Ứng dụng phương pháp sinh học để tổng hợp CHITOSAN từ phế liệu chế biến thủy sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TỔNG HỢP
CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Mã số: Đ2013-02-53

Chủ nhiệm đề tài: TS. Bùi Xuân Đông

Đà Nẵng, 12/2013
1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ TỔNG HỢP
CHITOSAN TỪ PHẾ LIỆU CHẾ BIẾN THỦY SẢN

Mã số: Đ2013-02-53

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài
(ký, họ và tên, đóng dấu)

Đà Nẵng, 12/2013
2

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ và tên)


NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
TT

Họ và tên

Đơn vị công tác và
lĩnh vực chuyên môn
Khoa Hóa - Trƣờng Đại học Bách Khoa, Đại
học Đà Nẵng

1

KS. Trƣơng Văn Thiên

2

KS. Phạm Thị Kim Thảo

Khoa Hóa - Trƣờng Đại học Bách Khoa, Đại

học Đà Nẵng

3

KS. Nguyễn Xuân Hoàng

Khoa Hóa - Trƣờng Đại học Bách Khoa, Đại
học Đà Nẵng

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Tên đơn vị
trong và ngoài nƣớc
Công ty cổ phần XNK Thủy sản Miền
trung: Công ty chế biến và xuất khẩu
thủy sản Thọ Quang

Họ và tên ngƣời đại diện đơn vị
Nguyễn Anh Tuấn

3


MỤC LỤC

MỤC LỤC ................................................................................................................................. 4
DANH MỤC BẢNG BIỂU ....................................................................................................... 6
DANH MỤC HÌNH VẼ............................................................................................................. 7
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................................... 9
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................... 10

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS....................................................................... 12
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................. 14
Chƣơng I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 15
1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin/chitosan ......................................................... 15
1.1.1 Giới thiệu về chitin ................................................................................................. 15
1.1.2 Giới thiệu về chitosan ............................................................................................. 16
1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của chitin/chitosan ....................................... 17
1.1.4 Các phƣơng pháp thu nhận chitin ........................................................................... 19
1.1.5 Thu nhận chitosan ................................................................................................... 25
1.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacsillus subtilis và enzyme protease ...................................... 30
1.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis. ................................................................ 30
1.2.2 Giới thiệu về enzyme protease. ............................................................................... 32
1.2.3 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis của các tác giả trong nƣớc ............. 37
1.3 Các lĩnh vực ứng dụng của chitin/chitosan .................................................................... 37
1.3.1 Trong y học ............................................................................................................. 38
1.3.2 Trong xử lý nƣớc thải và làm trong nƣớc sinh hoạt................................................ 39
1.3.3 Trong nông nghiệp .................................................................................................. 39
1.3.4 Trong mỹ phẩm ....................................................................................................... 40
1.3.5 Trong thực phẩm ..................................................................................................... 40
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 42
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị .................................................................................. 42
2.1.1. Nguyên liệu: ........................................................................................................... 42
2.1.2. Hoá chất và thiết bị: .............................................................................................. 43
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................................. 43
2.2.1 Định lƣợng nƣớc ..................................................................................................... 43
2.2.2 Định lƣợng muối Calci carbonat ............................................................................. 43
2.2.3 Định lƣợng chitin .................................................................................................... 44
2.2.4 Phƣơng pháp xác định độ deacetyl của chitosan .................................................... 44
2.2.5 Một số phƣơng pháp xác định khác: ....................................................................... 44
2.3 Sơ đồ các mô hình thí nghiệm (hình 2.2) ....................................................................... 44

2.4 Xử lý số liệu ................................................................................................................... 46
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 47
3.1 Kết quả nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học của vỏ tôm, nguyên liệu nội tạng cá
và phƣơng pháp bảo quản nguyên liệu nội tạng cá. ............................................................. 47
3.1.1 Thành phần hóa học của một số nguyên liệu chứa chitin, phổ biến ở thành phố Đà
Nẵng ................................................................................................................................. 47
3.1.2 Kết quả xác định thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá ........................ 48
3.1.3 Kết quả nghiên cứu bảo quản nguyên liệu nội tạng cá phục vụ thu hồi chế phẩm
enzyme protease ............................................................................................................... 48
3.2 Chọn phƣơng pháp thu hồi chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá, khảo sát hoạt độ
của chế phẩm enzyme protease thu đƣợc. ............................................................................ 49
4


3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản lên hoạt tính của chế phẩm enzyme
protease tách chiết từ nội tạng cá ......................................................................................... 52
3.4 Các kết quả nghiên cứu sản xuất chitin/chitosan ứng dụng enzyme protease tách chiết
từ nội tạng cá ........................................................................................................................ 54
3.4.1 Kết quả nghiên cứu phƣơng pháp xử lý nguyên liệu vỏ tôm trƣớc khi loại bỏ
protein: ............................................................................................................................. 55
3.4.2 Kết quả nghiên cứu phản ứng thủy phân protein trong nguyên liệu vỏ tôm .......... 56
3.4.3 Kết quả đánh giá chất lƣợng chitin đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp ứng dụng
enzyme protease từ nội tạng cá ........................................................................................ 59
3.4.4 Đánh giá chất lƣợng chitosan sản xuất từ chitin ứng dụng chế phẩm enzyme
protease từ nội tạng cá ..................................................................................................... 60
3.4.5 Kết quả nghiên cứu xử lý các loại phế thải sinh ra trong quá trình xử lý nguyên liệu
thành chitin/chitosan ........................................................................................................ 61
3.5 Kết quả nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B. subtilis để loại bỏ protein trong nguyên liệu
vỏ tôm .................................................................................................................................. 61
3.5.1 Kết quả nghiên cứu nhằm chuẩn bị giống vi khuẩn Bacillus subtilis. .................... 61

