Nghiên cứu ưng dụng công nghệ sản xuất vacxin AND đa chủng gumboro phòng bệnh cho gà

BKHCN
VCNSH

BKHCN
VCHSH

VKHCNVN
VCNSH

Bé KHOA HäC
Vµ C¤NG NGHÖ

VIÖN KHOA HäC Vµ
C¤NG NGHÖ VIÖT NAM

VIÖN C¤NG NGHÖ SINH HäC
------------------------


Bộ khoa học và công nghệ

Viện kh và cn việt nam

39 Trần Hng Đạo Hà Nội

18 Hoàng Quốc Việt Hà Nội

------------------------------------

Viện công nghệ sinh học

BáO CáO
Tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài KC.04.29

NGHIÊN CứU ứng dụng công nghệ
Sản xuất vacxin adn đa chủng gumboro
phòng bệnh cho gà

Chủ nhiệm: PGS.TS. Lê Thanh Hoà

Hà Nội/11-2006

Bản quyền báo cáo thuộc Viện Công nghệ sinh học. Sao chép và sử dụng toàn bộ hoặc từng
phần tài liệu này phải đợc Viện trởng Viện Công nghệ sinh học và Bộ Khoa học và Công
nghệ đồng ý. Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài cấp nhà nớc
KC 04 29 của Bộ Khoa học và Công nghệ do Viện Công nghệ sinh học chủ trì


Mục lục báo cáo đề tài

Trang

Báo cáo tổng kết
A.

B.

Tóm tắt báo cáo

1

Thông tin về đề tài

3

A1. Chủ nhiệm và cơ quan chủ trì đề tài

3

A.2. Danh sách những ngời thực hiện đề tài và phân công
công việc

4

A3. Các nội dung đang ký thực hiện theo hợp đồng

6

A4. Các sản phẩm đăng ký của đề tài

7

Tổng quan tài liệu

8

B1. tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nớc
B1.1 Giới thiệu bệnh Gumboro
B1.2 Chẩn đoán Gumboro
B1.3 Các serotype và phân nhóm độc lực của virus Gumboro
B1.4 Sinh học phân tử hệ gen của virus Gumboro

B1.5 Vacxin phòng bệnh Gumboro
B1.6 Nguyên lý thiết kế vacxin ADN và phơng thức sử dụng
B1.7 Vector biểu hiện gen kháng nguyên
B1.8 Các thành phần kích ứng gen và miễn dịch
B1.8.1 Chuỗi Kozak kích ứng biểu hiện gen
B1.8.2 Chuỗi CpG kích ứng miễn dịch
B1.9 Miễn dịch học của vacxin ADN
B1.9.1 Vai trò của tế bào tua (DC) xử lý ADN kháng nguyên
B1.9.2 Vai trò của vị trí và các tế bào tiếp nhận ADN vacxin
B1.9.3 Nguyên tắc tạo miễn dịch của vacxin ADN

8

B2. tổng quan tình hình nghiên cứu trong nớc

8
8
9
9
11
13
14
16
16
17
18
18
21
22
23

C.

Các phơng pháp nghiên cứu chính

29

D.

Báo cáo các kết quả đạt đợc

32

D1. Kết quả thu thập nguyên liệu và thiết kế giống gốc
D1.1 Kết quả thu thập mẫu và tiếp truyền bệnh phẩm
D1.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm Gumboro
D1.1.2 Kết quả tiếp truyền virus Gumboro trên phôi và gà mẫn cảm
D1.2 Kết quả phân tích và chọn lọc chủng đại diện
D1.2.1 Bố trí nghiên cứu chọn lọc chủng cung cấp nguồn gen
D1.2.2 Các plasmid vector sử dụng trong nghiên cứu vacxin ADN
D1.2.3 Kết quả chọn lọc nguồn gen các chủng đại điện
D1.3 Kết quả thiết kế plasmid giống gốc pG-VP2

32
32
32
33
34
34
38

39
42


D1.3.1 Tách VP2 từ plasmid trung gian
D1.3.2 Thu nhận khung plasmid pcDNA3.1(+)
D1.3.3 Nối VP2 vào pcDNA3.1(+) tạo plasmid gốc pG-VP2
D1.3.4 Kết quả kiểm tra pG-VP2 bằng enzyme giới hạn
D1.3.5 Kết quả kiểm tra khung đọc và phân tích thành phần gen VP2
D1.4 Kết quả thiết kế plasmid giống gốc pG-A
D1.4.1 Thu nhận và lu giữ phân đoạn A chứa gen VP2-4-3
D1.4.2 Tách gen kháng nguyên VP2-4-3 và nối vào pcDNA3.1(+)
D1.4.3 Kết quả kiểm tra khung đọc và phân tích thành phần gen VP2
D2. kết quả sản phẩm
D2.1 Qui trình công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro

42
43
43
44
45
48
48
50
51
53
53

D2.2 Qui trình kiểm định và sử dụng vacxin ADN đa chủng Gumboro

59

D2.3 Sản phẩm plasmid giống gốc và vacxin (đơn và đa chủng)

63

D3. Kết quả kiểm nghiệm biểu hiện gen và miễn dịch vacxin
D3.1 Kết quả kiểm nghiệm biểu hiện gen VP2 trong hệ thống E. Coli
D3.1.1 Yêu cầu kiểm nghiệm và nguyên vật liệu
D3.1.2 Phơng pháp biểu hiện
D3.1.3 Kết quả biểu hiện của gen VP2
D3.2 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin bằng ELISA
D3.2.1 Yêu cầu và bố trí thí nghiệm
D3.2.2 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin quy mô phòng thí
nghiệm
D3.2.3. Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin thử nghiệm mở rộng
ỏ miền Bắc đợt I
D3.2.4 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin thử nghiệm mở rộng
ở miền Bắc đợt II
D3.3 Kết quả kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin bằng phơng pháp công
cờng độc
D3.3.1 Yêu cầu thí nghiệm
D3.3.2 Bố trí thí nghiệm
D3.3.3 Kết quả chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% trên gà của chủng
BDG
D3.3.4 Kết quả công cờng độc kiểm nghiệm miễn dịch của vacxin
D3.3.5 Kết luận thí nghiệm công cờng độc
D3.4 Kiểm định pháp lý của vacxin
D3.4.1 Xây dựng tiêu chuẩn vacxin
D3.4.2 Xây dựng phiếu kiểm định vacxin xuất xởng

D3.4.3 Kết quả kiểm định pháp lý của vacxin

65
65
65
65
66
67
67
68
68
71
74
74
75
77
79
81
82
82
84
84


D4. Kết quả giải m gen và đăng ký bản quyền
D4.1 Danh sách giải mã gen VP2 và phân đoạn A
D4.2 Danh sách đăng ký bản quyền ngân hàng gen
D5. Công bố khoa học
D5.1 Danh sách bài báo
D5.2 Danh sách xuất bản sách và chơng sách

D6. Kết quả đào tạo
D6.1 Khóa luận tốt nghiệp đại học
D6.2 Luận văn cao học
D6.3 Đề cơng nghiên cứu sinh
D7. Tổng kết sản phẩm của đề tài

85
85
86
86
86
88
88
88
89
89
90

E.

Tình hình sử dụng kinh phí và báo cáo quyết toán tài
chính

91

F.

