Phân tích và xác định các đặc điểm hóa học đặc trưng của dược liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

phân tích và xác định các đặc điểm
hóa học đặc trng của dợc liệu
phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa

Chủ nhiệm đề tài: dscki. Nguyễn kim bích
Cơ quan chủ trì đề tài : Viện Dợc Liệu

6265
28/12/2006

NĂM 2006


Phần A: Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài.
1. Kết quả nổi bật của đề tài :
Đề tài đã xây dựng đợc phơng pháp và kỹ thuật có tính chất thờng
qui để xác định các đặc điểm hoá học đặc trng của dợc liệu phù hợp với đối
tợng cha xác định thành phần hoạt chất, phục vụ có hiệu quả cho công tác
tiêu chuẩn hoá về mặt xây dựng phép thử định tính hoá học dợc liệu.
Các dợc liệu chọn làm đối tợng nghiên cứu gồm có 20 dợc liệu sau :
11. Ô dợc
1. Ba kích
12. Sài hồ
2. Bồ công anh
13. Tô mộc
3. Cẩu tích
4. Cỏ nhọ nồi.

14. Tang bạch bì
15. Thảo quyết minh
5. Dây đau xơng
16. Thổ phục linh
6. Đảng sâm
17. Tiền hồ
7. Đỗ trọng
18. Trạch tả
8. Hà thủ ô
19. Xa tiền tử
9. Mộc hơng
20. Xuyên khung.
10. Nga truật
Các mẫu làm đối tợng nghiên cứu đều biết rõ nguồn gốc thu hái, đã
qua kiểm tra và xác định đúng tên khoa học.
Phơng pháp xác định các đặc điểm hoá học đặc trng đợc xây dựng
dới dạng xác định vân tay nhóm chất của dợc liệu; đợc thực hiện bằng
phơng pháp sắc ký, với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng là chủ yếu, phù hợp với đối
tợng cha xác định đợc thành phần hoạt chất.
Kết quả hình ảnh các sắc ký đồ xác định các đặc điểm đặc trng dạng
vân tay hoá học của 20 dợc liệu, đợc trình bày dới dạng atlas ( hình ảnh
in màu) cùng với các phơng pháp xác định, là tài liệu tham khảo bổ ích áp
dụng trong phân tích và xây dựng tiêu chuẩn dợc liệu, phục vụ kiểm tra và
đánh giá chất lợng nguyên liệu và sản phẩm thuốc từ dợc liệu.
Kết quả xác định các đặc điểm vân tay của dợc liệu (bằng kỹ thuật
SKLM) đã thể hiện đợc ứng dụng có hiệu quả trong định tính phân biệt
chống nhầm lẫn hoặc giả mạo dợc liệu, nh : phân biệt Cỏ nhọ nồi với Sài
đất, Dây đau xơng với Dây ký ninh , ô dợc với ô dợc nam, ô dợc với rễ
sim ( giả mạo), Lức (Sài hồ nam ) với Sài hồ ( Sài hồ bắc), Mộc hơng với
Nam mộc hơng. Kết quả đã góp phần minh hoạ cho các đặc điểm vân tay

đã xác định là đặc trng cho dợc liệu.
Kết quả ứng dụng vân tay hoá học đã đợc xác định trong định tính
dợc liệu, có thành phần trong một số chế phẩm thuốc đông dợc đang lu
hành, cho thấy, các đặc điểm vân tay dợc liệu, đã đợc ứng dụng có hiệu quả
để định tính phát hiện sự có mặt của dợc liệu đó, trong thành phẩm thuốc
gồm hỗn hợp đa thành phần dợc liệu. Kết quả các đặc điểm vân tay của dợc
liệu đã đợc xác định là cơ sở và định hớng cho việc khảo sát xây dựng
phơng pháp định tính dợc liệu trong chế phẩm.
1


Các kết quả vân tay hoá học của 20 dợc liệu nghiên cứu trong đề tài sẽ
góp phần bổ sung t liệu về định tính trong các chuyên luận dợc liệu của
DĐVNIII.
Các kết quả xác định vân tay hoá học của dợc liệu đã góp phần xây
dựng mô hình thiết lập kho dữ liệu về dấu vết hoá học các dợc liệu nói
chung, áp dụng trong kiểm nghiệm, thẩm định, đánh giá tính đúng của dợc
liệu.
2. Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cơng nghiên cứu đã đợc
phê duyệt.
a. Tiến độ : Đề tài thực hiện trong 2 năm, song còn gặp khó khăn trong việc
lấy mẫu một số dợc liệu và tìm kiếm thành phẩm thuốc đông dợc phục vụ
cho nghiên cứu và khảo sát, nên tiến độ bị kéo dài hơn so với qui định.
b. Thực hiện mục tiêu nghiên cứu : Thực hiện đầy dủ các mục tiêu đề ra.
c. Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cơng.
Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cơng.
Chất lợng sản phẩm đạt yêu cầu
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí :
Tổng kinh phí đợc cấp 150 triệu
Đã quyết toán xong.

3. Đề xuất
Với kết quả xác định các đặc điểm hoá học đặc trng dạng vân tay
hoá học của 20 dợc liệu kể trên, đề tài đã bớc đầu xây dựng đợc mô hình
về phơng pháp phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trng của dợc
liệu, áp dụng cho đối tợng cha xác định đợc thành phần hoạt chất. Thời
gian tới, chúng tôi xin đề nghị Bộ cho phép mở rộng và tiếp tục nghiên cứu
đối với các đối tợng dợc liệu khác. Trên cơ sở khai thác sâu hơn khả năng
phân tích bằng kỹ thuật SKLM, đặc biệt là kỹ thuật hiện đại nh TLC Scanner
một kỹ thuật đã đợc áp dụng có hiệu quả trong phân tích định tính và định
lợng dợc liệu nhng vẫn còn mới mẻ ở VN, góp phần tích cực trong việc
xây dựng phơng pháp phân tích phục vụ cho nghiên cứu, tiêu chuẩn hoá,
thẩm định và kiểm nghiệm dợc liệu.

2


Phần B: nội dung chi tiết kết quả nghiên cứu
I. Đặt vấn đề
Hiện nay nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc từ dợc liệu, phục vụ
phòng và chữa bệnh ở nớc ta cũng nh các nớc trên thế giới có xu hớng
ngày càng gia tăng.
Việt Nam có tiềm năng phát triển dợc liệu. Nằm trong vùng khí hậu
nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, nớc ta có nguồn tài nguyên động thực vật vô
cùng phong phú và đa dạng. Cộng đồng các dân tộc Việt Nam vốn có nhiều
kinh nghiệm trong việc sử dụng các cây thuốc để điều trị bệnh và bồi bổ sức
khoẻ. Với phơng châm kế thừa vốn cổ truyền của y học dân tộc, xây dựng
một nền y học hiện đại và đại chúng, đến nay nhiều mặt hàng thuốc có nguồn
gốc từ thảo dợc đã đợc sản xuất và lu hành rộng rãi trên cả nớc, phục vụ
chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. Tính đến năm 2002 cả nớc có 257 cơ sở đợc
cấp giấy phép sản xuất dợc liệu và đông dợc với tổng số 1617 mặt hàng

thuốc có nguồn gốc từ dợc liệu, chiếm gần 1/3 số mặt hàng thuốc sản xuất
trong nớc [1]. Theo đó nhu cầu cung cấp nguồn nguyên liệu dợc liệu phục
vụ cho sản xuất và chữa bệnh theo y học cổ truyền ớc tính 50.000 tấn/
năm[1].
Đi đôi với việc sử dụng và lu hành dợc liệu và thuốc có nguồn gốc
dợc liệu với số lợng lớn nh vậy, vấn đề quản lý chất lợng thuốc đặc biệt là
quản lý chất lợng dợc liệu, để đảm bảo sử dụng thuốc an toàn và hiệu quả,
luôn là câu hỏi đợc đặt ra cho Ngành và còn nhiều bức xúc cần đợc tháo gỡ
và giải quyết. Tình trạng dợc liệu lu thông trên thị trờng không rõ nguồn
gốc, thiếu sự kiểm soát về chất lợng còn phổ biến, do vậy dợc liệu đem sử
dụng và sản xuất có chất lợng không ổn định, kém chất lợng và dễ bị nhầm
lẫn hoặc bị giả mạo. Trớc xu thế chuẩn bị hội nhập khu vực và thế giới, trớc
nhu cầu cấp bách phải nâng cao chất lợng thuốc đợc sản xuất trong nớc,
một vấn đề đặt ra cho ngành dợc là phải sử dụng nguồn nguyên liệu dợc
liệu làm thuốc với chất lợng ổn định và dợc liệu phải đợc tiêu chuẩn hoá
về nhiều mặt.
Vấn đề tiêu chuẩn hoá dợc liệu là nội dung quan trọng trong quản lý
chất lợng dợc liệu và đã đợc quan tâm thảo luận nhiều nhất tại diễn đàn
hoà hợp thuốc thảo dợc gọi tắt là FHH ( Forum for harmonization of herbal
medicines ) của các nớc trong khu vực Tây thái bình dơng, đợc tổ chức tại
Tokyo tháng 5 năm 2002 . Tại diễn đàn này đã thống nhất qui định tiêu chuẩn
hoá dợc liệu về các mặt : đúng, tốt và tinh khiết [1].
Để đảm bảo chất lợng dợc liệu đạt yêu cầu về các mặt nh đã nêu,
các chỉ tiêu kỹ thuật thể hiện trong các tiêu chuẩn dợc liệu luôn có xu
hớng đòi hỏi ngày càng chặt chẽ và phải đợc nâng cao, do vậy các phép thử
đợc xây dựng để đánh giá cũng đòi hỏi phải đơc cải tiến, trong số đó gồm