3.5.2 Kết quả ứng dụng Bacillus Subtilis để loại bỏ protein trong vỏ tôm ...................... 65
3.6 So sánh chất lƣợng chitosan sản xuất theo các phƣơng pháp hóa học và ứng dụng công
nghệ sinh học ....................................................................................................................... 70
3.7 Đề xuất sơ đồ công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng công nghệ sinh học ......... 71
3.6.1 Dây chuyền công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng chế phẩm
enzyme protease từ nội tạng cá (hình 3.18) ..................................................................... 71
3.6.2 Dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng vi khuẩn B.subtilis (hình
3.19) ................................................................................................................................. 72
KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 75
PHỤ LỤC................................................................................................................................. 78
Phụ lục 1: Phƣơng pháp pha loãng thập phân ...................................................................... 78
Phụ lục 2: Môi trƣờng hoạt hoá giống (pH=6,5) ................................................................. 78
Phụ lục 3: Môi trƣờng kiểm tra hoạt lực enzyme ................................................................ 78
Phụ lục 4: Thành phần thuốc nhuộm Amido-Black............................................................. 78
Phụ lục 5: Môi trƣờng nhân giống cấp 1 ............................................................................. 78
Phụ lục 6: Môi trƣờng nhân giống cấp 2 ............................................................................. 79
Phụ lục 7: Phƣơng pháp chuẩn độ phooc-môn .................................................................... 79
Phụ lục 8: Phƣơng pháp chuẩn độ Kjeldahl ......................................................................... 80
Phụ lục 9: Môi trƣờng kiểm tra hoạt lực enzyme ................................................................ 81
Phụ lục 10: Thu nhận chitin/chitosan bằng phƣơng pháp hóa học (mẫu đối chứng)........... 81
Phụ lục 11: Thu nhận chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá ........................................ 82
Phụ lục 12: Nghiên cứu quá trình thủy phân protein trong vỏ đầu tôm bằng chế phẩm
enzyme protease, thu nhận từ nội tạng cá ............................................................................ 82
Phụ lục 13: Nghiên cứu quá trình thủy phân protein trong vỏ đầu tôm bằng vi sinh vật
Bacillus subtillis ................................................................................................................... 83
Phụ lục 14: Các bƣớc tiến hành nghiên cứu phƣơng pháp tách chiết chitin sử dụng vi khuẩn
B. Subtilis ............................................................................................................................. 83

5

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm ........................................................... 47
Bảng 3.2 - Thành phần hóa học của nguyên liệu nội tạng cá .................................................. 48
Bảng 3.3 - Một số tính chất của chế phẩm protease thu nhận từ nguyên liệu tƣơi và nguyên
liệu đông lạnh ........................................................................................................................... 51
Bảng 3.4 – Một số chỉ tiêu chất lƣợng của chitin sản xuất bằng phƣơng pháp ứng dụng
enzyme protease từ nội tạng cá ................................................................................................ 60
Bảng 3.5 – Một số đặc điểm chất lƣợng chitosan thu nhận từ chitin tách chiết từ vỏ tôm ứng
dụng enzyme protease từ nội tạng cá ....................................................................................... 60
Bảng 3.6 – Một số đặc điểm của phế thải rắn và lỏng ............................................................. 61
Bảng 3.7 - Mật độ khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trƣờng hoạt hoá với các độ pha loãng khác
nhau .......................................................................................................................................... 62
Bảng 3.8 - Đƣờng kính vòng thuỷ phân của các khuẩn lạc ..................................................... 63
Bảng 3.9 - Sự giảm khối lƣợng vỏ tôm qua từng công đoạn ................................................... 70
Bảng 3.10 – Một số chỉ tiêu chất lƣợng của chitin sản xuất bằng phƣơng pháp ứng dụng vi
khuẩn B. subtilis ....................................................................................................................... 70
Bảng 3.11 – So sánh một số đặc điểm chất lƣợng của chitosan sản xuất theo phƣơng pháp hóa
học và ứng dụng công nghệ sinh học ....................................................................................... 71

6


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitin.................................................................................... 16
Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của chitosan ............................................................................. 17
Hình 1.3 – Sơ đồ tổng quát thu nhận chitin bằng phƣơng pháp hóa học ................................. 19
Hình 1.4 - Các phƣơng án thu nhận chitin ............................................................................... 20
từ các nguồn nguyên liệu khác nhau ........................................................................................ 20

Hình 1.5 – Kriel ....................................................................................................................... 21
Hình 1.6 – Phản ứng tóm tắt quá trình điều chế chitosan ........................................................ 26
Hình 1.7 - Máy sấy, tạo hạt loại FL ......................................................................................... 30
Hình 1.8 - Thiết bị nghiền tới kích thƣớc siêu nhỏ Cage-Paktor ® .......................................... 30
Hình 1.9 - Vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhuộm gram ..................................................... 31
Hình 1.10 - Hình ảnh đĩa khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................... 31
Hình 2.1 – Sự khác nhau của một số nguyên liệu tôm, vỏ của chúng dùng để thu nhận
chitin/chitosan .......................................................................................................................... 42
Hình 2.2 – Sơ đồ mô hình các bƣớc thực hiện trong nghiên cứu ............................................ 46
Hình 3.1 - Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên chỉ tiêu chất lƣợng nội tạng cá bảo quản ở
nhiệt độ -18 ÷ -200C ................................................................................................................. 49
Hình 3.2 - Biểu đồ sự phụ thuộc hoạt độ các nhóm enzyme protease ..................................... 50
trong các vùng pH khác nhau................................................................................................... 50
Hình 3.3 - Sơ đồ quy trình tách chiết enzyme protease ........................................................... 51
từ nội tạng cá ............................................................................................................................ 51
Hình 3.4 - Chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá đông lạnh ............................ 52
Hình 3.5 – Sự phụ thuộc của hoạt độ của chế phẩm enzyme protease .................................... 53
vào nhiệt độ môi trƣờng ........................................................................................................... 53
Hình 3.6 - Ảnh hƣởng của thời gian bảo quản lên hoạt độ enzyme protease tách chiết từ nội
tạng cá ...................................................................................................................................... 53
Hình 3.7 - Ảnh hƣởng của thời gian lên độ khử khoáng và hàm lƣợng chất khoáng còn lại
trong vỏ tôm ............................................................................................................................. 56
Hình 3.8 – Sự phụ thuộc độ khử protein trong nguyên liệu vỏ tôm vào thời gian thủy phân . 57
Hình 3.9 – Sự phụ thuộc của độ khử protein vào nồng độ chế phẩm enzyme protease từ nội
tạng cá ...................................................................................................................................... 58
Hình 3.10 - Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên phản ứng enzyme thủy phân protein trong nguyên
liệu............................................................................................................................................ 59
Hình 3.11 - Đĩa khuẩn lạc sau khi nhuộm bởi thuốc nhuộm Amido-Black. ........................... 62
Sau khi nhuộm chúng tôi quan sát thấy chung quanh các khuẩn lạc xuất hiện các vòng thuỷ
phân màu sáng, những vùng môi trƣờng còn lại có màu xanh đậm của thuốc nhuộm nhƣ hình

