nếu bị rầy hại nặng thì phần
dưới thân cây lúa có màu nâu đen, do tổ chức dẫn nhựa cây bị rầy phá hoại nghiêm
trọng làm cho cây lúa bị khô héo và chết. Lúa ở thời kỳ làm đòng và trổ nếu bị rầy hại
nặng thì tác hại càng nghiêm trọng hơn. Rầy có thể hút nhựa ở cuống đòng non, đồng
thời rầy cái chích rách mô thân cây để đẻ trứng. Các vết thương cơ giới đó tạo điều
kiện cho nấm bệnh xâm nhập tạo điều kiện làm cho cây lúa bị thối nhũn, đỗ rạp, gây
nên hiện tượng bông lúa bị lép một nữa hoặc toàn bộ. Hiện tượng cháy rầy đầu tiên
mang tính cục bộ một vài m2, nhưng nếu gặp điều kiện thuận lợi vết cháy rầy lan toả
rất nhanh tới một vài ha hoặc cả cánh đồng trong vòng một đến hai tuần.
* Truyền bệnh virus
Rầy nâu có thể lấy được cả hai loại virus gây bệnh Vàng lùn và bệnh Lùn xoắn
lá vào cơ thể và có thể truyền được đồng thời cả 2 triệu chứng của bệnh vàng lùn và
lùn xoắn lá (Bản Tin Khuyến Nông Hậu Giang, 2006).
Theo Lương Minh Châu (2006) [13] bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá truyền bệnh
từ rầy nâu, nhưng không phải con rầy nào cũng mang virus này. Theo điều tra chỉ có
từ 1 - 1,5 % rầy mang virus.
Một con rầy tuổi ba có thể truyền bệnh cho khoảng 200 cây lúa và truyền cùng
lúc cả hai loại bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá vào cây lúa. Quan hệ giữa virus gây bệnh
và rầy nâu với môi trường truyền bệnh được khẳng định là theo cơ chế bền vững.
Khoảng 6-76 % rầy nâu có khả năng truyền virus (trung bình là 40 %). Virus
nhân mật số trong rầy. Rầy non có khả năng truyền virus mạnh hơn rầy trưởng thành.
Tỷ lệ truyền bệnh của rầy nâu không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và rầy cái hay
giữa rầy cánh dài và rầy cánh ngắn. Rầy vẫn tiếp tục truyền virus sau khi lột xác. Sự
truyền bệnh của rầy thường không liên tục trong suốt vòng đời mà thường bị gián

đoạn. Rầy có thể không truyền được bệnh trong 1 - 4 tuần hoặc cho đến khi chết. Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

9

/>

biotype của rầy nâu đều có khả năng truyền bệnh như nhau. Virus không được truyền
qua trứng rầy bị bệnh.
1.2. Đặc tính kháng rầy nâu ở lúa
1.2.1. Cơ chế tính kháng đối với côn trùng
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007) [5], sự phá hoại của côn trùng
đối với mùa màng khác với bệnh cây về mặt cơ chế, bởi vì chúng thuộc sinh vật bậc
cao (eukaryote) có đặc điểm thích nghi (fitness) với điều kiện mới khá mạnh mẽ và đa
dạng.
Cây trồng và côn trùng cùng tiến hành hiện tượng đồng tiến hoá, cùng hiện
hữu trong môi trường sinh thái phù hợp với chúng, trong một giai đoạn lịch sử khá
dài. Côn trùng (insect) chỉ trở thành sinh vật gây hại (pest) khi con người bắt đầu tiến
hành thâm canh trong nông nghiệp. Trong tự nhiên sự cân bằng sinh học vốn có đã bị
phá vỡ, đa dạng sinh học ngày càng bị thu hẹp, môi trường sống luôn bị đe dọa, tính
hệ thống trong môi trường sinh thái cũng bị phá vỡ nghiêm trọng.
Việc phát triển giống kháng sâu hại được quan sát chủ yếu trên nền tảng các
giống bản địa và mức độ đa dạng di truyền cao hơn gấp nhiều lần giống cải tiến. Kết
quả đánh giá của Heinrich và ctv. (1985) [44] cho thấy có 0,91% giống lúa cổ truyền
địa phương kháng rầy nâu trong số 30709 mẫu giống thanh lọc, trong khi đó có 48%
quần thể lúa hoang kháng rầy nâu trong số 248 quần thể thanh lọc. Khả năng phát
hiện nguồn gen kháng trong loài hoang dại gấp 48 lần trong giống lúa bản địa.
Painter (1951) đã phân chia cơ chế tính kháng của giống cây trồng đối với côn
trùng gây hại thành 3 mức độ sau:
a. Cơ chế không ưa thích (non-preference)

Cây có đặc điểm di truyền như thế nào đó làm cho côn trùng không thể ăn, ký
sinh, đẻ trứng, cư ngụ. Những đặc điểm này biểu hiện thông qua màu sắc, các dạng
lông tơ, độ hở góc lá, mùi hương tiết ra, vị đắng... . Cơ chế này tương đương với tính
kháng dọc.
b. Cơ chế kháng hoá sinh (antibiotic)
Cây chủ có thể sản sinh ra hoá chất gây ảnh hưởng đến tập tính sinh học của
côn trùng, làm cho côn trùng giảm kích thước, trọng lượng, chu kỳ sống bị rút ngắn,
giảm sinh sản. Kogan và Ortman (1978) đề nghị sử dụng thuật ngữ antixenosis để chỉ
hiện tượng cây không thể trở thành cây chủ của côn trùng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 10