Nhận xét và đánh giá kết quả đạt đợc của đề tài

92

Phụ lục báo cáo tổng kết
Phụ lục I: Một số phơng pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu
vacxin ADN
Phụ lục II: Một số phơng pháp huyết thanh học sử dụng trong kiểm nghiệm
miễn dịch vacxin ADN
Phụ lục III: Một số hình ảnh hoạt động của đề tài
Phụ lục IV: Tài liệu cơ bản phục vụ nghiên cứu đề tài
Mục lục hình
Mục lục bảng


Báo cáo tổng kết

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

Tóm tắt báo cáo
Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm
(Infectious Bursal Disease - viết tắt là IBD) là một bệnh cấp tính, có khả năng lây
lan rất cao ở gà con 2-6 tuần tuổi, gây chết với tỷ lệ khá cao, từ 10-30%. Số còn lại
còi cọc, chậm lớn, dễ phát bệnh, bị suy giảm miễn dịch. Virus Gumboro có hệ gen
gồm 2 phân đoạn ARN là phân đoạn A và B. Phân đoạn A gồm 3 gen hợp nhất
VP2-4-3 và gen VP5. Gen VP2 mã hoá protein kháng nguyên VP2 đồng thời cũng
là yếu tố gây bệnh của virus. Tuy có vacxin nhợc độc (chủng virus đã làm giảm
độc lực) sản xuất từ giống virus nhập từ nớc ngoài, nhng ở nớc ta, mức độ bảo
hộ miễn dịch không ổn định do tính kháng nguyên giữa vacxin và virus gây bệnh
có mức độ đồng nhất không đồng đều. Đề tài KC.04.29: Nghiên cứu ứng dụng
công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro phòng bệnh cho gà đợc tiến
hành với mục tiêu tổng thể là nghiên cứu ứng dụng thêm một loại vacxin thế hệ
mới, đa dạng hoá vacxin Gumboro ở quy mô nhỏ và đánh giá hiệu quả bảo vệ trên

đàn gà thử nghiệm.
Để thực hiện đợc mục tiêu trên, đề tài cần thiết kế đợc plasmid biểu hiện
tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên VP2 từ nhiều chủng Gumboro chọn lọc khác
nhau của Việt Nam, sản xuất và thu nhận đợc ADN tinh khiết làm nguồn nguyên
liệu thử nghiệm vacxin ADN đa chủng, ổn định, chất lợng đạt điều kiện quy định
OIE/WHO và triển khai thử nghiệm vacxin ADN, kiểm tra an toàn, vô trùng và
hiệu lực đảm bảo tiêu chuẩn của OIE/WHO quy định. Đề tài đã sử dụng các
phơng pháp sinh học phân tử trong thiết kế plasmid tái tổ hợp (RT-PCR, dòng
hoá, giải trình trình tự, chọn lọc tách ADN tái tổ hợp), các phơng pháp kiểm tra
giống và vacxin (an toàn, vô trùng, hiệu lực), các phơng pháp huyết thanh học
(ELISA) xác định bảo hộ miễn dịch.
Trong 2 năm thực hiện, đề tài đã thu nhận đợc hơn 90 mẫu virus cờng độc
gây bệnh từ 3 miền (Bắc, Trung, Nam), 3 mẫu vacxin và đã thu nhận và phân tích
vùng siêu biến đổi (474 bp) của gen VP2, từ đó chọn lọc các chủng có kháng
nguyên đồng nhất theo nhóm của từng vùng địa lý. Trên cơ sở đó, đã phân lập và
lu giữ toàn bộ gen VP2 trong 15 plasmid trung gian (pCR2.1TOPO), từ nguồn gen
này đã thiết kế đợc 15 plasmid gốc (pG-VP2) chứa toàn bộ gen VP2 và một số
1


Báo cáo tổng kết

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

plasmid gốc (pG-A) chứa toàn bộ phân đoạn A, làm nguyên liệu chọn giống sản
xuất vacxin ADN và tiến hành nghiên cứu xây dung 2 bộ Quy trình: i) Quy trình
công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng tại Việt Nam; ii) Quy trình kiểm định và
sử dụng vacxin ADN đa chủng tại Việt Nam.
Sử dụng giống gốc chứa gen VP2 (pG-VP2), đề tài đã sản xuất đợc
100.000 liều vacxin đơn chủng cho 5 chủng chọn lọc (20 àg ADN/liều đơn chủng),

khi phối hợp với nhau, đợc 20.000 liều đa chủng (100 àg ADN/liều đa chủgn) để
làm vacxin đa chủng thử nghiệm. Đề tài đã sử dụng 30.000 liều đơn chủng (6.000
liều đa chủng) để tiến hành thử nghiệm và bố trí 5 đợt kiểm tra miễn dịch ở miền
Bắc và miền Trung. Kết quả triểm tra bằng ELISA (kit IDEXX của Mỹ) cho thấy
vacxin có bảo hộ miễn dịch tơng đối tốt (79-96%) có kháng thể ở tuổi gà 35-56
ngày tuổi), nhng hàm lợng kháng thể chỉ duy trì dới 3 tháng. Về bản quyền, đề
tài đã đăng ký 11 bản quyền bao gồm 10 chuỗi gen VP2 và một chuỗi gen VP2-343 (phân đoạn A) của Việt Nam trong Ngân hàng gen. Đề tài cũng góp phần đào tạo
nghiên cứu sinh, 1 cao học, 8 sinh viên tốt nghiệp và xuất bản 10 công trình, bài
báo và các chơng sách (2 quyển đã in và 1 quyển bản thảo).
Đánh giá chung, đề tài đã hoàn thành nhiệm vụ đề ra, đã có đủ số lợng
plasmid gốc chứa gen VP2, đã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất
và kiểm định vacxin, đã sản xuất vacxin theo yêu cầu đã đăng ký và bớc đầu thử
nghiệm hiệu lực của vacxin. Đề tài mở hớng và định hớng nghiên cứu loại hình
vacxin ADN lần đầu tiên ở Việt Nam. Tuy nhiên, do tình hình cúm gà nặng nề
trong các năm 2004-2005 ảnh hởng đến tiến độ và phạm vi nghiên cứu của đề tài,
một phần do tiến độ cấp kinh phí, một phần do thời gian hạn định cho nghiên cứu
một loại vacxin rất ngắn nên diện thử nghiệm vacxin cha đợc rộng hơn và các
phơng pháp kiểm tra miễn dịch cha đợc áp dụng nhiều hơn (ví dụ: cần công
cờng độc để thử thách hiệu lực). Mặt khác cũng cần so sánh vacxin ADN sản xuất
từ plasmid giống gốc chứa toàn bộ phân đoạn A (pG-A) với vacxin ADN từ giống
gốc chứa toàn bộ gen VP2 (pG-VP2), để chọn lọc nguồn giống thích hợp.
Đề tài đã hoàn thành tất các nội dung đăng ký với mức độ đạt hoặc vợt, tuy
còn một vài điểm cần bổ sung khảo sát. Đề tài đã mở hớng triển khai ứng dụng
vacxin ADN có triển vọng tại Việt Nam.

2


B¸o c¸o tæng kÕt
thùc hiÖn ®Ò tµi

kc.04.29


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

Tên đề tài:

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng Gumboro
phòng bệnh cho gà

A. thông tin về đề tài
A1. chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì đề tài
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Thanh Hoà
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính
Điện thoại: (4)7567297; (4)7564391 (CQ)/ (4)8525566 (NR); Mobil: 0912336855
Fax: (4)8363144
Email: ,

Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Địa chỉ cơ quan: 18 Đờng Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội Việt Nam.
Thời gian thực hiện: 24 tháng (01/01/2004 31/12/2005)
Kinh phí đợc cấp: 1.900 triệu (một nghìn chín trăm triệu).

