PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÚC TRÌNH THỰC TẬP
PROTEIN & ENZYME
MÃ HỌC PHẦN:
NHÓM: 12B

SINH VIÊN THỰC HIỆN:
MSSV: B1303671

TRẦN QUỐC KHÁNH

CẦN THƠ,
11.2015


MỤC LỤC
BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN.................................................................................................1
I.ĐỊNH NGHĨA......................................................................................................................1
II.NGUYÊN TẮC...................................................................................................................1
III.DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU.....................................................1
1.Dụng cụ thí nghiệm:.........................................................................................................1
2.Quy trình trích ly protein:................................................................................................2
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................................................3
1.Kết quả:............................................................................................................................3
2.Thảo luận:........................................................................................................................3
BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ..........................................................................................4
I.DỤNG CỤ, HÓA CHẤT......................................................................................................4
1.Dụng cụ............................................................................................................................4

2.Hóa chất...........................................................................................................................4
II.TIẾN HÀNH.......................................................................................................................4
III.KẾT QUẢ - THẢO LUẬN................................................................................................5
1.Kết quả.............................................................................................................................5
2.Thảo luận..........................................................................................................................6
2.1Phương pháp trao đổi ion...........................................................................................6
2.2Trạng thái tích điện của protein – enzyme ở điều kiện trích ly, pH 4, pH 6..............7
2.3pH của mỗi phân đoạn được rửa giải. Ý nghĩa thực tiễn của các trị số pH vừa xác
định được trong quá trình tinh sạch................................................................................7
2.4Hiện tượng nhiều hơn 1 phân đoạn protein được rửa giải khỏi cột gel trao đổi ion. .8
BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD........................9
I.GIỚI THIỆU.........................................................................................................................9
II.NỘI DUNG THỰC HÀNH...............................................................................................10
1.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.............................................................................................10
2.Tiến hành thí nghiệm.....................................................................................................10
2.1Xây dựng đường chuẩn BSA...................................................................................10
2.2Định lượng protein có trong mẫu.............................................................................11
III.KẾT QUẢ........................................................................................................................11
1.Xây dựng đường chuẩn BSA.........................................................................................11
2.Định lượng protein có trong mẫu...................................................................................12
IV.ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN.........................................................................13
BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI
TIẾN.........................................................................................................................................15
I.THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT.................................................................................15
II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM.............................................................................................15
1.Dựng đường chuẩn Tyrosin...........................................................................................15
2.Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến.....................................16
3.Tính toán kết quả:..........................................................................................................18
III.ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN.........................................................................18
BÀI 5: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL

POLYACRYLAMIDE( SDS – PAGE).................................................................................19


BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN
I.

ĐỊNH NGHĨA
Trích ly enzyme là quá trình thu nhận enzyme thô từ các nguồn nguyên liệu
động vật, thực vật và vi sinh vật để thực hiện các bước tinh sạch và các nghiên cứu
khác.
Dịch trích enzyme thô từ thịt khóm là nguồn enzyme thô cho các thí nghiệm kế
tiếp để tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, khảo sát hàm lượng protein
bằng phương pháp Bradford, khảo sát hoạt tính bằng phương pháp Kunitz cải tiến, và
xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.
II.

NGUYÊN TẮC
Thu nhận các enzyme trong tế bào nhưng vẫn duy trì hoạt động của enzyme ở
mức cao nhất, tránh gây biến tính và hạn chế những ảnh hưởng bất lợi tới enzyme.
Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: Cắt, nghiền, ép bằng thủ công và dùng
máy ép nước trái -> Tế bào được bao bọc và bảo vệ bởi màng tế bào nên để ly trích
enzyme trước tiên ta cần phá vỡ màng tế bào. Chú ý: Mẫu cần được làm sạch và phải
trữ lạnh nếu chưa tiến hành trích ly enzyme.
Thu nhận enzyme bằng phương pháp li tâm: Phương pháp này được sử dụng
rộng rãi trong công nghệ enzyme nhằm tách enzyme ngoại bào hay nội bào (sau khi
phá vỡ tế bào) ra khỏi dung dịch.
III.

DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU

1. Dụng cụ thí nghiệm:
- Cân điện tử 1500gr
-

Micropipette

-

Đĩa petri

-

Máy ly tâm lạnh

-

Đầu cole các loại

-

Dao, thớt, vải lọc

-

Máy ép nước trái cây

-

Ống eppendorf

-

Tủ lạnh
Nguyên liệu: 1/4 trái khóm (lấy phần vỏ).
1


2. Quy trình trích ly protein:
¼ trái khóm (m1 gr)
Thu phần vỏ(m2 gr)
Ép

Bả khóm

Vắt (Bằng vải the)
Tổng dịch trong (V ml)

Cặn

Bỏ

Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút trong 20 phút)
Dịch trong (V0 ml)

Cặn
Bỏ

Trữ mẫu (dịch enzyme): 22ml/bọc +
1ml/ống eppendoft (6 ống) + 1 bọc
trữ phần mẫu dư 60ml.