3

có phép thử định tính hoá học có liên quan đến đánh giá tính đúng, góp phần
quan trọng đáng kể trong việc kiểm tra và đánh giá chất lợng dợc liệu.
Theo báo cáo về sự bổ sung và sửa đổi trong DĐTQ 2005 tại diễn đàn FHH
tháng 5/2005 [59], các số thống kê về phép thử định tính hoá học trong các
chuyên luận dợc liệu của DĐTQ 2005 cho biết, các phép thử định tính bằng
phơng pháp SKLM gồm có 342 trong tổng số 531 phép thử hoá học, chiếm
64% và đã tăng thêm về số lợng so với DĐTQ 2000 là 114 phép thử, các
phép thử khác nh phép thử vật lý và phản ứng hoá học là 172 chiếm 32%, số
lợng tăng hơn so với DĐTQ 2000 là 9 , phép thử định tính bằng phơng pháp
SKLCA đã đợc bổ sung là 5. Các con số nói trên cho thấy, phép thử định tính
bằng phơng pháp SKLM chiếm tỷ cao và có xu hớng tăng hơn hẳn so với
định tính bằng phơng pháp khác.
Hiện nay, các chỉ tiêu định tính bằng phơng pháp hoá học đã đợc xây
dựng và qui định trong các chuyên luận dợc liệu của DĐVNIII. Theo thống
kê, trong số 248 chuyên luận dợc liệu có 83 chuyên luận có chỉ tiêu định tính
SKLM chiếm 33,4% ; 77 chuyên luận định tính bằng phản ứng hoá học,
chiếm 31% và 88 chuyên luận cha có chỉ tiêu định tính, chiếm 35,5%. Các số
đã nêu cho thấy, phơng pháp định tính SKLM chiếm tỷ lệ thấp, trong khi đó
các phơng pháp định tính bằng phản ứng hoá học trong ống nghiệm chiếm tỷ
lệ đáng kể và vẫn còn nhiều chuyên luận cha có phép thử định tính, xác định
đặc trng về hoá học. Hầu hết trờng hợp này đều rơi vào các đối tợng dợc
liệu cha xác định đợc thành phần hoạt chất, thậm chí, kể cả các dợc liệu có
thể đã đợc biết thành phần hoạt chất hoặc thành phần hoá học đặc trng,
nhng cha có điều kiện xác định, do cha có chất đối chiếu.Trớc thực trạng
nh đã nêu và trớc xu thế chuẩn bị hội nhập, dợc liệu có chất lợng phải
đạt tiêu chuẩn của khu vực, việc xây dựng các chỉ tiêu đánh giá chất lợng
dợc liệu liên quan đến định tính xác định đặc trng hoá học, cần thiết phải
đợc cải tiến và nâng cao cho phù hợp với xu thế chung, góp phần từng bớc
nâng cao khả năng kiểm tra và đánh giá chất lợng dợc liệu, phục vụ cho
công tác quản lý chất lợng dợc liệu và chế phẩm thuốc từ dợc liệu ngày

một tốt hơn. Để đáp ứng một phần yêu cầu đó , đề tài đã đợc thực hiện với
tiêu đề : Phân tích và xác định các đặc điểm hoá học đặc trng của dợc
liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hoá
Mục tiêu của đề tài nh sau :
1. Xây dựng đợc phơng pháp, kỹ thuật phân tích một số thành phần
hoá học đặc trng, coi nh là dấu vết hoá học của khoảng 20 dợc liệu, trong
danh mục thuốc thiết yếu, cha xác định đợc hoạt chất. Xác định nhận biết
các dợc liệu này bằng kỹ thuật so sánh dấu vết trên.
2. Sử dụng các dấu vết hoá học trên vào kiểm nghiệm chất lợng
dợc liệu và một số thành phẩm có chứa dợc liệu tơng ứng đang lu hành
trên thị trờng.
3. Góp phần xây dựng mô hình thiết lập kho dữ liệu về dấu vết hoá
học các dợc liệu nói chung để áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc.

4


II. Tổng quan
2.1. Tổng quan đặc điểm hoá học đặc trng của dợc liệu
Đối với dợc liệu, bên cạnh phơng pháp nhận dạng bằng kỹ thuật hiển
vi , phơng pháp phát hiện liên quan đến thành phần hoá học, từ lâu cũng đã
đợc áp dụng và ngày càng trở nên có hiệu quả trong việc nhận dạng, phân
biệt và chống nhầm lẫn dợc liệu.
Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học, các phơng pháp phân tích
với kỹ thuật hiện đại, đặc biệt là các kỹ thuật sắc ký đã không ngừng đợc cải
tiến và áp dụng có hiệu quả trong nghiên cứu, chiết tách và phân tích xác định
các thành phần hóa học của cây thuốc. Nhờ đó, nhiều chất mới đặc trng cho
cây thuốc đã đợc phát hiện, phục vụ nhu cầu nghiên cứu thuốc mới và góp
phần nâng cao tiêu chuẩn hoá chất lợng dợc liệu và thuốc thảo mộc. Với
mục đích trên, các kỹ thuật sắc ký nh SKLCA, SKLM, SKLM hiệu năng

cao, SKK, SKK- KP, điện di mao quản... đã và đang đợc áp dụng phổ biến ở
các quốc gia nh Mỹ, các nớc thuộc cộng đồng chung châu Âu và một số
nớc châu á nh Trung quốc , ấn độ... Trong đó, xác định vân tay dợc liệu
bằng kỹ thuật SKLM và SKLCA đã đợc áp dụng để nhận biết, theo dõi và
đánh giá chất lợng dợc liệu. Ví dụ, dựa vào hình ảnh vân tay SKLM của cây
thuốc để nhận biết và phân biệt giữa các loài [30]; dựa vào sắc ký đồ vân tay
SKLCA có thể xác định đợc vùng trồng của Xuyên khung [19], Khơng hoạt
[28]; đánh giá chất lợng Hoàng liên chân gà (Coptidis rhizome) dựa vào đặc
điểm vân tay SKLM của protoberberin alcaloid [54]; áp dụng vân tay hoá học
xác định sự thay đổi thành phần hoá học của Trạch tả trong quá trình chế biến
[69]... Tuy nhiên các kỹ thuật đợc áp dụng trong phân tích phục vụ tiêu
chuẩn hoá dợc liệu và các chế phẩm thuốc thảo mộc, cần có các yếu tố đáng
quan tâm khác, nh điều kiện kinh tế, trang thiết bị, khả năng áp dụng của
mỗi đối tợng dợc liệu...
Trong các chuyên luận dợc liệu và chế phẩm thuốc đông dợc của
dợc điển DĐTQ 2000 gồm có các kỹ thụât sắc ký đợc áp dụng trong các
phép thử định tính và định lợng nh SLKM, SKLCA và SKK. Trong đó kỹ
thuật SKLM đợc áp dụng cho định tính chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các chỉ
tiêu định tính liên quan đến hoá học. Cụ thể, theo thống kê về phép thử định
tính dợc liệu bằng phơng pháp vật lý và hoá học có 228 phép thử định tính
bằng pp SKLM trong tổng số 403 phép thử, chiếm 56%. Trong khi đó, các chỉ
tiêu định tính dợc liệu bằng phơng pháp SKLM ghi trong DĐVNIII chiếm
tỷ lệ còn thấp, cần thiết phải đợc xây dựng và bổ sung.Trớc khi đi vào vấn
đề xây dựng phơng pháp phân tích, cần tìm hiểu rõ khái niệm về đặc điểm
hoá học đặc trng của dợc liệu và các yêu cầu có liên quan .
Khái niệm về đặc điểm hoá học đặc trng của dợc liệu bao hàm đặc
trng của hợp chất thiên nhiên nói chung, không chỉ giới hạn là các thành
phần hoạt chất . Who đã định nghĩa về chất đặc trng ( characterizing
compound) nh sau : Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận
5

của cây có thể đợc dùng để đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất
lợng chế phẩm của cây thuốc đó, không nhất thiết là hoạt chất [70].
Tổ chức y tế thế giới WHO hớng dẫn đánh giá hiệu lực và an toàn của thuốc
có nguồn gốc từ thảo mộc đã qui định chỉ tiêu đánh giá chất lợng dợc liệu
về mặt hoá học, nh sau: Phải mô tả các phép thử vật lý và hoá học đợc tiến
hành để xác định các thành phần hoá học của cây và mô tả sắc ký đồ của phân
đoạn hoạt chất hoặc chất đặc trng. Nếu không phải xác định một hỗn hợp các
chất đặc trng (dấu vân tay) của cây thuốc [70].
Điều đó có nghĩa là:
* Chỉ tiêu định tính phát hiện thành phần hoá học đặc trng hay một
hỗn hợp các chất đặc trng của dợc liệu bằng phơng pháp sắc ký là một yêu
cầu cần thiết và đợc thực hiện để đánh giá chất lợng dợc liệu đó.
* Các đặc điểm hoá học đặc trng của một dợc liệu đợc thể hiện có
thể là đặc trng của một hoạt chất, một hợp chất, hoặc là đặc trng của một
nhóm hoạt chất hay một hỗn hợp các chất của dợc liệu đó. Một hỗn hợp các
chất đặc trng cho dợc liệu còn gọi là dấu vân tay của dợc liệu đó.
* Các qui định đặc trng hoá học của dợc liệu đợc thực hiện với
yêu cầu ở hai mức khác nhau, đó là : xác định chất đặc trng và xác định hỗn
hợp các chất đặc trng để nhận biết. Trong đó, yêu cầu xác định đặc điểm hoá
học dới dạng vân tay của một hỗn hợp các chất chiết đợc từ dợc liệu, là
yêu cầu tối thiểu phải đợc áp dụng cho định tính dợc liệu, đặc biệt là đối
tợng khi cha xác định đợc thành phần hoạt chất.
Thông thờng, các phép thử định tính dợc liệu bằng phơng pháp sắc
ký, trong các chuyên luận dợc liệu của các dợc điển nh DĐTQ 2000,
DĐVNIII...thể hiện đánh giá định tính dợc liệu theo hai cách: Cách thứ nhất,
dùng chất chuẩn để đối chiếu và phát hiện. Các chất chuẩn này có thể là thành
phần hoạt chất hoặc một chất đại diện đặc trng của dợc liệu. Ví dụ nh
rutin trong Hoa hoè, palmatin trong Hoàng đằng, brucin trong Mã tiền... Cách

thứ hai, dùng một hỗn hợp chất hay nhóm chất đợc chiết ra từ dợc liệu làm
đối chiếu. Trên thực tế các phép thử đánh giá theo cách thứ nhất là ở mức cao
hơn, nhng còn bị hạn chế do trở ngại phải có chất chuẩn để đối chiếu. Một số
chất đặc trng dùng làm đối chiếu đã đợc qui định cụ thể trong một số
chuyên luận dợc liệu của DĐVNIII để đánh giá, nhng trên thực tế còn khó
kiếm. Ví dụ, catalpol trong Địa hoàng, jasminoidin
trong Dành dành,
turberostemonin trong Bách bộ... Chính vì vậy, các đối tợng dợc liệu trên
đã đợc qui định áp dụng cả hai cách : hoặc dùng chất đối chiếu, hoặc dùng
dịch chiết của dợc liệu đó làm đối chiếu (áp dụng trong trờng hợp không có
chất chuẩn). Các trờng hợp qui định tơng tự nh vậy còn phổ biến đối với
các dợc liệu đã biết thành phần hoạt chất, ví dụ nh Bình vôi, Cà độc dợc,
Đại hoàng... Nh vậy, có thể nói, xây dựng phơng pháp xác định đặc điểm
đặc trng của dợc liệu dới dạng xác định đặc trng của một nhóm chất là
cần thiết phục vụ cho tiêu chuẩn hoá, áp dụng phổ biến cho các dợc liệu, kể
cả các đối tợng đã đợc biết thành phần hoạt chất hoặc chất đặc trng.