3


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

A2. danh sách những ngời thực hiện đề tài và phân công công việc

Nhóm
I

Lê Thanh Hoà
1
2
3
4
5
6
7
8

II

Họ và tên

Lê Thị Kim Xuyến
Nguyễn Thị Bích Nga
Hoàng Thị Minh Châu
Đoàn Thị Thanh Hơng
Nguyễn Thị Tuyết Nhung
Nguyễn Văn Vũ
Võ Công Huân
Vũ Thị Tiến
Phạm Việt Cờng

1 Nguyễn Hoàng Dơng
2 Phạm Đức Thuận
Lê Thị Hồng Minh
3
III

Nguyễn Thị Kim Cúc
1 Nguyễn Thị Tuyết Mai

Học hàm
Cơ quan công tác
học vị
PGS.TS,
Phòng Miễn dịch học,
NCVC
Viện Công nghệ Sinh học
ThS
ThS
ThS
ThS
ThS
CN
CN
CN
-

Phân công
phụ trách
Chủ nhiệm

đề tài
Tham gia
-

TS,
NCVC

Phụ trách
nhánh chính

CN
ThS
ThS
TS,
NCVC
ThS

Liên hiệp Khoa học sản
xuất CNSH và MT
Viện Công nghệ sinh học
Phòng Vi sinh phân tử
Viện Công nghệ Sinh học
-

Tham gia
-

Phân công công việc chính
Thu nhận mẫu, tách ARN tổng số, thiết kế các loại
primer cho phản ứng RT-PCR vùng siêu biến đổi

và khảo sát tính đặc hiệu của chúng.
Phân tích biến đổi gen VP2 và tạo dòng ổn định.
Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn
VP2, từ các chủng đại điện đợc chọn lọc, để làm
plasmid gốc.
Nghiên cứu chuyển nạp plasmid gốc vào các dòng tế
bào chuẩn, giữ giống gốc.
Nghiên cứu kỹ thuật tinh sạch ADN plasmid làm
vacxin.
Bố trí thử nghiệm vacxin ở các cơ sở thí nghiệm.
Tổng kết đề tài, hội nghị và xuất bản.
Nghiên cứu tách chiết ARN tổng số của một số
chủng virus.
Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR phân đoạn
A, VP2.
Nghiên cứu các điều kiện lên men, nhân ADN
plasmid tái tổ hợp từ plasmid gốc.
Sản xuất vacxin quy mô nhỏ, đánh giá hiệu lực.
Sản xuất lô lớn, kiểm tra tiêu chuẩn an toàn vô trùng
hiệu lực của vacxin. Xây dựng quy trình an toàn.

4


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

danh sách những ngời thực hiện đề tài và phân công công việc (tiếp)
Học hàm

Nhóm

Họ và tên

Cơ quan công tác
học vị

IV

PGS.TS,
NCVC

Phòng Di truyền phân tử
Viện Công nghệ Sinh học

Phụ trách
nhánh

V

1 Đỗ Thị Huyền
Quyền Đình Thi

ThS
TS

Phòng Enzyme học
Viện Công nghệ Sinh học

Tham gia

Phụ trách
nhánh

VI

1 Đào Thị Tuyết
2 Lê Thị Thu Giang
Lê Quang Huấn

CN
ThS
TS

1 Vũ Thị Bích Hờng
2 Trần Thị Thanh Huyền
VII
Phùng Đức Tiến

ThS
CN
TS

1
VIII

TS
TS

Phòng Công nghệ tế bào ĐV
Viện Công nghệ Sinh học

TT nghiên cứu gia cầm Thuỵ
Phơng, Viện Chăn nuôi
Trung tâm Tài nguyên MT
và CNSH, Đại học Huế
TT Thú y vùng Cần Thơ
Cục Thú y
-

Tham gia
Phụ trách
nhánh
Tham gia
Phụ trách
nhánh
Tham gia
Phụ trách
nhánh
Tham gia
Phụ trách
nhánh
Tham gia
-

IX

Trơng Nam Hải

Phân công
phụ trách

Nguyễn Thị Nga
Đinh Thị Bích Lân
1 Nguyễn Quang Vinh
2 Phùng Thăng Long
Nguyễn Bá Thành

BSTY
PGS.TS
TS

1 Trần Thị Cẩm Vân
2 Trần Đình Từ

ThS
PGS.TS

Phân công công việc chính
Su tập và tạo các loại tế bào chủ thích hợp,
cung cấp tế bào để sản xuất vacxin.
Thiết kế plasmid gốc chứa gen VP2 phân lập từ
các chủng Gumboro ở tỉnh Thừa Thiên Huế.
Thử nghiệm liệu pháp vacxin (chất mang, bổ trợ,
phơng pháp sử dụng)
Phân lập gen VP2 từ các chủng Gumboro ở các
tỉnh phụ cận Hà Nội và thiết kế plasmid gốc cho
sản xuất vacxin ADN.
Khảo nghiệm vacxin ở miền Bắc

Thu thập một số mẫu virus Gumboro
Khảo nghiệm vacxin ở miền Trung

Thu nhận các chủng virus Gumboro từ mỗi vùng
địa lý khác nhau tại Việt Nam. Kiểm tra lâm
sàng bệnh tích và tiếp truyền lấy mẫu bệnh
phẩm. Khảo nghiệm vacxin ở miền Nam

5


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

A3. các nội dung đăng ký thực hiện theo hợp đồng
Gồm 6 mục công việc cần thực hiện tập trung trong 2 nhóm chính:
NHóM I: (thu thập nguyên vật liệu thiết kế giống vacxin)
Mục 1: Thu thập mẫu bệnh phẩm và khuôn ARN virus Gumboro
1. Thu thập, phân lập virus gây bệnh Gumboro (30 mẫu x 3 vùng địa lý, các miền
Bắc-Trung-Nam , tổng cộng 90 mẫu).
2. Tiếp truyền virus trên gà mẫn cảm đảm bảo nguồn nguyên liệu, thu giữ giống
virus.
3. Thiết kế các đoạn mồi cơ bản và tổng hợp 50 loại mồi.
4. Nghiên cứu tách chiết ARN tổng số của các chủng virus.
Mục 2: Thu nhận, phân tích vùng siêu biến đổi, phân tích chọn lọc chủng
5. Thiết kế các loại primer cho phản ứng RT-PCR vùng siêu biến đổi của gen VP2
và khảo sát tính đặc hiệu của chúng.
6. Thiết kế các loại primer cho gen VP2 và phân đoạn A, phân tích biến đổi gen VP2
ở vùng siêu biến đổi và tạo dòng ổn định, chọn lọc chủng thích hợp.
Mục 3: Thu nhận gen kháng nguyên và thiết kế plasmid gốc
7. Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR thu nhận gen VP2 (1,4 kb) và phân đoạn

A (3,1 kb).
8. Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn VP2, từ các chủng đại diện đợc
chọn lọc, để làm plasmid gốc (pG-VP2).
9. Nghiên cứu lắp ráp plasmid tái tổ hợp phân đoạn A, từ các chủng đại diện đợc
chọn lọc, để làm plasmid gốc (pG-A).
10. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp đánh giá biểu hiện phân đoạn VP2, phân đoạn A đạt
tiêu chuẩn để làm plasmid gốc.
11. Su tập và tạo các loại tế bào chủ thích hợp (dòng tế bào chủ ổn định).
12. Nghiên cứu chuyển nạp plasmid gốc vào các dòng tế bào chuẩn, giữ giống gốc
(dòng tế bào tái tổ hợp chứa plasmid gốc).
NHóM II: (Sản xuất, kiểm nghiệm và thử nghiêm vacxin)
Mục 4: Nghiên cứu sản xuất vacxin
13. Nghiên cứu các điều kiện lên men, nhân ADN plasmid tái tổ hợp từ plasmid gốc
(ADN plasmid chứa gen VP2 hoặc phân đoạn A để làm vacxin).
14. Nghiên cứu kỹ thuật tinh sạch ADN plasmid chứa gen VP2 hoặc phân đoạn A để
làm vacxin, kiểm tra an toàn, vô trùng.