Ghi tên nhãn và đem vào tủ lạnh trữ
ở - 20oC.

2


Ghi nhận tổng thể tích dịch enzyme thu được V2 (ml).
Lưu ý: Toàn bộ quy trình cần thao tác nhanh, trong điều kiện lạnh 4 oC (trữ
trong các dụng cụ đặt trong khay nước đá khi chờ đợi các nhóm và thực hiện các
bước) để hạn chế sự biến tính của enzyme cũng như hạn chế sự phân giải của các
enzyme proteolytic có trong dịch chiết.
IV.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả:
Thu được dịch trích enzyme thô từ thịt khóm.
Khối lượng ¼ trái khóm (m1): 344,4gr
Khối lượng vỏ (m2): 139,9gr
Dịch trong V0: 88ml
2. Thảo luận:
Phần trăm vỏ khóm thu được so với nguyên liệu ban đầu là:
Phần trăm vỏ khóm = (m1/m2)*100
= (139,9/344,4)*100
= 40,6%
Tại sao phải xác định các thông số đầu vào của mỗi nguyên liệu?
• Để tính hiệu xuất thu hồi.
• Hiểu được công dụng, liều lượng trong từng trường hợp sử dụng.
• Đạt hiệu trái cao trong sản xuất, tránh lãng phí nguyên liệu.

3

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
I.

DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
1. Dụng cụ
- Hệ thống sắc ký lỏng bơm nhu động
- Máy phân đoạn sắc ký (fraction collector)
- Cốc thủy tinh,
- Ống eppendorf,…
2. Hóa chất
- Gel SP – StreamLine
- Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4
- Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 6

II.

TIẾN HÀNH
Bước 1. Chuẩn bị gel SP – StreamLine:

Cân bằng 10 gram bằng gel SP – StreamLine bằng dung dịch đệm ammonium
acetate 0,1M, pH 4.
Bước 2. Chuẩn bị cột gel SP – StreamLine:
Nhồi gel vào cột thủy tinh, cân bằng cột gel với dung dịch đệm ammonium
acetate 0,1M, pH 4 (3 lần thể tích cột), tốc độ dòng chảy 1 mL/phút.
Bước 3. Load mẫu lên cột:
Bơm 40 mL dung dịch nước khóm (bromelain) pha loãng với dung dịch
ammonium acetate (tỉ lệ 1:1) qua cột với tốc độ 1 mL/phút.
Bước 4. Rửa cột gel:

Rửa cột bằng dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4 với tốc độ dòng
chảy là 1 mL/phút; theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ, cho đến khi phân đoạn
protein không bám trên cột được đẩy ra hết khỏi cột. Thu phân đoạn protein không
bám, đồng nhất mẫu và xác định thể tích (VUB mL).
Bước 5. Rửa giải:
Protein bám trên cột gel được rửa giải bằng dung dịch đệm ammonium acetate
0,1M, pH 6 với tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút; thu dung dịch protein được rửa giải;
theo dõi sắc ký đồ để xác định các phân đoạn protein khác nhau.
Bước 6. Thu phân đoạn và trữ mẫu:
4


Thu mẫu vào các ống nghiệm thủy tinh trong quá trình sắc ký (trung bình
khoảng 5 mL/ống).
Xác định lượng protein trong mỗi ống bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 280
nm (OD280)
Thu, tách riêng các phân đoạn protein dựa theo sắc ký đồ vẽ được từ số liệu
OD280.
Đồng nhất mỗi phân đoạn riêng biệt và xác định tổng thể tích của mỗi phân
đoạn (VUB, VF1, VF2,…).
Trữ enzim ở - 200C:
+ 6 ống eppendorf, mỗi ống chứa 1 mL dịch enzim (để xác định hàm lượng
protein, hoạt tính enzim và điện di SDS – PAGE trong các bài sau).
+ Phần dịch enzim của mỗi phân đoạn còn dư cho vào 1 bọc khác để trữ lại.
III.