3.11........................................................................................................................................... 63
Hình 3.12 - Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis soi dƣới kính hiển vi ................................... 64
Hình 3.13 - Vòng thuỷ phân của vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhân giống cấp 1 ........... 64
Hình 3.14 - Vòng thuỷ phân của vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi nhân giống cấp 2 ........... 64
Hình 3.15 – Sự thay đổi hàm lƣợng đạm hòa tan trong môi trƣờng chứa vi khuẩn B. Subtilis
và vỏ tôm ở nhiệt độ 480C ....................................................................................................... 66
Hình 3.16 - Hàm lƣợng đạm hòa tan thu đƣợc khi thủy phân protein trong vỏ tôm với các tỉ lệ
bổ sung giống khác nhau ở 480C ............................................................................................. 67
Hình 3.17 – Sự phụ thuộc của quá trình thủy phân protein trong vỏ tôm vào nhiệt độ ........... 68
Hình 3.18 – Sơ đồ công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng chế phẩm enzyme
protease từ nội tạng cá ............................................................................................................. 72

7


Hình 3.19 – Sơ đồ công nghệ phức hợp sản xuất chitin/chitosan ứng dụng vi khuẩn B. subtilis
.................................................................................................................................................. 73

8


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chitin
Chitosan
KK
KP
KA
EDTA
G20X

Vỏ tôm
VSV
QMAFAM

:
:
:
:
:
:
:
:
:
:

poly (1,4) - 2 acetamido - 2 deoxy -  - D glucose
poly (1,4) -2-amino-2-deoxy-β-D-glucan
Quá trình khử khoáng
Quá trình khử protein
Công đoạn deacetyl
Etilendiamin tetraaxetic axit
Enzyme proteinase protosubtilina
Đầu tôm + vỏ tôm
Vi sinh vật
Quantity of Mesophilic Aerobic and Facultative Anaerobic
Microorganisms

9

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Ứng dụng phƣơng pháp sinh học để tổng hợp chitosan từ phế liệu chế
biến thủy sản
- Mã số: Đ 2013-02-53
- Chủ nhiệm: TS. Bùi Xuân Đông
- Thành viên tham gia: KS. Phạm Thị Kim Thảo, KS. Nguyễn Xuân Hoàng, KS.
Trƣơng Văn Thiên.
- Cơ quan chủ trì: Trƣờng Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng
- Thời gian thực hiện: từ 10/04 – 30/12/2013
2. Mục tiêu:
Ứng dụng phƣơng pháp sinh học để sản xuất chitin/chitosan nhằm hạn chế sử
dụng hóa chất, gây ô nhiễm môi trƣờng
3. Tính mới và sáng tạo:
Sử dụng khả năng xúc tác phản ứng của enzyme protease trong nội tạng cá và
enzyme protease của vi khuẩn B. subtilis để loại bỏ protein ra khỏi chitin trong vỏ tôm
4. Tóm tắt kết quả nghiên cứu:
Trên cơ sở nghiên cứu quá trình khử protein trong vỏ tôm bằng biện pháp ứng
dụng công nghệ sinh học và thực nghiệm sản xuất chitin/chitosan ở quy mô pilot theo
công nghệ mới đƣợc nghiên cứu đã thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:
- Sản phẩm chitin sản xuất ứng dụng chế phẩm enzyme protease tách chiết từ nội
tạng cá có chất lƣợng tốt với hàm lƣợng protein nhỏ hơn 0,5%, và chỉ tiêu vi sinh vật
đạt chuẩn an toàn (SanPin 2.3.2.1078-01 – LB Nga); chitosan sản xuất từ loại chitin
này có độ deacetyl là 79-89% và độ nhớt cao đến 18 dl/g phù hợp với các báo cáo
khoa học trong nƣớc và quốc tế.
- Sản phẩm chitin sản xuất ứng dụng vi khuẩn B. subtilis có chỉ tiêu cảm quan

thấp, và vi sinh vật tổng số tƣơng đối cao ở mức 3,3x105 nhƣng vẫn nằm trong giới
10


hạn an toàn (SanPin 2.3.2.1078-01 – LB Nga); chitosan sản xuất từ loại chitin này có
độ nhớt là 18,1 dl/g – có chất lƣợng bảo đảm so với báo cáo trong nƣớc và quốc tế.
5. Tên sản phẩm:
- 2 sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan
- các sản phẩm chitin, chitosan và chất màu carotenoid
6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:
- Hiệu quả về công tác giảng dậy:
Hƣớng dẫn thành công hai sinh viên làm đồ án tốt nghiệp nghiên cứu năm học
2012-2013 là: Trƣơng Quang Thơm (08SH) và Võ Thị Ngọc Thùy (11SHLT).
- Chuyển giao kết quả nghiên cứu:
Dây chuyền công nghệ sản xuất chitin/chitosan ứng dụng công nghệ sinh học
đƣợc đăng tải trên chợ trực tuyến: Chợ công nghệ và thiết bị Việt nam.


Ngày
tháng
năm
Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ và tên)

Cơ quan Chủ trì
(ký, họ và tên, đóng dấu)

11

DANANG UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
UNIVERSITY OF DANANG

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information:
Project title: Produce chitosan from the wastes of aquatic processes by using biotechnique
Code number: Đ 2013-02-53
Project Leader: Doctor Bui Xuan Dong
Coordinator: Pham Kim Thao, Nguyen Xuan Hoang, Truong Van Thien
Implementing institution: Danang University of Technology – University of
Danang
Duration: from April 10, 2013 to December 30, 2013
2. Objective(s): Produce chitin/ chitosan by bio-technique to eliminate the using of
chemicals to prevent environmental pollution.
3. Creativeness and innovativeness: Applying the catalization of protease in internal
fish organs and protease from Bacillus subtilis to discard protein from chitin in shrimp
shells.
4. Research results:
Base on the using of bio-technique to demineralise the shrimp shells and the
implementation of pilot studies with new technique, we received some given results:
- Chitin product produced by using protease extracted from internal fish organs had
high quality such as protein content was less than 0.5% and the microorganism quota
was obtained the Safety Standard (SanPin 2.3.2.1078-01 – Russia); Chitosan produced
from these chitin products had deacetylation degree from 79% to 89% and the
viscosity was up to 18 dl/g. The product quality can be compared to products reported
from inside and outside of Vietnam.
Chitin product prepared by Bacillus subtillis fermentation had low perceptible
showing and the total microorganism in the sample was quite high, at 3.3x10-5 but still
12

under the Safety Standard (SanPin 2.3.2.1078-01 – Russia). The viscosity of Chitosan
produced from these chitin products was 18.1dl/g. The product quality can be
compared to products reported from inside and outside of Vietnam.
5. Products:
- Two production lines of Chitin and Chitosan;
- Chitin, chitosan and carotenoid pigment products
6. Effects, transfer alternatives of research results and applicability:
- Teaching: Conducting two students to do their final research thesis, including
Truong Quang Thom (08SH) and Vo Thi Ngoc Thuy (11SHLT).
- Hand over the research results: Production lines to produce chitin/ chitsan by
bio-technique were placed in the online market: The Technology and Equipment
Market of Vietnam ().
Date:…………………….
IMPLEMENTING INSTITUTION