6


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

15. Sản xuất lô vacxin quy mô nhỏ và lớn (yêu cầu cần đạt: 100.000 liều vacxin), thử
nghiệm liệu pháp vacxin (chất mang, bổ trợ, phơng pháp sử dụng), bố trí thử
nghiệm vacxin ở trại thí nghiệm, đánh giá hiệu lực.
Mục 5: Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất, kiểm nghiệm vacxin
16. Xây dựng quy trình sản xuất, kiểm nghiệm, sử dụng vacxin.
17. Bố trí khảo nghiệm ở địa phơng tại miền Bắc và miền Trung.

Mục 6: Tổng kết
Báo cáo tổng kết, công bố Ngân hàng gen, công bố khoa học, đào tạo, trao đổi
khoa học.
A4. các sản phẩm đăng ký của đề tài
Sản phẩm QUY TRìNH
1. Quy trình I: Công nghệ sản xuất vacxin ADN đa chủng phòng bệnh Gumboro tại
Việt Nam.
2. Quy trình II: Kiểm định chất lợng vacxin ADN đa chủng và sử dụng.
Sản phẩm giống và vacxin
1. Plasmid giống gốc pG-VP2 (15 plasmid).
2. Plasmid giống gốc pG-A (15 plasmid).
3. Vacxin ADN đơn chủng (100.000 liều (20àg ADN/liều)) và phối hợp đa chủng (5
chủng) là 20.000 liều (100àg ADN/liều) phòng bệnh Gumboro.
4. Các công trình khoa học đợc đăng trên các tạp chí chuyên ngành (8 trong nớc, 45 quốc tế).
5. Các kết quả đào tạo đại học và sau đại học (6 cử nhân, 1-2 cao học, 1-2 nghiên cứu
sinh).
6. Đăng ký bản quyền và công bố trong Ngân hàng gen.
7. Báo cáo khoa học tại các hội nghị, hội thảo.

7


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

b. tổng quan tài liệu
B1. Tổng quan tài liệu tình hình nghiên cứu ngoài nớc
B1.1 Giới thiệu bệnh Gumboro
Bệnh Gumboro hay còn gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infectious

Bursal Disease - viết tắt là IBD) là một bệnh cấp tính, có khả năng lây lan rất cao ở gà
con 2-6 tuần tuổi, gây chết với tỷ lệ khá cao, từ 10-30%. Số còn lại còi cọc, chậm lớn,
dễ phát bệnh, do vậy, khi bị bệnh, thông thờng cần phải tiêu diệt cả đàn gà. Mỗi năm,
ớc tính 35 tỷ USD thiệt hại do IBDV gây ra đối với chăn nuôi gà thế giới (Lukert và
Saif, 1997). Do có sức đề kháng rất mạnh với điều kiện thiên nhiên cũng nh các yếu
tố vật lý và hoá học, nên virus lu hành rộng rãi. Đích tấn công của IBDV là các cơ
quan tổ chức Lympho - đặc biệt là túi Fabricius (có kích thớc bằng hạt lạc, cấu tạo
múi, nằm ở dới hậu môn) cũng nh các loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch, trớc
hết là Lympho B và đại thực bào. Các bệnh tích đặc trng chủ yếu là túi Fabricius sng
to (2-3 lần), thủy thũng, xung huyết, xung quanh túi có thẩm dịch, sau 3-4 ngày bị teo
dần và sau 1 tuần chỉ còn 1/3 kích thớc ban đầu. Bệnh tích cũng biểu hiện ở sự xuất
huyết cơ lờn và đùi do các sản phẩm và độc tố trong quá trình sinh bệnh gây tắc mạch
máu, mao quản, gây hoại tử tế bào và xuất huyết thẩm dịch. Khi bị huỷ hoại, các cơ
quan và tế bào có thẫm quyền miễn dịch không thực hiện đầy đủ chức năng đáp ứng
miễn dịch, do vậy, gia cầm trở nên bị suy giảm nghiêm trọng về miễn dịch
(immunosuppression). Mọi chơng trình vacxin khác, không hoặc kém phát huy hiệu
lực do hệ miễn dịch của gà bị thiểu năng bởi tác hại của IBDV (Lukert và Saif, 1997).
Mức độ suy giảm miễn dịch phụ thuộc vào độc lực của virus, thời gian và nơi xâm
nhập của IBDV vào cơ thể gà, nếu bị nhiễm dới 3 tuần tuổi hoặc càng sớm, thì gà
càng bị hậu quả suy giảm miễn dịch nặng nề (Lukert và Saif, 1997).
B1.2 Chẩn đoán Gumboro
Ngoài các phơng pháp chẩn đoán IBDV cổ điển nh nuôi cấy trong phôi gà, gà
con mẫn cảm, môi trờng tế bào xơ phôi gà, mổ khám toàn thân và xem bệnh lý túi
Fabricius, nhiều phơng pháp mới ngày càng hoàn thiện dần đợc áp dụng nh kính
hiển vi điện tử; miễn dịch huỳnh quang; khuếch tán trên thạch AGP, miễn dịch hấp phụ
enzym ELSA, trung hoà virus VN (virus neutralization); dò ADN bổ sung (cDNA
probe); hợp lai ADN không phóng xạ và nhiều phơng pháp khác (OIE:
Lukert và Saif, 1997). Gần đây, do nhu cầu cần chẩn đoán nhanh
để giảm thiệt hại, hơn nữa, do lợi thế là hệ gen IBDV đã đợc giải trình toàn bộ, nên
8

Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

các nghiên cứu chẩn đoán sinh học phân tử dựa trên phản ứng PCR ngợc (RT-PCR)
đợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả kinh tế to lớn (Jackwood và Jackwood, 1997;
Liu và cs, 2001; Lê Thanh Hoà, 2003a,b).
B1.3 Các serotype và phân nhóm độc lực của virus Gumboro
Virus gây bệnh Gumboro là virus ARN 2 sợi dơng, thuộc nhóm Birnavirus
(Avibirnavirus) trong họ Birnaviridae, đợc Cosgrove phát hiện và phân lập đầu tiên tại
Gumboro, địa hạt Sussex bang Delaware của Mỹ (Cogrove, 1962). Ngày nay, IBDV
gây bệnh ở hầu hết các vùng chăn nuôi tập trung trên thế giới, với hàng trăm biến
chủng khác nhau, nhng tất cả thuộc về 2 serotype: Serotype I và Serotype II, trong đó
Serotype I có mức độ độc lực và tính gây bệnh cao; Serotype II không có ý nghĩa lớn về
dịch tễ học (Lukert và Saif, 1997). Các chủng virus Gumboro thuộc Serotype I bao gồm
4 nhóm chính: i) nhóm cổ điển (classical) (Cosgrove, 1962); ii) nhóm biến đổi (variant)
phát hiện từ 1984-1985 (Rosenberger và cs, 1985); iii) nhóm nhợc độc (attenuated),
và iv) nhóm độc lực rất cao (very verulent), xuất hiện từ 1987-1988, gây chết gà với tỷ
lệ 30-70% (Van Der Berg và Meulemans, 1991). Chủng đầu tiên do Cosgrove phân lập
thuộc nhóm 1/Serotype I. Tuy không biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trầm trọng, các
chủng thuộc nhóm biến đổi (variant) tồn tại lâu trong gà, gây suy giảm miễn dịch
nghiêm trọng ở đàn gà. Vacxin của nhóm này khó bảo hộ cho các chủng gây bệnh
thuộc nhóm khác (Snyder và cs, 1992). Các chủng độc lực rất cao (vvIBDV) phát hiện
đầu tiên ở Bỉ, Anh, Hà Lan, tiếp đó ở tất cả mọi nớc châu âu, châu Phi, Nhật Bản,
Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan và các nớc Đông - Nam á, trong đó có Việt Nam
(Liu và cs, 2001; Sun và cs, 2003; Lê Thanh Hoà, 2003a). Trong 15 năm nay, sự biến
đổi phức tạp về đặc tính gây bệnh và chủng giống đã làm phức tạp hoá dịch tễ học và
chơng trình vacxin phòng chống Gumboro (INCO Report, 1999). Chủng G202, phân

