Nghiên cứu, xác định đồng thời hàm lượng vitamin a, d2, d3 trong một số thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG MỘT SÔ
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI
HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D2, D3 TRONG MỘT SÔ
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. MAI THỊ THANH HUYỀN

NGHỆ AN - 2015


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề - Khoa
Hóa, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực Phẩm và Môi trường, Trường Đại
học Vinh.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:
• TS. Mai Thị Thanh Huyền - Bộ môn Hóa Phân tích, Trường Đại học
Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
• PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa, PGS.TS. Trần Đình Thắng, TS. Đinh
Thị Trường Giang - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận
lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận văn.
• ThS. Chu Thị Thanh Lâm - Phòng thí nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại học
Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm.
Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô, Cán bộ bộ
môn Hóa Hữu cơ, Hóa Phân tích - Khoa Hóa, Phòng Đào tạo Sau Đại học,
các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã
động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Nghệ An, tháng 10 năm 2015
Tác giả

Nguyễn Thị Mai Hương

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6
MỞ ĐẦU 11

1. Lý do chọn đề tài 11
2. Mục đích nghiên cứu 12
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 12
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 12
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 13

1.1. Vitamin D 13
1.1.1. Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi 13
1.1.2. Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể 17
1.2. Vitamin A 20
1.2.1. Giới thiệu 20
1.2.2. Vai trò của vitamin A 22
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể 24
1.3. Các phương pháp xác định vitamin A và D 24
1.3.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học 24
1.3.2. Phương pháp quang phổ 25
1.3.3. Các phương pháp xét nghiệm miễn dịch 26
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 37

2.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 37

2.1.1. Hóa chất 37


5
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ 37
2.2. Thu thập và bảo quản mẫu 38
2.3. Xử lý mẫu 38
2.4. Chuẩn bị các dung dịch vitamin cho phép đo HPLC 38
2.5. Lựa chọn và cài đặt, vận hành thiết bị HPLC 39
2.6. Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích 40
2.7. Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin A, D2, D3 trong dung
dịch 40
2.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động 40
2.9. Phương pháp khảo sát đánh giá 40
2.9.1. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn định lượng của phương
pháp 40
2.9.2. Giới hạn phát hiện (LOD) 42
2.9.3. Giới hạn định lượng (LOQ) 42
2.9.4. Xác định độ lặp lại (repeatability) 43
2.9.5. Xác định độ thu hồi 44
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1. Các thông số khảo sát 45
3.3. Khảo sát các điều kiện phân tích trên HPLC 45
3.3.1. Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của vitamin D2, D3, A trong
dung dịch 45
3.3.2. Lựa chọn cột phân tích cho máy HPLC 46
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động 47
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 51
3.3.5. Kết quả khảo sát phương pháp đo lập phương pháp chạy

chuẩn vitamin A, D2, D3 52
3.4. Xây dựng đường chuẩn của vitamin 52


6
3.5. Khảo sát độ lặp lại của máy 56
3.6. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp 56
3.7. Xác định hiệu suất thu hồi 58
3.8. Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 60
KẾT LUẬN 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65
PHỤ LỤC 68

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
25(OH)D

:

25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2

:

25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3

:

25-hydroxyl vitamin D3

BHT

:

butylate hydroxytoluen.

BSTFA

:

N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

DM

:

Chất khô(dry matter).

EtOH

:

Etanol

FTIR

:

Phép phân tích Fourier hồng ngoại (Fourier transform infrared)

HPLC

:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IT

:

Bẫy ion ( Ion trap)

IS

:

Chất nội chuẩn(internal standard)

LC

:

Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)

MeOH

:

Metanol

MS

:

Phổ khối (Mass spectrometry)

MTBE

:

Methyl-tert-butyl ether.