/>

c. Cơ chế chống chịu (tolerance)
Cây chủ có đặc điểm làm cho côn trùng đến với qui mô quần thể không lớn,
chưa tới ngưỡng gây hại. Đây là hiện tượng có trong tự nhiên hàng trăm triệu năm,
khi chưa có sự can thiệp của con người vào làm phá vỡ cân bằng sinh học của môi
trường sống. Cây có thể chống chịu được và giảm thiểu tối đa sự tác hại của côn
trùng. Nhưng khi mật số côn trùng vượt qua ngưỡng an toàn, cây trở nên nhiễm. Ranh
giới giữa chống chịu và nhiễm khá mong manh.
Biểu hiện của cây chống chịu là làm cho mức độ gây hại của côn trùng bị hạn
chế, làm chậm trễ sự thiệt hại, hoặc vượt qua được thiệt hại, quần thể côn trùng không
phát triển đến mức gây hại cây chủ, và nó làm mồi cho thiên địch, duy trì sự sống của
thiên địch, giúp cho cân bằng sinh học trong tự nhiên tốt hơn. Người ta nghiên cứu
tính chống chịu này theo xu hướng gen kháng thứ yếu (minor genes) hay kháng số
lượng như trường hợp bệnh cây.
1.2.2. Các kiểu sinh học rầy nâu
Theo Trần Đình Long và ctv (1997) [23], các dạng khác nhau của một loài côn
trùng được gọi là các kiểu sinh học (biotype). Mặc dù sự phát sinh các kiểu sinh học
mới ở côn trùng có tần số thấp hơn nhiều so với sự xuất hiện các chủng nấm hay vi

khuẩn gây bệnh, nhưng qua việc tăng cường thâm canh lúa trong vài chục năm gần
đây, các kiểu sinh học rầy nâu mới đã hình thành kèm theo sự thay đổi độc tính của
các quần thể rầy nâu đã làm cho nhiều giống lúa kháng rầy trước đây trở nên nhiễm.
Đến nay các nhà khoa học đã phân lập được 4 kiểu sinh học rầy nâu phân bố tại các
vùng trồng lúa chính trên thế giới. Tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế năm 1994, bằng
phương pháp nuôi phân lập rầy nâu qua nhiều đời trên các giống lúa TN1, Mudgo và
IR36, các nhà khoa học đã phân lập được 3 quần thể rầy nâu mang độc tính khác
nhau, gọi là kiểu sinh học 1, kiểu sinh học 2 và kiểu sinh học 3 với đặc tính gây hại
như sau:
+ Kiểu sinh học 1: là loại hình rầy nâu phổ biến trên đồng ruộng tại Viện
Nghiên cứu Lúa Quốc tế (và ở Việt Nam trong những năm 70), chỉ có thể sống và gây
hại trên các giống lúa không mang gen kháng rầy.
+ Kiểu sinh học 2: có thể sống và gây hại trên những giống lúa mang gen Bph1
hoặc không mang gen kháng, nhưng không gây hại được trên những giống mang gen
bph2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 11

/>

+ Kiểu sinh học 3: sống và gây hại trên những giống mang gen bph2, nhưng
không gây hại được trên những giống mang gen Bph1 hoặc Bph3.
Ngoài ra còn thấy ở khu vực Nam Á (Ấn Độ, Srilanka và Bangladesh) có các
kiểu sinh học rầy nâu mang độc tính cao hơn so với các kiểu sinh học rầy ở khu vực
Đông Nam Á (Nguyễn Công Thuật và ctv, 1996) [16]. Theo tác giả Bùi Chí Bửu
(1997)[5] thì quần thể rầy nâu với độc tính mạnh có mặt tại Ấn Độ thuộc kiểu sinh
học 4.
Nghiên cứu đặc điểm của các kiểu sinh học rầy nâu di chuyển từ vùng này
sang vùng khác cho thấy độc tính của chúng không ổn định (Xiao, 1998) [117].
Những nghiên cứu về khả năng gây độc ở rầy hoang dại trên hai giống lúa Thai Col
(mang gen kháng rầy bph8) và Pokkali (mang gen kháng rầy Bph9) cho thấy chúng

trở lại trạng thái gây độc khi được nuôi liên tục từ 9-15 thế hệ trên chính các cây chủ
mang gen kháng đặc hiệu (Ketipearachchi và ctv, 1998) [62].
Biến động độc tính của quần thể rầy nâu ở Việt Nam là đáng lo ngại. Trong
những năm 1976-1977, quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long đã chuyển từ
kiểu sinh học 1 sang kiểu sinh học 2. Còn ở đồng bằng sông Hồng, quần thể rầy nâu
cũng đã dịch chuyển từ kiểu sinh học 1 sang kiểu sinh học 2 vào các năm 1987-1988
(Nguyễn Công Thuật và ctv, 1991, 1996) [15], [16]. Do vậy các giống lúa mang gen
Bph1 như IR26, IR28, IR30, CR104, NN1A... vốn kháng được rầy kiểu sinh học 1 đã
trở nên nhiễm. Gần đây, quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long đã chuyển
thành một kiểu sinh học mới rất khác biệt, không giống với các kiểu sinh học đã biết
ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế. Các nhà khoa học của Viện Lúa đồng bằng sông
Cửu Long cho rằng quần thể rầy nâu này thực chất là hỗn hợp của kiểu sinh học 2 với
kiểu sinh học 3 (Lương Minh Châu và Nguyễn Văn Luật, 1998) [13]. Tuy nhiên, theo
một số nghiên cứu khác, quần thể rầy nâu ở đồng bằng sông Cửu Long có độc tính
mạnh hơn hỗn hợp của cả 2 kiểu sinh học nói trên. Như vậy rất có thể ở đồng bằng
sông Cửu Long đang tồn tại 1 kiểu sinh học rầy mới, như quan điểm của Nguyễn
Công Thuật và ctv (1996) [16]. Sự chuyển dịch kiểu sinh học rầy như vậy kèm theo
sự thay đổi độc tính (theo hướng tăng lên) đã làm mất tính kháng của các giống lúa
mang gen kháng Bph1 và bph2 ở đồng bằng sông Cửu Long, làm cho nhiều giống
kháng rầy trước đây trở nên nhiễm, gây thiệt hại rất nhiều cho sản xuất lúa và đặt ra
những thách thức to lớn cho các nhà chọn giống. Cho đến nay, các giống kháng rầy
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 12