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
1. Kết quả
Bảng 1. Kết quả đo OD ở bước sóng 280 nm
Ống nghiệm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29

Chỉ số OD
0,117
0,121
0,106
0,098
0,096
0,101
0,350
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
3,000
1,931
1,305
0,936
0,697
0,548
0,417
0,317
0,278
0,262
0,248
0,237
0,222
0,206

Ống nghiệm
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68

69

5

Chỉ số OD
0,212
0,243
0,331
0,245
0,287
0,528
0,564
0,667
0,775
0,799
0,697
0,615
0,511
0,400
0,321
0,266
0,229
0,207
0,190
0,185
0,183
0,178
0,181
0,189
0,192

0.193
0,199
0,201
0,204


30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40

0,199
0,195
0,193
0,190
0,183
0,179
0,176
0,176
0,175
0,188
0,233

70
71
72
73
74
75
76
77
78
79

0,205
0,208
0,208
0,207
0,214
0,198
0,189
0,177
0,172
0,165

Hình 2.1 Biểu đồ sắc ký dựa vào chỉ số OD ở độ hấp thụ 280 nm

Bảng 2.2 Kết quả phân đoạn thu được
Phân đoạn
Số ống thu được
Đỉnh

UB

5 - 39
Không xác định được

F1
41 - 44
43

F2
45 - 55
50

F3
67 - 76
71 - 72

Bảng 2.3 Tổng thể tích và thể tích trữ lại của mỗi phân đoạn
Phân đoạn
Tổng thể tích (ml)
Thể tích trữ lại (ml)

UB
175
6

F1
20
6

2. Thảo luận
2.1 Phương pháp trao đổi ion

 Nguyên lý chung của sắc ký trao đổi ion:
6

F2
55
6

F3
50
6


Tách các phân tử dựa trên điện tích: protein mang điện tích bề mặt, tùy vào pH
của môi trường chúng sẽ tích điện dương hay âm, với pH < pI protein tích điện dương
và pH > pI protein sẽ tích điện âm. Vì vậy có thể chọn loại gel thích hợp cho từng loại
protein dựa vào pI và độ bền pH của protein.
 Có hai loại gel trao đổi ion:
- Gel trao đổi ion dương: có các nhóm chức năng mang điện tích âm, tương tác
ion với các protein mang điện tích dương.
- Gel trao đổi ion âm: có các nhóm chức năng mang điện tích dương, tương tác
ion với các protein mang điện tích âm.
Các protein được đẩy tuần tự theo lực tương tác, các protein tương tác ion yếu
với gel sẽ được đẩy ra trước.
2.2 Trạng thái tích điện của protein – enzyme ở điều kiện trích ly, pH 4, pH 6
 pH 4: Gel trao đổi ion sử dụng trong thí nghiệm mang điện tích âm. pI của
bromelain là 4,6 nên khi rửa cột gel bằng pH 4 bromelain (và một số protein khác) sẽ
tích điện dương (pH < pI), tương tác với gel nên bám vào cột gel. Protein thu được
trong giai đoạn này là protein không bám (tích điện âm). Dựa vào kết quả đo OD của
mẫu thu được khi rủa với dung dịch đệm pH 4, ta thấy lúc đầu hàm lượng protein thu
được cao, sau đó thấp dần. Khi giá trị OD của mẫu thu được gần bằng với giá trị OD

của dung dịch đệm dùng để cân bằng cột ban đầu thì dừng lại, giai đoạn thu protein
không bám kết thúc.
 pH 6: Khi rửa giải với dung dịch đệm pH 6, bromelain (và một số protein khác)
lúc này sẽ tích điện âm (do pH > pI). Do vậy chúng không thể bám vào cột gel và sẽ bị
đẩy ra khỏi cột.
2.3
pH của mỗi phân đoạn được rửa giải. Ý nghĩa thực tiễn của các trị số
pH vừa xác định được trong quá trình tinh sạch
Bảng 2.4 Giá trị pH của mỗi phân đoạn
Phân đoạn

UB

F1

F2

F3

pH

4

4,5

6

6

Ý nghĩa:

- UB: pH < pIbromelain nên bromelain chúng ta cần tinh sạch tích điện dương và
bám được vào gel mang điện tích âm, còn các protein thu được trong giai đoạn này là
các protein không bám.

7


- F1: do dung dung dịch đệm pH 6 để rửa giải nên pH của các phân đoạn tăng
dần lên, ở pH 4,5 (vẫn nhỏ hơn pIbromelain) nên đây vẫn không phải là protein chúng ta
cần tinh sạch.
- F2 và F3: pH của dung dịch ở 2 phân đoạn này là 6, lớn hơn pI bromelain, lúc này
bromelain chuyển sang tích điện âm, không bám được vào gel mang điện tích âm nữa
nên sẽ bị đẩy ra khỏi cột gel. Rất có thể đây là protein chúng ta cần tinh sạch.
2.4
Hiện tượng nhiều hơn 1 phân đoạn protein được rửa giải khỏi cột gel
trao đổi ion
Khi rửa giải bằng dung dịch đệm pH 6, bromelain sẽ tích điện âm ( do pH > pI)
trong khi hạt gel vẫn tích điện âm. Do điện tích cùng dấu nên bromelain không bám
vào hạt gel và bị đẩy ra ngoài. Tuy nhiên hỗn hợp protein không bám ngoài bromelain
còn có một số protein tích điện âm khác. Vận tốc di chuyển của protein qua cột tùy
thuộc vào điện tích thực của chúng tại điểm pH tương ứng. Đối với sắc ký trao đổi ion
âm, những protein càng âm sẽ tách giải càng sớm. Trong các loại protein đó thì protein
có điện tích âm lớn sẽ có ái lực với gel nhỏ nhất nên sẽ bị đẩy ra khỏi gel đầu tiên, kế
đến là protein có điện tích âm nhỏ hơn. Vì vậy khi rửa giải bằng dung dịch đệm pH 6
sẽ thu được nhiều hơn 1 phân đoạn.