SPE

:

chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

UPLC

:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

UV

:

Tia tử ngoại


7
DAD

:

Đầu dò mảng diot

RMSE

:

Độ lệch khởi động (root mean square error)

THF

:

Tetra hydro furan

ACN

:

Aceton nitril

LOD

:

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ

:

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang


9
Hình 1.1. Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D 14
Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi [12]. 20
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu 39
Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS của vitamin D2 46
Hình 3.2. Sắc ký đồ của vitamin A, D2, D3 ở tốc độ dòng 0,3 ml/phút cột C8
46
Hình 3.3. Sắc ký đồ của vitamin A, D2, D3 ở tốc độ dòng 0,5ml/phút cột C18
47
Bảng 3.1. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ
MeOH:THF 47
Hình 3.4. Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:THF 48
Hình 3.5. Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:MTBE 49

Bảng 3.2. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ
MeOH:MTBE 49
Hình 3.6. Sắc ký đồ các vitamin khi thay đổi tỷ lệ MeOH:ACN 50
Bảng 3.3. Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đổi tỷ lệ
MeOH:ACN 50
Hình 3.7. Sắc ký đồ của các vitamin ở các tốc độ dòng khác nhau 51
Bảng 3.4. Sắc ký đồ của vitamin D2 ở dòng 1 ml/phút (a) và 0,5 ml/phút (b)
52
Bảng 3.5. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitA 53
Bảng 3.6. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D2 53
Bảng 3.7. Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D3 53
Hình 3.8. Peak của các nồng độ vitamin D2, D3, A trong đường chuẩn xếp
chồng lên nhau 54
Hình 3.9. Đường chuẩn vitamin A 54
Hình 3.10. Đường chuẩn vitamin D2 55
Hình 3.11. Đường chuẩn vitamin D3 55


10
Bảng 3.8. Độ lặp lại của máy HPLC 56
Bảng 3.9. LOD, LOQ của vitamin A 57
Bảng 3.10. LOD, LOQ của vitamin D2 57
Bảng 3.11. LOD, LOQ của vitamin D3 58
Bảng 3.12. Kết quả xác định hiệu xuất thu hồi đối với các vitamin 59
Bảng 3.13. Tổng hợp các điều kiện phân tích vitamin A, D2, D3 60
Bảng 3.14. Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 60
Hình 3.12. Sắc đồ mẫu cà rốt 61
Hình 3.13. Sắc đồ mẫu gan bò 61
Hình 3.14. Sắc đồ mẫu gan cá Tra 61
Hình 3.15. Sắc đồ mẫu gan gà 62

Hình 3.16. Sắc đồ mẫu nấm sò 62
Hình 3.17. Sắc đồ mẫu nấm đông cô 62
Hình 3.18. Sắc đồ mẫu nấm đùi gà 63
Hình 3.19. Sắc đồ mẫu nấm Linh chi 63
Hình 3.20. Sắc đồ mẫu gan lợn 63


11
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Vitamin là một chất không sinh năng lượng nhưng nó không thể thiếu
trong sự sống của con người. Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong các
phản ứng sinh hóa, từ quá trình trao đổi chất, đến xây dựng hệ thống miễn
dịch trong cơ thể. Mỗi loại vi chất có những công dụng riêng và đều chứa
trong nguồn thực phẩm hàng ngày. Vitamin giúp chuyển hóa tối đa chất dinh
dưỡng thành năng lượng sống cho cơ thể, tăng cường sức đề kháng, bảo vệ cơ
thể.Cơ thể con người cần 13 loại vitamin: A, C, D, E, K và 8 loại vitamin
thuộc nhóm B nhưng cơ thể con người chỉ tổng hợp được vitamin D khi có
ánh sáng mặt trời. Chính vì vậy cơ thể lấy vitamin từ nguồn bên ngoài là chủ
yếu, có thể lấy vitamin từ thức ăn, đồ uống chứa nhiều vitamin như các lại
rau, củ, trái cây…
Vitamin D và vitamin A là hai vitamin thuộc nhóm vitamin tan trong
dầu. Vitamin A rất cần thiết cho thị giác, cho sự tăng trưởng, sự phát triển và
duy trì của biểu mô. Vitamin A có nhiều trong gan, thận động vật, các chế
phẩm từ sữa, trứng và dầu gan cá. Thiếu vitamin A gây hiện tượng tăng sừng
da, khô mắt, quáng gà lúc xẩm tối.Vitamin Dcó chức năng sinh học là duy trì
nồng độ canxi và phốt pho bình thường trong huyết tương bằng cách tăng
hiệu quả hấp thụ các chất khoáng từ khẩu phần ăn ở ruột non và tăng huy
động canxi, phốt pho từ xương và máu. Vitamin D có nhiều trong gan cá, bơ,
sữa, trứng, nấm… Thiếu vitamin D sẽ gây còi xương ở trẻ em, yếu cơ.

