PHÚC TRÌNH THỰC tập VI SINH vật môi TRƯỜNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÚC TRÌNH THỰC TẬP
VI SINH HỌC MÔI TRƯỜNG
MÃ HỌC PHẦN: CS107

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. Nguyễn Thị Liên

SINH VIÊN THỰC HIỆN
Nguyễn Thị Kiều Nga

B1303685

Nguyễn Bảo Ngọc

B1303689

Đỗ Đình Thao

B1303719

Cần Thơ, 10/2015


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Bài 1:

Trường Đai học Cần Thơ

QUAN SÁT VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU NƯỚC

1. Mẫu nước rạch hẻm 51
Các vi sinh vật quan sát được: phacus, tảo silic, vi khuẩn hình cầu.
2. Mẫu nước ao cá tra
Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn, tảo, nguyên sinh động vật, trùng roi.
3. Mẫu nước ao tù

Các vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn, tảo, nguyên sinh động vật.
4. Mẫu nước ao sen
Các vi sinh vật quan sát được: tảo mắt, tảo lục

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

1

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

5. Mẫu nước cống căn tin KTX khu A
Vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn

6. Mẫu nước rỉ rác
Vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn

7. Mẫu nước sông lớn
Không có vi sinh vật
8. Mẫu nước cửa sông
Vi sinh vật quan sát được: vi khuẩn

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

2

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Bài 2:

Trường Đai học Cần Thơ

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE
TỪ ĐẤT VÙNG RỄ CÂY PHƯỢNG

I. Giới thiệu
Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose.
Cellulose chiếm tới 35-50% khối lượng khô sinh khối thực vật. Tất cả sản phẩm sinh
khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật. Hệ
thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và không được an toàn. Tuy nhiên
trong khoảng thời gian ngắn (khoảng 48h) thì hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của bò có thể
phân giải tới 65% cellulose. Hơn thế nữa, nhờ hệ vi sinh vật trong đường ruột mà loài
mối có thể tiêu hóa đến 90% cellulose của gỗ. Trong hệ thống sinh học phức tạp như
rễ cây hoặc những mảnh vỡ thực vật trong đất, cellulose có thể được phân hủy trong

thời gian chậm hơn (Schwarz, 2001). Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men
hiếu khí hoặc kỵ khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt. Các vi sinh vật có thể phân giải
cellulose gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn được tìm thấy trong đất, nước hoặc đường
tiêu hóa của một số động vật – nơi cung cấp lượng cellulose dồi dào để vi sinh vật
phân giải và phát triển.

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

3

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

Đồng bằng sông Cửu Long là vùng chuyên canh cây lúa, hằng năm thải ra một
lượng lớn rơm rạ. Một lượng rất ít rơm rạ được sử dụng để trồng nấm hay làm thức ăn
cho gia súc, phần lớn còn lại được xử lí theo phương pháp truyền thống là đốt trực tiếp
trên đồng ruộng. Điều này gây ra nhiều hậu quả như góp phần làm ô nhiễm không khí
và phá hủy hệ sinh thái đất làm cho đất ngày càng bạc màu. Một biện pháp nhằm tận
dụng rơm rạ có hiệu quả hơn là sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose giúp
phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ bón cho đất, góp phần cải thiện độ phì nhiêu cho
đất (Cao Ngọc Điệp et al., 2011).
Ngoài ra, cellulose là chất hữu cơ được tổng hợp nhiều nhất trên thế giới hiện
nay, có khoảng 60-90 tỷ tấn hằng năm được các loài thực vật tạo ra. Đây cũng là loại
polymer được sử dụng nhiều nhất (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,…). Ở cấp độ
sinh quyển, hàng tỷ tấn cellulose được tạo ra mỗi năm cần phải được phân hủy, nếu
không chúng sẽ tích tụ lại và gây nguy hiểm cho hệ sinh thái. Việt Nam là một nước

nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú và đa dạng. Enzyme
cellulose là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân cellulose thông qua việc thủy
phân liên kết 1,4- β – glucosid trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung cấp cho
công nghiệp lên men. Nguồn thu enzyme cellulose lớn nhất hiện nay là vi sinh vật.
II. Phương tiện và phương pháp
1. Phương tiện
-

Nguồn mẫu: đất vùng rễ cây phượng

-

Môi trường phân lập: phân lập trên môi trường với nguồn carbon là CMC
(Carboxymethyl cellulose)