lập năm 1987 tại Việt Nam, thuộc nhóm 4/Serotype I (Lê Thanh Hoà, 1992; 2003a; Lê
Thanh Hoà và cs, 2002). Do phức tạp về kháng nguyên và gây bệnh của Gumboro,
trong chơng trình vacxin, chúng ta bắt buộc cần phải xem xét tính thích hợp của loại
hình vacxin nhập ngoại với các chủng cờng độc gây bệnh trong một quốc gia, sao cho
sử dụng có hiệu quả (INCO Report, 1999)
B1.4 Sinh học phân tử hệ gen virus Gumboro
Hệ gen của virus Gumboro chứa axit ribonucleic (ARN) gồm 2 phân đoạn A và
B móc vào nhau (Hình B-1). Phân đoạn A bao gồm một tổ hợp (một khung đọc mở)
9


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

gồm các phân đoạn gen kế tiếp nhau có trách nhiệm tổng hợp các loại protein VP2,
VP3, VP4 và VP5; phân đoạn B tổng hợp protein VP1.
1kb

2kb

3kb

5

3

B

A

VP1

VP5

VP2

VP4

VP3

Ph ân đoạn A
Sao m
ARN thông tin
Dịch m
protein chung (108 kDa )
Ph ân cắt giai đoạn 1
VP2a (45-50 kDa )

Tiền protein

VP3 -4 (55-60 kDa )

Sản phẩm
protein độc lập

Ph ân cắt giai đoạn 2
VP2b (40-45 kDa )
CAPSID
(kháng nguyên

độc lực)

VP4 (28 kDa )

VP3 (30-32 kDa )

PROTEASE

CAPSID
(protein
cấu trúc)

(protein enzyme)

Hình B-1. Sơ đồ minh hoạ hệ gen của virus Gumboro và quá trình tổng hợp protein cấu
trúc. Ghi chú: Hệ gen virus Gumboro bao gồm 2 phân đoạn (A và B), trong đó phân đoạn B mã hoá
cho 1 loại protein (VP1); phân đoạn A mã hoá cho protein VP5và một protein chung, sau khi đợc
phân cắt sẽ cho 3 loại protein sản phẩm độc lập bao gồm VP2, VP3 và VP4 (xem Lê Thanh Hoà,
2003a).

Phân đoạn A có độ dài khoảng 3200 nucleotid, mã hoá cho một protein chung
(VP2-4-3) sau đó đợc phân cắt thành các protein VP2; VP4 và VP3 riêng biệt và
protein VP5 có phân tử lợng 17 kDa. VP1 là protein có hoạt tính enzyme protein
ARN-polymerase. VP2 là protein vỏ, đợc mã hoá bởi đoạn gen có độ dài khoảng 1350
10


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

nucleotid trong phân đoạn A của hệ gen, thuộc loại hình kháng nguyên ts (typespecific), kích thích sinh kháng thể trung hoà. VP2 có độ bảo tồn cao ở hai đầu 5 và 3
về thành phần nucleotid và thành phần axit amin, nhng lại có một vùng khoảng gần
500 nucleotide ở chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác nhau, nên đợc
gọi là vùng siêu biến đổi. Trong vùng siêu biến đổi, một dãy bao gồm khoảng 150
axit amin (vị trí 206 đến 350 của VP2) gọi là epitope có cấu trúc vòm không gian đặc
biệt, chịu trách nhiệm kích thích và kết hợp với kháng thể tơng ứng (Bayliss và cs,
1990, Lê Thanh Hoà, 2003a). Vùng siêu biến đổi này quyết định tính độc lực và tính
kháng nguyên của virus, do vậy, đợc chọn để so sánh định type, chẩn đoán, giám
định, lập phả hệ các chủng virus cờng độc Gumboro và nghiên cứu vacxin tái tổ hợp
(Yamaguchi và cs, 1996; Scherbacova và cs, 1998; Chang và cs, 2002) (Hình B-1).
B1.5 Vacxin phòng bệnh
Vacxin ứng dụng phòng chống bệnh Gumboro gồm 2 loại: vacxin truyền thống
(vacxin vô hoạt, vacxin nhợc độc sống) thuộc thế hệ cũ, và vacxin thế hệ mới bao
gồm các loại vacxin tái tổ hợp chứa ADN gen kháng nguyên hoặc sản phẩm protein
kháng nguyên (Jackwood và Jackwood, 1997; Lukert và Saif, 1997; Chang và cs,
2002). Có rất nhiều chơng trình phòng bệnh sử dụng các loại vacxin Gumboro khác
nhau ở từng nớc, từng vùng bị nhiễm phụ thuộc dịch tễ bệnh và loại gia cầm nuôi
dỡng, nhng chơng trình vacxin đều dựa vào nguyên tắc:
1. Cung cấp nguồn kháng nguyên để hệ miễn dịch thu nhận và kích thích đáp
ứng miễn dịch dịch thể (IgG) có tác dụng trung hoà virus gây bệnh.
2. Hàm lợng kháng thể thu nhận đợc phải đảm bảo bảo hộ miễn dịch, cho dù
thu nhận từ gà mẹ (miễn dịch thụ động) hoặc do gà con tạo ra (miễn dịch chủ động)
3. Phải bảo hộ miễn dịch trong giai đoạn 2-6 tuần tuổi là lúc gà dễ bị virus tấn
công và gây bệnh.
Các loại vacxin thế hệ cũ đã đợc sử dụng rộng rãi bao gồm: vacxin nhợc độc
sống và vacxin vô hoạt (Lukert và Saif, 1997). Vacxin nhợc độc sống (live
attenuated) có 3 loại phân biệt theo mức độ độc lực là thấp, trung bình và cao. Loại
vacxin nhợc độc có độ độc thấp không gây suy giảm miễn dịch, loại trung bình và cao
gây teo túi Fabricius và ảnh hởng hệ miễn dịch của gà nếu dùng trớc độ tuổi 2 tuần.

Vacxin có độ độc thấp sử dụng cho gà bố mẹ, loại trung bình và cao sử dụng cho gà
thịt (OIE: Thế mạnh của vacxin nhợc độc là gây miễn dịch tốt,
11


