Đánh giá và xác định quy trình phân tích kháng sinh trong thủy sản, đại học nông lâm tp HCM

Đánh giá và xác định quy trình phân
tích kháng sinh trong thủy sản
GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng
Nhóm 6:
Đào Trần Mỹ Phương
Trần Hoàng Phượng
Trần Thị Kim Ngân
Liên Thanh Nhã
Nguyễn Thanh Phú


MỤC LỤC
I. Mở đầu
II. Nguyên nhân tồn đọng kháng sinh trong thủy sản
III. Tác hại của kháng sinh trong thủy sản
IV. Giới thiệu phương pháp Elisa
1. Nguyên tắc
2. Phương pháp
3. Ứng dụng
V. Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn dư kháng
sinh
1. Nhóm QUINOLONE trong tơm tại một số tỉnh ven biển
khu vực phía Bắc
2. Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol
trong thủy sản thông qu phân tích khẳng định bằng LC –
MS/MS


I. Mở đầu
• Dư lượng kháng sinh là tình trạng kháng sinh chứa trong
thực phẩm (thịt, cá, trứng, sữa,...) còn ở dạng nguyên chất

hay đã bị chuyển hóa mà việc sử dụng những loại thực
phẩm này có thể gây ra những tác hại khơng ngờ đối với
người tiêu dùng.
• Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm ảnh hưởng xấu
đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong
những nguyên nhân gây những bệnh hiểm nghèo như
ung thư, đột biến gen, quái thai, dị ứng và tăng nguy cơ
xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật,
đặc biệt vi sinh vật gây bệnh


II. Nguyên nhân tồn đọng kháng sinh trong thủy sản

- Do thiếu hiểu biết hoặc do tiết kiệm đá
đà sử dụng kháng sinh hoá chất độc hại,
nh: Chloramphenicol, Nitrofurans, hàn
the, urê, sunfit để bảo quản thuỷ sản.
- Do nhiễm từ kem bôi tay của công
nhân (trong thành phần có chứa kháng
sinh cấm Chloramphenicol)
- Do cố tình sử dụng trong quá trình sơ
chế (công đoạn ngâm nhúng, tẩy trắng,
)


III. Tác hại của kháng sinh trong thủy sản
Ho¸ chÊt, kháng
sinh
Chloramphenicol
Nitrofuran

Sunfit
Hàn the
Urê

Tác hại
Gây suy tuỷ, còi cọc, ung th
máu, nhờn thuốc
Gây độc trên gen di chuyền, gây
ung th, nhờn thuốc
Gây dÞ øng
Gây rối loạn tiêu hóa, suy dinh
dưỡng, giảm trí nhớ, tổn
thương và hư hại tế bào gan, …
Gây ảnh hưởng đến hệ thần
kinh


IV. Giới thiệu phương pháp ELISA

ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét
nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa
trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc
hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng.
Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và độ đặc
hiệu của kháng thể là không đổi.


1. Nguyên tắc
Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa
giếng. Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu,KN sẽ

tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do
có gắn enzyme tạo thành
một phức hợp
kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của
enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy
phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát
sáng.




Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA


2. Phương pháp
Có 2 phương pháp xét nghiệm ELISA:
Phương pháp ELISA gián tiếp(indirect ELISA):
dùng để phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết
thanh
Phương pháp ELISA trực tiếp( direct ELISA): dùng
để phát
kháng
nguyên
trong mẫu xét nghiệm.
Các
loạihiện
enzyme
thường
dùng
Alkaline phosphatase

Peroxydase
Glucoxydase
β-galactosidase


3. Ứng dụng
Trong thực phẩm
Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi
sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng
sinh.
Phát hiện độc tố trong tảo.
Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus
aureus,sán lá gan… trong thực phẩm.
Phát hiện chất chloramphenicol (chất khơng được phép
có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản khác)
Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư
thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…


Trong y học
Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát
hiện kháng nguyên p24.
Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và
C,bệnh ung thư.
Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm
màng não) do loại giun kí sinh ở phổi chuột gây ra.
Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền TrungTây Nguyên.


IV. Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn

dư kháng sinh

1/ Nhóm QUINOLONE trong tơm tại một số tỉnh ven biển
khu vực phía Bắc

2/ Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lượng Chloraphenicol
trong thủy sản thơng qu phân tích khẳng định bằng LC –
MS/MS


1/ Nhóm QUINOLONE trong tơm tại một số tỉnh ven biển
khu vực phía Bắc

1/ Một số khái niệm
2/ Cách lấy mẫu
3/ Phương pháp
4/ Kết quả và đánh giá


Mẫu trắng: là mẫu tơm khơng chứa nhóm kháng sinh
quinolone đã được khẳng định bằng phương pháp sắc ký lỏng
phổ khối (LC-MS/MS) tại phịng thí nghiệm phân tích thực
phẩm - Bộ môn Khoa học thực phẩm- Khoa Thú y - Đại học
Liège, Vương quốc Bỉ.
Dung dịch kháng sinh chuẩn: Kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng
sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng trong nghiên cứu này
gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và
sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich
(St Louis, MO, USA).

Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự
có mặt của NH 4 OH 2M.
Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung
dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất.
Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch
PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam
Na2HPO4.2HO và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước
cất).
Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lơ khác
nhau do phịng thí nghiệm Hormonologie - CER,
Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp.


Cách lấy mẫu
Chín mươi mẫu tơm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào
6 tháng khác nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và
12 năm 2006) tại các chợ 4 địa phương đại diện gồm Hà
Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An. Mỗi địa phương,
mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ khác nhau.
Riêng Hà Nội, ngồi chợ mẫu cịn được lấy ở ba siêu thị.
Các mẫu đều có nguồn gốc từ các đầm nuôi ở các địa
phương đại diện, riêng mẫu được lấy tại Hà Nội được
xác định nguồn gốc từ Quảng Ninh, Hải Phòng và Nam
Định. Mẫu sau khi lấy được bảo quản lạnh chuyển về phịng
thí nghiệm loại bỏ đầu và vỏ. Sau khi nghiền đồng nhất
bằng máy moulinex, mẫu được lưu giữ ở âm 80°C.


Tính ổn định của kít được đánh giá qua kết quả phân tích

đường chuẩn của 10 bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác
nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kít được lặp lại 2
lần. Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở phân tích 6
dung dịch chuẩn sarafloxacin có nồng độ tương ứng là
0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0 ng/ml.
Để đánh giá khả năng phát hiện và khả năng ứng dụng
của kít trong điều kiện phịng thí nghiệm ở Việt Nam, các
tham số liên quan đến khả năng phát hiện của phương pháp
được đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu. Mỗi kháng
sinh thử 20 mẫu trắng (được xem như mẫu thực sự âm
tính) và 20 mẫu củng cố các quinolone đại diện ở nồng
độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện (0,7 ppb). Các tham
số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính
tốn theo các cơng thức sau:


Trong đó :
N là tổng số mẫu phân tích = N+ + NN+ là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố)
N- là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng)
PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu
FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N+ mẫu
FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu
NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N- mẫu


Kết quả và đánh giá


Tính ổn định và khả năng phát hiện