8


BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

BRADFORD

I.

GIỚI THIỆU
Như đã biết, có nhiều phương pháp định lượng protein như: phương pháp quan
phổ, phương pháp BCA, phương pháp Lowry, phương pháp Bradford… Nhưng trong
quá trình học chúng ta sử dụng phương pháp Bradford.
Phương pháp Bradford thực hiện trên phản ứng của protein với thuốc thử
Bradford được thực hiện trong môi trường acid mạnh.
Nguyên tắc phương pháp này:
- Dựa trên sự biến đổi độ hấp thụ ánh sáng (OD) của Coomassie Brilliant Blue
trong tương tác với protein.
- Trong môi trường acid mạnh, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có
bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ
bước sóng cực đại ở 595 nm.

Hình 1: Công thức cấu tạo của Comassie brilliant blue G250
(Nguồn: Bài giảng Protein và enzyme - Nguyễn Đức Độ)

- Độ hấp thụ ở bước sóng có liên quan chặc chẽ, liên quan trực tiếp tới nồng độ
protein.
Phương pháp Bradford có độ nhạy cao (xác định protein trong khoảng 0,02 – 2
mg/ml), đơn giản, nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, do các protein có độ hấp thụ khác
9


nhau nên cần chú ý chọn loại protein có cấu trúc tương đồng với protein cần xác định
hàm lượng làm chất chuẩn.
II.

NỘI DUNG THỰC HÀNH

1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
 Thiết bị, dụng cụ.
- Máy đo quang phổ.
-

Micropipette và đầu cole.

-

Ống nghiệm thuỷ tinh.

-

Cuvette phastic.

 Hoá chất.
- Dung dịch comassie brilliant blue (CBB) G250.
-

Bovine serum albumin (BSA) 1mg/ml.

-

Cồn tuyệt đối.
2. Tiến hành thí nghiệm
2.1 Xây dựng đường chuẩn BSA.
 Chuẩn bị đường chuẩn

Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240
và 300 µg / ml .
Bảng 1: Bảng pha nồng độ dung dịch chuẩn
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

7

[BSA] ( µg / ml )

0

30

60

120

180

240

300

VBSA ( µl )

0

30

60

120

180

240

300

1000

970

940

880

820

760

700

VNước cất ( µl )

 Quy trình thực hiện
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch BSA và nước cất.
Đánh số thứ tự các ống nghiệm trên khay theo thứ tự từ 2 – 7 (Tương ứng với
nồng độ dãy protein BSA chuẩn).
Bước 2: Lấy đúng thể tích BSA và nước cất theo bảng trên vào các ống nghiệm
vừa đánh số. Lắc đều dung dịch vừa pha.

10


Bước 3: Đánh số các ống nghiệm trên khay theo thứ tự từ 1 đến 7 (Tương ứng
với nồng độ dãy protein BSA chuẩn).
Lấy 100 µl dung dịch từ các ống nghiệm ở bước 2 vào các ống nghiệm vừa
đánh dấu (Hút riêng 1000 µl nước cất cho vào ống nghiệm 1).
Bước 4: Cho 2ml thuốc thử CBB vào ống nghiệm ở bước 3. Lắc đều ống
nghiệm tránh tạo bọt.
Bước 5: Sau 10 phút, tiến hành đo OD 595nm các ống nghiệm ở và ghi nhận kết
quả.
2.2 Định lượng protein có trong mẫu.
 Pha loãng mẫu
Chuẩn bị các mẫu protein: mẫu thô, mẫu trích protein UB, mẫu F 1, mẫu F2 và

mẫu F3 . Trong đó, chỉ có mẫu thô pha loãng 5 lần, các mẫu còn lại không pha loãng.
 Định lượng protein có trong mẫu
Quy trình thực hiện:
Bước 1: Đánh số các ống nghiệm theo thứ tự tương ứng với thứ tự mẫu: UB, F 3
, F1 , F2 và mẫu thô.
Bước 2: Lấy 100 µl dung dịch các mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm trên
(Chú ý mẫu thô lấy mẫu đã pha loãng).
Bước 3: Thêm 2ml dung dịch thuốc thử CBB vào mỗi ống nghiệm trên. Lắc
đều các ống nghiệm tránh tạo bọt.
Bước 4: Sau 10 phút tiến hành đo OD595nm các ống nghiệm và ghi nhận kết quả.
III.