Thành phần môi trường: (NH4)2SO4

1g

K2HPO4

1g

MgSO4.7H2O

0,5g

NaCl

0,001g

CMC

10g

Agar

20g

Thêm nước cất cho đủ 1 lít
pH = 7.0

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

4

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

-

Trường Đai học Cần Thơ

Dụng cụ và thiết bị: cân, máy khuấy từ, bình tam giác, tủ ủ vi sinh vật, tủ cấy
vô trùng, kim cấy, que cấy trải thủy tinh, đĩa Petri, đèn cồn, nồi khử trùng
nhiệt ướt, micropipette,…

2. Phương pháp

Các bước thực hiện:
-

Cân khoảng 10 g đất

-

Cho đất vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng

-

Khuấy đều trong 30 phút

-

Để lắng trong khoảng 15 phút

-

Lấy 50 µl phần dịch trong phía trên trải lên môi trường

-

Ủ ở 300C cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc (từ 2-3 ngày)

-

Chọn khuẩn lạc đơn cấy chuyển sang môi trường mới

-

Lặp lại bước trên cho tới khi ròng

-

Lấy mẫu làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đai 400 lần để
xác định độ thuần của mẫu phân lập (tất cả các tế bào trên thị trường quan sát
có sự đồng nhất về hình dạng, ghi nhận (có thể chụp hình lại) hình dạng tế
bào vi khuẩn (que/cầu, kết đôi/đơn/kết chuỗi/kết đám) và khả năng chuyển
động (chuyển động thật/Brown).

-

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: hình dạng, dạng bìa, độ nổi, kích thước, bề mặt
(ướt/khô, phẳng/nhăn/gấp nếp), màu sắc.

-

Vi khuẩn thuần chủng.

III. Kết quả.

-

Nguyễn Thị Kiều Nga:
Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được:

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

5

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

-

Trường Đai học Cần Thơ

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc:

+ Hình dạng: tròn
+ Dạng bìa: nguyên
+ Độ nổi: mô
+ Màu sắc: trắng đục
+ Kích thước khuẩn lạc đo ở thời điểm sau khi cấy: 0,2 cm
+ Bề mặt khuẩn lạc: ướt, phẳng
- Đặc điểm của tế bào vi khuẩn:
+ Hình dạng: que ngắn
+ Dạng liên kết của các tế bào: kết đôi
+ Khả năng chuyển động thật: có chuyển động thật, vừa.

-

Nguyễn Bảo Ngọc:
Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được:

Khuẩn lạc Vi Khuẩn
-

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc:

+ Hình dạng: tròn
+ Dạng bìa: bìa nguyên
+ Độ nổi: mô
+ Màu sắc: trắng đục
+ Kích thước khuẩn lạc đo ở thời điểm sau khi cấy: 2 mm
+ Bề mặt khuẩn lạc: ẩm ướt, phẳng
- Đặc điểm của tế bào vi khuẩn:
Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

6

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

+ Hình dạng: que ngắn
+ Dạng liên kết của các tế bào: kết đôi
+ Khả năng chuyển động thật: có chuyển động thật, vừa.

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

7

Công nghệ sinh học K39

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

 Đỗ Đình Thao:
- Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được:

- Mô tả đặc điểm khuẩn lạc:
+ Hình dạng: tròn
+ Dạng bìa: bìa nguyên
+ Độ nổi: lài
+ Màu sắc: vàng nhạt
+ Kích thước khuẩn lạc đo ở thời điểm sau khi cấy: 2,2 mm
+ Bề mặt khuẩn lạc: khô, nhăn
- Đặc điểm của tế bào vi khuẩn:
+ Hình dạng: hình cầu
+ Dạng liên kết của các tế bào: kết đôi, kết chuỗi và kết đám
+ Khả năng chuyển động thật: không

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

8

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Bài 3:

Trường Đai học Cần Thơ

KIỂM TRA KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CMC
CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC

I. Mục tiêu.
Kiểm tra khả năng thủy phân CMC của dòng vi khuẩn phân lập được và khảo sát
một số đặc tính khác.
II.Phương tiện và phương pháp nghiên cứu.
1. Phương tiện
- Vi khuẩn đã phân lập ròng, cấy trên môi trường CMC, ủ ở 300 trong 3 ngày.
- Thuốc nhuộm Congo Red, dung dịch muối NaCl.
- Hóa chất nhuộm Gram.
- Que cấy, lam, nước cất, đèn cồn, cồn.
2. Phương pháp
2.1. Kiểm tra khả năng thủy phân CMC của vi khuẩn phân lập
-