/>

điểm 2-3 trước đây như CR203, CR84-1 chỉ còn kháng rầy ở mức điểm 4-5 và đã có
lúc nhiễm cấp 8.
1.2.3. Di truyền tính kháng rầy nâu ở lúa
Nguồn kháng rầy đã được xác định lần đầu tiên vào năm 1967 do Pathak và
ctv. Một chương trình chọn giống và di truyền đã được bắt đầu vào năm 1968. 2 gen

kháng rầy Bph1 và bph2 đã được xác định vào năm 1970 Giống kháng rầy đầu tiên
mang gen Bph1 là IR26 đã được đưa ra vào năm 1973 và đã được chấp nhận rộng rãi
tại Philippine, Indonesia và Việt nam. Nhưng đã trở nên nhiễm vào nawm 1976-1977
bởi ảnh hưởng của biotype 2. Vào thời điểm này, giống IR36 và IR38 và sau đó là
IR42 với gen bph2 đã được đưa ra và nhanh chóng thay thế IR26. Tính kháng của nó
đã kéo dài được 14 năm đến tận 1991. Sau đó là một sô giống khác như IR60, IR62,
IR72 kháng với biotype 3 đã được đưa ra. Bằng các thí nghiệm phân tích di truyền và
chỉ thị phân tử, các nhà khoa học đã xác định được 1 số gen kháng rầy chính (Bảng
1). (Bùi Chí Bửu và ctv, 1997; Nguyễn Công Thuật và ctv, 1996; Ikeda, 1985; Ishii
và ctv, 1994; Khush và Brar, 2011; (Liu va CS 2009); Murai và ctv, 2001 [6] [16]
[52] [53] [63] . Các gen Bph20, Bph21 cũng đã được lập bản đồ trên NST lúa.
Bảng 1. Các gen kháng rầy nâu và giống chỉ thị mang gen kháng
Dòng chỉ thị

Gen kháng

Trội/Lặn

TN1

Không

-

Mudgo

Bph1

Trội

ASD7

bph2

Lặn

Rathu Heenati

Bph3

Trội

Babawee

bph4

Lặn

ARC10550

bph5

Lặn

Swarnalata

Bph6

Trội

T12

bph7

Lặn

Chinsaba

bph8

Lặn

Pokkali

Bph9

Trội

O. australiensis

Bph10

Trội

O. officinalis

bph11(t)

Lặn

O. officinalis

bph12(t)

Lặn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 13

/>

Năm 1993, Quader và các cộng sự đã khảo nghiệm di truyền tính kháng rầy
nâu của bốn giống lúa Bangladesh. Kết quả chỉ ra rằng có một gen lặn kháng rầy
trong giống lúa ARC10550, hai gen trội bổ trợ trong giống ARC6650, một gen trội
trong cả hai giống Swarnalata và T27A
Bảng 2. Mối liên hệ giữa biotype rầy nâu và gen kháng rầy ở lúa
Cấp độ kháng với từng
Tên giống

Gen

biotype
1

2

3

4

Mudgo

Bph1

R

S

R

S

ASD7

bph2

R

R

S

S

Rathu Heenati

Bph3

R

R

R

R

Babawee

bph4

R

R

R

R

ARC 10550

bph5

S

S

S

R

Swarnalata

Bph6

S

S

S

R

T12

bph7

S

S

S

R

Chin Saba

bph8

R

R

R

–

Balamawee

Bph9

R

R

R

–

TN1

None

S

S

S

S

O. australiensis

Bph18

R

R

R

R

O. officinalis

Bph6, Bph13

R

R

R

R

O. minuta

Bph20, Bph21

R

–

–

O. latifolia

Bph12

–

R

–

–

Các tác giả Ấn Độ Tomar J.B và ctv, 1996) cũng đã khảo sát di truyền tính
trạng kháng rầy nâu ở 15 dòng, giống lúa dựa trên các thế hệ F1, F2, F3 và lai trở lại.
Kết quả cho thấy các dòng BG 379-4, IET 7944, IET 7946 và BG 379-1 mang 1 gen kháng
trội (phân ly 3:1), các dòng MTU 5195 và RP2075-5-7-32 mang 1 gen kháng lặn
(phân ly 1:3), các dòng MTU 5295 và Rathu Heenati mang 2 gen kháng trội (phân ly
15:1), các dòng Ptb33 và IR 1960-274-3-3-1 mang 3 gen kháng trội (phân ly 63:1),
các dòng Babawee và CR 266-407-6-1 mang 1 gen kháng trội và 1 gen kháng lặn
(phân ly 13:3), các dòng IR 17488-2-3-2 và CR 57 MR 1523 mang 2 gen kháng bổ
trợ (phân ly 9:7), dòng IET 7947 mang 3 gen kháng bổ trợ (phân ly 27:37).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 14

/>

Ngoài ra, tính kháng rầy do gen tế bào chất kiểm soát cũng đã được phát hiện
ở một số giống lúa trong tự nhiên (Rao, 1993).