6


Các trờng hợp định tính dùng dịch chiết dợc liệu thay thế cho một
chất làm đối chiếu nh đã nêu ở trên, thể hiện mối tơng quan giữa chất đặc
trng và nhóm chất đặc trng; các đặc điểm đặc trng của thành phần chất
cũng thể hiện là đặc trng của nhóm chất, bao gồm có chất đặc trng đó. Có
thể nói, đánh giá đặc trng của một nhóm chất đại diện dùng thay thế nh đã
nêu là cơ sở để đánh giá chất đặc trng đó. Điều này có ý nghĩa trong việc tìm
và xác định đặc trng của nhóm chất sẽ căn cứ theo hớng tìm hoạt chất
hoặc chất đặc trng đã đợc biết của dợc liệu.
Mặt khác, khi dùng một nhóm chất chiết từ dợc liệu, làm đối chiếu
thay thế cho một chất, phơng pháp chiết hay còn gọi là xử lý mẫu phải đợc

tiến hành theo hớng chiết đợc tối đa chất đặc trng đã đợc xác định của
dợc liệu đó. Ví dụ tetrahydropalmatin là thành phần hoạt chất chính đã đợc
qui định làm chất đối chiếu trong phép thử định tính Bình vôi; atropin và
scopolamin đợc qui định trong định tính Cà độc dợc. Do vậy việc xử lý mẫu
của các dợc liệu này đã đợc thực hiện theo hớng chiết alcaloid, để dịch
chiết thu đợc có tỉ lệ thành phần hoạt chất nh đã nêu đạt tối đa. Jasminoidin
là một thành phần đặc trng của dợc liệu Dành dành, thuộc nhóm iridoid
glycosid, đã đợc qui định làm chất đối chiếu trong phép thử định tính, do vậy
dịch chiết dợc liệu đã đợc xử lý theo hớng chiết glycosid với dung môi
methanol [4] Nh vậy, phơng pháp chiết hay xử lý mẫu dợc liệu là một
trong các yếu tố có ảnh hởng đến kết quả xác định vân taynhóm chất của
một dợc liệu, cần đợc quan tâm khảo sát.
Đặc điểm hoá học đặc trng của một chất hoặc của một nhóm chất đợc
thể hiện về các mặt nh sau :
Đặc trng về màu sắc : Đợc biểu thị bằng các màu dới ánh sáng thờng
hoặc màu phát quang dới UV366nm, do bản chất tự nhiên của thành phần
chất hoặc do đợc tạo thành sau phản ứng hoá học với các loại thuốc thử đặc
trng ( thể hiện trên sắc ký đồ SKLM ).
Tìm đặc điểm đặc trng này phụ thuộc vào việc khảo sát lựa chọn thuốc thử
thích hợp để phát hiện.
Đặc trng về vị trí của vết hoặc của các pic tạo thành trên sắc ký đồ : Đợc
biểu thị bằng các giá trị Rf ( SKLM) hoặc giá trị thời gian lu TR (SKLCA,
SKK) của vết, các vết hoặc pic, các pic trên sắc ký đồ.
Tìm đặc trng về vị trí của vết hoặc pic ta phải tiến hành khảo sát hệ dung môi
sắc ký ( hay còn gọi là pha động ) thích hợp để tách các thành phần phân tích
rõ rệt trên sắc ký đồ.
Đặc trng về tỷ lệ và mức độ đậm nhạt của các vết hay tỷ lệ mật độ của các
pic trên sắc ký đồ : Đợc biểu hiện bằng các vết có màu sắc với độ đậm nhạt
khác nhau trên sắc ký đồ đối với phơng pháp SKLM hoặc là các pic có chiều
cao hoặc diện tích pic khác nhau, khi thực hiện bằng các phơng pháp

SKLCA, SKK Tỷ lệ mức độ đậm nhạt của các vết hoăc pic cần xác định
trên sắc ký đồ, có thể là căn cứ giúp ta đánh giá chất lợng dợc liệu không
chỉ về mặt định tính mà cả về mặt xác định bán định lợng của dợc liệu đó.

7


Tỷ lệ này còn phụ thuộc vào phơng pháp chiết và xử lý mẫu, do vậy cũng cần
đợc quan tâm .
Bởi vậy, các yếu tố có liên quan và ảnh hởng đáng kể đến kết quả xác
định các đặc điểm đặc trng của dợc liệu bằng phơng pháp sắc ký gồm có :
Phơng pháp xử lý mẫu, hệ dung môi sắc ký (pha động) và phơng pháp phát
hiện. Các yếu tố này cần đợc quan tâm và khảo sát khi tiến hành xây dựng
phơng pháp xác định đặc điểm đặc trng hoá học dới dạng vân tay của
dợc liệu. Bên cạnh đó còn có yếu tố ảnh hởng khác cũng cần đợc quan tâm
nh : pha tĩnh đợc áp dụng của các kỹ thuật sắc ký ( SKLM, SKLCA, SKK) ;
dung lợng mẫu áp dụng sắc ký, nhiệt độ...

2.2. Các phơng pháp xác định các đặc điểm hoá học đặc trng của
dợc liệu.
Nh đã trình bày ở phần trên, tiến hành xác định đặc điểm hoá học đặc
trng của một dợc liệu, đặc biệt là đối tợng dợc liệu cha xác định đợc
hoạt chất, đồng nghĩa với việc xác định đặc điểm đặc trng dạng vân tay
nhóm chất của dợc liệu đó. Vì thế, việc tìm hiểu khái niệm về các nhóm chất,
sự phân loại và đặc diểm của nhóm chất là cần thiết cho việc khảo sát phơng
pháp xác định các đặc điểm đặc trng của nhóm chất đó.
2.2.1. Nhóm chất của cây thuốc.
Các thành phần hoá học của cây thuốc hay của dợc liệu nhìn chung
đều đợc phân loại thành các nhóm chất, việc phân tích và xác định các thành
phần đó đều dựa trên cơ sở xác định nhóm chất của nó. Sự phân loại thành

nhóm chất theo nhiều cách khác nhau, ví dụ theo nguồn gốc sinh tổng hợp,
theo tính chất hoà tan và theo sự có mặt của nhóm chức quyết định tính chất
của nhóm chất. Chẳng hạn, các chất thuộc nhóm phenolic có tính chất a nớc
và có nguồn gốc từ acid shikimic (aromamatic precursor shikimic acid), gồm
có: phenol- phenolic acid, phenylpropanoid, flavonoid,anthocyanin, xanthonstilben và các chất màu quinol. Các terpenoid có tính chất thân dầu, sinh tổng
hợp từ isopentenyl pyrophosphat, gồm có tinh dầu, diterpenoid, triterpenoid ,
steroid và carotenoid. Các hợp chất chứa nitơ có tính kiềm, đợc phát hiện
bằng phản ứng với thuốc thử ninhydrin hoặc đragendorff [38]
Theo Bài giảng dợc liệu [6] [8], đã phân loại các hợp chất trong cây
thành các các nhóm chính nh : tinh dầu, alcaloid , anthranoid, coumarin,
flavonoid, tanin, saponin, glycoside tim, các mono và diterpen glycosid ,
glycosid cyanogenic, đờng , các acid hữu cơ...Trong số đó có một số nhóm
chất còn đợc xếp vào nhóm glycosid do công thức của các chất thuộc nhóm
này phần lớn ở dạng gắn đờng nh anthranoid, coumarin, flavonoid, tanin,
saponin, glycoside tim, các mono và diterpen glycosid , glycosid cyanogenic.
Theo H. Wagner và S. Bladt [30] đã phân loại các thành phần hoạt chất
của cây thuốc thành các nhóm chất để phát hiện chúng bằng phơng pháp
SKLM. gồm có các nhóm chính nh sau : alcaloid , anthraglycosid, arbutin,

8


glycosid tim, các chất đắng (bitter principles), lignan, flavonoid, acid
phenolcarbocylic, saponin, tinh dầu, coumarin , valepotriat ...
Theo J.B. Harborne [38] đã phân loại các hợp chất chất tự nhiên của
thực vật nói chung đợc tổng quát theo sơ đồ 2.1
Tuy nhiên, việc phân thành các nhóm chất dù theo cách nào cũng chỉ
mang tính chất tơng đối, do tính chất hoá học đa dạng của hợp chất thiên
nhiên, một chất thuộc nhóm chất này có khi cũng đợc xếp vào nhóm khác.
Ví dụ welderolacton có trong Cỏ nhọ nồi và Sài đât có thể xếp vào nhóm

isoflavonoid, hoặc cũng có thể đợc xếp vào nhóm coumarin [8], solasodin
đợc xếp vào nhóm alcaloid cũng có khi thấy đợc xếp vào nhóm saponin
steroid. Thành phần cucurbitacin thuộc nhóm triterpen có phổ biến trong hạt
của các cây thuộc họ Cucurbitaceae, đợc xếp vào nhóm chất đắng, cũng có
khi đợc xếp vào nhóm saponin... [8] [30]
Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ đề cập đến một số nhóm
chất chính có liên quan và có thể áp dụng đợc trong phân tích định tính bằng
kỹ thuật thông dụng nh SKLM, gồm các nhóm chất nh sau : alcaloid,
terpenoid ( tinh dầu, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid), terpenoid
glycosid ( iridoid glycosid, saponin), anthranoid, flavonoid, coumarin, acid
phenolcarboxylic, lignan, đờng và acid amin . Phần trình bày các nhóm chất
dới đây mang tính chất giới thiệu, góp phần tìm hiểu thêm về khái niệm của
từng nhóm chất và các thành phần của nhóm chất. Sự phân loại của các phân
nhóm , về tính đa dạng và phức tạp của các thành phần chất và nhóm chất, là
cơ sở tạo nên các đặc điểm đặc trng riêng của các thành phần chất trong tự
nhiên. Các tính chất có liên quan đến phơng pháp chiết, tách và phát hiện
nhóm chất sẽ đợc trình bày ở các phần tiếp sau.