Dùng que cấy lấy sinh khối của vi khuẩn trải trên đĩa Petri và chấm lên môi

trường CMC, ủ ở 300C trong khoảng 3 ngày, sau đó dĩa môi trường được nhuộm với
dung dịch Congo Red (1g/L) trong 15 phút. Cuối cùng đổ hết dung dịch Congo Red ra
và rửa dĩa môi trường với dung dịch muối NaCl 1M. Vi khuẩn thủy phân CMC sẽ tạo
ra vùng không màu xung quanh khuẩn lạc (vòng halo).
-

Công thức tính khả năng thủy phân:

(Đường kính vòng halo – Đường kính khuẩn lạc)/Đường kính vòng halo x 100
2.2. Thử nghiệm catalase
Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau 24 – 48 giờ ủ. Chuyển
sinh khối lên miếng lam. Nhỏ lên sinh khối một giọt H 2O2 3%. Quan sát nhanh sự hình
thành bọt khí và ghi nhận kết quả.
- Dương tính: khi có sự hình thành bọt khí.
- Âm tính: không có sự hình thành bọt khí.
2.3. Thử nghiệm oxydase
Nhỏ khoảng 3 – 4 giọt nước cất lên miếng lam vô trùng, sau đó để giấy lọc có
tẩm thuốc thử oxydase vào, lấy sinh khối vi khuẩn trên môi trường sau 24 – 48 giờ ủ,
dùng que cấy trải đều sinh khối trên giấy lọc nơi có thuốc thử oxydase. Quan sát màu
sau khoảng 10 giây.
- Dương tính: xuất hiện màu xanh đậm
Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

9

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

- Âm tính: không xuất hiện màu
2.4. Nhuộm Gram vi khuẩn phân lập được
Quy trình nhuộm Gram:
- Lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cho vào một giọt nước cất trên miếng lam và cố
định mẫu.
- Nhỏ vào mẫu đã cố định 1 giọt Crystol violet, để yên trong 1 phút, sau đó rửa

bằng nước cất.
- Nhỏ vào 1 giọt Lugol, để yên trong 1 phút, sau đó lần lượt với nước cất, cồn,
nước cất.
- Nhỏ vào 1 giọt Safranine, để yên trong 1 phút, sau đó rửa lại với cồn, hơ miếng
lam cho khô rồi quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 40X.
Vi khuẩn bắt màu xanh của Lugol là vi khuẩn Gram dương, do vách tế bào dày.
Vi khuẩn bắt màu hồng của Safranine là vi khuẩn Gram âm, do vách tế bào mỏng
nên Lugol đã bị cồn rửa trôi.
III.

Kết quả.

 Nguyễn Thị Kiều Nga:
1. Khả năng thủy phân CMC
Có khả năng thủy phân CMC khá cao do tạo được vòng halo xung quanh khuẩn
lạc trên môi trường CMC sau khi nhuộm với Congo Red và rửa bằng NaCl.

2. Thử nghiệm catalase
Dương tính: xuất hiện bọt khí khi cho H2O2 vào sinh khối khuẩn lạc.

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

10

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

3. Thử nghiệm oxydase
Âm tính: không xuất hiện màu quanh giấy lọc.
4. Nhuộm Gram
Vi khuẩn Gram âm: tế bào vi khuẩn có màu hồng.


Nguyễn Bảo Ngọc:

1. Khả năng thủy phân CMC

Mẫu đối chứng

Mẫu thực nghiệm

Không có khả năng thủy phân CMC do không tạo được vòng halo xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường CMC sau khi nhuộm với Congo Red và rửa bằng NaCl.

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

11

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

2. Thử nghiệm catalase

Dương tính: xuất hiện bọt khí khi cho H2O2 vào sinh khối khuẩn lạc.

3.Thử nghiệm oxydase
Dương tính: Xung quanh giấy xuất hiện màu xanh
4. Nhuộm Gram
Vi khuẩn Gram âm: tế bào vi khuẩn có màu hồng.

 Đỗ Đình Thao:
1. Khả năng thủy phân CMC
Không có khả năng thủy phân CMC do không tạo được vòng halo xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường CMC sau khi nhuộm với Congo Red và rửa bằng NaCl.
Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

12

Công nghệ sinh học K39


Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Trường Đai học Cần Thơ

2. Thử nghiệm catalase
Dương tính, có hình thành bọt khí
3.Thử nghiệm oxydase
Âm tính: trên giấy xuất hiện màu xanh
4. Nhuộm Gram
Vi khuẩn Gram âm: tế bào vi khuẩn có màu hồng

Phúc trình thực tập vi sinh môi trường

13

Công nghệ sinh học K39