13

PROJECT LEADER


MỞ ĐẦU
Trong nguyên liệu vỏ tôm, chitin liên kết rất chặt chẽ với protein, lipid và các chất
khoáng (pha rắn). Việc thu nhận chitin từ nguồn nguyên liệu này xây dựng trên căn
bản là đƣa protein và các chất khoáng về trạng thái lỏng (pha lỏng), và từ đó loại bỏ
chúng ra khỏi chitin. Để sản xuất chitin đạt các tiêu chuẩn chất lƣợng quốc tế cần loại
bỏ hoàn toàn protein và khoáng chất, cũng nhƣ lipid.
Hiện nay phƣơng pháp hóa học đƣợc dùng phổ biến để thu nhận chitin bằng cách
sử dụng các hóa chất đậm đặc, tức là xử lý nguyên liệu trong những điều kiện “khắc

nghiệt” (môi trƣờng axit mạnh, bazơ mạnh, nhiệt độ cao và thời gian kéo dài), thƣờng
dẫn tới làm giảm chất lƣợng chitin thƣơng phẩm. Các hƣ hỏng của sản phẩm chitin
thƣờng gặp khi thu nhận theo phƣơng pháp hóa học là: biến dạng cấu trúc phân tử,
giảm độ nhớt của dung dịch chitin và chitosan. Bên cạnh đó việc bảo quản và sử dụng
các hóa chất có độ đậm đặc cao mà đòi hỏi sự tiếp xúc trực tiếp của công nhân gây
nhiều quan ngại trong vấn đề bảo đảm an toàn và sức khỏe cho ngƣời lao động. Theo
phƣơng pháp hóa học có thể thu nhận đƣợc sản phẩm phân giải protein là hỗn hợp các
axit amin tự do hòa lẫn cùng các chất độc hại, các chất độc hại sinh ra do protein bị
thủy phân sâu dẫn đến phân giải cả các axit amin nên việc sử dụng sản phẩm dịch thủy
phân gặp phải nhiều hạn chế, ví dụ không sử dụng đƣợc trong thực phẩm hay trong
sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Các hƣớng sử dụng chitin và dẫn xuất từ chitin trong thực tế trong những năm gần
đây không ngừng đƣợc mở rộng dẫn tới cần tìm kiếm và thử nghiệm các phƣơng pháp
mới để thu nhận các polymer sinh học này. Một vấn đề có tính thời sự còn tồn tại là
nghiên cứu phƣơng pháp xử lý nguyên liệu vỏ tôm tạo điều kiện thu hồi chitin và toàn
bộ các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học có trong nó, bên cạnh việc hƣớng tới
phát triển bền vững trên cơ sở giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
Mục tiêu của nghiên cứu này là ứng dụng phƣơng pháp sinh học để tổng hợp
chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản nhằm thu đƣợc các sản phẩm chính nhƣ: chitin,
chitosan và các sản phẩm phụ nhƣ chất màu carotenoid và chế phẩm enzyme protease
từ nội tạng cá.

14


Chƣơng I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin/chitosan
Vỏ tôm, ghẹ, cua, mai mực và nhiều loại vỏ giáp xác khác chiếm 15 tới 35% tổng
khối lƣợng khai thác, là nguồn nguyên liệu quý để điều chế các hợp chất polymer tự
nhiên – nhƣ aminopolysaccharide (chitin và chitosan), và những dẫn xuất của chúng là

các oligosaccharite và glucosamine, những sản phẩm ngày nay đã trở nên thiết yếu
trong các lĩnh vực khác nhau. Ví dụ:
+ sử dụng làm các chất phụ gia thực phẩm, hay thành phần của thực phẩm chức
năng
+ sử dụng làm các chế phẩm y dƣợc (để giảm cân, điều hòa áp huyết, giảm
colesteron; các chế phẩm chống ung thƣ và các loại thuốc kháng thể)
+ sử dụng trong mỹ phẩm để bảo vệ da và tóc
+ sử dụng để làm sạch nƣớc trong các đầm hồ tự nhiên và nhân tạo (keo tụ và hấp
phụ các hỗn hợp độc hại, các loài vi khuẩn, các kim loại nặng)
+ dùng trong các chế phẩm nông nghiệp (các chế phẩm chữa bệnh cho động vật,
chế phẩm chống lại bệnh cho thực vật) [21, 27].
1.1.1 Giới thiệu về chitin
Chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cùng với xellulo là những hợp chất hữu
cơ phổ biến nhất trên bề mặt trái đất. Nó là nguồn tài nguyên dồi dào, ƣớc tính vào
khoảng 100 nghìn tỷ tấn/năm. Nhƣng khác với xellulo, chitin còn là nguồn sinh khối
tự nhiên ít đƣợc khai thác.
Chitin lần đầu tiên đƣợc Giáo sƣ khoa học tự nhiên, giám đốc vƣờn thực vật thuộc
Viện hàn lâm khoa học của TP Nensi (Pháp) – Henri Braconnot phát hiện năm 1811
khi nghiên cứu thành phần của nấm và ông đặt tên là “fungin”. Năm 1823 A.Odier
điều chế chitin từ cánh bọ cánh cứng và đặt tên là “chitin” (Tiếng Hy-lạp. citwu- nghĩa
là áo). Còn chitosan lần đầu tiên phát hiện năm 1859 bởi nhà khoa học C. Rouget,
cũng từ thời điểm này giới khoa học bắt đầu nghiên cứu thực nghiệm và sử dụng
những polymer này.

15


Những công trình đầu tiên ở Nga, liên quan tới việc điều chế chitin đƣợc thực
hiện dƣới sự chỉ đạo của Viện sĩ P. Sorugin những năm 1934-1935. Các thử nghiệm
sử dụng chitosan đƣợc F. Cadov thực hiện năm 1941.