KẾT QUẢ
1. Xây dựng đường chuẩn BSA.
Bảng 2: Kết quả đo OD595nm đường chuẩn BSA

[BSA] ( µg / ml )

0 (Đ/C)

Giá trị OD1

0,654

Giá trị OD2

30

60

120

180

240

300

0,730

0,840

1,024

1,196

1,324

1,415

0,656

0,770

0,862

1,044

1,231

1,350

1,422

Giá trị OD3

0,646

0,759

0,879

1,066

1,235

1,372

1,435

Giá trị ODTB

0,652

0,753

0,860

1,045

1,221

1,349

1,424

ODTB – ODĐ/C

0,000

0,101

0,208

0,393

0,569

0,697

0,772

11


Hình 2: Biểu đồ đường chuẩn BSA
Nhận xét:
- Từ biểu đồ đường chuẩn BSA ta nhận được phương trình hồi quy tuyến tính:
y = 0,0027x + 0,0389 với độ tin cậy R2 = 0,9809
Trong đó:

y là giá trị ODTB – ODĐ/C
x là nồng độ BSA ( µg / ml ).

- Hệ số R2 càng lớn, phân bố càng chuẩn, độ tin cậy càng cao. Từ biểu đồ trên, ta
thấy R2 > 95% chứng tỏ phương tình tuyến tính có độ tin cậy cao và có sự phân bố
chuẩn. Nghĩa là ta có thể xác định được 98,09% hàm lượng protein trong mẫu.
2. Định lượng protein có trong mẫu
Bảng 3: Kết quả đo OD595nm hàm lượng protein trong mẫu
Loại mẫu

UB

F3

F1

F2

mẫu thô

Giá trị OD1

0,748

0,700

0,690

1,000

1,126

Giá trị OD2

0,720

0,653

0,656

0,982

1,149

Giá trị OD3

0,703

0,659

0,669

0,996

1,111

Giá trị ODTB

0,724

0,671

0,672

0,993

1,129

ODTB - ODĐ/C

0,072

0,019

0,020

0,341

0,477

Công thức tính hàm lượng protein trong mẫu:
Nồng độ protein =

y − 0,0389
0,0027

Hàm lượng protein trong mẫu ( mg / ml ) = Nồng độ protein * Hệ số pha loãng * 10-3
Bảng 4: Hàm lượng protein trong mẫu (mg/ml)
12

y

Hệ số

Tổng

[protein]

pha loãng

thể tích

( µg / ml )

(ml)

Hàm lượng protein Hàm lượng pro
trong mẫu

trong mẫu

( mg / ml )

(mg/tổng ml)

UB

0,072

1

175

12,2593

0,0123

2,1525

F3

0,019

1

50

0,0000

0,0000

0,0000

F1

0,02

1

20

0,0000

0,0000

0,0000

F2

0,341

1

55

111,8889

0,1119

6,1545

mẫu thô

0,477

5

88

162,2593

0,8113

71,3944

 Chú ý:
- Sinh viên không được tự ý điều chỉnh máy đo quang phổ .
- Pha loãng mẫu theo sự hướng dẫn của cán bộ phụ trách.
- Đo mẫu có nồng độ từ thấp đến cao.
- Quá trình lắc các ống tránh nghiệm tạo bọt.
IV.

ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Từ kết quả hàm lượng protein trong các mẫu, ta nhận thấy hàm lượng protein
trong mẫu thô cao nhất, kế đến là phân đoạn F2, đến UB, cuối cùng là phân đoạn F 1 và
F3 không chứa protein.
Nguyên nhân:
- Mẫu thô là enzyme của dịch trích ly , chưa được tinh sạch bằng phương pháp
sắc kí trao đổi ion nên chứa các nhiều loại enzyme (protein) khác nhau là các loại
protein bám lẫn không bám trên cột gel. Do đó hàm lượng protein trong mẫu cao nhất.
- Hàm lượng protein chứa trong UB là hàm lượng các loại protein không bám
trên gel có trong dịch trích ly.
- Phân đoạn F1 và F3 không chứa protein do phân đoạn F1 là phân đoạn đầu
trong quá trình rửa giải khi mới thay đổi dung dịch đệm nên có thể protein bám trên
cột gel chưa bị rửa trôi khỏi cột, phân đoạn F 3 là phân đoạn sau cùng trong quá trình
rửa giải của nhóm nên có thể trước đó protein bám trên cột đã được rửa và đẩy hết
khỏi cột. Do đó, ở hai phân đoạn này không chứa protein.
- Phân đoạn F2 là phân đoạn giữa trong quá tình rửa giải của nhóm, khi đó lượng

dung dịch đệm đã đủ để đẩy các protein bám trên cột gel ra ngoài, nên hàm lượng
protein trong phân đoạn này khá cao và cao hơn hẳn các phân đoạn khác. Riêng
nguyên nhân hàm lượng protein trong phân đoạn F 2 cao hơn cả UB là do trong mẫu
dịch trích ly chứa nhiều protein bám trên cột gel hơn các loại protein không bám.
13