Vitamin cần thiết cho cơ thể nhưng thừa vitamin cũng có thể gây nên những
vấn đề nghiêm trọng. Trái với nhóm các vitamin tan trong nước khi thừa đều
thải ra theo đường nước tiểu thì các vitamin tan trong dầu được dự trữ ở gan
với các mức độ khác nhau. Với một lượng vitamin A, D quá cao có thể gây


12
ngộ độc cho cơ thể. Nếu thừa vitamin A trong thời gian dài gây đau xương
khớp, rụng tóc, môi khô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to. Còn khi dùng với liều
cao D2, D3 hàng nghìn lần liều phòng có thể gây ngộ độc. Các triệu chứng hay
gặp là kém ăn, buồn nôn, nóng, tiểu nhiều, ngừng lớn, xanh xao, đôi khi gây
co giật khó thở.
Với những đặc điểm trên, kiểm soát và bổ sung hàm lượng vitamin phù
hợp là rất quan trọng, nhất là khi trên thị trường ngày càng xuất hiện nhiều
loại thực phẩm chế biến sẵn có bổ sung vitamin A và D. Vì vậy việc phân tích
hàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng một
quy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xây
dựng bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm địa phương.Có nhiều phương
pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong thực phẩm, trong
đó phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép phân tích với độ nhạy và
độ chọn lọc cao. Vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU, XÁC
ĐỊNH ĐỒNG THỜI HÀM LƯỢNG VITAMIN A, D 2, D3 TRONG MỘT SÔ
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng được phương pháp xác định đồng thời hàm lượng vitamin A,
D2, D3 trên máy HPLC.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội
tụ, độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp.

- Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin A,
D2, D3trong một số thực phẩm
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong một số thực phẩm gan, cà rốt và nấm.


13
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vitamin D
1.1.1. Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi
Vitamin D là tinh thể không màu không mùi không vị, không tan trong
nước mà tan trong chất béo và các dung môi hữu cơ. Nó được phát hiện ra
năm 1922, được phân lập năm 1932, tìm được cấu trúc năm 1936, và đến năm
1959 được tổng hợp nhân tạo. Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm
sterol có cấu trúc tương tự nhau, có khả năng làm tăng hấp thụ canxi và
photphat trong cơ thể chống bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương hay xốp
xương ở người già. Nhóm chất này gồm từ D 2 đến D7 song quan trọng nhất là
D2 (ergocalciferol được tổng hợp từ ergosterol có nhiều trong nấm và men
bia), D3(cholecalferol có trong thịt, cá, gan, trứng, sữa... được tổng hợp từ 7dehydrocholeterol ở dưới da nhờ ánh sáng tia từ ngoại). Trong cơ chế sinh
học, đặc tính và vai trò của chúng khá giống nhau. Trong cơ thể vitamin D
chuyển hoá ở gan và thận tạo ra chất chuyển hoá có đặc tính là 1,25
-dihydroxycholecalciferol nhờ enzim deoxylase.
Vitamin D có vai trò quan trọng trong quá trình tạo xương và răng nhờ
có tác dụng chuyển hoá và tăng hấp thu canxi và phot pho ở ruột. Bên cạnh
đó, canxi cũng cần thiết cho hoạt động của tim, cơ bắp và hệ thần kinh, đồng
thời tham gia vào quá trình đông máu. Ở trẻ nhỏ vitamin D tham gia vào quá
trình canxi hoá sụn nên rất cần thiết cho sự phát triển xương ở trẻ. Trẻ em bị
thiếu vitamin D dẫn đến còi xương, lùn, xương bị dị dạng, răng không đều bị
dị hình, ở người lớn nêu thiếu vitamin D sẽ dẫn đến loãng xương. Cung cấp
đủ lượng vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp và

một số bệnh ung thư, vì vitamin D điều hoà lượng canxi trong máu ức chế tế
bào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư đại trực tràng. Bà mẹ mang


14
thai nếu thiếu vitamin D dẫn đên con sinh ra còi xương, khuyết tật, nhất là 3
tháng đầu thai kì, sẽ là tổn thương não không thể phục hồi.