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

thế yếu là dễ tăng độc lực trở thành cờng độc (lại độc) và trở thành nguy cơ tàng
nhiễm (Lukert và Saif, 1997, Lê Thanh Hoà, 2003a). Vacxin vô hoạt (inactivated)
dạng nhũ dầu đợc tạo ra để gây miễn dịch cho gà mẹ nhằm cung cấp kháng thể thụ
động cho gà con đảm bảo bảo hộ miễn dịch trong 2 tuần đầu sau khi nở (OIE:
).
Các loại vacxin thế hệ mới đã đợc thử nghiệm thành công và ứng dụng trong
thực tế bao gồm: vacxin dới nhóm (subunit vaccine), vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền
(vectoral vaccine), vacxin virus Gumboro không có lõi (VLP; virus-like particle
vaccine), và vacxin ADN (DNA vaccine). Tóm lợc: 1) Vacxin dới nhóm là tái tổ
hợp gen kháng nguyên của virus Gumboro vào palssmid biểu hiện, sản xuất trong hệ
thống nấm men (Fahey và cs, 1991), hệ thống baculovirus và tế bào côn trùng (Dybing
và Jackwood, 1998), tách chiết polypeptit kháng nguyên bằng công nghệ (in vitro) bổ
sung chất bổ trợ rồi làm vacxin; 2) Vacxin tái tổ hợp có vectơ truyền là phân lập và
tái tổ hợp gen kháng nguyên vào một loại virus làm nhiệm vụ dẫn truyền nh virus
Herpes gà tây (Darteil và cs, 1995), virus Adeno (Sheppard và cs, 1998), virus đậu gà
(Shaw và Davison, 2000), Semliki Forest virus (Phenix và cs, 2001), virus vacxin
Marek (Tsukamoto và cs, 2002); và đa vào cơ thể làm vacxin; 3) Vacxin virus
Gumboro không có lõi là tạo nên hệ thống vectơ tái tổ hợp toàn bộ gen kháng nguyên,
gen cấu trúc và sản xuất chúng trong hệ thống tế bào thích hợp để chúng lắp ghép tạo
nên vỏ virus Gumboro, nhng không chứa ARN hệ gen (VLP; virus-like particle)
(Fernandez và cs, 1998; Lee và cs, 2003); 4) Vacxin ADN là tái tổ hợp gen kháng

nguyên vào một loại plasmid vectơ biểu hiện, chuyển nạp vào tế bào E. coli, sản xuất
ADN plasmid, tách chiết và tinh sạch để làm vacxin (Fodor và cs, 1999; Chang và cs,
2002; Chang và cs, 2003; Kim và cs, 2004; Sun và cs, 2005).
Vacxin thế hệ mới tạo ra bằng cả 4 hớng nói trên tỏ ra có hiệu quả thực tế
phòng chống bệnh Gumboro tại nhiều nớc trên thế giới (Chang và cs, 2002; Chang và
cs, 2003). Gần đây, vacxin ADN chứa VP2 và phân đoạn A (VP2-VP4-VP3) của các
chủng GP40 và D78 ứng dụng có hiệu quả cao tại Hungary (Fodor và cs, 1999; Kim và
cs, 2004); và chứa toàn bộ phân đoạn A (VP2-VP4-VP3) của chủng chuẩn STC đã
đợc ứng dụng thành công tại Mỹ (Chang và cs, 2002; Chang và cs, 2003; Sun và cs,
2005). Vacxin ADN chứa toàn bộ VP2-4-3 (phân đoạn A) có hiệu lực vacxin tốt hơn
vacxin ADN chỉ chứa duy nhất gen VP2, có thể do polypeptide kháng nguyên lúc tổng
12


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

hợp đợc gấp khúc và tạo cấu trúc không gian giống nh vỏ virus có trong tự nhiên, tức
là có cấu trúc giống nh VLP. Vacxin ADN phòng chống Gumboro đợc tiêm vào cơ
hoặc/và vào bụng một vài lần (2-3 lần) lúc 1-2 ngày, lúc 1 tuần và lúc 2 tuần tuổi cho
hiệu quả miễn dịch cao nhất (Fodor và cs, 1999; Chang và cs, 2002). Vacxin ADN
phòng bệnh Gumboro đã đợc đăng ký bản quyền chính thức ở Mỹ, và đợc sử dụng ở
nhiều nớc trên thế giới (Aboud-Pirak và cs, 2002).
B1.6 Nguyên lý thiết kế vacxin ADN và phơng thức sử dụng
Việc đa một chuỗi nucleotid của gen kháng nguyên vào một loại plasmid biểu
hiện (expression vector), rồi sử dụng toàn bộ ADN của plasmid tái tổ hợp này để gây
miễn dịch đã đợc nghiên cứu từ đầu những năm 1990 (Tang và cs, 1992) và sử dụng
thành công nh là một loại vacxin thế hệ mới phòng chống có hiệu quả nhiều bệnh
truyền nhiễm (Robinson và Pertmer, 2000). Do vacxin ADN có u thế là dễ dàng trong

thiết kế, đơn giản trong sản xuất, tiện lợi trong sử dụng, và cho miễn dịch đáp ứng yêu
cầu, trong 5 năm gần đây, với mục đích bảo vệ con ngời và động vật, đã có hàng chục
loại vacxin ADN đợc thiết kế, thử nghiệm, một số đã sử dụng tiền lâm sàng
(preclinical trial) đối với hầu hết các đối tợng, bao gồm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng
và thậm chí cả prion (Chattergoon và cs, 1998; Robinson và Pertmer, 2000). Đã có ít
nhất 50 loại vacxin ADN virus; 9 loại vacxin ADN vi khuẩn; 9 vacxin ADN ký sinh
trùng và prion, đã đợc thống kê và phân tích trong bài tổng quan về vacxin ADN của
Robinson và Pertmer (2000).
Vacxin ADN là sản phẩm của quá trình chọn lọc, phân lập gen kháng nguyên,
thiết kế vectơ và kết nối chúng thành một tổ hợp gọi là plasmid vectơ tái tổ hợp,
chuyển nạp vào tế bào vi khuẩn thích ứng, tách chiết ADN và tinh sạch, rồi sử dụng
ADN plasmid tái tổ hợp nh là một loại chế phẩm làm vacxin trên đối tợng là ngời
và động vật (Babiuk và cs, 2002). Plasmid làm khung cho vectơ tái tổ hợp trong thiết
kế vacxin ADN phải là một plasmid biểu hiện (expression vector), mà về nguyên tắc,
ngoài các thành phần cần có của một plasmid hoạt động, phải bố trí một promotor rất
mạnh, đủ để thực hiện chức năng biểu hiện gen protein kháng nguyên gài vào sau nó,
đợc sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide promotor lấy từ cytomegalovirus
(Robinson và Pertmer, 2000). Trong vectơ biểu hiện protein, cần có thêm các tiểu phần
trợ giúp khác, trớc hết là tiểu phần tín hiệu poly-A gắn vào sau chuỗi gen kháng
nguyên tái tổ hợp, sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide có chức năng gắn tín hiệu
13


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

polyA của gen -globin của thỏ (rabbit -globin polyadenylation signals) hoặc của
gen hocmôn sinh trởng bò (bovine growth hormone polyadenylation sequence, ký
hiệu là BGH).