Nghiên cứu cơ chế của tính kháng rầy nâu trên những loài lúa dại Oryza
officinalis, O. punctata, O. latifolia và trên 6 giống lúa trồng, trong đó bao gồm 5
giống lúa chỉ thị mang gen kháng rầy: Rathu Heenati (Bph3), Babawee (bph4),
ARC10550 (bph5), Swarnalata (Bph6), Ptb33 (bph2+Bph3) cùng với giống TN1
(không mang gen kháng) cho thấy các loài lúa dại duy trì tính kháng cao qua 48 giờ
thả rầy, trong khi ở các giống lúa trồng, tốc độ phá hủy cây tăng theo thời gian thả
rầy. Nghiên cứu này cũng cho thấy lượng thức ăn rầy ăn vào và lượng thức ăn tiêu
hóa được trong ruột rầy ở các giống lúa trồng cao hơn ở lúa dại. Tốc độ sinh trưởng,
tuổi thọ, số trứng và tỉ lệ nở của trứng rầy trên lúa dại thấp hơn so với lúa trồng. Rất
có thể lúa dại mang nhiều gen kháng rầy hơn so với lúa trồng nên các cây lúa dại
mang đặc tính kháng rầy tốt hơn. Theo Jairin và cs 2007, [57] các gen Bph1, bph2,
Bph3, bph4 đã được sử dụng rộng rãi trong chương trình chọn giống ở Thái lan,
nhưng những giống này đã mất khả năng kháng rầy nâu mặc dù Bph3 đã được xác
định là có mức kháng cao, phổ kháng rộng đối với rầy nâu.
2. CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ NHỮNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU DI
TRUYỀN VÀ CHỌN TẠO GIỐNG LÚA
2.1. Chỉ thị phân tử
2.1.1. Khái niệm chung chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử là một công cụ mới trong nghiên cứu di truyền và chọn giống
cây trồng. Hiệu quả của phương pháp này trong chọn giống là rất lớn như: nhanh, rẻ,
chính xác, nâng cao được năng suất sản lượng. Ứng dụng của DNA-Marker trong
chọn giống như: Lập bản đồ QTL/gen kiểm soát những tính trạng quan trọng có ý
nghĩa kinh tế. Chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection - MAS)
cho một tính trạng. Chuyển QTL/gen vào giống mới nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại
(Marker-assisted backcrossing MABC) vào giống mới. Tạo các dòng đẳng gen cho
các tính trạng kháng sâu bệnh phục vụ việc phân lập gen. Chọn tạo giống phân tử của
tổ hợp nhiều tính trạng khó mà chọn giống truyền thống không làm được.
Đặc điểm của chỉ thị phân tử ADN:
- rất nhiều đa hình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 15

/>

- là đồng trội hoặc trội
- nhiều chỉ thị phân tử thuộc loại “đơn locus–nhiều alen”
- không bị ảnh hưởng bởi áp lực môi trường
Chỉ thị phân tử (CTPT) ADN có nhiều loại, đa dạng và ổn định trong mọi giai
đoạn của sinh vật. Cây trồng có khoảng 108 – 1010 nucleotit trong ADN tổng số. Thậm
chí, nếu chỉ tính một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể đã dẫn đến một số lượng khổng
lồ các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể đó. Chỉ thị phân tử ADN có ưu điểm hơn nhiều so
với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá sinh. CTPT ADN rất phong phú do sự đa dạng của
ADN, chúng có tính ổn định và không lệ thuộc vào các yếu tố môi trường cũng như
giai đoạn phát triển của sinh vật. Một chỉ thị ADN lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau:
Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, tập tính
chọn lọc trung tính (trình tự ADN của cơ thể nào cũng là trung tính với các điều kiện
môi trường), dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng. Tuy nhiên, gần như không thể
tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn tất cả những ðiều kiện trên. Tùy thuộc vào
những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số
điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và ctv., 2001)[17].
Chỉ thị phân tử được chia làm 3 loại chính:
- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
- Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR
- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại. Nhóm chỉ thị này thực
ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên
có thể xếp vào một nhóm riêng.
2.1.2. Phân loại các loại chỉ thị phân tử
2.1.2.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction fragment
length polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn )
Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN đặc hiệu trong cấu trúc. Sự thay đổi,
mất đi hay thêm vào các nucleotide khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm riêng biệt của

mỗi họ, giống, loài, thậm chí mỗi cá thể. Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn
để cắt phân tử ADN của hệ gen, sau đó dùng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò.
người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có chiều dài khác nhau.
Sự khác nhau về kích thước các đoạn được tạo ra do xử lý enzym giới hạn đối
với các phân tử ADN trong nhân hoặc trong các cơ quan tử khác nhau được gọi là
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 16

/>

tính đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn. Chỉ thị này được các nhà di truyền học
lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở
người. Trong phương pháp RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt ADN genome
thành nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những
đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen như đảo đoạn,
thêm hoặc mất đoạn ADN tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể.
Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những
enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, các đoạn cắt ra của ADN với kích
thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem
xét các mẫu nhiễm sắc thể. Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai
với các mẫu ADN (Nguyễn Quang Thạch, và ctv) [21].
Đặc điểm của chỉ thị RFLP:
- Là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng
một lôcut gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc BB) và
các cá thể dị hợp tử AB.
- Chỉ thị RFLP rất đáng tin cậy, dùng để kiểm tra các chỉ thị phân tử khác
- Hạn chế của chỉ thị RFLP: phương pháp phát hiện RFLP tiêu tốn nhiều thời
gian và sức lực, lượng công việc cồng kềnh.
2.1.2.2. Các chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR
a. Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs – Đa hình các đoạn
ADN khuyếch đại ngẫu nhiên)