Hình 1.1. Khái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D
Các biểu hiện cho thấy trẻ bị thiếu vitamin D: thần kinh bị kích thích,
ngủ không yên giấc, hay tỉnh giấc, quấy khóc, và rõ ràng nhất là ở trẻ dưới 3
tháng tuổi), hay bị mồ hôi trộm cả khi trời lạnh, bị co giật nếu sốt cao, có thể
khó thở. Nếu tình trạng thiếu vitamin D trầm trọng sẽ gây biến đổi cơ, biến
dạng xương, sẽ ảnh hưởng đến chiều cao tầm vóc của trẻ sau này và khó có
thể phục hồi. Vì vậy, các mẹ cần cung cấp đủ lượng vitamin D mỗi ngày cho
trẻ để trẻ phát triển bình thường với tầm vóc cao to khoẻ mạnh.


15
Thiếu vitamin D làm giảm hàm lượng serotonin trong não, ảnh hưởng
đến tinh thần của con người. Serotonin là một loại hoocmon được gọi là
“hoocmon hạnh phúc”, suy giảm lượng hoocmon này khiến tâm trạng con
người bất ổn, dễ buồn chán, cáu bẳn, không kiểm soát được hành động và suy
nghĩ, nếu thiếu hụt một cách trẩm trọng sẽ dẫn đến trầm cảm. Nguyên nhân
chính dẫn đến thiếu hụt lượng vitamin D trong cơ thể là ít tiếp xúc với ánh
nắng mặt trời, dù cho có chế độ ăn đầy đủ và đều đặn.
Vitamin D đã được hoạt hoá duy nhất ảnh hưởng đến 2000 gen, đặc
biệt là tăng cường hệ miễn dịch. Vì vậy, thiếu vitamin D trong cơ thể gây ra
các chứng bệnh nan y như:
1. Bệnh cúm: ở trẻ nếu thiếu hụt vitamin D sẽ làm giảm khả năng miễn

dịch và dễ nhiễm bệnh ở đường hô hấp
2. Suy nhược cơ bắp: theo nghiên cứu, có những người khoẻ mạnh mà
cơ bắp yếu đó là do thiếu hụt vitamin D
3. Bệnh vảy nến: những người ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời khả
năng mắc bệnh là rất cao.
4. Bệnh thận mãn tính: do cơ thể thiếu hụt trầm trọng lượng vitamin D
làm tăng nguy cơ mắc bệnh thận.
5. Đái tháo đường: Theo nghiên cứu, cung cấp đủ lượng vitamin D cho
trẻ thì làm giảm 80% nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường typ 1.
6. Bệnh hen suyễn: Cung cấp đầy đủ lượng 1200 IU/ngày cho trẻ làm
giảm rõ rệt nguy cơ mắc bệnh hen học đường.
7. Bệnh nha chu: những người bị bệnh về nướu mãn tính đau nhức và
chảy máu nướu nên bổ sung thêm lượng vitamin D để cơ thể sản xuất đủ
defensins và cathelicidin. Đây là các hợp chất chứa các vi sinh vật giúp làm
giảm vi khuẩn gây bệnh trong miệng
8. Bệnh tim mạch: Thiếu hụt vitamin D trong cơ thể gây suy tim sung
huyết, nguyên nhân dẫn đến căn bệnh tim tiềm ẩn.


16
Theo các nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng vitamin D thường được
chuẩn đoán bằng cách đo nồng độ hợp chất 25-hydroxyvitamin D là một tiền
chất của 1,25-dihydroxyvitamin D trong máu. Một báo cáo năm 2008 đã chia
thành 4 loại :
• Hơi thiếu 50-100nmol/l (20-40ng/ml)

(1nmol/l = 0.4 ng/ml)

• Thiếu nhẹ 25-50nmol/l (10-20ng/ml)
• Thiếu trung bình 12.5-25.0 nmol/l (5-10ng/ml)