Về nguyên tắc, vacxin ADN có thể chứa đơn gen (mono-cistronic) hoặc đa gen
(multi-cistronic) hoặc đa phân đoạn epitope (poly-epitope) hoặc chứa thêm cả gen của
các thành phần kích ứng miễn dịch, trong đó có chuỗi CpG (Wang và cs, 2003), gen
kích thích và điều hoà miễn dịch có nguốn gốc là cytokine, ví dụ IL-2 (Liu và cs,
2005). Một trong những yêu cầu cực kỳ quan trọng khi thiết kế tổ hợp biểu hiện gen
kháng nguyên trong plasmid khung làm vacxin ADN là phải đa đợc chuỗi Kozak
(GCG/GCC) vào trớc bộ mã ATG của gen kháng nguyên (Kozak, 1987, 1997). Hai
phơng thức cơ bản đa vacxin ADN vào cơ thể là phơng pháp tiêm vào trong da
hoặc cơ (đơn giản là phơng pháp tiêm, injection), và phơng pháp bắn xuyên da và
cơ (đơn giản là phơng pháp bắn gen, gene gun delivery) (Fynan và cs, 1993), có ảnh
hởng mang tính chất quyết định đến cơ chế và loại hình đáp ứng miễn dịch, và do vậy,
quyết định hiệu lực của vacxin (Robinson và Pertmer, 2000). Phơng pháp tiêm thờng
hớng tới đáp ứng miễn dịch có vai trò chủ đạo của tế bào Th1 (helper T cell type 1),
và phơng pháp bắn gen lại hớng tới đáp ứng miễn dịch có vai trò chủ đạo của tế bào
Th2 (helper T cell type 2). Vacxin ADN đợc pha trong môi trờng đệm là muối
(saline), ví dụ, NaCl hay PBS (Phosphat Buffer Saline), tiêm với liều lợng từ 10 àg
đến 1 mg, bắn gen với liều 0,2 àg đến 20 àg (Robinson và Pertmer, 2000), liều nh vậy
chứa khoảng 1011-13 plasmid vectơ tái tổ hợp, đủ để kích thích miễn dịch. Về an toàn và
vô trùng cho một vacxin ADN, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 1998) quy định là không
chứa ADN nhân vi khuẩn, ARN ngoại lai, protein lẫn tạp, độc tố endotoxin trên hàm
lợng cho phép (Prazeres và cs, 1999).
B1.7 Vector biểu hiện gen kháng nguyên
Vacxin ADN thực chất là một loại chứa plasmid làm vector đã đợc sử dụng
trong tái tổ hợp gen kháng nguyên của một loại vi sinh vật gây bệnh nào đó mà chúng
ta cần phòng chống; có thể là vi khuẩn hay virus, hay các tác nhân gây bệnh khác.
Hiện nay một số loại vacxin ADN thành công chủ yếu là vacxin ADN chứa gen kháng
nguyên có nguồn gốc từ hệ gen virus.
Rõ ràng bản chất của một plasmid làm khung cho vector trong thiết kế vacxin
ADN phải là một plasmid biểu hiện (expression vector), mà theo nguyên tắc phải có
14

Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

một promotor rất mạnh và thích hợp với tế bào chủ, đủ để thực hiện chức năng protein
kháng nguyên gài vào sau nó (Robinson và Permer, 2000).

Atg

Toàn bộ gen kháng nguyên

tga;taa

ADN gen kháng nguyên (cần tái tổ hợp vào vector)

pDNAvac
(5,5kbp)

Hình B-2. Cấu trúc khung của plasmid vector và mô tả mô hình tái tổ hợp gen kháng
nguyên để làm plasmid gốc sản xuất vacxin ADN (khung pcDNA3.1 của Invitrogen,
Mỹ).

Promotor đợc sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotid lấy từ cytomegalovirus
(CMV). Thực chất đó là promotor điều hòa gen sớm (immediate early promotor) của
virus CMV. Trong vector biểu hiện protein ngoài promotor, cần có các tiểu phần trợ
giúp khác, trớc hết là tiểu phần tín hiệu poly-A gắn vào sau chuỗi gen kháng nguyên
tái tổ hợp. Sử dụng nhiều nhất là chuỗi nucleotide có chức năng gắn tín hiệu polyA
của gen -globin của thỏ (rabbit -globin polyadenylation signals) hoặc của gen

hocmôn sinh trởng bò (bovine growth hormone polyadenylation sequence, ký hiệu là
BGH) (Hình B-2). Tính tích cực trong biểu hiện cũng nh mức độ biểu hiện của ARN
thông tin gen kháng nguyên còn có thể đợc tăng cờng bằng cách chuyển đổi việc sử
dụng các bộ mã từ tế bào nhân sơ (prokaryotic codon usage) sang các bộ mã của tế bào
nhân chuẩn (eukaryotic codon usage) (Andre và cs, 1998).
15


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

Hệ vector biểu hiện có thể tái tổ hợp đơn gen (mono-cistronic) hoặc đa gen
(multi-cistronic). Trong trờng hợp tái tổ hợp nhiều gen, có thể đó là hai gen cùng biểu
hiện sản phẩm protein kháng nguyên, hoặc một gen biểu hiện protein kháng nguyên,
còn gen kia biểu hiện protein có tính chất kích thích và điều hòa miễn dịch có nguồn
gốc cytokine.
B1.8 Các thành phần kích ứng gen và miễn dịch
B1.8.1 Chuỗi Kozak kích ứng biểu hiện gen
Một số nucleotid nằm trực tiếp ngay trớc bộ mã khởi đầu (ATG) của gen trong
vùng sao chép thành ARN thông tin cùng với gen, có ảnh hởng rất lớn đến quá trình
nhận biết của ribosome ở tế bào, đặc biệt là ở tế bào nhân chuẩn, đối với ARN thông
tin đó (Kozak, 1987; 1997). Chuỗi Kozak đơn (GCC) hay (GCG) trực tiếp trớc bộ mã
ATG; hoặc chuỗi Kozak hợp nhất (GCCAUGG), trong đó AUGG là các nucleotid đầu
tiên của một gen, đợc chứng minh là có khả năng kích ứng biểu hiện gen cao hơn
nhiều lần so với một gen đơn thuần không có các chuỗi Kozak này. Nếu đợc thiết kế
lặp hay nói cách khác, thiết kế chuỗi Kozak kép (GCCGCC) hay (GCCGCCGCC), thì
gen chịu ảnh hởng điều hòa của chúng có biểu hiện mạnh hơn. Trong nhiều trờng
hợp, để tăng cờng biểu hiện gen, đặc biệt ở động vật, việc thiết kế nucleotid ở chuỗi
dẫn sau bộ mã ATG của một gen tái tổ hợp cũng cần phải điều chỉnh để tuân thủ quy

luật này. Ngời ta gọi đây là quy luật Kozak. Cụ thể, có một số quy luật Kozak trong
thiết kế biểu hiện gen nh sau:
i) Cần có chuỗi GCC hoặc GCG trớc bộ mã ATG của gen;
i) Cần có chuỗi GCCAUGG trớc và ngay phần đầu của gen;
i) Cần có chuỗi 2x/3x(GCC) trớc bộ mã ATG của gen;
i) Tại vị trí -3 cần có nucleotid gốc purin, nếu không, thì cần có Guanine (G)
ở vị trí thứ +4 (Lee và cs, 1997).
Vai trò của chuỗi Kozak càng đặc biệt quan trọng, nếu đợc thiết kế vào một
gen có nguồn gốc vi sinh vật bậc thấp (prokaryotic gen) để biểu hiện trong hệ thống tế
bào nhân chuẩn (eukaryotic cell). Do vậy, trong thiết kế cần kèm theo chuỗi Kozak để
tăng cờng khả năng biểu hiện gen mới cho sản phẩm với hàm lợng cao.

16


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

B1.8.2 Chuỗi CpG kích ứng miễn dịch
Hiệu lực của một vacxin ADN, ngoài yếu tố kích thích miễn dịch mạnh của
protein kháng nguyên (thành phần chính của vacxin ADN), còn có vai trò của một số
thành phần khác có vai trò kích thích trong quá trình đáp ứng miễn dịch, hay còn gọi là
các thành phần kích ứng miễn dịch.
Một trong các thành phần đó phải kể đến chuỗi CpG. CpG là cấu trúc thành
phần của hệ gen vi khuẩn, một loại hình cấu trúc ngắn thờng gặp (microsatellite), kể
cả bắt gặp chúng trong hệ gen động vật bậc cao, trớc hết là ở ngời (Krieg và cs,
1998). Nét đặc trng nhất phân biệt motif CpG của ngời, thuộc tế bào nhân chuẩn
(eukaryote) và CpG của vi khuẩn thuộc tế bào nhân sơ (prokaryote), là CpG của ngời
và động vật bị metyl hóa (methylation), còn ở vi khuẩn CpG không bị metyl hóa và