Chỉ thị RAPD được hình thành dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR được
William và cộng sự phát triển vào năm 1990. Phương pháp RAPD không cần dùng
cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà dùng các mồi đơn ngẫu nhiên để
nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Mồi ngẫu nhiên là đoạn oligonucleotide
dài khoảng từ 6– 12 nucleotit, nhiệt độ kết cặp thấp.
Do tính ngẫu nhiên nên các đoạn mồi này vừa là mồi xuôi, vừa là mồi ngược.
Các đoạn này sẽ bắt cặp với trình tự bổ sung trong hệ gen của sinh vật từ đó nhân
bản. Mồi càng ngắn thì khả năng bắt cặp càng cao và phản ứng dễ thực hiện. Mồi
càng dài thì khó bắt cặp nhưng kết quả nhân đoạn ADN càng chính xác (Trịnh Đình
Đạt, 2006)[24].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 17

/>

Ưu điểm của loại chỉ thị này là không cần phải biết trình tự các nucleotide trên
đoạn ADN cần nhân, tiêu tốn ít ADN mẫu. Bên cạnh đó chỉ cần một bộ mồi ta có thể
sử dụng được với các loài khác nhau. Quy trình thực hiện nhanh, dễ dàng và dùng ánh
sáng huỳnh quang để phát hiện băng ADN thay cho chất phóng xạ.
Bên cạnh đó cũng còn một số hạn chế như: chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi sự
có mặt hay vắng mặt những băng ADN đặc trưng nên không phân biệt được thể dị
hợp tử. RAPD có tính chất ngẫu nhiên nên việc lặp lại phân tích, điện di để tìm liên
kết gen thường không đồng nhất. Số băng thu được khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên
còn rất lớn và không chắc chắn khi có băng ADN giống nhau cùng kích thước trên
bản gel có thực sự là cùng một vị trí trên hệ genome hay không? Chỉ thị RAPD còn
có một hạn chế nữa là sự nhân bội của nhiều locus, độ nhạy của RAPD phụ thuộc vào
điều kiện của phản ứng, đặc biệt là ở những cơ thể có hệ gen lớn như lúa mì.
Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ
những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại (Naqvi và ctv,
1995) [51], trong phát hiện tính đa dạng của sinh vật, những thay đổi trong gen, đột

biến NST đều làm thay đổi kích thước của đoạn cần nhân vì khi có sự thay đổi một
bazơ nitơ nào đó thì sẽ ngăn cản việc tiếp hợp của mồi với ADN khuôn.
b. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài
các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn cắt ADN hệ gen và
nhân bội các đoạn ADN chọn lọc bằng kỹ thuật PCR, được phát triển bởi Vos và
cộng sự năm 1995. Để thiết kế được các mồi đặc trưng trước hết ta cắt các mẫu
nghiên cứu bằng enzym giới hạn. Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô
số mảnh có kích thước khác nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide
của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn
(adaptor). Sau đó dùng enzym ligase để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu
ADN đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor ta thiết kế mồi PCR. Mồi PCR gồm hai phần:
Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm
vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn
ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 18

/>

Chỉ thị AFLP rất chính xác, có thể sử dụng cho tất cả các thực vật, động vật.
Loại chỉ thị này vô cùng hữu hiệu trong việc “DNA fingerprinting” “lấy vân tay
ADN” của bất kỳ cá thể sinh vật nào. Nhược điểm: kỹ thuật cầu kỳ, tốn kém.
c. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu)
Chỉ thị STS do M.Olson và cộng sự đề xuất năm 1989. STS là một đoạn ADN
ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép
xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết
trước của ADN trong genome. STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locut đã biết
bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối
của những locut đặc trưng này (Trịnh Đình Đạt, 2006)[8]. Các đoạn mồi STS chứa

khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR.
Phương pháp này dựa trên nguyên lý PCR nên dễ thực hiện, không tốn kém,
hơn nữa lại sử dụng mồi đặc hiệu nên kết quả ổn định. Nhược điểm của chỉ thị này là
cần biết trình tự hai đầu của các đoạn mẫu dò mới có thể tiến hành được nghiên cứu,
không có tính chất đa hình như những ADN marker khác, tần suất đa hình thấp, thay
đổi ở mỗi locus và ở mỗi cặp lai cụ thể (Nguyễn Thị Lang, 2002)[18].
d. Chỉ thị CAPs (Cleaved Amplification Polymorphisms - Đa hình độ dài mảnh cắt
giới hạn).
CAP là chỉ thị dựa trên đa hình độ dài mảnh cắt giới hạn của các sản phẩm
PCR (Jarvis và ctv, 1994)[56]. Những sản phẩm PCR và STS, RAPD nhiều khi
không thể hiện đa hình độ dài giữa hai mẫu thí nghiệm được cắt thêm bởi các enzym
giới hạn. Các enzym sử dụng trong việc tìm loại chỉ thị này thường là enzym cắt 4.
Sản phẩm cắt được phân giải trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide tuỳ thuộc vào
kích thước của các mảnh cắt.
e. Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)
Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực
vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp
lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết
nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant và ctv.,
1995)[34]. Những vùng này đã được sử dụng trong việc xây dựng một kỹ thuật dựa
trên PCR, đó là kỹ thuật RGA. Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN
được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 19

/>

“nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã được
dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và mô tả đa dạng di truyền. (Chen và ctv.,
1999)[28].
f. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeates - Chỉ thị vi vệ tinh)