Hiện nay nhằm mục đích phát triển các nghiên cứu về chitin/chitosan ở Nga có
Hiệp hội liên bang về chitin (The Russian chitin society: www.chitin.ru), đƣợc thành
lập từ năm 2000.
Chitin là một poly (1,4) - 2 acetamido - 2 deoxy -  - D glucose. Công thức cấu
tạo của chitin đƣợc trình bày trên hình 1.1

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitin
Liên kết  (1,4) glucoside của mỗi mắt xích cấu tạo nằm lệch nhau một góc 1800
tạo nên mạch xoắn. Liên kết này kém bền, dễ bị cắt đứt bởi tác nhân ion H + của axit.
Sự có mặt của nhóm amino trong chitin làm cho chúng có những đặc tính sinh học
chuyên biệt và có thể tham gia các phản ứng đặc trƣng. Chitin là polymer có những
tính chất xác định, bao hàm cả khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật và có hoạt tính
sinh học. Nên chitin còn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhƣ một loại vật liệu chức năng
đặc biệt mới.
Điều khác biệt của chitin so với các polysaccharide khác là phân tử chitin tích
điện dƣơng mạnh, nó giúp cho chitin tạo ra liên kết với các phân tử mang điện tích âm
trên bề mặt.
Trong mỗi nguyên liệu khác nhau thì chitin có sự khác biệt về thành phần cấu tạo
và hàm lƣợng chitin khác nhau [12, 21, 25].
1.1.2 Giới thiệu về chitosan
Chitin có thể chuyển hóa thành nhiều dẫn xuất khác nhau, hay hặp nhất là
16


chitosan. Chitosan là poly (1,4) -2-amino-2-deoxy-β-D-glucan. Nó đƣợc tạo thành khi
N-deacetyl của phân tử chitin, có công thức cấu tạo nhƣ trên hình 1.2.
Chitosan có một số ƣu việt so với chitin, có thể kể đến nhƣ là tính tan trong nƣớc
và trong dung dịch acid. Khối lƣợng phân tử chitosan phụ thuộc vào điều kiện xử lý
chitin hay vỏ tôm, thông thƣờng từ 10 đến 1000 kDal. Đơn vị phần trăm độ deacety
đƣợc xác định bằng mức độ deacetyl (đây là tỉ lệ của khối lƣợng glucosamine so với

số monomer chung trong phân tử polymer – DD = m(m+n) = Namin/Ntổng), thƣờng từ
70-90%.

Hình 1.2 – Công thức cấu tạo của chitosan
1.1.3 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của chitin/chitosan
Do đặc trƣng về cấu tạo nên chitin và chitosan có tính chất đặc trƣng của nhóm
amino (-NH) và nhóm hydroxyl (-OH). Chúng có khả năng liên kết với nhiều kim loại
nặng tạo nên hợp chất gọi là chelate. Chitin có đặc tính hoạt hóa thấp do trong phân tử
chitin chỉ có hai nhóm hydroxyl trên mỗi mắt xích (monomer) có thể tham gia vào
phản ứng hóa học. Chitosan nhờ có nhóm amino tự do nên có năng lƣợng tự do lớn,
tạo điều kiện cho chitosan có thể hòa tan trong các dung dịch của các acid hữu cơ và
một số acid vô cơ.
Ngoài ra, các polymer này còn có thể bị thủy phân do chứa các liên kết glucoside
và liên kết peptide. Có thể dễ dàng tạo ra các nhóm ƣa nƣớc bằng cách biến tính
chitin/chitosan, nên mở ra khả năng mô hình hóa tính chất của chúng.
Chitin có 3 trạng thái tinh thể là: α, β và γ – chitin. Phổ biến nhất và bền vững
nhất là α-chitin, trong phân tử có các liên kết đối song song, chính nhờ các liên kết
hydro. Phân tử β và γ – chitin kém bền vững hơn và ít gặp hơn.
Chitosan cũng có thể tồn tại ở dạng tinh thể, sự tạo ra polymer chitosan phụ thuộc
vào trạng thái vật lí của nó.
17


Chitin/chitosan bền vững dƣới tác dụng của kiềm, nhƣng có thể bị thủy phân dƣới
tác dụng của các acid. Khi bị thủy phân hoàn toàn bởi dung dịch acid HCl hoặc acid
sunfuric ở nhiệt độ cao chitin và chitosan bị thủy phân đến monosaccharide-Dglucosamine. Ở điều kiện mềm hơn có thể tạo thành hỗn hợp các oligosaccharide.
Dung dịch HCl thƣờng đƣợc dùng để thủy phân từng phần, sản phẩm tạo ra trực tiếp
là glucosamine từ các đoạn oligosaccharide với khả năng polymer hóa 2-4. Xử lý bằng
siêu âm có thể làm phân hủy chitin và chitosan.
Sự thủy phân liên kết glucoside của phân tử chitin/chitosan dƣới tác dụng của các

yếu tố khác nhau (oxy hóa, xử lý nhiệt) làm đứt mạch polymer của chúng, làm giảm
khối lƣợng phân tử, tăng khả năng hòa tan, tính chất này thƣờng đƣợc ứng dụng để
điều chế dung dịch, và sau đó dùng vào các mục đíc khác nhau.
Sự thủy phân liên kết amid (peptit) của chitin tạo ra chitosan. Về nguyên tắc
không có danh giới rõ ràng giữa chitin và chitosan. Ở trạng thái tự nhiên chitin luôn có
một số nhóm amino tự do (5-15%). Thông thƣờng chitosan đƣợc cho là sản phẩm, có
thể hòa tan trong các dung dịch acid hữa cơ loãng (nhƣ acid acetic), tƣơng ứng với độ
deacetyl không dƣới 55-60%.Sự thủy phân của các liên kết peptide trong dung dịch
acid và bazơ hoặc dƣới tác dụng của các enzyme (chitosanase). Một phƣơng pháp
deacetyl với hiệu xuất cao thƣờng thủy phân bằng bazơ mạnh. Quá trình deacetyl làm
biến đổi cấu trúc polymer, dẫn đến làm giảm khối lƣợng phân tử polymer.
Trong tự nhiên chitin/chitosan bị phân giải bởi nhiều sinh vật khác nhau, chúng có
khả năng sinh enzyme chitinase và chitosanase.
Phần lớn enzyme chitinase trong vi sinh vật thủy phân liên kết N-acetyl-β-(1,4)glucosamin theo cơ chế khác nhau. Chitinase trong thực vật bậc bao không có chitin
nhƣ thành phần cấu tạo. Enzyme chitosanase thủy phân chitosan bằng cơ chế cắt endo.
Nhƣ vậy chitosan có thể bị phân giải dƣới tác động của nhiều chế phẩm enzyme khác
nhau nhƣ glycanase, lipase và protease từ những nguồn khác nhau. Enzyme cellulose
T. viride phân giải chitosan đến chitooligosacharide. Enzyme papain xúc tác thủy
phân chitosan và làm giảm độ nhớt của chitosan.
Xử lý chitin bằng các enzyme thủy phân mở ra khả năng sản xuất N-acetyl-Dglucosamin bằng các enzyme chitinase. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhóm N-acetyl lên
quá trình thủy phân với lysim chứng minh rằng, độ deacetyl tối ƣu bằng 0,7, khi đó có
18