14


BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG
PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN
I.
-

THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
Máy đo quang phổ, máy lắc ủ, máy ly tâm tốc độ cao ( 14.000 v/p), cân, …

-

Micropipet 20, 100, 200, 1000; ống eppendorf loại 1,5 ml …

-

Dung dịch đệm Na-phosphate

-

Casein 1% (m/v)

-

Dung dịch acid Trichloroacetic 15% (w/v)

-

Tyrosin 1µmol/ml

II.

TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. Dựng đường chuẩn Tyrosin
- Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
-

Dựng đường chuẩn Tyrosin theo bảng sau:
Bảng 1. Nồng độ Tyrosin

Ống nghiệm
[Tyrosin] (µmol/ml)
VTyrosin (µl)
Pha loãng (µl)

1
0
0
1500

2

0,2
300
1200

3
0,4
600
900

4
0,6
900
600

5
0,8
1200
300

6
1,0
1500
0

Bảng 2. Số liệu có được khi đem đo OD ở bước sóng 280nm:
Ống nghiệm

1

2

3

4

5

6

Lần 1

0,088

0,124

0,155

0,194

0,221

0,249

Lần 2

0,087

0,123

0,153

0,190

0,217

0,250

Lần 3

0,088

0,122

0,156

0,183

0,215

0,253

Trung bình

0,087667

0,123

0,154667

0,189

0,217667

0,250667

Trung bình hiệu
chỉnh

0

0,035333

0,067

0,101333

0,13

0,163

15


Hình 1: Biểu đồ đường chuẩn Tyrosin
2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến
Thí nghiệm được tiến hành trong các ống eppendorf. Tương ứng mỗi mẫu
enzyme, ta thực hiện một mẫu đối chứng để khi đo độ hấp thụ ta chuyển giá trị mẫu
đối chứng về 0. Dựa vào hàm lượng protein chọn độ pha loãng là: 1 và mẫu thô là 5.
Các bước đo hoạt tính mẫu đối chứng emzyme

16

Các bước đo hoạt tính mẫu


180 µl đệm phosphate pH 7,5
20 µl enzyme
↓ Ủ 370C, 20 phút
Bổ sung 600 µl Casein 1%
↓ Lắc ủ 10 phút, 370C
Bổ sung 600 µl TCA 15%
↓ Ổn định 40C, 10 phút
Ly tâm 10.000 v/p, 10 phút, 40C
↓
Đo độ hấp thụ ở 280 nm

180µl dung dich đệm
20µl enzyme
↓ Ủ 370C, 20 phút
Bổ sung 600 µl TCA 15%
↓ Lắc ủ 10 phút, 370C
Bổ sung 600 µl Casein 1%
↓ Ổn định 40C, 10 phút
Ly tâm 10.000 v/p, 10 phút 40C
↓
Đo độ hấp thụ ở 280 nm

Số liệu có được khi đem đo mẫu với đối chứng ở bươc sóng 280 nm.

Bảng 3. Giá trị OD của mẫu ở bước sóng 280nm

OD
Đối chứng

UB
0,310

Thô
0,324

F1
0,291

F2
0,286

F3
0,286

Lần 1

0,341

0,848

0,320

0,378

0,309

Lần 2

0,335

0,877

0,309

0,415

0,318

17


Lần 3

0,348

0,817

0,320

0,384

0,319

Trung bình

0,341

0,847

0,316

0,392

0,315

Trung bình
hiệu chỉnh

0,031

0,523

0,025

0,106

0,029

Từ phương trình đường chuẩn ta suy ra được hàm lượng tyrosin trong dịch thủy phân.
Bảng 4. Hàm lượng Tyrosin trong dịch thủy phân
Khối lượng
Tyrosin
(µM/ml)

UB

Thô

F1

F2

F3

1,9

17,086

1,716

4,216

1,839

3. Tính toán kết quả:
Đơn vị hoạt tính enzyme trong 1ml enzyme được tính theo công thức:
U = [(a x Vt)/(T x VE)] x k*
Trong đó:
U: Hoạt tính trong 1ml dung dịch enzyme
a: Nống độ Tyrosin trong dung dịch thủy phân (µM/ml)
Vt: Thể tích tổng dung dịch phản ứng (1400µl)
T: Thời gian phản ứng (10 phút)
VE: Thể tích enzyme (20µl)
k*: hệ số pha loãng
Theo tính toán ta có được đơn vị hoạt tính.
Bảng 5. Giá trị đơn vị hoạt tính

Đơn vị hoạt
tính

UB

Thô

F1

F2

F3

13,3

598,01

12,012

29,512

12,873

Đơn vị hoạt tính riêng: U-mg = U/[Protein tổng]
Bảng 6. Giá trị hoạt tính riêng
Đơn vị họạt
tính riêng

UB

Thô

F1

F2

F3

6,179

8,25

0

4,795

0

Độ tinh sạch có đượclà 0.58.
III.

ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

18


BÀI 5: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE( SDS – PAGE)
I.

GIỚI THIỆU CHUNG

Sau khi tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký ta thu được enzyme mục
tiêu, nhưng liệu rằng enzyme vừa qua sắc ký đã thuần khiết hay chưa? Để trả lời cho
câu hỏi này, kĩ thuật điện di được ra. Điện di là phương pháp kiểm định độ tinh sạch
của enzyme dựa trên sự khác nhau về trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện pI giữa
chúng.
Có hai kĩ thuật điện di đó là: Điện di một chiều( SDS – PAGE) và điện di hai
chiều( IEF).
- Điện di một chiều( SDS – PAGE): Là phương pháp phân tách protein dựa trên
trọng lượng phân tử. Trong kĩ thuật này, protein được xử lí bằng tác nhân gây biến tính
2 – mercaptoethanol, sau đó với sự có mặt của SDS làm cho tất cả protein đều tích
điện âm, protein có kích thước càng lớn thì tích điện càng nhiều. Tiếp theo, dưới tác
động của điện trường protein di chuyển trong gel polyacrylamide với vận tốc tuỳ thuộc
vào kích thước phân tử, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn
những protein có kích thước nhỏ khi đi qua những lỗ gel có kích thước nhất định.
Điện di hai chiều( IEF): Là phương pháp điện di phân tách protein dựa trên kích
thước phân tử và điểm đẳng điện pI của chúng. Trong kĩ thuật này có hai chiều điện di:
chiều thứ nhất protein được tách ra dựa trên điểm đẳng điện pI của chúng, ở pH mà
protein không tích điện và không di chuyển trong điện trường. chiều thứ hai dưới tác
dụng của điện trường do protein mang điện tích âm sau khi cân bằng trạng thái nên
protein sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương, khi protein di chuyển qua gel
polyacrylamide, sự cọ sát của các hạt acrylamide với phân tử protein tạo ra lực kháng
làm ngăn cản sự di chuyển của protein, protein có trọng lượng phân tử càng lớn thì lực
cản càng mạnh.
Ở đây chỉ khảo sát phương pháp điện di một chiều trên các phân đoạn của giai
đoạn sắc kí dịch nước khóm.

II. NỘI DUNG THỰC HÀNH
1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

 Thiết bị, dụng cụ.

- Máy khuấy từ, cân phân tích, cân điện tử, vortex, hệ thống điện di mini
protein III (Bio – Rad), máy lắc bàn, máy đo pH, tủ hút,...
- Dụng cụ: bộ micropipette( 20, 100, 200, 1000, 5000 µl), giá để ống eppendorf,
ống eppendorf, đầu cole vàng, đầu cole xanh, găng tay, cá từ, chai bia, cốc thuỷ tinh,
cốc nhựa,...
19


 Hoá chất.
-

Dung dịch acrylamide.

-

Dung dịch đệm Tris – HCl 1,5M pH 8,8.

-

Dung dịch đệm Tris – HCl 0,6M pH 6,8.

-

Amonium persulphat( APS).

-

Sodium dodecyl sulphat( SDS).

-

Tetramethylethylenediamine( TEMEDE).

-

Sample buffer.

-

β-mercaptoethanol.

-

Dung dịch điện di.

-

Dung dịch nhuộm gel và dung dịch rửa gel.
2. Tiến hành thí nghiệm

Bước 1. Chuẩn bị hộp điện di: Khuôn, lược cài, hộp điện di phải được rửa sạch
và lau khô bằng cồn. Sau đó ráp thành khuôn chuẩn bị đổ gel.
Bước 2. Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10%: Pha hỗn hợp 3,3 ml nước
cất, 4 ml acrylamide, 2,5 ml Tris – HCl pH 8,8, 100µl SDS 10%, 100µl APS10%, 4µl
TEMED khuấy bằng máy khuấy từ, nhanh chóng chuyển hỗn hợp dung dịch gel vào
khung kiếng đổ gel( sử dụng micropipette 1000ml), gel được bơm đến vạch cách đáy
răng lược khoảng 0,5cm( tránh tạo bọt trong khuôn gel), sau đó bơm tiếp một lượng
nước cất lên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Đợi gel đông khoảng 15 – 20

phút.
Bước 3. Chuẩn bị gel tập trung 4%: Pha hỗn hợp 2,7 ml nước cất, 0,67 ml
acrylamide, 0,5 ml Tris – HCl pH 6,8, 40µl SDS 10%, 40µl APS10%, 4µl TEMED
khuấy bằng máy khuấy từ, nhanh chóng chuyển hỗn hợp dung dịch gel vào khung
kiếng đổ gel( sử dụng micropipette 1000ml), răng lược được đưa vào cẩn thận để trách
tạo bọt khí phía dưới răng lược. Gel tập trung sẽ đông lại sau 20 phút.
Bước 4. Chuẩn bị mẫu protein: Thêm β-mercaptoethanol vào sample buffer
trước khi sử dụng. Trộn mẫu protein với sample buffer theo tỉ lệ:
-