- Chỉ thị SSR: Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989, là những
đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide,
theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần. Ví dụ:
NNNNNNN(GA)20-40NNNNNNNNN
NNNNNNN(CAT)16-26NNNNNNNNN
NNNNNNN(TTGG)12-18NNNNNNNNN
Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và ctv,
1982)[35], sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và
ctv, 1998)[27]. Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có
kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài.
Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote là khá phổ biến,
tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một
đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn
lần hoặc nhiều hơn. Các „vi vệ tinh” rất phổ biến trong hệ gen của tất cả các sinh vật.
Vùng có ADN lặp lại thường kém ổn định hơn so với các vùng khác, do đó ở các cá
thể khác nhau, trình tự đó được lặp lại với số lần khác nhau. Như vậy vùng “vi vệ
tinh” thường có độ đa hình cao hơn so với các vùng khác.
Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội dựa trên các trình tự lặp lại ngắn. Đây là loại
chỉ thị đang được sử dụng nhiều trong lập bản đồ gen, trong nghiên cứucứu đa dạng
di truyền và chọn giống MAS.
Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện, không tốn kém.
SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết
kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài. Tuy nhiên, SSR là
một loại marker chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại
các giống vật nuôi cây trồng khác nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật.
Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen trong chọn giống, xây dựng bản đồ
liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan
đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 20

/>

giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen
thuộc một locut.
Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và ctv,
1982)[35], sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo và
ctv, 1998)[27]. Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có
kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài.
g. Chỉ thị SNP (single nucleotide polymorphisms)
SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất
cao nhất trong genome người. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự cuả những phần
nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số
cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp. Một cặp base ở
một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp
base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí. Nếu cặp base ít phổ biến hơn
xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta định nghĩa vị trí cặp base đó là một
SNP. Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong genome người, nhiều hơn bất
cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó. Kỹ thuật SNP được áp dụng vào đầu
những năm 2000, từ genome người cho đến genome các sinh vật khác như cây
Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa L.).
SNP có những ưu điểm nổi bật sau:
 SNP có tính chất “diallelic” trong quần thể và tần suất alen của nó có thể
được ước đoán dễ dàng trong bất cứ quần thể nào, thông qua một loại xét nghiệm kỹ
thuật
 SNP là những chỉ thị phân tử có tính ổn định rất cao về mặt di truyền.
Loại chỉ thị này dựa trên so sánh trình tự của từng gốc nucleotide một, vì thế
rất chính xác, số lượng đa hình cực kỳ nhiều. Nhược điểm chính: phải sử dụng kỹ
thuật xác định trình tự ADN nên chỉ thực hiện được ở các phòng thí nghiệm có đủ
trang thiết bị. Người ta cũng có thể phát hiện chỉ thị này bằng cách sử dụng enzyme
CELI cắt sản phẩm PCR tại vùng có SNP của cây nghiên cứu. phương pháp này

mang lại hiệu quả cao và đã từng được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế
giới. Tuy nhiên loại enzyme này có giá khá cao trên thị trường.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 21

/>

2.2. Các nghiên cứu lập bản đồ gen kháng rầy nâu ở lúa
Gen kháng rầy nâu đầu tiên là Bph1 là một gen trội được xác định từ giống lúa
Mudgo thuộc loài phụ indica kháng rầy (Athwal et al. 1971) [26]. Bph1 đã được xác
định lập bản đồ với vị trí nằm trên cánh tay đòn dài của NST 12 liên kết chỉ thị phân
tử Restriction Fragment Length Polymorphism (Hirabayashi and Ogawa 1995) [47].
Gen bph2 được xác định từ giống lúa indica ASD7 (Athwal et al. 1971) [26]. Gen
Pbh2 được xác định lập bản đồ phân tử tại vị trí cánh tay đòn dài trên NST12 (Murata
et al. 1998; Murai et al. 2001). Để lập bản đồ phân tử Pbh2, tác giả đã sử dụng quần
thể lai giữa giống lúa Tsukushibare ( giống lúa japonica nhiễm rầy nâu) với dòng
Norin-PL4

(dòng

mang

đoạn

locus

gen

bph2

thế

hệ

BC2F11

giữa

Asominori‟*3/„IR1154–243‟. IR1154-243 là giống lúa Indica). Kết quả đã xác định
được bph2 là đơn gen tại vị trí với khoảng cách là 3.2-cM bao gồm tám chỉ thị phân
tử AFLP. bph2 đồng phân ly và liên kết chặt với chỉ thị phân tử KAM4 với khoảng
cách 1.0-cM. KAM4 là chỉ thị phân tử sequence-tagged-site (STS) với trình tự mồi
xuôi và ngược là: 5-TAACTGGTGTTAGTGCGAATGC- 3(KAM4-F) and 5AATTCACGGCATGTGAAGCCCTAG- 3(KAM4-R).
Hai gen Bph3 và bph4 được xác định lập bản đồ trên cánh tay đòn ngắn của
nhiễm sắc thể số 6 (Jairin et al. 2010, 2007; Kawaguchi et al. 2001) [57], [61], từ hai
giống lúa Rathu Heenati và Babawee (Lakshminarayana and Khush 1977). Để lập
bản đồ Gen kháng rầy nâu bph4, 15 chỉ thị phân tử SSR đa hình với khoảng cách di
truyền từ 0.0–63.4 cM trên nhiễm sắc thể số 6 đã được sử dụng kiểm tra di truyền 15
cá thể kháng và