xuất hiện trong hệ gen vi khuẩn với tần suất gấp hàng chục đến hàng trăm lần so với số
lợng CpG trong hệ gen động vật bậc cao. Nh vậy, rõ ràng CpG phải có một vai trò
nhất định, nên cấu trúc lặp thuộc motif CpG nh thế này mới đợc bảo tồn qua tiến hóa
và đợc lu giữ lại trong hệ gen của tế bào bậc thấp và bậc cao.
Ngày nay, CpG biết đến có hai loại, xét về mặt chức năng:
- CpG kích thích (CpG-S: CpG-stimulatory): có cấu trúc chuỗi nucleotid đặc
biệt, có thành phần là -UUCGYY-, có chức năng kích thích miễn dịch bẩm sinh của cơ
thể, theo cơ chế tự bảo vệ. Trớc hết chúng có vai trò kích thích tạo ra các sản phẩm
cytokine thuộc loại hình TH1 (T-Helper cells type 1) và hoạt hóa tế bào tua (dendritic
cells, DC), loại tế bào có vai trò trung gian trong trình diện kháng nguyên cho các tế
bào có thẩm quyền miễn dịch (Sumida và cs, 2004; Krieg và cs, 1998).
- CpG trung hòa (CpG-N: CpG-neutralizing): là chuỗi CpG có thành phần
CGCGCG-, có chức năng đối ngợc với CpG-S, nghĩa là cản trở miễn dịch bẩm sinh
của cơ thể, tạo điều kiện hỗ trợ vi sinh vật xâm nhập. Loại hình CpG-N thờng gặp
trong hệ gen của ngời gấp 2-5 lần so với CpG-S (Krieg và cs, 1998).
Hai loại hình CpG-S và CpG-N hoạt động trong quá trình kích thích miễn dịch
theo một cơ chế điều hòa qua lại, kính thích và kìm hãm, hay còn gọi là cơ chế feedback, một cơ chế vốn có của bất kỳ hệ thống hoạt động protein có hoạt tính cao nào
trong cơ thể.

17


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

Tái tổ hợp chuỗi CpG-S và CpG-G vào cấu trúc của vacxin ADN là thao tác
không thể thiếu đợc để thiết kế một vacxin ADN có hiệu ứng kích thích miễn dịch cao
(Krieg và cs, 1998) và thông thờng, chuỗi CpG của plasmid làm khung sử dụng cho
kiến tạo vacxin ADN đã đợc thiết kế từ trớc. Vấn đề là ở chỗ, cần có bao nhiêu cấu

trúc lặp CpG cho mỗi loại hình, sao cho ảnh hởng của cơ chế feed-back không theo
chiều tác dụng kìm hãm miễn dịch (Klinman và cs, 1997).
Những dẫn chứng sau đây cho thấy cần thiết phải thiết kế đúng số lợng và loại
hình CpG, để chúng ta có thể có đợc loại vacxin ADN có vai trò kích thích cả hai loại
đáp ứng miễn dịch: miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. Ví dụ, một
plasmid vector đợc bố trí 245 cấu trúc lặp CpG, trong đó 134 là CpG-N. Nếu có 56
CpG-N đột biết trong số 134 CpG-N này thì vacxin ADN này kích thích miễn dịch dịch
thể, tức là kích thích sinh kháng thể dịch thể gấp 2 lần, và có đến 30 40% tế bào
Lympho-T đợc biệt hóa thành tế bào Tc (Tc: cytotoxic T). Nếu cho thêm 16 cặp CpGS vào vector nói trên, hàm lợng kháng thể dịch thể đợc kích thích sinh ra tăng gấp 6
lần, nhng mức độ kháng thể tế bào Tc không thay đổi. Nếu cho cặp CpG-S lên đến
con số 50 cặp, thì hàm lợng kháng thể dịch thể vẫn không tăng hơn, nhng lợng Tc
sinh ra nhiều hơn, đến 55% tổng số tế bào Lympho-T đợc sinh ra, qua xét nghiệm
miễn dịch.
Nh vậy CpG-S có một giới hạn trong hiệu ứng kích thích miễn dịch dịch thể.
Giả thuyết cho việc tăng số lợng CpG-S kìm hãm hàm lợng kháng thể dịch thể sinh
ra là do các chuỗi này cùng kích thích sinh ra interferon (IFN) thông qua TH1 và
interferon tác dụng làm giảm biểu hiện gen kháng nguyên của vacxin ADN. Nh vậy
CpG là cần thiết bố trí vào vacxin ADN nh là một thành phần bổ trợ thuộc thế hệ mới
(bổ trợ bằng công nghệ gen), nhng không nhất thiết chính xác và kỹ lỡng về số
lợng và cấu trúc, mà chỉ cần sự có mặt của chúng trong cấu trúc plasmid làm vacxin
ADN là đủ (Wang và cs, 2003).
B1.9 Miễn dịch học của vacxin ADN
B1.9.1 Vai trò của tế bào tua (DC) xử lý ADN kháng nguyên
Vacxin ADN có u thế tạo nguồn kháng nguyên lâu bền, hàm lợng đủ để các
tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen presenting cells) tiếp nhận và giới thiệu
cho các loại tế bào có thẩm quyền miễn dịch tơng ứng đó là Lympho-B hay/hoặc
Lympho-T. APC luôn luôn ở trong trạng thái hoạt động và tập thể Lympho-B/Lympho18


Bỏo cỏo tng kt

LTH/KC.04.29(2004-2006)/VCNSH

T cũng luôn luôn ở trong trạng thái chịu tác động để biệt hóa thành các tế bào tham gia
tích cực quá trình đáp ứng miễn dịch một cách lâu bền.
Một đặc trng cơ bản nhất của miễn dịch học vacxin ADN là sự tạo ra trí nhớ
miễn dịch đợc tận dụng một cách có hiệu quả (Robinson và Pertmer, 2000), cũng
nh cơ chế linh hoạt trong sử dụng tế bào tua nang (follicular dendritic cells = FDC)
để duy trì và trình diện nguồn kháng nguyên đối với tế bào Lympho-B đã đợc biệt hóa
(Sumida và cs, 2004). FDC thuộc loại nguồn gốc không tủy xơng (non-bone marrow
derived cells), chúng là những tế bào tơng tác miễn dịch đặc hiệu của Lympho-B để
sản sinh kháng thể dịch thể (Ada, 2001).

Tế bào nguồn từ tủy xơng

Tế bào nguồn DC
pDC1

Tiếp nhận và
trỡnh diện
kháng nguyên
tham gia đáp
ứng miễn dịch

pDC2

DC non (cha chín)
iDC1

DC nguồn và

DC non tiếp
nhận kháng
nguyên (ẩm
bào và thực
bào)
tham
gia đáp ứng
miễn dịch

iDC2

DC trởng
thành trỡnh
diện kháng
nguyên
DC1

DC2

DC trởng thành (chín)
tham gia đáp ứng miễn dịch

DC1

DC2

DC trởng thành (chín)
tham gia đáp ứng miễn dịch

Hình B-3. Biệt hóa tế bào tua trong tham gia miễn dịch của vacxin ADN.

Ghi chú: DC non có thể tiếp nhận kháng nguyên là ADN gen kháng nguyên để tự sản xuất
hoặc protein kháng nguyên do tế bào da và cơ sản xuất để trởng thành trở thành DC thẩm quyền miễn
dịch hoạt động trong miễn dịch học của vacxin ADN.

Với phơng pháp tiêm vacxin ADN hòa tan trong dung môi nớc sinh lý hay
đệm phosphate (PBS), bằng cả hai cách: hoặc vào cơ hoặc vào nội bì, tế bào tua
(dendritic cells) đợc phát hiện là loại hình tế bào chủ yếu tiếp nhận ADN, chuyển tải
19