• Thiếu nghiêm trọng <12.5 nmol/l (<5ng/ml)
Theo nghiên cứu hàm lượng cần thiết 25(OH)D trong máu cần thiết để
tránh bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương ở người già là 15ng/ml. Lượng
cần thiết để tối ưu hoá sự hấp thu canxi ở ruột là 34ng/ml. Gần đây đã phát hiện
ra rằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể làm giảm đáng kể nguy cơ mắc
bệnh ung thư về nội tạng và trên 33ng/ml sẽ làm giảm 50% tỷ lệ mắc ung thư
trực tràng và ở mức 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú.
Tuy nhiên, bên cạnh các ưu điểm vượt trội của nó nếu quá lạm dụng
và cung cấp quá nhiều cho cơ thể cũng sẽ dẫn đến hậu quả khá nghiêm trọng.
Đó là làm tăng hàm lượng canxi quá mức trong máu, tăng canxi niệu làm đau
nhức xương khớp, tăng huyết áp, tạo sỏi thận, đau mỏi, suy nhược, đau đầu
mệt mỏi, giòn xương...
Giải pháp ngăn ngừa thiếu hụt vitamin D
Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể gồm : ánh sáng mặt trời (phơi
nắng 20 phút/ ngày) và từ thuốc bổ. Bên cạnh đó có khoảng 10% hàm lượng
vitamin D cấp cho cơ thể mỗi ngày được lấy từ bữa ăn. Các thực phẩm giàu
vitamin D như : trứng, cá, gan, sữa, nấm, các thực phẩm có bổ sung vitamin
D.... Lượng vitamin D cần thiết bổ sung theo khuyến cáo của Viện Dược
phẩm Mỹ là 200- 600IU/ngày. Nhưng thực tế, mỗi cơ thể cần một lượng
khác nhau tuỳ theo thể trạng, độ tuổi của mỗi người. Có một số trường hợp
lên đến 2000-4000IU/ngày.


17
1.1.2. Nguồn cung cấp vitamin D cho cơ thể
Có 3 con đường mà cơ thể hấp thụ được vitamin D: qua da, bằng ăn
uống và bằng thuốc bổ sung.
Theo truyền thống, nguồn vitamin D con người bắt đầu từ da, không
phải bắt nguồn từ miệng. Sự tổng hợp vitamin D của da xảy rất nhanh
chóng và mạnh mẽ, quá trình tổng hợp diễn ra dễ dàng chỉ sau một vài phút

được tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chứ
không phải chế độ ăn uống là nguồn cung cấp chính vitamin D cho cơ thể
cho dự trữ và tuần hoàn, có thể xem đây là một chức năng của phần bề mặt
da hở. Nguồn cung cấp vitamin D qua da giúp cung cấp 80-85% nhu cầu
vitamin D của cơ thể. Dưới tác dụng của tia cực tím các tiền chất vitamin D
có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽ được chuyển thành vitamin D.
Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm 2 da có thể sản xuất ra 18UI
vitamin D3 .
Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa hè (toàn thân, liều
tối thiểu UVB), mỗi cơ thể sản xuất ~ 20.000 IU vitamin D trong <30 phút.
Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa
(100 IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin tổng hợp tiêu chuẩn (400
IU/viên) trong một lần.
Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn. Vitamin D có
trong nguồn thực phẩm từ động vật (D 3) và thực vật (D2), có nhiều trong các
thực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật.
Những thực phẩm chứa nhiều Vitamin D:
Gan nấu chín:
Có lẽ nhiều người không biết rằng, gan là có một nguồn cung cấp
vitamin D tuyệt vời cho cơ thể. Mặc dù tất các loại thực phẩm như gan bò,
gan gà và gan bê đều có chứa một hàm lượng lớn vitamin D, nhưng gan bê có
hàm lượng vitamin D cao nhất trong số đó. Gan bê không những hữu ích cho


18
sự phát triển xương mà còn giúp cho làn da, mái tóc khỏe mạnh và thúc đẩy
tái tạo tế bào.
Sữa:
Sữa được xem là một trong những nguồn cung cấp vitamin D tốt
nhất. Một ly sữa có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể.

