Nghiên cứu sàng lọc phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit arachidonic và prostaglandin từ rong đỏ biển

 

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

LÊ TẤT THÀNH

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC, PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG
CÁC HOẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT ARACHIDONIC VÀ
PROSTAGLANDIN TỪ RONG ĐỎ BIỂN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2016
 

 



 
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………

LÊ TẤT THÀNH

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC, PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG
CÁC HOẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT ARACHIDONIC VÀ

PROSTAGLANDIN TỪ RONG ĐỎ BIỂN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HĨA HỌC

Chun ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên
Mã số: 62 44 01 17

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Phạm Quốc Long
2. TSKH. Andrey B. Imbs.

Hà Nội – 2016
 

 


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................................... iv
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT......................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ ...................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG................................................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN......................................................................................................4
1.1. Lipit và axit béo ..................................................................................................................4
1.1.1. Lipit .......................................................................................................... 4
1.1.2. Các axit béo ............................................................................................. 6
1.1.3. Lipit và axit béo của rong Đỏ ................................................................ 11
1.2. Phương pháp nhận dạng, phân lập lipit và axit béo ...................................................... 12

1.2.1. Phương pháp nhận dạng lipit ................................................................ 12
1.2.2. Phương pháp phân lập lipit từ sinh vật biển ......................................... 13
1.2.3. Phương pháp phân lập và nhận dạng axit béo ...................................... 15
1.3. Hoạt chất sinh học biển ................................................................................................... 15
1.4. Hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm axit béo C20 đa nối đơi – axit arachidonic 18
1.4.1. Nhóm axit béo C20 đa nối đôi ............................................................... 18
1.4.2. Axit arachidonic ..................................................................................... 19
1.4.3. Hoạt tính sinh học của axit arachidonic ................................................ 20
1.5. Hoạt chất prostaglandin: hố học và hoạt tính sinh học ............................................... 23
1.5.1. Hoá học hoạt chất prostaglandin .......................................................... 23
1.5.2. Sinh tổng hợp prostaglandin .................................................................. 25
1.5.3. Sàng lọc các prostaglandin E từ nguyên liệu tự nhiên .......................... 27
1.5.4. Tác dụng sinh lí của prostaglandin ....................................................... 27
1.6. Tổng quan về rong biển .................................................................................................. 33
1.6.1. Giới thiệu chung.................................................................................................... 33
1.6.2. Những nghiên cứu về rong biển ở Việt Nam ...................................................... 35


 

i
 


2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................................ 48
2.2.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu ....................................................... 48
2.2.2. Phương pháp phân lập, tách chiết lipit, axit béo, axit arachidonic,
prostaglandin ................................................................................................... 49
2.2.3. Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng và cấu trúc hoá học của

các axit béo và prostaglandin .......................................................................... 50
2.2.4. Phương pháp phân tích cấu tử chính và phân tích chùm ...................... 51
2.3. Các dung mơi, hố chất sử dụng .................................................................................... 51
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM .............................................................................................. 52
3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipit tổng ................................................................. 52
3.2. Xác định thành phần và hàm lượng các axít béo .......................................................... 53
3.3. Sàng lọc định tính, định lượng prostaglandin ............................................................... 53
3.3.1. Phân tích định tính prostaglandin ......................................................... 53
3.3.2. Phân tích định lượng PGE2 trong các mẫu rong Đỏ ............................. 54
3.3.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng prostaglandin và axit béo
trong quá trình sinh trưởng và phát triển của lồi rong Câu Gracilaria
vermiculophylla ni trong điều kiện phịng thí nghiệm ................................. 54
3.4. Phân lập prostaglandin từ rong Đỏ ................................................................................ 55
3.4.1. Phân lập PGE2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla .............. 55
3.4.2. Nhận biết PGE3 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla ............ 57
3.5. Phân lập, tinh chế thu nhận axit arachidonic từ loài rong Câu Gracilaria
tenuistipitata .......................................................................................................................... 57
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 60
4.1. Nghiên cứu sàng lọc lipit và axit béo của rong Đỏ....................................................... 60
4.1.1. Khảo sát hàm lượng lipit tổng ............................................................... 60
4.1.2. Khảo sát thành phần và hàm lượng các axit béo ................................... 63
4.1.2.1. Thành phần và hàm lượng axit béo của các loài thuộc họ rong
Câu Gracilariaceae ...................................................................................... 62


 

ii
 

4.1.2.2. Thành phần và hàm lượng axit béo của các lồi thuộc chi
Hypnea họ rong Đơng ................................................................................. 67
4.1.2.3. Thành phần và hàm lượng axit béo của 12 mẫu thuộc 7 họ rong Đỏ
còn lại .......................................................................................................... 71
4.1.2.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích luỹ lipit và hình
thành các axit béo của rong Đỏ .................................................................. 74
4.1.3. Sử dụng phương pháp phân tích thành phần chính và phương pháp
phân tích chùm để xử lý tập dữ liệu về thành phần axit béo của các mẫu rong
Đỏ..................................................................................................................... 79
4.2. Nghiên cứu phát hiện prostaglandin từ các loài rong Đỏ............................................. 83
4.2.1. Sàng lọc PGE2 từ các loài rong Đỏ ....................................................... 83
4.2.2. Khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng các axit béo,
prostaglandin trong quá trình sinh trưởng và phát triển của lồi rong Câu
Gracilaria vermiculophylla của Nga ni trong điều kiện phịng thí nghiệm ở
Việt Nam .......................................................................................................... 88
4.3. Phân lập hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ ................................................................ 93
4.3.1. Phân lập prostaglandin E2 từ loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla94
4.3.2. Nhận biết PGE3 ở loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla ............ 104
4.3.3. Bàn luận về sự chuyển hoá của axit béo họ eicosanoit thành các
prostaglandin bằng enzyme nội sinh từ rong Đỏ ........................................... 106
4.4. Phân lập và xác đinh cấu trúc axit arachidonic từ loài rong Câu Gracilaria
tenuistipitata ........................................................................................................................ 108
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 117
KẾT LUẬN ............................................................................................................................. 117
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................................... 120
CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ........................... 121
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 123
 

 


 

iii
 


LỜI CAM ĐOAN

 

Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tơi dưới
sự hướng dẫn của GS.TS. Phạm Quốc Long và TSKH. Andrey B. Imbs (Liên Bang
Nga). Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất kì cơng trình nào khác.
Tác giả

Lê Tất Thành


 

iv
 


LỜI CẢM ƠN

 

Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS.TS
Phạm Quốc Long và TSKH Andrey B. Imbs, những người thầy bằng cả tâm
huyết của mình đã hướng dẫn tơi về khoa học, gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên
cứu và chia sẻ nhiều vấn đề của cuộc sống trong suốt thời gian tôi nghiên cứu luận
án.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị em đồng nghiệp Phòng Hoá sinh hữu
cơ, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các sản phẩm thiên nhiên, Phịng Phân tích
hố học – Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên (VAST) đã giúp đỡ tôi về cơ sở
vật chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm, các kiến thức thực nghiệm… để tơi hồn
thành tốt cơng trình nghiên cứu của mình.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp Viện Sinh vật biển, Phân viện
Viễn Đông – Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga đã tạo điều kiện và giúp đỡ tơi
trong q trình hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Tơi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân ln
động viên để tơi có động lực trong cơng việc và hồn thành tốt cơng trình nghiên
cứu khoa học này.
Tác giả

Lê Tất Thành


 

v
 


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

A.O.A.C

Association of Official Analytical
Chemists

Hiệp hội các nhà hố phân tích

RNA

Ribonucleic acid

Phân tử ARN

Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon-13

COX

Cyclooxygenase

Enzyme Cyclo-oxygen

CPEFA

Cyclopropenoic acid

Axit cyclopropenoic

DEPT

Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer

Phổ DEPT

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

ED50

Effective dose 50%
Essential polyunsaturated fatty
acids
No essential polyunsaturated fatty
acids

Liều gây chết hiệu quả
Axit béo mạch dài không no

thiết yếu

13

C-NMR

E- PUFA
NE- PUFA

Axit béo không thiết yếu
Thụ thể nhóm E của
prostaglandin
Axit béo

EP

Eprostanoid

FA

Fatty acid

FFA

Free fatty acid
Gas chromatography Mass
spectrometry
Proton Magnetic Resonance
Spectroscopy

Axit béo tự do

Phổ tương quan 1H-13C xa

n-3
n-6
PCA

Heteronuclear Multiple Bond
Connectivity
High performance liquid
chromatography
High polyunsaturated fatty acid
n-3 fatty acid
n-6 fatty acid
Principal Component Analysic

PC

Principal Component

Cấu tử chính

PG

Prostaglandin

Prostaglandin

GS-MS

1

H-NMR

HMBC
HPLC
HUFA


 

vi
 

Sắc kí khí khối phổ
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
proton.

Sắc kí lỏng cao áp
Axit béo đa nối đơi cao
Axit béo có nối đơi ở vị trí n-3
Axit béo có nối đơi ở vị trí n-6
Phân tích cấu tử chính


PGE2

Prostaglandin E2

Prostaglandin E2

PGE3

Prostaglandin E3

Prostaglandin E3

PGI2

Prostaglandin I2

Prostaglandin I2

PGH2
POL
PUFA
TG
TXA2
VLDL

Prostaglandin H2
Lipit Peroxidation
Polyunsaturated fatty acids
Triglyceride
Thromboxan A2
Very-low-density lipoprotein

Prostaglandin H2
Peroxy hoá lipit
Các axit béo đa nối đôi

Triglyxerit
Thromboxan A2
Lipoprotein mật độ rất thấp


 

 


 

vii
 


DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lipit ............................................................................. 4
Hình 1.2. Cấu tạo lipit trên cơ sở glyxerin ........................................................... 5
Hình 1.3. Cấu tạo lipit trên cơ sở sphingozin ....................................................... 5
Hình 1.4. Sơ đồ sinh tổng hợp các axit béo họ omega-3 ....................................... 9
Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp các axit béo họ omega-6 ...................................... 10
Hình 1.6. Sắc kí bản mỏng (TLC) điều chế các lớp chất lipit .............................. 13
Hình 1.7. Cơng thức cấu tạo và sự chuyển hoá của một số dẫn xuất
prostaglandin ...................................................................................................... 24
Hình 1.8. Sinh tổng hợp các PG2 từ axit arachidonic (AA) .................................. 26
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu .............................................................................. 40
Hình 2.2. Ảnh 25 lồi rong Đỏ đại diện cho 69 mẫu nghiên cứu ......................... 45
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu chung ....................................................................... 52

Hình 4.1. Kết quả phân tích PCA của các mẫu rong Đỏ ...................................... 82
Hình 4.2. Biểu đồ phân loại hình cây của 69 mẫu rong Đỏ dựa vào thành phần và
hàm lượng các axit béo chính yếu ........................................................................ 83
Hình 4.3. Phân tích định tính PGE2 bằng sắc kí lớp mỏng ................................... 84
Hình 4.4. Sắc kí lớp mỏng định tính PGE2 có trong mẫu rong Gracilaria
vermiculophylla (Ohmi) Papenf. ni trong PTN ................................................ 92
Hình 4.5. Sơ đồ phân lập prostaglandin từ rong Câu Gracilaria vermiculophylla
(Ohmi) Papenf. ..................................................................................................... 94
Hình 4.6. Xác định PGE2 trong dịch chiết bằng các phương pháp khác nhau ..... 95
Hình 4.7. Cấu trúc hóa học của hợp chất PGE2 .................................................... 99
Hình 4.8. Tương tác H-H COSY (nét đậm) và H-C HMBC (mũi tên) của hợp chất
PGE2 ..................................................................................................................... 99
Hình 4.9. Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất PGE2 ........................................ 100
Hình 4.10. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 ....... 100
Hình 4.11. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 ...... 101
Hình 4.12. Phổ DEPT NMR (125 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 . 101


 

viii
 


Hình 4.13. Phổ COSY NMR (500 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 . 102
Hình 4.14. Phổ HSQC NMR (500 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất PGE2 102
Hình 4.15. Phổ HMBC NMR (500 MHz, CD3OD + CDCl3) của hợp chất
PGE 2 ..................................................................................................................... 103
Hình 4.16. Phổ LCMS của PGE3 .......................................................................... 106
Hình 4.17. Sơ đồ phân lập axit arachidonic từ rong Câu Gracilaria tenuistipitata

Zhang et Xia ..................................................................................................................109
Hình 4.18. Liên kết H-H COSY (nét đậm) và tương tác H-C HMBC của hợp chất
AAEE .................................................................................................................... 111
Hình 4.19. Phổ EI-MS của etyl arachidonat tinh khiết đã phân lập được ............ 112
Hình 4.20. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của etyl arachidonat ...................... 112
Hình 4.21. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của etyl arachidonat ..................... 113
Hình 4.22. Phổ DEPT (125 MHz, CDCl3) NMR của etyl arachidonat ................ 113
Hình 4.23. Phổ COSY NMR (500 MHz, CDCl3) của etyl arachidonat ............... 114
Hình 4.24. Phổ HSQC NMR (500 MHz, CDCl3) của etyl arachidonat ................ 116
Hình 4.25. Phổ HMBC NMR (500 MHz, CDCl3) của etyl arachidonat .............. 115
Hình 4.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất etyl arachidonat ................................. 115

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Tốc độ tăng sinh khối của rong Câu G. vermiculophylla ................. 89
Biểu đồ 4.2. Sự biến động hàm lượng PGE2 và AA ............................................. 107


 

ix
 


DANH MỤC BẢNG
 
Bảng 1.1. Các axit béo đa nối đôi trong tự nhiên phân bố theo họ cấu tạo ............. 8
Bảng 2.1. Danh sách 69 mẫu rong Đỏ nghiên cứu .............................................. 41
Bảng 4.1. Hàm lượng lipit tổng số của 70 mẫu rong Đỏ ..................................... 60
Bảng 4.2. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung về hàm lượng lipit tổng
của 70 mẫu rong Đỏ ......................................................................................... 62

Bảng 4.3. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung về các chỉ số axit béo
của họ rong Câu Gracilariaceae ........................................................................ 65
Bảng 4.4. Thành phần và hàm lượng các nhóm axit béo của 10 mẫu thuộc chi
Hypnea họ rong Đông ...................................................................................... 69
Bảng 4.5. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung về các chỉ số axit béo
của chi Hypnea họ rong Đông. ................................................................................ 69
Bảng 4.6. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung về các chỉ số axit béo
của 12 mẫu thuộc 7 họ còn lại. .......................................................................... 72
Bảng 4.7. Hàm lượng lipit và các axit béo của các họ rong Đỏ tại Cồn Cỏ - Quảng
Trị ................................................................................................................... 72
Bảng 4.8. Sự hình thành, tích luỹ lipit và các axit béo của chi rong Câu Gracilaria
tại Phù Long - Hải Phòng. ................................................................................. 75
Bảng 4.9. Hàm lượng lipit và axit béo của loài rong Câu chỉ vàng thu tại 8 tỉnh ven
biển Việt Nam .................................................................................................. 77
Bảng 4.10. Hàm lượng PGE2 và AA trong các mẫu rong Đỏ .............................. 86
Bảng 4.11. Kết quả khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của loài rong Câu
Gracilaria vermiculophylla thu ở biển Viễn Đông – LB Nga ............................. 88
Bảng 4.12. Thành phần, hàm lượng lipit và các axit béo của lồi rong Gracilaria
vermiculophylla ni trong phịng thí nghiệm .................................................... 90
Bảng 4.13. Hàm lượng PGE2 của các mẫu rong ni (µg/g rong tươi) ................ 93
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hiệu suất phân lập PGE2 ................ 96
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phân lập PGE2 ...................... 97

xi
 

 


Bảng 4.16. Các dữ liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR của PGE2 .......... 104

Bảng 4.17. Thành phần các axit béo trong mẫu dầu rong biển sau khi làm giàu bằng
phương pháp tạo muối với LiOH. ................................................................... 110
Bảng 4.18. Các dữ liệu phổ 1H, 13C, COSY and HMBC NMR của ethyl arachidonat
.............................................................................................................................. 116

xii
 

 


MỞ ĐẦU
Axit arachidonic là một axit béo không no, thành phần chính của các
phospholipit trong màng tế bào não, cơ bắp và gan. Trong tự nhiên, axit arachidonic
thường được phân lập từ lipit của gan, trứng các loài cá biển. Chúng cũng là thành
phần chính trong lipit của một số lồi rong biển. Axit arachidonic có tác dụng kích
hoạt hệ enzyme NADPH oxygenase giúp hoạt hố q trình trao đổi oxi, kích hoạt
các kênh ion K+, Ca2+, khe liên bào và dòng cation liên kết với chất vận chuyển
dopamin… Axit arachidonic (AA), axit eicosapentaenoic (EPA), có vai trị quan
trọng nhất trong lipit của cơ thể động vật bậc cao vì chúng là tiền chất để sinh tổng
hợp các chất điều hồ sinh học (cịn gọi là các hoocmon tổ chức) đặc biệt là các
prostaglandin, một nhóm hợp chất oxylipin (dẫn xuất oxi hố của axit béo có 20
ngun tử cacbon). Đây là những chất có phổ ứng dụng rất rộng trong y, dược và đã
được sử dụng làm thuốc điều tiết các quá trình thụ thai, mang thai và sinh đẻ qua sự
điều tiết hệ hoocmon cũng như các biến đổi có kiểm sốt của các hệ enzyme. Các
prostaglandin cịn tác động lên khả năng chịu đựng của hệ cơ phẳng, hệ bài tiết, hệ
tiêu hóa và hệ tuần hồn trong cơ thể sống. Chính vì hoạt tính mạnh ở nồng độ thấp,
prostaglandin đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu tổng hợp hay tìm kiếm
từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Ngay sau khi phát hiện được hoạt chất này có
trong lồi san hơ Plexaura homamalla, việc khai thác san hô để sản xuất các sản

phẩm trong đó có prostaglandin phát triển mạnh vào những năm 1970 nhưng sau đó
bị cấm theo các cơng ước quốc tế để bảo vệ hệ sinh thái rạn san hô.
Những năm gần đây, các nhà khoa học Nga đi đầu trong việc tìm kiếm các
hoạt chất prostaglandin từ rong Đỏ ở vùng biển Viễn Đơng - Liên bang Nga. Việc
này có ý nghĩa vơ cùng quan trọng vì đây là một nguồn lợi sinh vật biển có khả năng
tái sinh cao, có thể khai thác mà khơng sợ bị ảnh hưởng đến hệ sinh thái ven biển.
Rong biển từ lâu đã được dùng làm nguyên liệu cho rất nhiều ngành công
nghiệp để chế biến ra các sản phẩm có giá trị sử dụng cao như agar, alginat,
carrageenan, fuicoidan, các hoạt chất sinh học…[56] Người ta còn sử dụng rong Mơ
(Sargassum) làm nguyên liệu chiết alginat để khử độc, loại bỏ các nguyên tố kim loại

1
 

 


nặng độc hại hay các nguyên tố phóng xạ ra khỏi cơ thể như chì (Pb), cadimi (Cd),
uranium (U)…
Rong biển chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Nhiều hoạt chất từ
rong biển có khả năng ứng dụng trong y dược điển hình như: Curacin - A (chiết từ
một lồi rong tại bờ biển Curacao - phía nam biển Caribe), chất này thể hiện hoạt tính
chống ung thư vú cao hơn cả taxol; Fucoidan, một loại sulphat polysaccarit, chiết từ
rong nâu có khả năng ngăn ngừa di căn của ung thư, điều trị và hỗ trợ điều trị một số
bệnh nan y như ung thư, viêm loét dạ dày, rối loạn đường tiêu hố; phloroglucinol có
tác dụng thâu tóm các gốc tự do làm giảm cơ chế hình thành khối u; Các axit béo
không no nhiều nối đôi (PUFA-Polyunsaturated fatty acids) như axit arachidonic
(AA), axit eicosapentaenoic (EPA), axit docosahexaenoic (DHA) có tác dụng ức chế
cạnh tranh làm hạn chế hình thành các chất tiền viêm (leucotrien, thromboxane…) và
có nhiều ứng dụng trong y, dược [30,53].

Nghiên cứu về động thái hình thành, tích luỹ lipit và axit béo đặc biệt là các
hoạt chất eicosanoit và prostaglandin ở rong Đỏ giúp định hướng ni trồng cũng
như sử dụng có hiệu quả nguồn lợi này và là lĩnh vực rất mới mẻ ở Việt Nam. Vì
những lí do trên, chúng tơi đã lựa chọn rong Đỏ là đối tượng nghiên cứu của luận án.
Đề tài:“Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit béo, axit
arachidonic và prostaglandin từ rong Đỏ biển” có các nội dung sau:
1. Xác định hàm lượng lipit và thành phần axit béo đặc biệt là axit arachidonic
và prostaglandin của 68 mẫu rong Đỏ Việt Nam và 01 mẫu thu tại vùng biển
Viễn Đông - Liên bang Nga.
2. Phân tích sự biến động về hàm lượng lipit, thành phần axit béo do sự khác
biệt về mơi sinh và bản chất sinh học của lồi.
3. Đánh giá sự biến động hàm lượng các axit béo và prostaglandin trong q
trình ni trồng lồi rong Câu Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenf.
thu từ vùng biển Viễn Đông - Liên bang Nga ở điều kiện Việt Nam.
4. Sử dụng dữ liệu thành phần và hàm lượng các axit béo chính yếu để phân
loại hoá học thực vật (chemotaxonomy) đối với các lồi rong Đỏ bằng
phương pháp phân tích cấu tử chính (Principal Component Analysic - PCA).

2
 

 


5. Phân lập và nhận dạng các hoạt chất axit arachidonic, prostaglandin từ một
số lồi rong Đỏ có tiềm năng thu ở vùng biển Việt Nam và biển Viễn Đông Liên Bang Nga.
 


 

 

 

 

 

 

 

 

3
 

 


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Lipit và axit béo
1.1.1. Lipit
Lipit (có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp cổ - Lipos nghĩa là mỡ hay là chất béo) là
những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào các cơ thể sống, trong động
vật, thực vật và vi sinh vật. Chúng có thành phần hố học và cấu tạo khác nhau nhưng có tính chất chung là khơng hồ tan trong nước mà hồ tan trong các dung mơi
hữu cơ như: ete, clorofom, benzen, ete dầu hỏa... Lipit là hợp phần cấu tạo quan
trọng của các màng sinh học tế bào, là nguồn cung cấp năng lượng (37,6.106 J/kg),
nguồn cung cấp các vitamin A, D, E, F, K và F cho cơ thể sống.

Trong tự nhiên, những hợp chất thuộc về lớp chất lipit tồn tại rất đa dạng
như: các hydrocacbon bậc cao, các ancol, các aldehyt, các axit béo và các sản phẩm
thứ cấp của chúng như glycerit, sáp, phospholipit, glucolipit, sulfolipit... [97]. Lipit
có nhiều kiểu cấu trúc khác nhau, tuy nhiên cấu tạo lipit thường có chung một
nguyên tắc trong thành phần phân tử lipit bao gồm hai phần: một phần là các đuôi
mạch hydrocacbon kị nước; phần kia là tổ hợp nhóm các chất ưa nước (gọi là đầu
phân cực). Hai phần của phân tử lipit được liên kết với nhau bởi mắt xích liên kết ở
giữa và phân tử lipit tồn tại như một liên kết tổ hợp của hai phần, trong đó những
phần tử kị nước tham gia cấu tạo nên pha không phân cực, cịn nhóm những chất
phân cực hình thành nên ranh giới phân cách giữa pha không phân cực và nước (hình
1.1).

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lipit

4
 

 


 


Cấu trúc tổ hợp liên kết của phân tử lipit phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc tự
nhiên của các cấu tử tham gia vào thành phần của nó. Thường người ta dùng nguồn
gốc tự nhiên của mắt xích liên kết, giữa phần phân cực và phần không phân cực để
làm cơ sở phân loại lớp chất lipit [97]. Theo đó, lipit có hai dạng glyxerin và
sphingozin.
Trong thực tế đa phần dầu mỡ tồn tại dưới dạng este của glyxerin (1) với các
axit béo (gọi là glyxerit), khi mà cả ba nhóm hydroxyl (OH) của glyxerin đều được

este hóa thì gọi là triglyxerit hoặc là triaxylglyxerin (2). Do đó dầu mỡ cũng có tên là
lipit trung tính và có cơng thức cấu tạo (hình 1.2):
1

1 CH OH
2
HO

2

CH2

OCOR1

2

C

R2OCO

H

C
3 CH2

3 CH OH
2

Glyxerin (1)

H
OCOR3

Triglyxerit (2)

Hình 1.2. Cấu tạo lipit trên cơ sở glyxerin
Nhóm chất lipit khác cũng phân bố rộng rãi trong lớp màng tế bào, đặc biệt ở
não là các sphingolipit, chúng được cấu tạo trên cơ sở liên kết nhóm amin của
sphingozin (3) với các axít béo. Các sphingolipit đóng vai trị quan trọng trong việc
truyền dẫn tín hiệu và nhận biết tế bào, chúng có tác động đặc biệt vào mơ thần kinh.
Các hợp chất nhận được qua biến đổi được gọi chung là ceramit (4) và có cơng thức
cấu tạo mơ tả ở hình 1.3 [16,69].
CH2OH
H

C

NH2

H

C

OH

HO CH

CH

CH

CH

HO CH 2

(CH2)12

NH
O

CH3

Ceramit (4)

Sphingozin (3)

Hình 1.3. Cấu tạo lipit trên cơ sở sphingozin

5
 

 


1.1.2. Các axit béo
Cấu trúc đa dạng của lipit được bắt nguồn từ các axit béo khác nhau tham gia
vào trong thành phần của nó. Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn
500 axit khác nhau bởi mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon, số
lượng và vị trí các nối đơi trong mạch, vị trí và số lượng các nhóm chức, độ dài của
mạch hydrocacbon... Các axit béo có mặt trong thành phần lipit thực vật, động vật

trên cạn thường có từ 16 đến 20 nguyên tử cacbon trong phân tử. Trong khi ở sinh
vật biển đa phần chứa các axit béo mạch dài từ 20 đến 26, thậm chí đến 30 nguyên tử
cacbon [16].
Cách gọi tên axit béo theo danh pháp quốc tế, theo tên thơng thường hay tên
gọi nhanh. Ví dụ C18:2n-6 hay C18:2Δ9,12 là tên gọi nhanh của axit linoleic hay tên
theo danh pháp quốc tế là 9,12-octadecadienoic. Trong đó, trong tên gọi nhanh, chỉ
số đầu tiên chỉ số nguyên tử cacbon, chỉ số thứ hai chỉ số lượng nối đôi trong mạch
cacbon, chỉ số thứ ba sau n (hoặc ω) cho biết vị trí đầu tiên của nối đơi kể từ đầu
metyl (CH3), delta (Δ) với các số đếm đằng sau để chỉ sự có mặt của vị trí nối đơi
(hoặc nối ba) ở trong mạch hydrocacbon tính từ đầu cacbon carboxyl. Ngồi ra, có
thể có thêm kí hiệu của đồng phân lập thể như cis (Z) hay trans (E).
Ví dụ tên gọi của một số axit béo thường gặp nhất trong tự nhiên.
Tên gọi nhanh
14:0
16:0
18:0
18:1n-9
18:2n-6
18:3n-3
20:4n-6
20:5n-3
22:6n-3

Tên thông thường
Myristic
Palmitic
Stearic
Oleic
Linoleic
Linolenic

Arachidonic (AA)
Eicosapentaenoic (EPA)
Docosahexaenoic (DHA)

Tên qui ước quốc tế
Tetradecanonic
Hexadecanoic
Octadecenoic
Cis-9-octadecenoic
9,12-octadecadienoic
9,12,15-octadecatrienoic
5,8,11,14-eicosatetraenoic
5,8,11,14,17-eicosapentaenoic
4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic

1.1.2.1. Axit béo bão hoà
Hầu hết các axit béo bão hịa (axit béo no) có mặt trong tự nhiên có cấu tạo
mạch thẳng với số nguyên tử cacbon chẵn. Các axit với số nguyên tử cacbon từ C2C30 được biết đến, nhưng phổ biến và quan trọng nhất là C12-C22. Chúng có thể được
6
 

 


gọi tên theo tên thường và tên khoa học hoặc gọi theo kí hiệu số như C16:0, chỉ axit
no mạch thẳng có 16 nguyên tử cacbon. Những axit béo đơn giản trong tự nhiên là
các axit béo no, với mạch hydrocacbon dài, khơng phân nhánh có cơng thức chung
như sau (5).
CH3(CH2)nCOOH (5)
Trước đây người ta cho rằng số (n) bao giờ cũng là số chẵn, hiện nay nhờ các

phương pháp phân tích hiện đại, người ta đã phát hiện trong dầu mỡ tự nhiên có cả
các axít béo no có số nguyên tử cacbon (n) lẻ. Các axit này chiếm tỉ lệ khoảng 1% so
với tổng số các axit béo.
1.1.2.2. Axit béo không no một nối đôi
Hơn một trăm axit béo một nối đơi đã được tìm thấy trong tự nhiên, nhưng
hầu hết chúng là những hợp chất hiếm. Thực tế tất cả các axit béo một nối đôi đều có
cơng thức chung (6) [16].
CH3(CH2)m CH=CH(CH2)nCOOH

(6)

và đa phần có số nguyên tử cacbon chẵn, tồn tại ở dạng cấu hình -cis đồng
phân của axit béo một nối đôi (7) [16].
CH3(CH2)m
H

C

(CH2)nCOOH
H

C

(7)

1.1.2.3. Các axit béo không no đa nối đôi
Các axit béo tự nhiên có nhiều hơn một liên kết đơi (polyunsaturated fatty
acids – PUFA) có thể chia thành một số nhóm:
Nhóm thứ nhất và là nhóm quan trọng nhất cả về mặt cấu trúc và mức độ tồn
tại, là nhóm axit béo có những vị trí nối đơi được phân cách đều đặn bởi nhóm

metylen và nối đơi cấu hình dạng cis (Z) đại diện cho nhóm này là 2 axit: axit linoleic
và axit archidonic.
Nhóm thứ hai là các axit béo có tất cả hoặc một phần khơng no trong một hệ
liên kết bởi liên kết đôi liên hợp dạng cis (Z) hoặc trans (E).
Nhóm thứ ba là các axit béo có liên kết đơi C=C khơng bị phân cách đều đặn
bởi nhóm metylen (non methylene - interrupted diens NMID), ví dụ axit 5,9,12
C18:3 có trong dầu hạt cây tùng lớn.
7
 

 


Các axit béo khơng no đa nối đơi đều có chung công thức là (8)
CH3(CH2)m(CH=CHCH2)n(CH2)kCOOH (8)
Các axit béo không no đa nối đơi được phân cách đều đặn bởi nhóm metyl.
Các axit dạng này được phân biệt bởi khoảng cách từ nối đơi đầu tiên đến nhóm
metyl cuối cùng (H3C[CH2]mCH=CH-). Hầu hết các axit béo đa nối đôi quan trọng
thuộc họ n-3, n-6, n-9 và hình thành dựa trên cơ sở là các axit linolenic, linoleic,
oleic. Trong tự nhiên đến nay đã phát hiện 12 họ axit béo từ họ n-1 đến n-12 theo
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Các axit béo đa nối đôi trong tự nhiên phân bố theo họ cấu tạo
Họ: n-1 dẫn xuất của 9,12,15-16:3,
16:3, 18:3
Họ: n-2 dẫn xuất của 9,12,15-17:3,
15:3,17:3,17:4, 20:4
Họ: n-3 dẫn xuất của 9,12,15-18:3,
15:2, 15:3, 15:4, 16:3,16:4, 18:3, 18:4,18:5, 20:2,20:3, 20:4,
20:5, 21:5, 22:3, 22:5, 22:6, 24:3, 24:4, 24:5, 24:6, 26:5,
26:6, 28:7, 30:5

Họ: n-4 dẫn xuất của 9,12-16:2,
16:2, 16:3, 18:2, 18:3
Họ: n-5 dẫn xuất của 9,12-17:2,
15:2, 17:2, 17:3, 19:2, 19:4, 20:3, 20:4, 21:4, 21:5
Họ: n-6 dẫn xuất của 9,12-18:2,
15:2, 16:2, 18:2, 18:3, 20:2, 20:3, 20:4, 22:2, 22:3, 22:4,
22:5, 24:2, 24:4, 25:2, 26:2, 30:4
Họ: n-7 dẫn xuất của 9-16:1,
16:2, 17:2, 18:3, 19:2
Họ: n-8 dẫn xuất của 9-17:1,
15:2, 16:2, 17:2, 18:2, 19:2
Họ: n-9 dẫn xuất của 9-18:1,
17:2, 18:2, 20:2, 20:3, 22:3, 22:4
Họ: n-11 axit C19:2
Họ: n-12 axit C20:2

8
 

 


Các axit béo không no đa nối đôi được sinh tổng hợp bởi q trình chuyển
hố enzym: no hố, kéo dài mạch và ngắt mạch. Trong sinh vật biển, các axit béo
quan trọng nhất chủ yếu nằm trong họ omega-3, omega-6 [16, 69].
•

Axit béo omega-3
Hoạt chất omega-3 (hay ω3) là những axit béo mà trong phân tử có nhiều nối

đơi, nối đơi đầu tiên bắt đầu từ vị trí cacbon thứ ba tính từ nhóm metyl cuối cùng của
mạch. Điển hình cho các axit béo họ ω3 là axit eicosapentaenoic (EPA, C20:5 ω3 –
CH3CH2[CH=CHCH2]5CH2COOH) và axit docosahexaenoic (DHA, C22:6ω3 –
CH3CH2[CH=CHCH2]6CH2COOH). Chúng cũng là những axit béo đặc trưng của
sinh vật biển, đặc biệt là tảo biển.
Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp các axit béo omega-3 được trình bày ở hình 1.4.

Hình 1.4. Sơ đồ sinh tổng hợp các axit béo họ omega-3: (D) Desaturation (khử no),
(E) Elongation (kéo dài mạch).
9
 

 


Quá trình sinh tổng hợp các axit béo ω3 được bắt đầu từ các axit béo có 18
nguyên tử cacbon trong tự nhiên. Khởi đầu là axit C18 α-linolenic axit (ALA) trên
con đường sinh tổng hợp ω3 được khử no và kéo dài mạch cacbon để tạo ra axit
eicosatetraenoic (ETA). Sau đó ETA tiếp tục chịu khử no ở vị trí ∆5 tạo thành
eicosapentaenoic axit (EPA), q trình được tiếp tục kéo dài mạch tạo thành
docosapentaenoic axit (DPA), sau đó được tiếp tục khử no thành docoxahexaenoic
axit (DHA).
• Axit béo omega-6
Hoạt chất omega-6 (hay ω6) là những axit béo mà trong phân tử có nhiều nối
đơi, nối đơi đầu tiên bắt đầu từ vị trí cacbon thứ sáu tính từ nhóm metyl cuối cùng
của mạch. Điển hình cho các axit béo họ ω6 là axit γ-Linolenic (GLA) –
(CH3(CH2)4[CH=CHCH2]3-(CH2)3COOH)

và

axit

arachidonic

(AA

–

(CH(CH2)4[CH=CHCH2]4-(CH2)2COOH) là đặc trưng của thực vật và động vật trên
cạn.
Quá trình sinh tổng hợp các axit béo ω6 từ các axit có 18 nguyên tử cacbon
trong tự nhiên được mô tả ở hình 1.5.

Hình 1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp các axit béo họ omega-6: (D) Desaturation (khử no),
(E) Elongation (kéo dài mạch).

10
 

 


Từ axit C18, bước thứ nhất là khử no ở vị trí ω6 của axit linoleic tạo thành
axit γ-linolenic (GLA). Khử no xong thì tiếp tục kéo dài mạch tạo thành axit béo
dihomo-gamma-linoleic (DGLA) có 20 nguyên tử cacbon (hay axit 8,11,14,17-ciseicosatetraenoic), quá trình được tiếp tục với việc khử no ở vị trí ∆5 của DGLA tạo
thành axit arachidonic (AA).
1.1.3. Lipit và axit béo của rong Đỏ
Trong các lớp chất có hoạt tính sinh học cao từ rong biển thì lipit được
nghiên cứu khá nhiều do trong thành phần lipit của rong biển có chứa nhiều axit béo
thiết yếu đặc biệt là các axit béo không no nhiều nối đôi PUFA, các axit béo này

được xác định như một thành phần đặc trưng cho rong biển. Chính các axit béo
PUFA này là những chất chính thể hiện hoạt tính sinh học của lipit, trong đó quan
trọng nhất là các axit béo thuộc họ Omega-3 (hay n-3) và họ Omega-6 (hay n-6)
[1,15,16,17,74].
Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, hàm lượng lipit chiếm từ 1-10% trọng
lượng khô của rong Đỏ. Vanessa Gressler và cộng sự khi nghiên cứu thành phần sinh
hố của hai lồi rong Đỏ thu ở vùng biển Brasil đã xác định được hàm lượng lipit
tổng đạt từ 1,1-6,2% so với trọng lượng khô của rong [119]. Nor Salmi Abdullah
công bố xác định hàm lượng lipit của rong Câu Gracilaria manilaensis chiếm
0,175% trọng lượng khô [96].
Nghiên cứu của Khotimchenko (1983) [83] trên 155 loài rong biển Nhật Bản
cũng cho thấy, các axit không no nhiều nối đôi mạch >18C chiếm đến 37% trong
rong Nâu và rong Lục, trong đó chủ yếu là oleic, linoleic chiếm hơn 15%. Nghiên
cứu cũng cho thấy, thành phần định tính các axit béo ít thay đổi nhưng thành phần
định lượng thay đổi theo loài. Các tác giả Jaimieson, Reid (1972), Ackman, Mc
Lashion (1974) cũng có cùng quan điểm đó [16].
Khotimchenko S. V. (1991) đã xác định thành phần các axit béo của một số
lồi rong Đỏ, trong đó đáng chú ý là axit béo eicosapentaenoic axit (EPA) và axit
arachidonic (AA) [84].

11
 

 


Các tác giả Gahan A.El-Soubaly (2008); Shereef Khan M. (2012); Weinberger
F. (2011) đã nghiên cứu thành phần và hàm lượng các axit béo có hoạt tính sinh học
cao trong các lồi Đỏ trong đó phát hiện các axit béo khơng no nhiều nối đơi có mạch
cacbon từ C16 đến C22 [70,108,122].

1.2. Phương pháp nhận dạng, phân lập lipit và axit béo
1.2.1. Phương pháp nhận dạng lipit
Mỗi một lớp chất của lipit có một phương pháp nhận dạng và phân tích đặc
hiệu riêng như: các axit béo thơng thường có thể được phân tích bởi sắc kí khí (GC)
cịn các axit béo đặc hiệu như: axit cyclic, axit epoxy, axit hydroxy... thì phải sử dụng
sắc kí khí kết nối khối phổ (GC-MS) cùng với một số phản ứng hóa học riêng biệt.
Đối với triglyxerit phải kết hợp cả bản mỏng (TLC) và GC để lí giải. Các lipit phân
cực như phospholipit, glucolipit lại phải có những phương pháp đặc hiệu riêng để
nhận dạng như: TLC với các hệ dung môi riêng biệt, triển khai 2 chiều cùng các
thuốc thử đặc hiệu và kết hợp với các phản ứng hóa học đặc hiệu khác [16].
Với tiến bộ kĩ thuật phân tích của các phương pháp phổ vật lí, cùng với máy
móc hiện đại ngày càng được cải tiến đã giúp đỡ rất nhiều cho các nhà nghiên cứu
lipit có thể nhanh chóng bằng các thao tác đơn giản đã có ngay được những thông tin
cần thiết ban đầu về thành phần các lớp chất cơ bản của lipit, ví dụ: phân tích thành
phần lipit trên máy Iatrocan TLC/FID Japan, có kết hợp với hệ chất chuẩn đã nhanh
chóng cho ta biết sơ bộ về thành phần của các lớp chất: hydrocacbon, steryl este,
triglycerit, axit béo tự do, sterol và các lipit phân cực như: phospholipit,
glucolipit...[97].
Trong điều kiện phân tích tại phịng thí nghiệm, một trong những phương
pháp phân tích nhanh đơn giản và hiệu quả là sử dụng bản mỏng TLC điều chế nhanh
với hệ dung môi triển khai đặc hiệu. Qua đó ta có thể biết được những thơng tin
chung về hàm lượng, thành phần của các lớp chất như: hydrocacbon+este, lipit không
phân cực TG+DG+MG (triglyxerit (TG), diglixerit (DG), monoglixerit (MG), tổng
lipit phân cực (phospholipit và glucolipit), axit béo tự do và sterol.... [16]. Đây cũng

12