Thô : Sample buffer theo thể tích 20µl : 20 µl.

-

UB : Sample buffer theo thể tích 50µl : 5 µl.

-

F1: Sample buffer theo thể tích 50µl : 5 µl.

-

F2: Sample buffer theo thể tích 50µl : 10 µl.
20


-

F3: Sample buffer theo thể tích 50µl : 5 µl.
Lắc đều và đun cách thuỷ ở 100°C trong 10 phút, sau đó để nguội.

Bước 5. Bơm mẫu protein vào các giếng: Sau khi gel tập trung đông, lắp bộ
khung đổ gel vào hộp điện di, thêm dung dịch điện di ngập hoàn toàn tấm kiếng giữ
gel, cẩn thận lấy lược ra lần lượt bơm mẫu vào giếng( 5µl protein chuẩn, 20µl dung
dịch protein).
*Lưu ý:
-

Không để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh.

-

Ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng để dễ thảo luận.

Bước 6. Chạy điện di: sau khi bơm mẫu xong, đậy nắp hộp điện di lại và cho
dòng điện đi qua. Dòng điện chạy điện di là 25mA hoặc 80V, sau khoảng 2 giờ thì kết
thúc quá trình điện di.
Bước 7. Nhuộm gel: Lấy gel ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch
nhuộm gel trong khoảng 1 giờ.
Bước 8. Tẩy màu: Rửa gel bằng vi sóng. Cho gel vào nước cất rửa gel bằng vi
sóng trong khoảng 1 -2 phút, lặp lại 3 lần, mỗi lần kết thúc vi sóng thay nước cất mới.
Rửa gel bằng dung dịch tẩy trong khoảng 4-5 giờ lặp lại quá trình rửa tới khi phát hiện
các băng protein hiện rõ trên gel.
III.

KẾT QUẢ
Bảng 1. Sự tương quan giữa trọng lượng protein và giá trị Rf

Trọng
lượng

protein
chuẩn(KD)

14,4

18,4

25

35

45

66,2

116

logM

1,16

1,26

1,4

1,54

1,65

1,82

2,06

Giá trị Ri

0,7

1,2

1,8

2.3

3,0

3,8

4,3

Giá trị RB

5,1

5,1

5,1

5,1

5,1

5,1

5,1

Giá trị Rf

0,84

0,76

0,59

0,45

0,35

0,23

0,14

Ghi chú:
Các giá trị làm tròn chữ số thập phân đến hàng trăm.
Công thức tính Rf: Rf

21


Hình 1. Thể hiện sự tương quan giữa trọng lượng protein và Rf

Nhận xét:
Từ biểu đồ ta thu được phương trình hồi quy tuyến tính sau:
y = -0,8124x + 0,8001 với hệ số tương quan R2= 0,9673.
Trong đó:
y: là giá trị Rf.
x: là giá trị log của trọng lượng protein chuẩn (logM), đưa log của protein có
trọng lượng thấp nhất về 0 ⇒ logM = x + 1,16.
Biểu đồ thể hiện khi trọng lượng protein càng lớn thì Rf càng nhỏ.

Hình 2. Mẫu gel điện di SDS-PASGE
Bảng 2. Các giá trị Rf và trọng lượng phân tử protein có trong mẫu.
Các giá trị

Ri

RB

Rf

22

logM

M
(KD)


Thô

UB

4,8
3,4
2,8
3,2

5,1
5,1
5,1
5,1

0,941
0,667
0,549
0,627

1,142
1,324
1,469
1,373

13,87
21,08
29,44
23,60

F2

2,7

5,1

0,529

1,493

31,12

Ghi chú:
logM được tính theo công thức: logM
IV.

+ 1,16.

ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Trong mẩu thô có chứa 3 protein, UB chứa 1 protein và F2 chứa 1 protein.

Bromelain nằm trong mẩu thô và F2 với trọng lượng phân tử trong khoảng 29 31 kDa.
Phân đoạn F1 và F3 không cho kết quả rõ ràng do không có protein hoặc trong
quá trình điện di xảy ra sai sót ở bước cho mẫu vào giếng gel.

23