9


Sơ đồ 2.1:

Sơ đồ tổng quát
phân loại các thành phần nhóm chất trong cây.
- Phenol và Phenolic acid

- Phenyl propanoid
Hợp chất
Phenolic

Hợp

chất

thiên
Terpenoid
nhiên
Acid hữu cơ,
chất béo và
hợp chất liên
quan

Hợp chất nitơ

Đờng
và dẫn xuất

- Coumarin
- Acid hydroxycinnamic
(Acid phenolcarboxylic )
- Phenylpropen
- Lignan

- Flavonoid có màu
- Anthocyanin
- Flavon và Flavonol
- Xanthon và Stilben
- Flavanoid khác chiếm tỉ lệ nhỏ.: chalcon,
auron, flavanon,dihydrochalcon,isoflavon.

- Chất màu quinon : benzoquinon ,
aphtaquinon, anthraquinon ( anthranoid)
- Tinh dầu ( mono và sesquiterpen )
- Diterpenoid
Triterpen
- Triterpenoid và
Steroid
Steroid
Saponin
Glycosid tim
- Carrotenoid
- Các acid có trong cây
- Acid béo và lipid
- Alkan và các hydrocacbon liên quan
- Polyacetylen
- Hợp chất sulphua
- Alcaloid
- Amin
- Amino acid
- Cyanogenic glycosid
- Indol
- Purine, pyrimidin, cytokinin
- Chlorophyll
- Mono saccharid
- Oligo saccharid
- Đờng alcohol và cyclitol

10

2.2.1.1. Hợp chất phenolic [8][30][38]
a. Coumarin.
Coumarin là những dẫn chất benzo- pyron có cấu trúc C6 C3. Cho
đến nay đã có trên 200 chất đợc biết và đã đợc phát hiện có trong 27 họ. Có
thể phân loại coumarin thành các nhóm chính nh sau :
- Coumarin đơn giản hay còn gọi là coumarin không ngng tụ ( non
condensed coumarins) : thờng có các nhóm OH hoặc OCH3 đợc thế ở vị trí
C-6, C-7, có khi đợc thế ở C-5, C-8. Chất điển hình : Umberlliferon
(Angelicae radix) , scopoletin ( Scopoliae radix).
- Furamo coumarin:
Các chất thuộc nhóm này có thêm một vòng furan đợc gắn ở vị trí C-6
và C-7 (psoralen) hoặc ở C-7 và C- 8 (angelicin). Chất điển hình : Imperatorin,
begapten, angelicin ( Angelicae, Imperatoriae radix)
- Pyrano coumarin:
Có thêm vòng pyran ở vị trí C-6 , C-7 ( xanthyletin ) : ví dụ xanthyletin,
xanthoxyletin . Hoặc có vòng pyran ở vị trí C- 7 và C-8 , ví dụ visnadin,
samadin ( Ammi majoris fructus)
b. Lignan.
Lignan đợc tạo thành bởi sự oxy hoá của một cặp gồm 2 đơn vị phydroxyphenylpropene, thờng đuợc nối bởi 1 cầu oxy, thờng có ở trong
quả, tâm gỗ và rễ của cây. Có trên 50 cấu trúc này đã đợc phát hiện. Chất đại
diện: Pinoresinol, syrylganesinol.
Các dẫn xuất của pinoresinol và syringaresinol là thành phần hoạt chất
đựơc phát hiện có trong vỏ thân Đỗ trọng Cortex Eucommiae. Tangsenoid I và
syringin là các lignan có trong rễ Đảng sâm (Radix Codonopsis pilosulae)
Eleutheroside E, Eleutheroside B (Syringin) là thành phần chính có trong rễ
của cây Eleutherococcus senticosus MAXIM (Araliaceae).
c. Flavonoid.
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thờng gặp ở thực vật. Phần lớn
các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân benzo pyron (chromon) benzo dihydro - pyron , benzo dihydropyran (chroman)
và benzo pyrylium. Hiện nay có khoảng trên 4000 chất đã đợc xác định cấu

trúc.trong đó flavon và flavonol với nhóm thế là OH và /hoặc OCH3 chiếm tỉ lệ
lớn. Hầu hết các flavonoid là các chất phenolic.
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các
mức độ oxy hoá của mạch 3 carbon gồm có : Euflavonoid là các gốc flavonoid
có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3 và neoflavonoid
có gốc ở vị trí C-4.
Ngoài ra còn phân biệt các biflavonoid là những flavonoid dimmer,
triflavonoid đợc cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những
flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan.

11


- Euflavonoid gồm có các nhóm anthocyanidin, flavan, flavan3.ol, flavan 4.ol,
flavan 3,4 diol, flavanon, 3 hydroxy flavanon, flavon ,flavonol, dihydro
chalcon, chalcon, auron.
* Anthocyanidin: Là sắc tố rất phổ biến trong thực vật, tạo các màu đỏ
hoặc xanh trong môi trờng acid hoặc kiềm trong cây, hầu hết các sắc tố này
đều ở dạng glycosid (anthocyanin) nằm trong dịch tế bào.
* Flavan 3-ol: Catechin và các đồng phân của nó entcatechin,
epicatechin, ent epicatechin, cũng nh gallocatechin và các đồng phân gặp
tơng đối phổ biến trong thực vật, ví dụ nh trong lá Trà. Tanin ngng tụ
(proanthocyanidin) là dẫn xuất flavon 3-ol ở dạng dimer, trimer, tetramer,
pentamer. Ví dụ theasinensin A, B, C, D, F, G có trong một loại trà Camellia
sinensis.
* Flavon: Apigenin và luteolin là 2 flavon hay gặp nhất trong cây. Các
dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, những flavon có nhóm thế OH
hoặc OCH3 thì hiện nay đã biết trên 300 chất. Những flavon ở dạng glycosid
có trên 460 chất, ngoài ra còn biết hơn 45 chất flavon ở dạng sulfat.
* Flavonol: Là một nhóm lớn, trong cây các flavonol tồn tại dới dạng

glycosid là chủ yếu, đã biết trên 900 chất flavonol glycosid, các aglycon phổ
biến đợc biết là kaemferol, quercetin, myricetin Một số flavonol glycosid
có mạch đờng đợc acyl hoá, cũng có một số chất dới dạng sulfat.
* Chalcon: Là những chất có màu vàng, trong môi trờng kiềm dễ
chuyển thành màu cam hay màu đỏ, dễ nhận biết, thờng có trong họ cúc.
Chất đại diện: butein.
- Isoflavonoid : Gồm nhiều nhóm khác nhau nh isoflavan, isoflavan3-ene, isoflavan- 4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan,
coumestanTrong đó isoflavon chiếm tỷ lệ lớn nhất trong số các nhóm của
isoflavonoid với trên 360 chất đã đợc biết. Isoflavonoid thờng gặp trong họ
đậu Favaceae. Chất điển hình : Daizein, purearin ... có trong sắn dây Pueraria
thomsoni (Favaceae).
- Neoflavonoid : Chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật ví dụ
brazilin có trong thân cây Tô mộc Caesalpinia sapan L.(Caesalpiniaceae)
d. Các acid phenol (acid phenolic và acid phenolcarboxylic) [8] [30] [38]
- Acid phenolic : Là các dẫn chất của acid benzoic. Các thành phần này
thờng gặp trong cây. Một số chất đại diện : Acid salicylic, acid gallic, acid
protocatechic. Các acid gallic và acid protocatechic thờng có ở dạng tự do và
dạng ester.
- Acid phenolcarboxylic : Là dẫn chất của acid cinnamic hay acid
hydroxycinnamic. Chất đại diện : acid ferulic, acid caffeic, acid pcoumaric Acid caffeic có trong Cà phê, Actisô và nhiều cây khác , còn gặp
dới dạng ester với acid quinic nh acid chlorogenic và isomer của nó nh
acid isochlorogenic. Các acid chlorogenic là các thành phần phổ biến hay gặp
trong cây, ngoài ra còn gặp dới dạng dẫn xuất với đờng nh
caffeoylglucose, orobauchin.Acid ferulic có ở dạng tự do và dạng ester

12


trong gôm của các cây họ hoa tán, acid ferulic cũng đợc phát hiện có trong
Xuyên khung.