Ngoài ra, sữa không những rất bổ dưỡng cho trẻ em mà còn có tác dụng tốt
với sức khỏe của người lớn. Các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng vitamin D có
trong sữa có khả năng chống lão hóa, do đó hãy thêm sữa vào thực đơn
hằng ngày của bạn.
Lòng đỏ trứng:
Trứng là một thực phẩm giàu vitamin D, đặc biệt là phần lòng đỏ trứng.
Lòng đỏ trứng có khả năng điều hòa hệ thần kinh, hệ tim mạch và não. Hơn
nữa, trứng còn làm giảm nguy cơ bị đục thủy tinh thể cũng như kích thích tóc
mọc nhanh hơn.
Cá hồi:
Cá hồi cũng là những nguồn cung cấp vitamin D rất lớn. Thực tế, cá
hồi là một trong những nguồn vitamin D tự nhiên và các axít béo thiết yếu
rất hiếm có. Loại cá này giúp cải thiện các chức năng của não bộ và bảo vệ
hệ thần kinh. Nó hoạt động như một chất chống trầm cảm và do đó hỗ trợ
trong việc giúp não thư giãn, tăng hiệu quả hoạt động của não và cải thiện
trí nhớ.
Dầu gan cá:
Dầu gan cá tuyết được biết đến rộng rãi như là một nguồn cung cấp một
lượng lớn vitamin D. Loại dầu cá này có khả năng cải thiện tình trạng của tim
và hệ tim mạch. Hơn nữa, nó hỗ trợ trong việc tăng cường các hoạt động của
cơ bắp và độ đàn hồi của mạch máu. Các nghiên cứu đã cho thấy dầu gan cá
giúp làm giảm lượng cholesterol cao trong máu và làm loãng máu, do đó giảm
nguy cơ tắc nghẽn động mạch.


19
Cá mòi đóng hộp
Mặc dù cả cá mòi tươi và đóng hộp đều được ưa chuộng nhưng cá mòi
đóng hộp được cho rằng có lợi hơn cho sức khỏe. Ngoài các chất dinh dưỡng
khác, cá mòi đóng hộp rất giàu vitamin D, do đó giúp cải thiện sức khỏe của

xương và sức khỏe tim mạch. Hơn nữa, loại thực phẩm này còn được biết đến
như một phương pháp điều trị viêm nhiễm hiệu quả và kiểm soát mức đường
trong cơ thể.
Pho mát
Pho mát là một trong những sản phẩm làm từ sữa rất giàu vitamin D.
Lượng vitamin D này sẽ giúp hấp thụ lượng canxi cao từ phô mai, qua đó tăng
cường độ chắc khỏe của xương và ngăn ngừa chứng loãng xương hiệu quả.
Hơn nữa, sự có mặt của vitamin D trong pho mát rất hữu ích cho việc tăng
cường sức khỏe răng miệng và tránh sâu răng. Điều này rất hữu ích trong việc
ngăn ngừa sự hao mòn men răng.
Cá trích
Cá trích là một trong những nguồn giàu chiết xuất vitamin D. Với hơn
952 IU vitamin D chỉ trong một chén cá trích, loại cá giàu dinh dưỡng này là
một thực phẩm thiết yếu trong chế độ ăn uống khỏe mạnh. Đặc biệt là cá trích
Đại Tây Dương có lợi hơn nhiều so với cá ở Thái Bình Dương. Mọi cách chế
biến cá trích đều không làm giảm đi lượng vitamin D cung cấp cho cơ thể.
Nấm
Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho thấy nấm là một nguồn
cung cấp vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt, cá
.v.v... và vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình nấu ăn [16].
Các báo cáo về nấm của một số nước trên thế giới cho thấy hàm lượng
vitamin D trong nấm tự nhiên ở trong khoảng 2 - 40 µg/100g, có thể đáp ứng
đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồn
vitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [20].


20
Lượng vitamin D cơ thể cần mỗi ngày phụ thuộc vào tuổi của mỗi người.
Trung bình lượng khuyến cáo hàng ngày từ tổ chức Food and Nutrition Board cho
các lứa tuổi khác nhau được liệt kê dưới đây đơn vị quốc tế (IU) bảng 1.1.

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D mỗi ngày của các lứa tuổi [12].

STT

Lứa tuổi

Liều

Liều lượng

lượng(IU)

(µg)

Khuyến cáo-

Khuyến cáotối đa
5-25

1

0-6 tháng

tối đa
200-1000

2

6-12 tháng

400-1500

10-37,5

3

1-3 năm

600-2500

15-62,5

4

4-8 năm

600-3000

15-75

5

9-13 năm

600-4000

15-100

6

14-18 năm

600-4000

15-100

4

19-70năm

600-4000

15-100

5

Từ 71 tuổi trở đi
Phụ nữ mang thai và cho
con bú

800-4000

20-100

600-4000

15-100

6

1.2. Vitamin A
1.2.1. Giới thiệu
Vitamin A là một nhóm các hợp chất hữu cơ dinh dưỡng không bão
hòa, là tên gọi chung của retinol và các este của nó (retinyl acetat, retinyl
propionat, retinyl palmitat) và một lượng pro vitamin A carotenoid và betacarotene [2].