thể thu đƣợc các đoạn oligosaccharide đến tetramer.
Oligosaccharide có độ dài polymer từ 2-8 ứng dụng nhƣ phụ gia thực phẩm, thành
phần chế phẩm y dƣợc đƣợc điều chế bằng cách phân giải chitosan bằng enzyme
chitosanase từ vi khuẩn Bacillus № 7-M bền ở pH từ 5-11.
Chitosan hòa tan cũng đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp enzyme nhƣ sau: xử lý
chitosan với độ deacetyl 60-90% bằng enzyme chitosanase trong môi trƣờng acid ở

nhiệt độ 30-60 0C. Sản phẩm thu nhận đƣợc, tách ra bằng phƣơng pháp siêu âm, có
khả năng hòa tan trong nƣớc [21,25].
1.1.4 Các phương pháp thu nhận chitin
Chitin là polymer không tan nên không thể thu nhận trực tiếp từ vỏ tôm, cua. Để
thu nhận chitin cần thực hiện tuần tự việc tách protein và các chất khoáng, cấu trúc
nên lớp vỏ cứng chứa chitin, nghĩa là chuyển protein và khoáng chất về trạng thái hòa
tan, và loại bỏ chúng. Từ những phƣơng pháp thu nhận chitin đã biết chúng ta có thể
phân chia chúng thành hai nhóm phƣơng pháp cơ bản: nhóm 1 - phƣơng pháp hóa
học, xử lý bằng acid, kiềm…; nhóm 2 - các phƣơng pháp công nghệ sinh học, ứng
dụng các chế phẩm enzyme và các vi sinh vật phân giải protein.

Hình 1.3 – Sơ đồ tổng quát thu nhận chitin bằng phƣơng pháp hóa học
a) Xử lý hóa học:
19


Phần lớn các phƣơng pháp thu nhận của nhóm này xây dựng trên một hoặc hai
bƣớc làm sạch chitin khỏi protein và các hợp chất khoáng - gọi là khử protein và khử
khoáng. Một số phƣơng pháp khác có thêm bƣớc khử lipid và các chất khác [13].
Thu nhận chitin từ những nguồn nguyên liệu khác nhau có sơ đồ tổng quát nhƣ
hình 1.3
Phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu và chất lƣợng chitin cần thu nhận, cũng nhƣ để
thu nhận chitosan từ chitin mà số lƣợng các bƣớc khử protein và khử khoáng khác
nhau, trật tự có thể thay đổi theo sơ đồ nhƣ hình 1.4

Hình 1.4 - Các phƣơng án thu nhận chitin
từ các nguồn nguyên liệu khác nhau
Các phƣơng án này thể hiện việc thu nhận chitin từ các nguồn nguyên liệu khác
nhau, phụ thuộc vào yêu cầu về chất lƣợng sản phẩm chitin. Ví dụ để xử lý vỏ tôm, bọ
cánh cứng (lớp vỏ mỏng) chỉ cần công đoạn xử lý kiềm (xử lý 1 lần). Xử lý kép (2 lần

xử lý kiềm và acid) để khử hoàn toàn protein khỏi chitin. Các khoáng chất còn lại xử
lý bằng acid không vƣợt quá 1-3%. Việc lặp lại bƣớc khử khoáng có thể thu nhận
chitin không chứa tạp chất, bƣớc này cần thực hiện với các nguyên liệu có lớp vỏ dày
(nhƣ vỏ cua,…) [17].
Việc áp dụng tuần tự các bƣớc KK và KP có một số lợi ích về chất lƣợng chitin.
Việc áp dụng tuần tự này ảnh hƣởng lên chất lƣợng chitin thu nhận đƣợc và từ chitin
thu nhận chitosan. Ví dụ, khi xử lý nguyên liệu chứa chitin theo sơ đồ KK-KP độ nhớt
của của chitosan thu đƣợc cao hơn rất nhiều so với sơ đồ công nghệ KP-KK.
Hiệu suất các quá trình KK và KP phụ thuộc vào độ nghiền nhỏ của vỏ tôm, vỏ
cua, nghĩa là tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với các chất hóa học, nhƣng khi
20


nghiền nhỏ nguyên liệu cũng làm hiệu suất sản phẩm giảm do thất thoát trong quá
trình xử lý [18].
Các thông số của công đoạn KP và KK của các nghuyên liệu khác nhau cũng khác
nhau. Theo phƣơng pháp Hackman [12] vỏ crab đƣợc xử lý bằng dung dịch HCl 2N
trong 5h ở nhiệt độ phòng, sau đó hỗn hợp đƣợc nghiền nhỏ và khử protein bằng dung
dịch acid NaOH ở 1000C trong 12h. Để khử hoàn toàn protein cần thực hiện các công
đoạn trong 4 lần. Phƣơng pháp Whisler và BeMiller [12] thực hiện khử protein của
nguyên liệu nghiền nhỏ trong dung dịch NaOH 10% trong thời gian 72 h, khử màu
bằng etanol 95%, sau đó rửa bằng dung môi hữu cơ, khử protein bằng dung dịch HCl
37% trong 4h. Khử khoáng theo phƣơng pháp Horowits, Rosoman và Blumental [12]
đƣợc thực hiện trƣớc khi khử protein, nguyên liệu xử lý bằng dung dịch acid fomic
90% trong 18h ở nhiệt độ phòng, sau đó khử protein bằng dung dịch NaOH 10% trong
2,5h đun nóng. Các nhà khoa học đều không nghiên cứu ảnh hƣởng của trật tự các
bƣớc khử khoáng, khử protein lên chất lƣợng chitin/chitosan. Nhƣng sau này, ngƣời ta
đã phát hiện trật tự KK, KP ảnh hƣởng đến chất lƣợng chitosan thu nhận đƣợc.
Từ các phƣơng pháp trên, có một điều rõ ràng là các công đoạn đều thực hiện ở
điều kiện khắc nghiệt, nguyên liệu chứa chitin đƣợc xử lý trong dung dịch acid và

dung dịch kiềm một thời gian dài và ở nhiệt độ cao để khử protein. Điều này dẫn đến
biến dạng cấu trúc, và một phần đã khử deacetyl (KA) của chitin.

Hình 1.5 – Kriel
Tại LB Nga từ những năm 1970-1980 (ở Vladivostoc, Murmansk, VNIRO) đã
ứng dụng công nghệ sản xuất chitin và chitosan từ vỏ nhuyễn thể (kriel) và vỏ tôm
21


(hình 1.5). Chitin đƣợc thu nhận nhờ khử protein bằng dung dịch NaOH 1N trong 30
phút ở nhiệt độ 70-800C, sau đó khử khoáng bằng dung dịch HCl 1N trong 30 phút ở
nhiệt độ phòng.
Để tăng hiệu suất quá trình khử protein bằng dung dịch kiềm nhẹ, các nhà khoa
học đã ứng dụng các chất có hoạt tính bề mặt. Phƣơng pháp thu nhận chitin từ vỏ
nhuyễn thể (kril), đƣợc đề xuất bởi A.I. Gamzazade cùng cộng sự [22]: vỏ nhuyễn thể
(krel) đƣợc khử protein trong dung dịch NaOH 2-5% ở nhiệt độ phòng trong 6-8h.
Trong công đoạn khử protein dùng phối hợp các chất hoạt động bề mặt anion (sodium
dodecyl sulfate, muối natri acid aurino), làm giảm nồng độ NaOH, bên cạnh đó làm
tăng hiệu suất khử màu và lipid.
Phƣơng pháp sản xuất chitin từ vỏ nhuyễn thể (kriel) ứng dụng ở Ba lan [23] xây
dựng trên cơ sở xử lý sử dụng nguyên liệu đông lạnh. Nguyên liệu đƣợc giá đông,
nghiền nhỏ, sau đó rửa sạch và khử khoáng bằng dung dịch acid HCl 3,5% trong 1,5h
ở nhiệt độ phòng. Sau đó tiến hành loại bỏ lipid và và chất màu bằng hỗn hợp giấm và
etanol (acetate ester). Khử protein bằng dung dịch NaOH 3,5% ở nhiệt độ 250C trong
2h. Sự phát triển công nghệ sản xuất chitin ở các quốc gia chỉ khác nhau ở việc chọn
hóa chất phục vụ quá trình KK và KP [14].
Ở Ấn độ trong công nghiệp sản xuất chitin từ phế liệu chế biến tôm Matapenaeus
dobsoni. Khử protein đƣợc tiến hành trong dung dịch NaOH 0,5% đun nóng trong 30
phút. Phần dung dịch đƣợc tách khỏi chitin và tận dụng để sản xuất protein. Bƣớc khử
protein đƣợc thực hiện lần thứ hai bằng dung dịch NaOH 3%. Nguyên liệu tiếp tục

đƣợc khử màu bằng dung dịch hypochloride chứa 0,3-0,5% clo lỏng, sau đó rửa bằng
nƣớc và tiến hành khử khoáng bằng dung dịch HCl 1,25N ở nhiệt độ phòng trong 3h.
Chitin sản xuất ra đƣợc dùng đế sản xuất chitosan.
Ở Mỹ ngƣời ta sử dụng công nghệ sản xuất chitin của các nhà khoa học Peniston
K.P. và Jonson E.L. [25]. Nguyên liệu chứa chitin đƣợc nghiền nhỏ ở dạng ẩm ƣớt tới
kích thƣớc 1,3-1,8 mm và tiến hành KP ở nhiệt độ 65-710C trong thời gian 1-2h trong
dung dịch NaOH 0,05-0,2N theo cơ chế chảy ngƣợc.Trong dung dịch NaOH trƣớc khi
dùng để khử protein cho thêm 0,1% Na2SO4, để kích họat quá trình thủy phân. Sau đó
tách ra phần dung dịch chứa protein để sản xuất protein, phần rắn chuyển qua công
đoạn khử khoáng bằng HCl.
22


Tất cả các phƣơng pháp thống kê trên đây chỉ khác nhau ở trình tự thực hiện hai
công đoạn KK và KP, và các thông số của công đoạn trên căn bản phƣơng pháp hóa
học.
Khử khoáng (KK) là công đoạn quan trọng trong sản xuất chitin. Độ khử khoáng
xác định bằng độ nhớt và các thông số vật lý, hóa học khác, độ khử khoáng của chitin
cũng giống nhƣ của chitosan, tức là mang cùng một ý nghĩa. Để khử khoáng (khử
CaCO3 và Ca3(PO4)2) từ nguyên liệu chứa chitin ngƣời ta thƣờng dùng acid HCl, acid
formic, HNO3 và acid sunfuric. Hạn chế ở đây là khi xử lý chitin bằng acid có thể dẫn
tới phá hủy một phần cấu trúc và độ deacetyl của chitin, giảm độ nhớt của dung dịch
chitosan.
Có các phƣơng pháp khác thu nhận chitin, không giống nhƣ các phƣơng pháp tiêu
chuẩn nhƣ trên. Đó là phƣơng pháp của Foster và Hackaman [12] thực hiện ở điều
kiện “mềm”, không dẫn tới làm hỏng cấu trúc và độ deacetyl của chitin. Tất cả công
nghệ chỉ bao gồm 1 bƣớc xử lý nguyên liệu chứa chitin trong dung dịch etilendiamin
tetraaxetic axit (EDTA). Vỏ cua đƣợc xử lý một thời gian dài – 2-3 tuần trong dung
dịch EDTA khi pH = 9. Một số loại nguyên liệu mỏng nhƣ vỏ tôm, nhuyễn thể (kriel)
sau khi nghiền nhỏ chỉ mất 15 phút xử lý. Sau khi xử lý chitin chứa 1% tro và 5%

protein.
Peniston K.P. và Jonson E.L. [26] còn đề cử phƣơng pháp: nghiền nhỏ nguyên
liệu chứa chitin đến kích thƣớc 3-6 mm. Sau đó hỗn hợp cho vào thiết bị phản ứng
cùng với NaOH 0,5-2% trong thời gian 1-4h ở nhiệt độ 50-700C để khử protein. Sau
đó tiến hành theo mô hình KK và KP bằng dung dịch NaOH 30-50% ở nhiệt độ 1201500C. Khi đó xảy ra đồng thời quá trình deacetyl của chitin chuyển hóa CaCO3 về
dạng Ca(OH)2 theo phƣơng trình:

Ở nƣớc thải sau công đoạn này chứa các thành phần nhƣ hydroxit natri, acetat
natri va cacbonat natri. Dung dịch NaOH có thể tái sử dụng. Hiện tƣợng này hay gặp
là hiện tƣợng ăn mòn da.
Điểm tồn tại chung của tất cả các phƣơng pháp trên là xử lý nguyên liệu trong
23


điều kiện và môi trƣờng “khắc nghiệt” của acid và bazơ, nhƣ vậy cần các thiết bị bền
vững với khả năng chống ăn mòn, nhƣ vậy làm tăng giá thành sản xuất và sản phẩm.
Ngoài gia khi thiết kế nhà máy cần thiết kế các khu vực pha chế hóa chất, cũng nhƣ
bảo quản chúng, gây nguy hại đến an toàn sản xuất và môi trƣờng. Protein sau khi
tách khỏi acid và bazơ từ dịch thủy phân chứa nhiều muối, làm hạn chế khi sử dụng
chúng.
b) Tổng quan các quá trình sinh học sản xuất chitin
Ứng dụng enzyme tạo điều kiện “mềm” để xử lý nguyên liệu chứa chitin, có thể
gộp nhiều công đoạn làm một nên đơn giản hóa công nghệ. Đồng thời giảm thiểu tính
khắc nghiệt của môi trƣờng phản ứng lên thiết bị và tăng tuổi thọ của chúng.
Phƣơng pháp đơn giản nhất để thu nhận chitin là lợi dụng quá trình tự phân hủy
dƣới tác dụng của enzyme có trong nguyên liệu (quá trình tự giải). Những phƣơng
pháp này đƣợc ứng dụng để sản xuất chitin từ phụ phẩm kriel [27] và vỏ cua [28]. Quá
trình khử protein (KP) đƣợc tiến hành bằng cách nhào trộn nguyên con kriel với
nguyên liệu chứa chitin theo tỉ lệ 1:2 ở nhiệt độ 500C. Hỗn hợp thu đƣợc cần nhào trộn
liên tục trong 5 giờ. Độ chuyển dịch protein từ nguyên liệu vào pha lỏng đạt 68%. Kết

quả thu đƣợc chitin chứa 34% khoáng chất và 12% protein. Nhƣ vậy phƣơng pháp này
không loại bỏ đƣợc hoàn toàn protein ra khỏi chitin, tức là quá trình KP không hoàn
toàn và cần công đoạn phụ để loại bỏ protein. Ngoài ra, trong hỗn hợp phản ứng chứa
enzyme chitinase, tác động lên chitin, làm giảm khối lƣợng phân tử của chitin.
Từ quan điểm để đạt đƣợc hiệu suất khử protein cao, một phƣơng pháp có tính
ứng dụng cao hơn là sử dụng vi khuẩn phân giải protein stam Pseudomanas
maltophilia [29]. Nguyên liệu vỏ cua (crab) đƣợc khử khoáng bằng dung dịch HCl 2N
trong thời gian 2 ngày ở nhiệt độ phòng, sau đó nghiền nhỏ đến kích thƣớc 0,5 cm.
Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung 0,8 g nguyên liệu chứa chitin với so với 80 ml
dung dịch K2HPO4 0,2%, tiếp tục cho vào hỗn hợp dung dịch HCl để điều chỉnh pH
về pH 7,0. P. maltophilia cấy trong ống nghiệm, lắc đều đặn ở nhiệt độ 300C. Cuối
quá trình chitin đƣợc rửa sạch bằng nƣớc. Hàm lƣợng protein trong chitin giảm xuống
còn 1%. Phƣơng pháp khử protein trong vỏ nhuyễn thể (kriel) tƣơi bằng vi khuẩn
Bacillus Subtilis, độ thủy phân protein đạt 98% sau 36 giờ, thu đƣợc chitin chứa
protein dƣới 1% [30].
24


Các nhà khoa học đã nghiên cứu các phƣơng pháp sản xuất chitin từ vỏ cua, vỏ
ghẹ ứng dụng các enzyme khác nhau. Phƣơng pháp thu nhận chitin [12] bằng cách KK
bằng HCl 1,4N ở nhiệt độ phòng trong 24h. Sau đó khử protein bằng enzyme papain,
pepsin hoặc tripsin.
Phƣơng pháp của Rogozina và cộng sự [31] thì công đoạn KK và KP đƣợc gộp
làm một bằng enzyme nguồn gốc vi sinh vật hoạt động trong môi trƣờng acid:
protorizinase và protavamorinase. Quá trình xảy ra ở pH 3,0 ở nhiệt độ 35-400C trong
24h. Chế phẩm enzyme protease đƣợc thu hối từ nấm Aspergillus niger, A. fietidus, A.
orizai. Chitin thu đƣợc không chứa tro, chứa 5-10% protein. Có thể loại bỏ hoàn toàn
protein ở công đoạn cuối bằng dung dịch kiềm.
Tại LB Nga, trong công nghiệp ngƣời ta sản xuất chitin từ vỏ nhuyễn thể (kriel)
bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme proteinase protosubtilina G20X [32] và

pankreatuna [33] hoạt động trong môi trƣờng kiềm.
Các phƣơng pháp công nghệ sinh học thu nhận chitin có nhƣợc điểm chung là
không loại bỏ hết protein ra khỏi chitin (độ tinh sạch dƣới 95%), có thể ảnh hƣởng xấu
đến chất lƣợng chitin, và ứng dụng của chitin. Ngoài ra, khi lựa chọn chế phẩm
enzyme cần đặc biệt chú trọng đến khả năng chúng có chứa enzyme chitinase, vì trong
quá trình xử lý nguyên liệu nếu hoạt lực chitinase mạnh có thể dẫn đến phá hỏng cấu
trúc của chitin thành phẩm.
1.1.5 Thu nhận chitosan
a) Deacetyl hóa (DA) chitin
Dẫn xuất deacetyl hóa đầu tiên khi biến tính chitin là chitosan, là polymer cao
phân tử của glucosamin, hòa tan trong dung môi acid hữu cơ và vô cơ loãng (ngoại trừ
acid sunfuric).
Điểm khác biệt giữa chitin và chitosan là khả năng hòa tan của chitosan trong
dung dịch acid, nên có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp và y dƣợc. Để
thu nhận chitosan cần khử nhóm acetyl từ N-acetyl-D-glucosamin (chitin) hay còn gọi
là phản ứng deacetyl hóa (DA). Phản ứng điều chế chitosan thu gọn nhƣ hình 1.6.
Phản ứng DA đi kèm với việc cắt đứt liên kết glucosit của polymer. Nhƣ vậy,
chitosan là chất trùng hợp phân tán theo khối lƣợng phân tử - polymer D-glucosamin,
25