e. Anthranoid.
Anthranoid nằm trong nhóm lớn thuộc chất màu quinon là những sắc tố
đợc tìm thấy chủ yếu trong ngành nấm, địa y, thực vật bậc cao. Căn cứ vào số
vòng thơm dính thêm vào nhân quinon mà ngời ta sắp xếp thành
benzoquinon , naphtaquinon, anthraquinon
Anthranoid ( anthraquinon ) đợc chia thành 2 nhóm lớn: nhóm phẩm
nhuộm và nhóm nhuận tẩy.Trong phạm vi phân tích cây thuốc nhóm nhuận
tẩy đợc quan tâm nhiều , những chất thuộc nhóm này thờng có 2 nhóm OH
dính ở vị trí 1,8 và ở vị trí 3 thờng là nhóm CH3, CH2OH, CHO hoặc COOH.
Ngời ta hay gặp các dẫn chất có cùng một cấu trúc, chỉ khác nhau ở mức độ
oxy hóa C-3 trong cùng một loài. Ví dụ trong Đại hoàng, Chút chít, Thảo
quyết minh thì có mặt cả 3 chất: Chrysophanol, aloe emodin và rhein. Những
dẫn chất anthranoid khi ở trong thực vật có thể tồn tại dới dạng ôxy hoá
(anthraquinon) hoặc dạng khử (anthron, anthranol)
Trong cây anthranoid tồn tại dới dạng aglycon và dạng gắn đờng.
Dạng gắn đờng chủ yếu là O-glycosid, liên kết glycosid thờng gặp ở vị trí
C-1, C-8, hoặc C-6-OH, dạng C-glycosid chỉ xuất hiện ở nhóm anthron với
liên kết C-C thờng ở C-10 (barbaloin), hoặc vừa C- glycosid vừa O
glycosid nh aloinosid, cả 2 chất này đều có trong Lô hội.
Dẫn chất anthranoid trong cây đôi khi còn gặp dới dạng dimmer nh
hipericin: có trong cây Hipericum Perforatum. Ararobinol có trong cốt khí
muồng, senosid A, B, C có trong Phan tả diệp, cassiamin (dianthraquinon )
thờng gặp trong chi Cassia.
2.2.1.2. Terpenoid [6] [8] [30] [38]
Terpenoid là những chất có cấu tạo từ các isopren C5 H8.và chúng đợc
phân loại dựa theo số isopren có trong công thức gồm có các thành phần nh
sau : Monoterpen 2 đơn vị (C10) , sesquiterpen 3 đơn vị (C15), diterpen 4 đơn
vị(C20),triterpen 6 đơn vị (C30), carotenoid 8 đơn vị (C40)
Các terpenoid còn đợc xếp thành nhóm theo tính chất bay hơi nh tinh dầu
là những mono và sesquiterpen bay hơi (C10 C15), đến nhóm diterpen bay

hơi kém (C20), cuối cùng là các nhóm không bay hơi.
a.Monoterpen và sesquiterpen ( tinh dầu ):
Một số chất đại diện : Các dẫn xuất của monoterpen nh limonen có trong
tinh dầu vỏ chanh Citrus limonia Osbeck, citronelal, geraniol có trong tinh
dầu Sả Citronelle java. Menthol có trong tinh dầu Bạc hà Mentha arvensisL,
M. piperita L. Cineol trong tinh dầu của cây Tràm Melaleuca leucadendron L.
Camphor có trong tinh dầu cây Long não Cinnamomum camphora (L), Nees
et Eberm. (Lauraceae). Các dẫn chất của sesquiterpen nh: .Zingilberen,
areurcumemen, .farnesen có trong tinh dầu Gừng: Zingiber officinale Rose
(Zingiberaceae). Artemisinin có trong Thanh hao Artemiasia annua L
(Asteraceae).
13


Các thành phần bay hơi có trong tinh dầu, ngoài các thành phần dẫn
chất mono và sesquiterpen có thể có các thành phần bay hơi khác là các dẫn
chất nhân thơm chiếm tỷ lệ cao ví dụ nh aldehyd cinnamic của tinh dầu Quế
cinnamomum cassia Nees et BI. (Lauraceae). Eugenol có trong tinh dầu của
Hơng nhu: Ocimum sametum L hoặc Ocimum gratissium L (Lamiaceae).
b. Mono và diterpenoid glycosid.
Trong cây,thành phần monoterpenoid glycosid đợc gặp nhiều nhất là
nhóm iridoid, cho đến nay đã đợc biết đến trên 600 chất. Khung cơ bản gồm
một vòng xyclopantan nối với một vòng hydropyran. Các iridoid thờng gặp
trong các họ Scrophulariaceae nh Sinh địa, Huyền sâm, Rubiaceae nh
Dành dành, lá lông mơ, Plantaginaceae nh Mã đề, và một số họ khác .
- Iridoid gồm các nhóm :
* Iridoid có aglycon đủ 10 carbon : Gardosid, scanzhisid trong Dành
dành, loganin trong lá Kim ngân...
* Iridoid không đủ 10 carbon : Catalpol trong Sinh địa, aucubin trong lá
Mã đề .

* Các iridoid trên 10 carbon :Fulvoplumierin, plumierid trong vỏ cây
đại
* Secoiridoid : Gentiopicrim trong Long đởm.
- Diterpenoid glycosid : gặp giới hạn trong một số loài ví dụ : Darutosid
trong Hy thiêm, neo-andrographolid trong Xuyên tâm liên, steviosid có trong
Cỏ ngọt...
c. triterpenoid và steroid:
Triterpenoid chia thành 4 nhóm chính: Triterpen (true triterpen ) ,
steroid, saponin và glycosid tim. Các triterpen thờng có vị đắng nên còn
đợc xếp vào nhóm chất đắng ví dụ, các limonoid, quassinoid là .các triterpen
có phổ biến trong họ Rutaceae, Meliaceae, Simaroubaceae. Các triterpen tự
nhiên có thể tồn tại dới dạng tự do hoặc glycosid, ví dụ chandravadana,
momordicosid k, l, F1 , F 2, G và I là các glycosid triterpenoid có trong quả
Mớp đắng Momordica charantia L.
Sterol trớc đây chủ yếu đợc quan tâm nh là những chất hocmon của
động vật (nh hocmon nội tiết,) Trong những năm gần đây, số lợng nhóm
chất này đợc phát hiện trong cây tăng lên nhiều. Chất điển hình sitosterol (
sitosterol) stigmasterol và campesterol. Những sterol này có thể xuất hiện dới
dạng tự do hoặc glycosid.
d. Saponin:
Saponin đợc phát hiện có trong trên 70 họ. Phần lớn các saponin có
trong cây thuốc dới dạng triterpen glycosid và một số dạng steroid saponin.
Phần gắn đờng có thể đợc nối qua nhóm OH ở vị trí C3-OH
(monodesmosidic saponin) một số ít trờng hợp phần đờng gắn qua 2 nhóm
OH hoặc qua một nhóm OH và một nhóm carboxyl của aglycon
(bisdesmosidic saponin).

14

Saponin triterpenoid đợc chia thành 2 phân nhóm gồm : Saponin
triterpenoid pentacyclic ( có cấu trúc 5 vòng ) và saponin triterpenoid
tetracyclic (4 vòng). Trong nhóm có cấu trúc 5 vòng lại đợc chia thành các
nhóm nhỏ gồm có : olean, ursan, lupan và hopan, trong đó nhóm olean chiếm
phần lớn trong số các saponin triterpenoid trong tự nhiên. Phần aglycon của
nhóm olean thờng là dẫn chất của 3- hydroxy olean 12-ene còn gọi là
amyrin, ví dụ : acid oleanolic, hederagenin, gypsogenin. Các saponin nhóm
ursan ,ví dụ nh asiaticosid có trong Rau má và Ngũ gia bì chân chim và
betulinic thuộc nhóm lupan cũng có trong Rau má. Nhóm saponin
triterpenoid có cấu trúc 4 vòng đợc chia thành 3 nhóm gồm có: damaran,
lanostan, cucubitan. Đại diện nhóm damaran là các saponin của Nhân sâm, ví
dụ, ginsengnosid Rx(x = a,b,c,d,e, f,g,h ). Phần lớn các saponin thuộc nhóm
cucurbitan gặp trong họ Cucurbitaceae nh dihydro cucubitacin và
cucubitacin glucosid có trong rễ cây Bryonia alba L. (Cucubitaceae). Hầu hết
các saponin triterpenoid có hoạt tính phá huyết, mức độ mạnh hay yếu tuỳ
thuộc vào cấu trúc và nhóm chức thay thế.
Saponin steroid đợc chia thành các nhóm:
Nhóm spirostan: Các sapogenin sarsasapogenin , smilagenin, tigogenin,
diosgenin, hecogenin
Nhóm furostan :Sarsaparillosid, avenacosidA ( bidesmosid)
Nhóm aminofurostan : Jurubin có trong Solanum paniculatum
Nhóm spirosolan : Solasonin có trong cây Cà úc Solanum laciniatum
Nhóm solanidan : Solanin có trong mầm khoai tây
Các chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan ,solanidan đều có
chứa Nitơ, mang tính alcaloid, dới dạng glycosid còn đợc gọi là
glycoalcaloid.
2.2.1.3. Alcaloid [6]
Alcaloid là hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số nhân dị vòng, có phản
ứng kiềm, thờng gặp trong thực vật,đôi khi có trong động vật, thờng có lực
tính rất mạnh và cho phản ứng hoá học với tính chất chung của alcaloid.

Hiện nay đã biết khoảng 6000 alcaloid từ hơn 5000 loài, hầu hết ở thực
vật bậc cao, tập trung ở một số họ nh trúc đào(Apocynaceae) 800 chất, thuốc
phiện (Paraveraceae) gồm 400 chất, họ đậu (Fabaceae) gần 500 alcaloid, họ
cam( Rutaceae) 300 alcaloid, họ hành (Liliaceae) 250 alcaloid, họ cà
(Solanaceae) 200 chất và các họ khác nh thuỷ tiên (Amaryllidaceae), họ mã
tiền (Logamiaceae), họ cúc (Asteraceae), họ thầu dầu (Euphobiaceae).Có
những họ có tới trên 50% số loài có chứa alcaloid nh : Ramunculaceae,
Berberidaceae, Papaveraceae...
Rất ít trờng hợp trong cây chỉ có một alcaloid duy nhất mà thờng là
hỗn hợp nhiều alcaloid, trong đó thành phần alcaloid chính có hàm lợng cao
và các alcaloid phụ có hàm lợng thấp hơn. Trong cây, alcaloid ít khi ở dạng
tự do mà tồn tại ở dạng muối của các acid hữu cơ nh citrat, tactrat, malat,
oxalat, acetat... đôi khi ở dạng muối của acid vô cơ tan trong dịch tế bào. ở
15