21

CH3

H3C

CH3

CH3
R

CH2

CH3
- Một số dạng vitamin A:
Retinol C20H30O (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 - 6 trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - ol

CH3

CH3

H3C

CH3
CH2

OH

CH3
Retinyl acetat C22H32O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl acetat

H3C

CH3

CH3

CH3

O
CH2 O

C

CH3

CH3
Retinyl propionate C23H34O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl propionat

H3C

CH3

CH3

CH3

O
CH2 O

C

CH2

CH3

CH3
Retinyl palmitat (C35H47O2 )(2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 6 - 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl
propionat


22

H3C

CH3

CH3

O

CH3
CH2 O

C

(CH2)14 CH3

CH3
Vitamin A có tính chất hóa học sau:
- Không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete,
ethanol…
- Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độ
không quá cao.
- Dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí, ánh sáng làm tăng quá trình oxy
hóa vitamin A
- Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase thì retinol chuyển sang
dạng retinal.
- Phản ứng với SbCl3 cho phức chất màu xanh.
- Phản ứng với H2SO4 cho phức chất màu nâu.
1.2.2. Vai trò của vitamin A
Vitamin A có vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi thai, hình
thành cơ quan trong quá trình phát triển của thai nhi, chức năng miễn dịch
bình thường, và phát triển của mắt và thị lực.
Vitamin A có các chức năng :
- Bảo vệ cấu trúc của da trong toàn bộ cơ thể.
- Yểm trợ thị giác trong quá trình phân biệt vùng sáng và vùng tối.
- Xúc tác sự phóng thích tố sinh dục và hưng phấn quá trình thụ thai.
- Phát triển sự tăng trưởng của nhau và bào thai.
- Hưng phấn quá trình kiến tạo tủy xương.
- Ức chế độc chất sinh ung thư và gây xơ cứng tế bào.
Vitamin A là một vi chất có vai trò đặc biệt quan trọng với cơ thể, gồm
4 vai trò chính :

23
- Trên mắt: vitamin A có vai trò tạo sắc tố võng mạc giúp mắt nhìn
được trong điều kiện thiếu ánh sáng, nếu thiếu vitamin A sẽ giảm khả năng
nhìn trong bóng tối hay còn gọi là mắc bệnh quáng gà, nếu không điều trị sẽ
dẫn tới mù lòa.
- Trên da và niêm mạc: vitamin A giúp tăng tiết chất nhày và ức chế sự
sừng hóa. Nếu thiếu vitamin A sẽ làm giảm bài tiết chất nhày và tăng sự sừng
hóa khiến cho mắt bị khô da bị khô, nứt nẻ và sần sùi.
- Trên xương : cùng với vitamin D, vitamin A có vai trò giúp cho sự
phát triển xương và tham gia vào quá trình phát triển cơ thể, đặc biệt ở trẻ em.
Nếu thiếu vitamin A trẻ em sẽ còi xương, chậm lớn.
- Trên hệ miễn dịch : vitamin A giúp tăng tổng hợp các protein miễn dịch
nâng, cao sức đề kháng của cơ thể do có tác dụng chống oxy hóa. Khi thiếu
vitamin A cơ thể dễ bị mắc các bệnh nhiễm khuẩn và tổn thương ở đường hô hấp,
tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục. Dễ nhạy cảm với tác nhân gây ung thư.
Mới đây người ta còn phát hiện vitamin A còn có khả năng làm
tăng sức đề kháng với các bệnh nhiễm khuẩn, uốn ván, lao sởi, phòng
ngừa ung thư…
Thiếu vitamin A dẫn đến nguy cơ chậm lớn và ngừng phát triển, sừng
hóa các màng nhầy ( ở niệu đạo, phế nang, đường tiêu hóa,..) đặc biệt là sừng
hóa ở giác mạc gây mù lòa. Nếu thừa vitamin A sẽ gây đau bụng, buồn nôn,
bơ phờ, chậm chạp, phù gai thị, thóp phồng, vài ngày tiếp theo da bong toàn
thân rồi hồi phục dần khi đã ngừng thuốc. Nó có thể gây buồn nôn, vàng da,
dị ứng, biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổn thương cơ và bụng, uể oải
và thay đổi tính tình. Ngộ độc mãn có thể xảy ra sau khi uống 40.000 đơn vị
hoặc hơn mỗi ngày, dùng thời gian dài gây đau xương khớp, rụng tóc, môi
khô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to. Trong các trường hợp kinh niên, rụng tóc,
khô màng nhầy, sốt, mất ngủ, mệt mỏi, giảm cân, gãy xương, thiếu máu và