nhiễm rầy nâu từ hai quần thể F2 tổ hợp lai giữa giống

TN1/Babawee và Babawee/KDML105.
Kết quả xác định được chỉ thị phân tử SSR, RM586 liên kết chặt với gen bph4.
Từ bản đồ liên kết di truyền và phân tích QTL của 95 và 78 cá thể trong quần thể F2
tổ hợp lai TN1/Babawee và Babawee/KDML105, kết quả xác định locus bph4 và
Bph3 có cùng vị trí trên nhiễm sắc thể 6 giữa hai chỉ thị phân tử RM589 và RM586.
Các gen kháng rầy nâu bph5, Bph6 and bph7, đã được xác định trên ba giống lúa
tương ứng là ARC10550, Swarnalata và T12 (Khush et al. 1985; Kabis and Khush
1988) [63], [60]; Gen kháng rầy nâu BPH6 được xác định vị trí trên cánh tay đòn dài

giữa hai chỉ thị phân tử RM6997 and RM5742 nhiễm sắc thể số 4 (Qiu et al. 2010).
Gen bph8 đã được xác định trên ba giống lúa Col. 5 Thailand, Col. 11 Thailand và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 22

/>

Chin Saba. Gen bph9 đã được xác định lập bản đồ phân tử trên giống lúa
Kaharamana, một giống lúa kháng rầy nâu của Sri Lanka. Tác giả đã sử dụng 180 cá
thể trong quần thể phân ly F2 tổ hợp lai giữa Kaharamana và 02428. Kết quả xác định
gene kháng rầy nâu Bph9 ở giống lúa Kaharamana tại vị trí giữa hai chỉ thị phân tử
RM463 and RM5341 với khoảng cách tương ứng là 6.8 cM and 9.7 cM trên nhiễm
sắc thể số 12(Murata et al. 2001).
Lúa hoang dại là một nguồn rất giầu gene kháng rầy nâu. Tới nay, ít nhất 10 gen
chính kháng rầy nâu đã được xác định từ loài lúa hoang. Gen Bph10 đã được xác định
trên nhiễm sắc thể 12 từ loài lúa hoang O. australiensis (Ishii et al. 1994) [53]. Các
gen kháng rầy nâu bph8, Bph9 and Bph10(t), kháng các chủng biotypes 1, 2 và 3.
Gen kháng rầy nâu bph11được xác định trên cánh tay đòn dài nhiễm sắc thể số 3 ở
giống lúa O. officinalis (Hirabayashi et al. 1998) [47]. Gen trội kháng rầy nâu BPH12
đã được xác định trên cánh tay đòn ngắn nhiễm sắc thể 4 tại vị trí giữa hai chỉ thị
phân tử RM16459 và RM1305 trên giống lúa hoang O. latifolia (Yang et al. 2002;
Qiu et al. 2012) [122], [92]. Hai Gen trội Bph13 xác định tại vị trí trên cánh tay dài
nhiễm sắc thể số 2 từ giống lúa O. eichingeri (Liu et al. 2001) và cánh tay đòn ngắn
nhiễm sắc thể số 3 từ giống lúa O. officinalis (Renganayaki et al. 2002) . Hai gen trội
kháng rầy nâu Bph14 và Bph15 cũng được tìm thấy và lập bản đồ phân tử từ giống
lúa O. officinalis, hai gen này được lập bản đồ phân tử tại vi trí tương ứng trên cánh
tay đòn dài nhiễm sắc thể số 3 và cánh tay đòn ngắn trên nhiễm sắc thể số 4 (Huang et
al. 2001) [51]. Một gen kháng rầy nâu khác là Bph17 đã được xác định tại vị trí cánh
tay đòn ngắn trên nhiễm sắc thể số 4 từ giống lúa Rathu Heenati (Sun et al. 2005).
Gene, bph19 được lập bản đồ từ giống lúa AS20-1 tại vị trí trên cánh tay đòn
ngắn nhiễm sắc thể số 3 (Chen et al. 2006) [34]. Gen Bph18 được xác định ở dòng lai

IR65482-7-216-1-2, là dòng mang gen kháng từ dòng lúa hoang O. australiensis.
Dòng lúa mang gen kháng này biểu hiện mức kháng cao ðối với biotype rầy nâu Hàn
Quốc. Gen Bph18 được định vị tại vùng tận cùng trên vai dài của nhiễm sắc thể số
12. Những nghiên cứu sâu hơn của tác giả đã chỉ ra rằng gen Bph18 nằm trong vùng
gen 0,843Mb, vùng này bao gồm 3 BAC clone, kẹp giữa chỉ thị R10289 - RM6869,
và được xác định nằm trong BAC clone OSJNBa0028L05. Thông tin trình tự được
dùng để thiết lập mồi STS 7312.T4A. Allen chỉ thị cho băng 1,078bp đồng phân ly
hoàn toàn với tính trạng kháng rầy nâu. Tác giả giả định rằng đây chính là vị trí của
gen kháng rầy nâu có nguồn gốc từ lúa hoang O. australiensis. Cặp mồi STS
7312.T4A cũng được tác giả khuyến cáo sử dụng trong MAS (K. K. Jena và ctv.
(2006) [58]. Li và CS xác định và lập bản đồ gen kháng rầy nâu bph18(t) từ loài lúa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 23

/>

hoang O. rufipogon Griff., accession GX2183, bph18(t) kháng rộng với các chủng
biotypes rầy nâu của châu Á như biotypes 1 và 2, Bangladesh, Cửu Long – Việt Nam
và Pantnagar (India) (Li et al. 2006).
Hai gen kháng rầy nâu Bph20 và Bph21 được lập bản đồ phân tử từ giống lúa
hoang O. minuta, tại vị trí tương ứng trên cánh tay đòn ngắn nhiễm sắc thể số 4 và
cánh tay đòn dài trên nhiễm sắc thể số 12 (Rahman et al. 2009). Tương tự hai locus
gen bph22(t) và bph23(t) được xác định và lập bản đồ phân tử từ giống lúa hoang O.
rufipogon Griff. Hai locus gen bph22(t) và bph23(t) có vị trí tương ứng trên nhiễm
sắc thể số 4 và số 8 (yuan et al. 2011).
Gen Bph25 được xác định vị trí trên cánh tay đòn ngắn nhiễm sắc thể số 6, liên
kết chặt với các chỉ thị phân tử S00310. gene Bph26 được xác định gần vị trí cánh tay
đòn dài nhiễm sắc thể số 12, liên kết chặt với chỉ thị phân tử RM309, RM5479,
S20103 và MSSR2 (Yoshimura et al. 2012).
Gen Bph27 đã được xác định và đăng ký trên Oryza base (Yamazaki et al. 2010:
BPH27 được lập bản đồ tại vị trí 17-cM

giwaxhai chỉ thị phân tử SSR markers RM273 và RM471 trên cánh tay đòn dài nhiễm
sắc thể số 4 (Li et al. 2006). Đã lập bản đồ chi tiết gen Bph27 từ quần thể lai giữa
giống lúa kháng Balamawee và giống japonica nhiễm 02428 với khoảng cách 63 kb
giữa hai InDel markers Q52 and Q20. (He và CS 2013)
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu
Đối với rầy nâu, nhiều nhà chọn giống đã thành công trong việc chọn tạo giống
mang một hay một vài gen kháng rầy nâu vào một giống. Để tạo ra giống lúa kháng
bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào
"genome đích". Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ
hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào "genome đích" (quy tụ
nhiều gen vào 1 dòng ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn, hoặc đôi khi không thể
thực hiện được. Ở đây, thay vì đánh giá kiểu hình các cá thể con lai để chọn ra cá thể
mang gen kháng, người ta xác định các cá thể mang gen kháng thông qua chỉ thị phân
tử liên kết chặt với gen kháng. Các nhà khoa học Thái Lan đã tạo ra được những dòng
lai mới, mang các QTLs kháng rầy nâu, mang gen kháng bạc lá Xa21 và có khả năng
chống chịu ngập được cải thiện dựa trên nền gen của dòng KDML 105 (Therayut
Toojinda và ctv. (2004) .
Ở Nhật Bản, các nhà khoa học cũng đã thành công trong việc quy tụ các gen
kháng rầy nâu Bph1 và Bph2 vào các dòng lai nhờ chọn lọc bằng chỉ thị phân tử. Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 24

/>

dòng lai này biểu hiện tính kháng tương đương đối với các giống mang một gen Bph1
và biểu hiện tính kháng hơn hẳn so với các dòng chỉ mang một gen Bph2 (Prem N.
Sharma và ctv. (2004). N.S. Gamalath và ctv. (2005) cũng đã thông báo về việc quy
tụ hai gen kháng Bph1 và bph2 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 12 vào giống nhiễm
Tsukushibare. Những nghiên cứu tiếp theo của nhóm tác giả về ARNm sử dụng
phương pháp dấu phân tử ARNm dựa trên chỉ thị AFLP đã nhân dòng 12 trong số 41
băng đa hình giữa giống nhiễm và các dòng quy tụ. 3 trong số các đoạn này được

định vị trên nhiễm sắc thể số 12.
Nhờ sử dụng phương pháp lai trở lại kết hợp với chọn lọc bằng chỉ thị phân tử
SSR, đã thu được 6 dòng lúa mang hai gen kháng rầy nâu Bph14 và Bph15 khi lai
dòng lúa B5 mang 2 gen kháng này và các dòng phục hồi 9311 và 1826. Các dòng lúa
thu được biểu hiện tính kháng cao đối với rầy nâu và đang được thử nghiệm, các dòng
mang 2 gen kháng biểu hiện tính kháng cao hơn so với các dòng lai mang một gen
kháng.
Tại Việt Nam, rầy nâu (Nilaparvata lugens) là côn trùng hại lúa nguy hiểm gây
“cháy rầy”, đồng thời cũng là côn trùng môi giới truyền bệnh vi rút ảnh hưởng rất lớn
đến sản xuất lúa ở khắp các tỉnh trong cả nước. Rất nhiều giống lúa kháng rầy được
tuyển chọn tại Viện DTNN, Viện CLT, Viện lúa ĐBSCL, Viện BVTV và các cơ quan
nghiên cứu khác đã được công nhận để đưa ra sản xuất và đã đem lại hiệu quả kinh tế
to lớn, tuy những giống này dù rất phong phú vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu thâm
canh tăng năng suất cũng như về mùa vụ canh tác rất đa dạng ở các vùng trồng lúa
trong cả nước. Mặt khác sự thay đổi độc tính của các quần thể rầy nâu dẫn đến hình
thành các biotype mới đã làm cho nhiều giống lúa kháng rầy đưa ra trước đây trở lên
nhiễm. Qua khảo sát đánh giá tính kháng rầy nâu đối với 2 vùng sinh thái ĐBSH và
ĐBSCL đối với tập đoàn giống lúa và các dòng thử nghiệm cho thấy hầu hết các
giống lúa trồng phổ biến tại ĐBSH, giống địa phương ĐBSCL và các giống lúa cao
sản đều bị nhiễm rầy. Chỉ có dòng OM6073, Pkaanpa, Khơ me đỏ và một số dòng lúa
đã được quy tụ 2 gen kháng của Viện Di truyền Nông nghiệp là có tính kháng cao.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN 25

/>