một số ít trờng hợp kết hợp với đờng tạo ra dạng glycoalcaloid nh Solanin,
solamacgin, trong cây cà lá xẻ (Solanum lacianatum).
Alcaloid thờng đợc phân loại tuỳ theo cấu trúc của nhân, gồm 3
nhóm chính: alcaloid không có nhân dị vòng, alcaloid có nhân dị vòng và
alcaloid có nhân khác ( nhân sterol và terpen). Alcaloid không có nhân dị
vòng nh ephedrin có trong Ma hoàng, leonurin có trong ích mẫu. Các
alcaloid có các nhân khác nh : solanin , solamacgin là các alcaloid có cấu
trúc steroid có trong Cà lá xẻ Solanum lacianatum Ait. (Solanaceae). Aconitin
là 1 loại alcaloid có cấu trúc diterpen có trong ô đầu . Ngoài ra, còn có cấu
trúc khác nh tuberostemonin có trong Bách bộ.
Các alcaloid có nhân dị vòng đợc phân loại tiếp thành các nhóm có
kiểu khung dị vòng khác nhau:
- Dẫn xuất nhân pyrrol hoặc pirrolidin
- Dẫn xuất nhân pyridin hoặc piperidin nh nicotin trong thuốc lá,

arecolin trong hạt cau (semen Arecae)
- Dẫn xuất tropan: Scopolamin trong Cà độc dợc.
- Dẫn xuất của nhân quinolin: quinine, quinidin trong vỏ Canhkina.
- Dẫn xuất isoquinolin
- Dẫn xuất của quinolizidin: spactein trong Sarothamnus scoparius.
- Dẫn xuất nhân indol
- Dẫn xuất nhân imidazol: pilocapin trong Pilocarpus jaboprandi
- Dẫn xuất nhân purin: cafein, theophylin, theobromin
- Dẫn xuất của quinazolin:
- Dẫn xuất của nhân acridin: rutacridon, arborinin trong Ruta
graveolens
- Dẫn xuất của nhân pyrrolizin
Trong số các nhóm dẫn xuất này có 2 nhóm isoquinolin và indol, đợc sử
dụng nhiều trong điều trị nên đợc phân loại tiếp thành nhiều phân nhóm
Dẫn xuất isoquinolin
gồm 9 phân nhóm : Cấu trúc
tetrahydroisoquinolin, benzylisoquinolin, ptalidisoquinolin, protoberberin,
protopin, aporphin, morphinan, benzphenanthridin, emetin.Ví dụ : Papaverin
(thuộc benzylisoquinolin),noscapin (thuộc ptalidisoquinolin), morphin,
coddein và thebain (morphinan) là các thành phần có trong nhựa thuốc phiện .
Berberin (protoberberin ) có trong Hoàng liên. Emetin , cephelin (thuộc
emetin) có trong Ipeca.
Dẫn xuất indol gồm 6 phân nhóm: Cấu trúc indolalkylamin,
physostigmin, carbolin, ergolin, strychnin và các alcaloid nhân indol có cấu
trúc phức tạp ở các cây thuộc chi Catharanthus, ví dụ : các alcaloid có cấu
trúc ergolin, có trong cựa loã mạch., cấu trúc strychnin có trong chi Strychnos
2.2.1.4. Acid amin
Các acid amin có phổ biến trong hệ thực vật và động vật nói chung là
thành phần cấu tạo protein, ngoài ra trong hệ thực vật còn có các thành phần
acid amin không thuộc nhóm cấu tạo protein non-protein acid ví dụ :

16


azetidine2- carboxylic acid là thành phần đặc trng có trong một số cây thuộc
họ Liliaceae. Một số thành phần acid amin có tác dụng trị sán nh curcubitin (
amino-3-carboxy-3-pyrolidin) có trong hạt bí ngô, acid kainic có trong tảo
Diginea simplex Agardh, acid quisqualic có trong hạt cây Sử quân tử [8]
Saussureamin A, B,C,D,E là các thành phần aminoacid- sesquiterpen có tác
dụng sinh học đã đợc phát hiện trong rễ Mộc hơng [77].
2.2.1.5. Đờng
Đờng trong cây đợc phân loại thành 3 nhóm căn cứ theo kích thớc của
phân tử gồm có: monosaccharid (ví dụ glucose, fructose), oligosaccharid và
polysaccharid. Oligosaccharid đợc tạo thành bỏi sự ngng tụ của 2 hay vài
đơn vị monosaccharid, ví dụ nh sucrose.Polysaccharid gồm có nhiều và tạo
thành một chuỗi dài đơn vị monosaccharid, thành phần này chỉ đợc tách và
phát hiện dới dạng sản phẩm thuỷ phân bằng kỹ thuật sắc ký thông thờng
nh SKLM, sắc ký giấy... [38]

2.2.2. Các phơng pháp định tính phát hiện
Trong phạm vi của đề tài, chúng tôi xin giới thiệu một số phơng pháp
và kỹ thuật có liên quan đến xác định các đặc điểm hoá học đặc trng dạng
vân tay nhóm chất của dợc liệu, gồm có các phơng pháp sắc ký nh
SKLM, SKLCA, SKK. Phơng pháp định tính bằng phản ứng hoá học đợc
giới thiệu để tham khảo.
2.2.2.1. Phơng pháp định tính bằng phản ứng hoá học
Là phơng pháp định tính dựa vào phản ứng hoá học của một số nhóm
chất với thuốc thử tạo thành các sản phẩm kết tủa hoặc có màu đặc trng, còn
đợc gọi là phơng pháp định tính trong ống nghiệm. Thuốc thử thờng đợc
áp dụng phát hiện một số nhóm chất của dợc liệu, đợc tóm tắt ở bảng 2.1.
Phơng pháp định tính trong ống nghiệm có tính chất sơ bộ , tính chất

đặc trng chỉ giới hạn ở một số nhóm chất (nh đã trình bày ở bảng 2.1). Phản
ứng màu tạo thành để phát hiện nhóm chất đôi khi còn bị hạn chế, khó phát
hiện bởi sự ảnh hởng của các thành phần nhóm chất khác có trong dợc liệu.
Trong phạm vi đề tài, chúng tôi không tiến hành khảo sát xác định đặc điểm
hoá học đặc trng bằng phơng pháp định tính ống nghiệm, phơng pháp
đợc nêu chỉ mang tính chất giới thiệu để so sánh.

17


Bảng 2.1 : Định tính các nhóm chất hoá học của dợc liệu bằng phơng
pháp định tính trong ống nghiệm.
T
T

Nhóm chất

1

Flavonoid

2

Alcaloid

3

Coumarin

4

5

Anthraglycosid

Tanin

6

Glycosid tim

7

Steroid

8 Đờng khử
9 Acid hữu cơ
10 Chất béo

Phản ứng định tính

Phát hiện

Phản ứng cyanidin
Phản ứng với dd FeCl3 5%
Phản ứng với kiềm

Sản phẩm có màu hồng
Sản phẩm màu xanh tím
Sản phẩm có màu vàng

đậm hoặc vàng cam
Có tủa
Có màu nâu vàng
Có tủa và màu
Có tủa trong trong môi
trờng acid và tan / kiềm
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng

Phản ứng với TT Mayer
Phản ứng với TT Dragendorff
Phản ứng với TT Bouchardat
Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Phản ứng Diazo
Phản ứng Bortraeger
Phản ứng với dd gelatin 1%
phản ứng với dd phèn sắt amoni
Phản ứng Styasny :
loại tanin pyrogalic
loại tanin catechic
phản ứng legal
phản úng Baljet
Phản ứng xanthydrol
Phản ứng Salkospki
Phản ứng Liberman
Phản ứng với TT Fehling
Phản ứng với dd Na2CO3
Hơ trên giấy lọc

Có tủa

Có tủa và màu
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng
Có màu đặc trng
Tủa có màu
Có bọt khí

2.2.2.2. Phơng pháp sắc ký lớp mỏng.
Là phơng pháp tách các chất trên hai pha trong đó pha động là chất
lỏng gồm các dung môi và pha tĩnh là chất rắn thông thờng là silicagel đợc
tráng trên bản mỏng.
Các yếu tố liên quan đến phơng pháp : Khi tiến hành phân tích bằng
kỹ thuật sắc ký trên bản mỏng cũng nh các kỹ thuật sắc ký cột, có 3 yếu tố
chính liên quan đến phơng pháp đó là pha tĩnh, pha động và cách phát hiện.
Kết quả phân tích phụ thuộc nhiều vào các yếu tố trên. Thêm vào đó, còn có
các yếu tố ảnh hởng khác, nh phơng pháp chuẩn bị mẫu hay còn gọi xử lý
mẫu và lợng chấm mẫu, cần đợc lựa chọn cho phù hợp với từng đối tợng

18


phân tích. Các yếu tố này sẽ đợc trình bày kỹ hơn ở phần phơng pháp
nghiên cứu.
Pha tĩnh:
Hiện nay, có nhiều loại pha tĩnh đã đợc sử dụng để tách các nhóm chất
bởi kỹ thuật này. Một số pha tĩnh thông dụng đã đợc áp dụng định tính các

dợc liệu, có ghi trong các dợc điển nh : Silicagel G F254 Merck, silicagel
H, polyamid, cellulose
Bên cạnh đó, một số loại pha tĩnh khác đã đợc sản xuất với công nghệ
cao, góp phần nâng cao hiệu quả phân tích, nh bản mỏng hiệu năng cao
HPTLC, Lichrospher Si 60 F254. Một số pha tĩnh dới dạng bản mỏng pha
đảo HPTLC plates RP-2, RP-8, RP-18... mở rộng khả năng tách tốt đa số các
thành phần từ rất kém phân cực nh dầu béo và các chất thơm, đến rất phân
cực nh các thành phần có tính acid và bazơ, các cặp ion. Bản mỏng HPTLC
plates NH2 đã đợc dùng để tách và phát hiện một số chất đờng,
catecholamin, steroid hormon và các acid của hoa quả, đạt hiệu quả cao.
Trên thực tế, sự lựa chọn pha tĩnh còn phụ thuộc vào mục đích phân tích
và hiệu quả kinh tế. Pha tĩnh đợc áp dụng phổ biến hiện nay là Silicagel G
F254 Merck bản tráng sẵn, có thể áp dụng phân tích đối với hầu hết các thành
phần nhóm chất. Pha tĩnh loại này đã đợc chọn áp dụng cho phân tích dợc
liệu của đề tài.
Pha động:
Là các hệ dung môi tách các thành phần chất cần phân tích, việc khảo
sát lựa chọn hệ dung môi phù hợp đối với từng đối tợng phân tích là cần thiết
để đảm bảo tách và phát hiện rõ các thành phần phân tích trên sắc ký đồ. Việc
lựa chọn hệ dung môi thực hiện theo qui tắc tam giác (triangular diagram)
của Egon Stahl [26], tức là giữa 3 yếu tố gồm có hệ dung môi của pha động,
thành phần cần tách và mức độ hoạt hoá của pha tĩnh có mối quan hệ tơng
ứng với nhau. Để tách các thành phần kém phân cực, dùng pha động là dung
môi hoặc hệ dung môi kém phân cực là thích hợp, bên cạnh đó pha tĩnh nh
Silicagel G yêu cầu đợc hoạt hoá ở mức độ cao, bằng cách sấy ở nhiệt độ
1050 C trong 1 giờ trớc khi sử dụng. Ví dụ, để tách các thành phần kém phân
cực của tinh dầu , các dung môi và hệ dung môi kém phân cực đã đợc dùng
nh chloroform hoặc toluene : ethylacetat ( 93 : 7 ), ( 95 : 5) và pha tĩnh cần
đợc hoạt hoá. Ngợc lại để tách các thành phần phân cực nh các glycosid,
cần các hệ dung môi có thành phần phân cực và pha tĩnh không đòi hỏi mức

độ hoạt hoá cao ,ví dụ nh các hệ dung môi đã đợc áp dụng tách glycosid đã
nêu ở phụ lục 3 . Theo nguyên tắc lựa chọn hệ dung môi thích hợp nh đă nêu
, cho thấy, nhiều pha động với thành phần dung môi và tỉ lệ khác nhau có thể
đợc áp dụng để tách các chất cần phân tích. Thành phần hệ dung môi có khi
có thêm một tỷ lệ nhất định các dung môi có tính acid hoặc kiềm, với mục
đích làm tăng hiệu quả tách các chất cần phân tích. Chẳng hạn, các hệ dung
môi đợc áp dụng tách các alcaloid thờng có thêm thành phần kiềm nh
amoniac hoặc diphenylamin và các hệ dung môi tách các flavonoid thờng có
thêm acid, nh acid acetic, acid formic...( xem phụ lục 3). Tuy nhiên, có
19


trờng hợp ngoại lệ, chẳng hạn, có thể tách berberin (alcaloid) với hệ dung
môi có thành phần acid, hay tách acid glycyrrhetic ( saponin) trong rễ Cam
thảo (Liquiritiae radix) với hệ dung môi kiềm ( xem phụ lục 3 )
Trên thực tế, đã có nhiều hệ dung môi đã đợc áp dụng trong phân tích
các thành phần chất và nhóm chất của dợc liệu và các chế phẩm. Một số hệ
dung môi đợc giới thiệu để tham khảo, đã đợc áp dụng tách một số thành
phần chất và nhóm chất trong dợc liệu cũng nh chế phẩm, với pha tĩnh chủ
yếu là SilicagelG, nh đã đợc ghi ở phụ lục 3.
Phơng pháp phát hiện:
Khác với các kỹ thuật sắc ký cột, một trong số u thế nổi bật của kỹ
thuật SKLM là khả năng phát hiện phong phú các thành phần, nhóm chất của
dợc liệu . Bên cạnh khả năng phát hiện dựa vào đặc điểm tự nhiên, vốn có
màu hoặc phát quang của thành phần phân tích, sự phát hiện dựa vào các phản
ứng hoá học của các thành phần chất và nhóm chất với các loại thuốc thử
khác nhau, tạo ra các sản phẩm dẫn xuất có màu hoặc có phát quang màu đặc
trng, đã góp phần đáng kể trong việc tìm và phát hiện các thành phần đặc
trng cho dợc liệu và các chế phẩm bởi kỹ thuật này. Bên cạnh đó, thuốc thử
đợc áp dụng để phát hiện các thành phần chất rất phong phú. Hiện nay đã có

trên 250 thuốc thử các loại [26] [30] [40], trong đó gồm có thuốc thử phát
hiện nhóm chất, ví dụ : thuốc thử Dragendorff dùng để phát hiện alcaloid nói
chung ; 4-nitroanilin diazo hoá phát hiện các hợp chất phenolic ; thuốc thử
Ninhydrin phát hiện các acid amin và các amin bậc 1; thuốc thử - naphthol/
acid sulfuric phát hiện đờngThuốc thử phát hiện nhóm chức nh : thuốc
thử dinitrophenylhydrazin phát hiện nhóm chức aldehyd và keton; thuốc thử
Fast blue salt phát hiện nhóm chất phenol Thuốc thử phát hiện theo cấu tạo
của công thức nh : thuốc thử EP (4- dimethyl aminobenzaldehyd/ acid
acetic/ acid phosphoric ) phát hiện terpenoid có cấu trúc khung kiểu azulen
thờng cho màu xanh đặc trng; thuốc thử Van Urk để phát hiện các dẫn xuất
của vòng indol ( các secale alcaloid ); thuốc thử Libermann- Burchard phát
hiện các triterpen và steroid... Hơn nữa, các phản ứng tạo màu cũng thể hiện
khác nhau giữa các chất thuộc cùng một nhóm chất, khi phun cùng một loại
thuốc thử , góp phần tạo nên các đặc điểm đặc trng cho từng thành phần chất
trên sắc ký đồ. Chẳng hạn nh, các thành phần của tinh dầu cho các màu sắc
khác nhau từ màu xanh- xanh tím- tím tím đỏ với thuốc thử vanilin / acid
sulfuric, các thành phần thuộc nhóm flavonoid cho các vết có phát quang khác
nhau từ màu lục vàng vàng cam với thuốc thử NP/ PEG hoặc acid boric/
acid oxalic trên sắc ký đồ Một số thuốc thử phổ biến đã đợc áp dụng phát
hiện các thành phần chất và nhóm chất đợc ghi ở phụ lục 4.
2.2.2.3. Phơng pháp sắc ký lỏng cao áp ( SKLCA).
Là phơng pháp sắc ký phân bố (pha đảo là chủ yếu), trong đó pha
động là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi có độ phân cực thích hợp,
còn pha tĩnh chứa trong cột là chất lỏng phủ trên một chất mang dạng rắn hay
một chất mang rắn đã đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với một nhóm hữu
cơ .
20


Pha tĩnh:

Gồm các tiểu phân silica gel mà trên bề mặt của nó đợc bién đổi bằng
liên kết hoá học, mà trong số đó liên kết kiểu octadecylsilan là phổ biến, đợc
dùng nhiều nhất, ngoài ra, kiểu octylsylan cũng đợc sử dụng. Các nhóm liên
kết này làm thay đổi tính chất tách cuả cột còn gọi là cột pha đảo. Các loại cột
pha đảo đợc sử dụng phổ biến hiện nay nh Lichrospher RP18... [4] [57]. Pha
tĩnh trên thực tế thờng cố định, chỉ thay đổi cột pha tĩnh trong trờng hợp cần
thiết và có yêu cầu riêng biệt.
Pha động :
Là các hệ dung môi có độ phân cực thích hợp với đối tợng cần phân
tích, việc lựa chọn pha động thích hợp cho mỗi đối tợng cần phân tích là yếú
tố cần thiết phải đợc tiến hành khảo sát. Để góp phần làm tăng hiệu quả tách
đối với từng đối tợng phân tích cụ thể, đôi khi thành phần pha động có bổ
sung thêm các dung dịch đệm, tạo môi trờng PH thích hợp hoặc/ và tỷ lệ
thành phần pha động đợc khảo sát, thay đổi theo chơng trình gradient thích
hợp ...
Phát hiện :
Detector UV là phổ biến để phát hiện các chất có khả năng hấp thụ tử
ngoại và khả kiến nh các thành phần thuộc nhóm hợp chất phenolic,
flavonoid, anthranoid, lignan, coumarin, alcaloid...
Các yếu tố có liên quan khác:
Khác với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng có pha tĩnh chỉ dùng một lần, không
đòi hỏi việc xử lý mẫu khắt khe, loại sắc ký cột rửa giải này, việc xử lý mẫu
thích hợp trớc khi đa vào cột là một yêu cầu cần thiết phải đợc quan tâm
khảo sát để vừa đảm bảo phân tích đạt hiệu quả, đồng thời bảo vệ cột. Bên
cạnh đó, các yếu tố khác cũng có ảnh hởng đến kết quả phân tích cần đợc
quan tâm khảo sát cho phù hợp nh : lợng mẫu áp dụng cho sắc ký, tốc độ
dòng, kích thớc cột...
Ưu điểm của kỹ thuật SKLCA là có khả năng tách tốt các thành phần
của nhóm chất với độ phân giải cao. Hiện nay kỹ thuật này đã đợc áp dụng
nhiều trong phân tích dợc liệu và chế phẩm, đặc biệt là các đối tợng có

thành phần hoạt chất đã biết và cần đợc xác định. Ví dụ , các phép thử định
lợng đợc áp bằng kỹ thuật SKLCA ghi trong các chuyên luận dợc liệu
DĐTQ 2005 gồm có 171 trong tổng số 281 các phép thử định lợng, chiếm
60,8% và chiếm 89% ( 171/ 192 ) trong số các phép thử định lợng bằng các
phơng pháp sắc ký [59].
Định tính dới dạng xác định vân tay nhóm chất của một dợc liệu
đợc áp dụng bởi kỹ thuật có khả năng tách tốt này, thông thờng căn cứ vào
xác định thành phần hoạt chất hoặc chất đặc trng của nhóm chất và cần thiết
phải có chất chuẩn để đối chiếu và xác định. Kết quả xác định vân tay bằng kỹ
thuật SKLCA có thể là cơ sở để so sánh đánh giá chất lợng dợc liệu không
chỉ về mặt định tính mà còn về mặt định lợng, thông qua kết quả đo pic của
thành phần chất cần xác định. Bên cạnh đó, trong một số trờng hợp, dựa vào
tỷ lệ diện tích hay chiều cao pic các thành phần đặc trng của dợc liệu, giúp
21


ta có thể phân biệt đợc các loài trong cùng chi. Ví dụ, căn cứ vào sự khác
nhau đặc trng của hai thành phần hoạt chất của Khơng hoạt là notopterol và
nodakenin, nhờ đó có thể phân biệt đợc giữa hai loài Notopterigium Incisum
và N. Forbessi, trong đó, notopterol chiếm tỷ lệ cao ở loài thứ nhất, ngợc lại
nodakenin chiếm tỷ lệ cao ở loài thứ hai [28].
Với đối tợng dợc liệu cha xác định thành phần hoạt chất, việc xác
định dạng vân tay của một nhóm chất bởi kỹ thuật SKLCA, phục vụ cho
tiêu chuẩn hoá dợc liệu, còn bị hạn chế. Trên thực tế, phép thử định tính dợc
liệu bằng kỹ thuật SKLCA cha có ghi trong DĐTQ 2000 và mới bổ sung 5
phép thử trong DĐTQ 2005 [59].
Xác định vân tay nhóm chất của dợc liệu trong trờng hợp này sẽ
đợc thực hiện theo hớng tìm thành phần hoạt chất đã đợc biết có trong
dợc liệu đó. Theo cách này, đề tài đã thử nghiệm kỹ thuật SKLCA áp dụng
xác định vân tay nhóm chất alcaloid bay hơi của dợc liệu Xuyên khung và

xác định thành phần lignan của Đỗ trọng, phối hợp với kỹ thuật SKLM để
nhận biết các nhóm chất cần xác định nh đã nêu , so sánh và đánh giá chất
lợng dợc liệu thông qua kết quả của tổng các pic đo đợc.
2.2.2.4. Phơng pháp sắc ký khí và sắc ký khí khối phổ (SKK, SKK-KP).
Sắc ký khí là phơng pháp tách trong đó pha động là chất khí ( khí
mang ) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn, hoặc chất lỏng phủ trên một
chất mang tính trơ dạng rắn, hoặc một film lỏng phủ đều trên thành. phơng
pháp sắc ký khí dựa trên cơ chế hấp phụ và phân bố.
Pha tĩnh :
Loại cột mao quản đợc áp dụng phổ biến
Pha động:
Khí mang phổ biến đợc áp dụng là khí nitơ, dòng khí mang qua cột với
một tốc độ và áp lực hằng định.
Phát hiện :
Detector ion hoá ngọn lửa (FID) đợc áp dụng phổ biến, phát hiện hầu
hết các thành phần chất hữu cơ.
Các yếu tố liên quan khác :
Nhiệt độ cột đợc khảo sát ở một giá trị không đổi hoặc đợc thay đổi
theo một chơng trình qui định, phù hợp với đối tợng phân tích, sao cho các
thành phần đợc tách tốt trên sắc ký đồ. Bên cạnh đó, các yếu tố ảnh hởng
khác cũng cần đợc quan tâm nh nhiệt độ buồng tiêm, nhiệt độ cổng
detector, xử lý mẫu, lợng tiêm mẫu...
Phơng pháp sắc ký khí đợc áp dụng hiệu quả trong phân tích các
thành phần chất bay hơi đợc của dợc liệu và chế phẩm, nh tinh dầu.
Cũng giống nh SKLCA, phơng pháp SKK có khả năng tách tốt các
thành phần với độ nhạy cao, do vậy, phơng pháp phân tích sẽ không đạt hiệu
quả nếu không có chất chuẩn để đối chiếu và xác định.

22

Ngày nay, kỹ thuật sắc ký khí gắn với detector khối phổ (skk - Kp), đã
góp phần mở rộng khả năng phát hiện thành phần chất tách đợc trên sắc ký
đồ, thông qua đối chiếu với phổ khối chuẩn của các chất có trong ngân hàng
khối phổ.Với khả năng này skk - Kp sẽ có hy vọng tìm và phát hiện các
thành phần đặc trng thuộc nhóm chất bay hơi đợc của dợc liệu.
Đề tài đã thử nghiệm áp dụng kỹ thuật skk - Kp trong định tính thành
phần bay hơi đợc, có trong dợc liệu ô dợc.
2.2.3. Phân tích sàng lọc hoá học dợc liệu bằng phơng pháp sắc ký lớp
mỏng.
Đối với một đối tợng phân tích là dợc liệu đã đợc biết thành phần
hoạt chất hoặc chất cụ thể đặc trng, việc định tính phát hiện dợc liệu trong
trờng hợp này sẽ chủ yếu căn cứ vào các thành phần chất đã đợc biết của
dợc liệu và thông thờng có chất chuẩn hoặc chất đối chiếu để xác nhận.
Hơn nữa trong trờng hợp nh vậy, việc phân tích các dợc liệu không chỉ
dừng ở mức đánh giá định tính mà có thể xác định định lợng, một khi có chất
chuẩn làm đối chiếu.
Đối với đối tợng phân tích là dợc liệu cha biết rõ hoặc cha xác định
thành phần hoạt chất và chất đặc trng cụ thể, việc phân tích xác định các
thành phần hóa học đặc trng của dợc liệu dới dạng tìm và xác định đặc
điểm đặc trng của nhóm chất. Tiến hành xác định các đặc điểm đặc trng của
nhóm chất gồm 2 bớc chính nh sau :
Bớc 1 : Tiến hành phân tích sơ bộ xác định các thành phần hoá học
của dợc liệu dới dạng nhóm chất hay còn gọi là phân tích sàng lọc hoá học
của dợc liệu đó. Kết quả phân tích sàng lọc sẽ cho biết thành phần hoá học
của dợc liệu khảo sát thuộc loại nhóm chất gì và có bao nhiêu nhóm chất
đợc phát hiện. Mặt khác, cung cấp các thông tin liên quan làm cơ sở cho việc
khảo sát tiếp theo xác định đặc điểm đặc trng của nhóm chất, nh hệ dung
môi tách nhóm chất, các đặc điểm đã đợc phát hiện, tỷ lệ nhóm chất đợc
phát hiện...

Bớc 2 : Đợc tiến hành khảo sát điều kiện phân tích, áp dụng cho từng
đối tợng nhóm chất, đã đợc phát hiện sơ bộ từ kết quả phân tích sàng lọc
của dợc liệu đó. Khảo sát về các yếu tố, các thông số tạo nên tính đặc trng
của nhóm chất nh : hệ dung môi sắc ký, phơng pháp phát hiện và các yếu tố
có liên quan khác nh: phơng pháp chiết mẫu , pha tĩnh, lợng chấm mẫu.
Các phơng pháp xác định sơ bộ nhóm chất của dợc liệu hay chế phẩm
thuốc nguồn gốc thảo mộc đã đợc biết gồm có: phơng pháp phân tích bằng
phản ứng hoá học trong ống nghiệm và phơng pháp sắc ký lớp mỏng.
Kết quả phân tích hoá học trong ống nghiệm với nội dung nh đã giới thiệu ở
bảng 2.1. cũng cho biết thông tin sơ bộ về các nhóm chất đợc phát hiện,
gồm nhóm chất gì và có bao nhiêu nhóm đợc phát hiện của dợc liệu đó. Tuy
nhiên, không cho ta biết các thông tin về thành phần nhóm chất đợc tách trên
sắc ký đồ.
23


Với mục đích áp dụng kỹ thuật phân tích sàng lọc SKLM vào việc khảo
sát xác định các thành phần hoá học đặc trng của các dợc liệu đã đăng ký
của đề tài, chúng tôi xin giới thiệu phơng pháp phân tích sàng lọc SKLM
dợc liệu và thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc, cha đợc biết thành phần hoạt
chất đã đợc nêu lên bởi các tác giả H. Wagner, S. Bladt [30] để tham khảo.
Phơng pháp đợc trình bày tóm tắt nh sau :
Pha tĩnh : Silicagel G F 254
Hệ dung môi SKLM đợc áp dụng cho phân tích sàng lọc gồm có 5 loại hệ
dung môi nh sau :
- HDM.1 : Ethylacetat : methanol : nớc ( 100 : 13,5 : 10 ) : Để phân tích các
thành phần phân cực ( glycosid ) nh alcaloid, anthraglycosid, arbutin,
glycosid tim, flavonoid, phenolcarboxylic acid, saponin,
- HDM.2 : Toluen : ethylacetat (93 :7): Để phân tích các thành phần kém
phân cực ( aglycon), nh tinh dầu, terpen , coumarin, các chất đắng,

valepotriat, các acid kém phân cực
- HDM.3 : Toluen : ethylacetat : diethylamin ( 70 : 20 : 10) : Phân tích
alcaloid
- HDM.4 : ethylacetat : acid acetic : acid formic : nớc ( 100: 11 : 11 : 26 ) :
Phân tích flavonoid
- HDM.5 : chloroform : acid acetic glacial : methanol : nớc(64: 32: 12: 8 ) :
Phân tích saponin.
Thuốc thử phát hiện :
Thuốc thử phát hiện các nhóm chất đợc áp dụng trong phân tích sàng lọc
gồm có:
- TT1: Thuốc thử kalihydroxid 10% / ethanol
- TT2: Thuốc thử Kedde
- TT3: Thuốc thử Dragendorff
- TT4: Thuốc thử natural product/ polyethylen glycol ( NP/ PEG)
- TT5: Thuốc thử vanilin acid sulfuric hoặc anisaldehyd acid sulfuric
- TT6: Thuốc thử acid hydrochloric- acid acetic
- TT7: Thuốc thử Berlin blue
Phơng pháp đánh giá kết quả phân tích đợc tóm tắt ở bảng 2.2
Mô hình phân tích sàng lọc nêu trên sẽ đợc tham khảo để áp dụng cho
phân tích xác định các đặc điểm hoá học đặc trng của dợc liệu đã đăng ký
trong đề tài này. Tuy nhiên, việc vận dụng một số hệ dung môi tách và thuốc
thử để phát hiện nhóm chất có điều chỉnh cho phù hợp với mục đích tìm vân
tay hoá học của dợc liệu. Cụ thể ,một số nhóm chất là hoạt chất không phổ
biến, đã có thuốc thử riêng biệt và đặc trng để phát hiện nh glycosid tim,
arbutin, valepotriat... sẽ không đề cập đến ở phần phân tích sàng lọc. Thêm
vào đó, một số nhóm chất phổ biến có thể áp dụng xác định đặc điểm đặc
trng cho dợc liệu cần đợc bổ sung nh : acid amin và đờng.

24