24
tiêu chảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm
trọng. Các triệu chứng ngộ độc nói trên chỉ xảy ra với dạng tạo thành trước
(retinoit) của vitamin A (chẳng hạn từ gan), còn các dạng caretonoit (như βcarotene trong cà rốt) không gây các triệu chứng như vậy.
1.2.3. Nguồn cung cấp vitamin A cho cơ thể
Vitamin A trong thực phẩm có nguồn gốc động vật dưới dạng retinol,
còn thức ăn có nguồn gốc thực vật ở dưới dạng caroten (tiền vitamin A).
Retinol (các nguồn động vật): cá tuyết và cá bơn, dầu gan, thịt bò, bê, thịt
cừu và thịt gà, gan, bơ, phô mai, trứng, sữa, cá thu, thịt bò, cá mòi đóng hộp...
Beta-Carotene (pro-vitamin A, các nguồn thực vật): cải xoăn, cà rốt
thường xuyên, rau mùi tây, rau bina, khoai lang, mơ khô, cải xoong, cải xanh,
xoài, cà chua, bắp cải, đậu Hà Lan đông lạnh...
1.3. Các phương pháp xác định vitamin A và D
1.3.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học
Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương
pháp thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được
xác định bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu
hụt vitamin D trong cơ thể. [16].
Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, bằng thử nghiệm
trên loài chuột (kiểm tra điểm vôi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh còi xương) đã
từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dược
phẩm. Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác
nhau của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn. Sau bảy
ngày, xương của những con chuột được xử lý bằng dung dịch nitrat bạc.
Lượng canxi mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên
ảnh chụp. Thang tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ
giữa các vùng tối trên xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho

25
gà con mới sinh thức ăn bổ sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitamin
D). Hàm lượng vitamin D trong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh
với khu vực mờ tối của chất chuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuần
với mỗi chế độ ăn uống.
Các sinh trắc nghiệm này có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ rất
thấp. Ví dụ, kiểm tra trên dòng chuột có thể phát hiện hàm lượng thấp tới 12
ng vitamin D. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệt
giữa các dạng khác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độ
tin cậy thấp so với các phương pháp khác.
Phương pháp thử nghiệm sinh học với vitamin A là đã tiến hành cho
chuột ăn thực phẩm đã bị rút hết chất béo bằng hỗn hợp ete-rượu (1909). Với
thí nghiệm này, Step đã đưa ra nhận xét rằng: trong thực phẩm có các yếu tố
hòa tan trong chất béo cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể gọi là yếu tố
A, sau này gọi là vitamin nhóm A.
Từ lâu người ta cho rằng vitamin A chỉ tồn tại chủ yếu trong các sản
phẩm động vật như gan cá, mỡ bò, trứng… Mãi đến năm 1920 Osborn,
Mendel và một số tác giả khác phát hiện thấy có các hợp chất tương tự ở thực
vật. Sau đó tới Eiler (1929), Mur (1930) đã đưa ra ý kiến cho rằng các hợp
chất tương tự đó, các Caroten chính là tiền thân của Vitamin A hay gọi là
provitamin A. Năm 1828-1931 nhà bác học Thụy Sỹ Paul Karrer đã dùng
phương pháp sắc ký để phân chia và phát hiện ra cấu trúc của Vitamin A và
Caroten. Năm 1950 nhiều nhà hóa học trong đó có Karrer đã tổng hợp thành
công chất β-Caroten là một trong số 3 dạng phân quan trọng của Caroten.
1.3.2. Phương pháp quang phổ
Phổ hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin
D. Trong các pha rắn, vitamin D2 có thể được phân biệt với vitamin D3 dựa
vào đỉnh phổ vitamin D2 tại 907 cm-1.Phổ FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin