Nghiên cứu tạo dẫn xuất của chitooligoaccharides, khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế matrix metalloproteinase

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ










BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU TẠO DẪN XUẤT CỦA
CHITOOLIGOSACCHARIDES, KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG
OXI HÓA VÀ ỨC CHẾ MATRIX METALLOPROTEINASE




CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
(Ký tên)





PGS.TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)














THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 12/ 2013
1

PHẦN MỞ ĐẦU
1. Tên đề tài: Nghiên cứu tạo dẫn xuất của chitooligosaccharide, khảo sát hoạt
tính kháng oxi hóa và ức chế matrix metalloproteinase.
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Ngô Đại Nghiệp
Cơ quan chủ trì: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.
Hồ Chí Minh.
Thời gian thực hiện: 24 tháng từ 09/2010 đến 09/2012
Kinh phí đƣợc duyệt: 460.000.000 đồng
Kinh phí đã đƣợc cấp:
Đợt 1: 300.000.000 đồng theo TB số 157/TBKHCN ngày 17/09/2010.

Đợt 2: 114.000.000 đồng theo TB số 27/TBKHCN ngày 13/04/2012.
2. Mục tiêu
Cải biến chitooligosaccharide (COS) bằng cách ghép các phân nhánh chức
năng nhằm nâng cao hoạt tính sinh học vốn có của COS như kháng oxi hóa và ức
chế matrix metalloproteinase (MMP-2 và 9), enzyme đóng vai trò trong quá trình
gây di căn của ung thư. Tạo ra sản phẩm sinh học mới là dẫn xuất COS ít độc hoặc
không độc, an toàn.




2

3. Nội dung nghiên cứu và tiến độ theo hợp đồng
TT
Nội dung, công việc
chủ yếu
Sản phẩm cần đạt
Mức độ
1
2
3
4
1
Nghiên cứu thu nhận
chitooligosaccharide
(COS) với trọng lượng
phân tử khác nhau (1-3
kDa và 3-5 kDa) từ
chitosan

Các thông số để thu nhận các
COS: ảnh hưởng của nồng độ
enzyme, thời gian thủy phân,
ảnh hưởng nhiệt độ và pH lên
quá trình thủy phân bằng
enzyme để thu nhận các phân
đoạn COS có trọng lượng
phân tử 1-3kDa và 3- 5kDa
bằng màng siêu lọc UF.
Đạt kết quả
2
Nghiên cứu cải biến
chitooligosaccharide
(COS) tạo các dẫn xuất
của COS
Phương pháp tạo một số dẫn
xuất của COS
Tối thiểu 6 dẫn xuất
Điều kiện thích hợp để gắn tạo
các dẫn xuất COS và đánh giá
quá trình gắn
Đạt kết quả
3

3
Thử nghiệm hoạt tính
kháng oxi hóa của COS
và dẫn xuất của COS
thông qua năng lực khử
và khả năng bắt gốc

DPPH
Kết quả năng lực khử, kháng
oxi hóa
Đạt kết quả
4
Báo cáo sơ kết giai
đoạn 1
Báo cáo kết quả theo quy định
Đạt, thông qua
5
Thử nghiệm hoạ
củ


Đạt kết quả
6
metalloproteinase
(MMP-2,-9,
collagenase)
collaganase
4 dẫn xuất ức chế
collaganase và 2
ức chế MMP
7
ệm
Đạt
4

thu cơ sở.
thu cơ sở.

8
Chỉnh sửa theo góp ý
hội đồng hoàn chỉnh
m thu.
ệm
thu.
Đạt
4. Các sản phẩm khác đã đạt
- Đã tham dự hội nghị quốc tế Chitin, Chitosan Châu Á, Thái Bình Dương
8/2011: 2 bài.
- Đã tham dự hội nghị CNSH toàn quốc khu vực phía nam 11/2011: 1 bài.
- Bài báo: 4 bài (2 bài tạp chí Khoa học và Công nghệ, 2 bài tạp chí Hóa học)
- Đào tạo: 1 thạc sỹ và 4 cử nhân.
5

1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về chitin, chitosan, chitooligosaccharides và dẫn xuất
Chitin là một polymer sinh học có trữ lượng nhiều thứ hai trong tự nhiên, chỉ
sau cellulose. Cấu trúc hóa học của chitin gần tương tự như cấu trúc hóa học của
cellulose. Chitin là polymer sinh học có các đơn phân là 2-acetamido-2-deoxy-β-D-
glucose hay N-acetyl glucosamine. Chitin là thành phần cấu trúc chính tạo nên lớp
vỏ ngoài của các loài động vật không xương sống như tôm, cua, mực, côn trùng
cũng như vách tế bào nấm. Chitin không hoà tan trong nước và các dung môi hữu
cơ phổ biến nhưng có thể hoà tan trong các dung môi như N, N–dimethylacetamide,
hexaflouroacetone hoặc hexanfluoro–2–propanol [6].
Mức độ deacetyl của chitin thông thường nhỏ hơn 10% và trọng lượng phân
tử của chitin khoảng 1,0 - 2,5 x 10
6
Da tương ứng với mức độ polymer khoảng 5000
– 10.000. Chitin còn có cấu trúc đa hình, tức là trong tự nhiên chitin tồn tại dưới

nhiều dạng khác nhau, trong đó chitin có 3 dạng chính: α-chitin, β-chitin và γ-chitin;
α-chitin là dạng phổ biến nhất [6][15].
Chitosan, polyglucosamine, được tạo ra bởi phản ứng deacetyl hoá nhóm N–
acetyl của chitin. Khi đó gốc acetyl (-COCH
3
) sẽ tách khỏi gốc amino (-NH
2
) trong
nhóm acetamide (-NHCOCH
3
), hay chúng có số nhóm amin tự do tăng lên rất nhiều
so với chitin. Chúng là các sản phẩm tự nhiên, không độc, an toàn với môi trường
và được sử dụng rộng rãi trong y học và nông lâm ngư nghiệp. Chitin, chitosan
cùng với các dẫn xuất của chúng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng
6

nấm, kháng oxi hóa [16], kích thích và tăng cường hoạt động của hệ thống miễn
dịch, ức chế khối u, ung thư, ức chế enzyme như angiotensin I converting enzyme
đóng vai trò trong việc điều hòa huyết áp và gây bệnh cao huyết áp hay
myeloperoxidase tạo các chất oxi hóa gây hư hại tế bào… Ngoài ra, chúng làm
giảm cholesterol và lipid trong máu nhất là các cholesterol có hại [17][30].
Mặt dù chitin và chitosan được biết là có tính chất và chức năng quan trọng
trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, do độ hoà tan kém trong điều kiện sinh lý làm cho
sự biến đổi hoá học của nó khó khăn và hạn chế ứng dụng cho đến nay.
Chitooligosaccharide (COS) hay chitosan oligomer là các polymer mạch
thẳng của 2–amino–2–deoxy–D–glucose (GlcN) và 2–acetamido–2–deoxy–D–
glucose (GlcNAc) liên kết β-(14) với mức độ trùng hợp (DP, degrees of
polymerization) từ 1 – 20 [16]. Các COS có DP từ 2 – 4 là hoà tan hoàn toàn trong
methanol nhưng những oligomer với DP lớn hơn 5 thì ít hoà tan hơn. Trong trường
hợp với các chitosan trọng lượng phân tử thấp (Lower Molecular Weight Chitosan,

LMWC, M
w
< 1,5 x 10
3
Da) thì độ hoà tan trong nước cao và thể hiện trên một
phạm vi pH rộng [15][16][17].
Chitooligosaccharide (COS) được biết đến với nhiều hoạt tính sinh học như
kháng nấm, kháng khuẩn, kháng ung thư, tác động tăng cường miễn dịch, tác dụng
chống lại sự nhiễm trùng [16][17]. Mặt dù COS có hoạt tính sinh học mạnh trong
nghiên cứu in vitro, nhưng lại có rất ít thông tin về khả năng gây độc và hoạt tính
sinh học của COS trong cơ thể con người. Tuy nhiên, các thí nghiệm về độc tính
7

của COS trên chuột cho thấy rằng COS không gây ra bất kỳ tỷ lệ tử vong, hoặc thay
đổi các thành phần hoá học trong máu, cũng như trong phân tích nước tiểu và trọng
lượng của chuột. Do đó, có thể coi COS không có độc tính và tác dụng phụ cấp tính
ở người. Hơn nữa, kết quả mô học cho thấy COS không gây ra bất kỳ tổn thương ở
các mô của chuột trong phạm vi liều thử nghiệm của COS. Ngoài ra, Rajapakse và
cộng sự báo cáo trường hợp không có tác dụng độc hại của COS ở 0,050 mg/ml – 1
mg/ml trên người và dòng tế bào bạch cầu chuột. Những phát hiện này tiếp tục
khẳng định rằng ở liều lượng của COS sẽ không gây ra bất kỳ tác dụng phụ không
mong muốn, ít nhất là ở động vật [29].
1.2 Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Từ trước tới nay, đã có những nghiên cứu cho thấy chitosan có hiệu quả
trong việc ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, khả năng kháng khuẩn của chitosan
phụ thuộc vào khối lượng phân tử, nồng độ, độ nhớt, loại vi khuẩn. Tsai và cộng sự
(2002) công bố chitosan ức chế hoàn toàn vi khuẩn E.coli ở nồng độ 100 ppm,
Bacillus cereus CCRC10250 ở nồng độ 200 ppm [30]. Carolyn (1979) công bố hoạt
tính kháng nấm của chitosan và chitin [7].
COS còn có khả năng bắt gốc tự do và kháng oxy hóa, hoạt tính này phụ

thuộc trọng lượng phân tử. Năm 2004, Je, Park và Kim báo cáo rằng COS với độ
deacetyl hóa cao (90%) thích hợp hơn trong việc bắt DPPH, hydroxyl, superoxide
và các gốc tự do có carbon trung tâm. Các nghiên cứu của Huang, Mendis và Kim
(2005) cho thấy khả năng thu hút ion kim loại của COS có ảnh hưởng rất lớn đến sự
8

bắt gốc hydroxyl của COS [20]. Các nghiên cứu của Kim và Thomas (2007) [13],
Chen và cộng sự (2003) [8], Ngo, Kim và Kim (2008) [22] cũng cho thấy khả năng
chống oxi hóa của COS.
Nghiên cứu của Je và Kim (2006) [21], Ngo và các đồng sự (2012) [23][18]
đã tổng hợp các dẫn xuất của chitosan, COS cho thấy hoạt tính chống oxy hóa, bảo
vệ tế bào được nâng cao.
Chitosan các dẫn xuất của chúng còn có hoạt tính ức chế ung thư di căn, một
vài công trình nghiênc cứu như: Qin và các đồng nghiệp (2004) [27][28], Hongbin
và cộng sự (2004) [12], Rajapakse và Mendis (2007) [29], Kim và Kim (2006) [14],
Ngo, Kim và Kim (2006) [24].
Chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng còn có khả năng kích thích tăng
trưởng động vật như: Vitastim là hỗn hợp gồm 10 loại oligosaccharide khác nhau do
các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu có thể kích thích khả năng kháng bệnh, ngăn
ngừa bệnh cho các loại thủy sản: tôm, cua, sò, cá…Nhiều nghiên cứu cho thấy
chitooligosaccharide có khả năng kích hoạt tính lysozyme ngoại bào cũng như kích
thích sự phát triển của tế bào cơ trơn giúp cho mạch máu lưu thông dễ dàng [9].
Hơn nữa oligoglucosamine còn có thể kích thích hoạt tính chitosanase ở thực
vật. Hiroshi Inui và cộng sự (2008) dùng môi trường có chứa oligoglucosamine
nuôi mô sẹo lúa nhận thấy hoạt tính chitosanase tăng nhanh và đạt đỉnh sau 2 ngày.
Mặc khác, khi xử lí mô sẹo lúa với oligosaccharide Shinyu và cộng sự (2002) cũng
cho kết quả tương tự.
9

Ngoài ra, chitooligosaccharide còn được ứng dụng trong thực phẩm chức

năng. Thực phẩm chức năng được chia làm 3 nhóm lớn probiotics, prebiotics và
biogenics. Thông thường probiotics là các oligosaccharides. Những nghiên cứu gần
đây cho thấy COS có ảnh hưởng tích cực lên sự phát triển của vi khuẩn bifido và vi
khuẩn lactic [15].
1.3 Các nghiên cứu trong nƣớc
Hiện nay, các nghiên cứu về COS và cách tạo ra các dẫn xuất của chúng để
nâng cao hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính kháng oxi hóa và ức chế matrix
metalloproteinase (MMP) còn rất hạn chế và ít hoặc chưa được công bố. Điều này
còn rõ hơn ở Việt Nam vì cho đến nay, chưa có một công bố nào tại Việt Nam cho
thấy COS và các dẫn xuất của chúng có hoạt tính chống oxi hóa và ức chế MMP-2,
MMP-9 mà hầu hết các nghiên cứu chủ yếu về thu nhận oligoglucosamine, các
nghiên cứu ứng dụng của COS trên đối tượng thực vật và kháng vi sinh vật.
Từ những năm 1999, tác giả Nguyễn Anh Dũng và Nguyễn Tiến Thắng đã
thu nhận oligoglucosamine có DP từ 8-16 bằng phương pháp thủy phân enzyme và
hóa học [2]. Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự (2000) nghiên cứu chế tạo oligochitosan
bằng phương pháp chiếu tia lên chitosan [4].
Nguyễn Anh Dũng (2003, 2004) nghiên cứu ảnh hưởng của
oligoglucosamine đến kích thích sinh trưởng, tăng năng suất và tăng cường khả
năng kháng bệnh trên thực vật [1][25]. Phạm Thị Lệ Hà, Nguyễn Quốc Hiến (2002)
nghiên cứu khả năng kháng nấm gây bệnh phồng lá chè bằng chitosan chiếu xạ [3].
10

Nguyễn Anh Dũng, Võ Thị Phương Khanh (2004) nghiên cứu khả năng kháng nấm
Fusarium oxysporum của oligoglucosamine và salicyden-glucosamine,
oligoglucosamine cải biến [33]. Phạm Thị Ánh Hồng và các cộng sự (2008) đã thu
nhận được COS và tạo dẫn xuất glucose-COS, glucosamine-COS với quy mô phòng
thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn và bước đầu ứng dụng trong bảo quản thực
phẩm [5]. Ngoài ra, chúng tôi đã thành công trong việc cải biến chitosan bằng cách
gắn một số aldehyde và ammonium bậc bốn, kết quả cho thấy có sự gia tăng hoạt
tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxi hóa) một cách đáng kể so với

chitosan ban đầu [6][32].
1.4 Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, ở Việt Nam và trên thế giới, khuynh hướng sử dụng các chất có
nguồn gốc sinh học được thu nhận từ các nguyên liệu tự nhiên để tạo thành các chế
phẩm sinh học không gây độc hoặc ít độc, ứng dụng cho các lĩnh vực khác nhau
như y dược, chăn nuôi, nông nghiệp, chế biến thực phẩm…, nhằm tạo ra các sản
phẩm sạch, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khỏe cộng đồng đang
được chú trọng. Một trong những hoạt chất sinh học có ưu điểm trên là các chế
phẩm chitin, chitosan, COS và các dẫn xuất của chúng. Trên thế giới, việc nghiên
cứu, ứng dụng chitosan, COS trong chăn nuôi và thực phẩm như là một thực phẩm
chức năng đã được ứng dụng trong sản xuất trong những năm gần đây.
Riêng đối với Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các hoạt tính của
chitosan, COS, dẫn xuất từ COS mà đặc biệt là hoạt tính chống oxi hóa và ức chế
11

MMP-2, -9 –enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình di căn của ung thư-
còn chưa được nghiên cứu nhiều.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó, việc nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa và
ức chế ung thư di căn của các dẫn xuất từ COS bằng cách cải biến COS nhằm nâng
cao hoạt tính sinh học vốn có của COS và hướng tới ứng dụng trong thực phẩm
chức năng và y dược là hết sức cấp thiết.
1.5 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn
Nghiên cứu hoạt tính kháng oxi hóa và ức chế MMP-2, -9 (đây là enzyme
đóng vai trò quan trọng trong quá trình di căn của ung thư), của các dẫn xuất mới
của COS là rất mới mẻ, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao không chỉ đối với Việt
Nam mà cả đối với thế giới trong việc nâng cao giá trị của các sản phẩm có nguồn
gốc từ tự nhiên. Hơn nữa, từ những thử nghiệm hiệu quả kháng oxi hóa và ức chế
MMP-2 và MMP-9 trên dòng tế bào nuôi cấy (HT1080) của các dẫn xuất của COS
hướng đến tạo ra chế phẩm thực phẩm chức năng bổ sung và ngăn ngừa các bệnh
nan y là một trong những khuynh hướng hiện nay, gắn kết nghiên cứu khoa học cơ

bản, phát triển và ứng dụng những kết quả, thành tựu đó vào thực tế sản xuất và đời
sống.
12

2 CHƢƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu thu nhận chitooligosaccharide với trọng lƣợng
phân tử từ 1-3 kDa và 3-5 kDa bằng màng siêu lọc UF
- Chitosan được thu mua từ Công ty ChitoWorld (khu Công Nghiệp Tân
Tạo, Lô 27, Phường Tân Tạo, Quận Bình Tân, Tp. Hồ Chí Minh) có độ
deacetyl hóa 85% (kèm theo phụ lục).
- Cellulase có tên thương mại BioLab, Singapore được cung cấp bởi Công
ty trách nhiệm hữu hạn Gia Tường, Bình Dương.
Khảo sát tỉ lệ pha loãng enzyme; pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng; độ bền
enzyme trong quá trình thủy phân chitosan.
Xác định tỷ lệ các phân đoạn COS thu được qua máy lọc tiếp tuyến ở những
khoảng thời gian thủy phân khác nhau: sử dụng phổ
1
H-NMR và công thức của
Lavertu và công sự (2003) để xác định độ deacetyl hóa của COS; sắc ký gel GPC
để xác định khôi lượng phân tử của COS.
2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu cải biến chitooligosaccharide tạo dẫn xuất
Tạo dẫn xuất N-aryl chitooligosaccharide: dẫn xuất COS với aldehyde thơm
được tạo bằng phản ứng giữa nhóm –NH2 ở vị trí C-2 của glucosamine với nhóm –
CHO của aldehyde. Quá trình tổng hợp này gồm 2 giai đoạn: hình thành base Schiff
và khử amin hóa với sự hỗ trợ của sodium cyanoborohydride hoặc sodium
borohydride (NaBH
4
).
13

Phương trình phản ứng như sau:

Tạo dẫn xuất N,O-aminoethyl chitooligosaccharide: các hợp chất alkyl
halogen có thể được dùng để cải biến một cách khá chuyên biệt các nhóm hydroxyl
trong carbohydrate, các polymer và các phân tử khác mà cụ thể ở đây là các gốc
đường glucosamine. Sự cải biến các nhóm hydroxyl có thể được thực hiện trong
điều kiện: 3 – 10 M NaOH, từ 35
o
C đến 50
o
C trong khoảng từ 1,5 đến 4 giờ [10].
Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm chitooligosaccharide cải biến:
xác định mức độ phân nhánh bằng phương pháp ninhydrin, cấu trúc bằng phổ IR và
NMR, độ tinh sạch bằng sắc kí bản mỏng.
2.3 Nội dung 3: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa của COS và dẫn xuất
Sử dụng phương pháp năng lực khử của Yen và Chen (1995) và kháng gốc tự
do DPPH bằng phương pháp của Shimada và cộng sự (1992).
2.4 Nội dung 4: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa lipid, protein màng, bảo
vệ DNA của COS và dẫn xuất
Xác định mức độ gây độc đối với tế bào nuôi cấy HT1080 theo phương pháp
MTT được mô tả bởi Hansen, Neilsen và Berg (1989) [11].
Hoạt tính kháng oxi hóa lipid theo phương pháp TBA (2-thiobarbituric acid)
được Niranjan Rajapakse và Se-Kwon Kim (2006) cải biến [29].
NaBH
4
14

Hoạt tính kháng oxi hóa protein màng theo phương pháp của Kim và cộng sự
(2010) [19].
Hoạt tính bảo vệ DNA được thực hiện trên cơ sở của Milne và cộng sự

(1993) nhưng có cải biên theo quy trình của Ngo D.N. (2008) [20].
2.5 Nội dung 5: Thử nghiệm hoạt tính ức chế matrix metalloproteinase
(MMP) của COS và một số dẫn xuất
Sàng lọc ban đầu những hợp chất có hoạt tính ức chế MMP bằng phương
pháp đo đường kính vòng phân giải gelatin.
Xác định hoạt tính theo phương pháp Zymography [26].
 Các số liệu được tính toán theo 3 lần thí nghiệm lặp lại (n=3) suy ra sai số
chuẩn (± standard error).
15

3 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu thu nhận chitooligosaccharide
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ở tỉ lệ pha loãng 100 lần phù hợp
cho quá trình thủy phân chitosan. Điều kiện cho quá trình thủy phân như sau: pH
6,0, nhiệt độ 55
o
C và thời gian là 5 giờ 30 phút. Hoạt tính của enzyme từ 30 phút
đến 2 giờ 30 phút giảm nhẹ từ 7 - 17%, đến khoảng 6 giờ hoạt tính của enzyme
giảm còn lại 58,46%. Thời gian thủy phân thích hợp và ngắn nhất để thu nhận phân
đoạn 1000 – 3000 Da là 3 giờ (21,94%) và phân đoạn 3000 – 5000 Da là 1 giờ
(22,37%).
Kết quả sắc ký GPC và phổ
1
H-NMR của các phân đoạn COS cho thấy: phân
đoạn COS 1000 – 3000 Da có trọng lượng phân tử trung bình là 1424 Da với độ
deacetyl hóa 73%; phân đoạn COS 3000 – 5000 Da có trọng lượng phân tử trung
bình là 3519 Da với độ deacetyl hóa là 83 %.
3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu cải biến chitooligosaccharide tạo dẫn xuất
3.2.1 Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất N-aryl chitooligosaccharide
Dung dịch COS 1% có pH 5 được cho thêm dung dịch aldehyde theo tỷ lệ từ

1- 2,5% tùy từng hợp chất, khuấy ở nhiệt độ 32
o
C để phản ứng hình thành tối đa
dạng base Schiff. Sau đó thêm 0.1g NaBH
4
làm tác nhân khử khuấy thêm cho đủ 24
giờ. Sau đó pH của dung dịch phản ứng được điều chỉnh lên pH 7 bằng dung dịch
NaOH 15%. Ly tâm thu lấy dẫn xuất và rửa sạch nhiều lần bằng nước cất rồi rửa
16

dẫn xuất nhiều lần với ether để loại bỏ các aldehyde không phản ứng. Sau cùng dẫn
xuất COS được đem sấy ở 40
o
C thu được dạng bột.
3.2.1.1 Dẫn xuất N-benzyl chitooligosaccharide (BCOS)
Kết quả nghiên cứu điều kiện cho quá trình tổng hợp dẫn xuất BCOS như
sau:
- pH = 5,0, hiệu suất tổng hợp đạt 3,65% và độ thay thế đạt 72,77%.
- Nhiệt độ: 32
o
C, hiệu suất tổng hợp là 4,5%, độ thay thế 56,84%.
- Tỉ lệ 1g COS và 2ml benzaldehyde, hiệu suất tổng hợp cao đạt 5,5% và
độ thay thế cao nhất đạt 72,65%.
- Thời gian tổng hợp liên tục trong 24 giờ.
Dẫn xuất BCOS sau khi được tổng hợp ở điều kiện xác định trên được tiến
hành đánh giá độ tinh sạch bằng sắc ký TLC, kết quả cho thấy không xuất hiện vết
benzaldehyde ở BCOS. Kết quả phổ IR và
1
H-NMR cho thấy chúng tôi đã tổng hợp
thành công dẫn xuất BCOS.

3.2.1.2 Dẫn xuất N-methylbenzyl chitooligosaccharide (MBCOS)
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện pH, nhiệt độ và tỉ lệ
aldehyde:COS lên hiệu suất tổng hợp và độ thay thế của MBCOS như sau:
- pH = 5,0 với hiệu suất là 50% và độ thay thế 7,08%.
- Nhiệt độ ở 32
o
C hiệu suất tổng hợp cao nhất 62,60% và độ thay thế cao
nhất đạt 7,76%.
17

- Tỉ lệ 1g COS và 2ml 4-methyl benzaldehyde đạt hiệu suất 61,53% với độ
thay thế 7,15%.
- Thời gian tổng hợp là 24 giờ.
Kết quả sắc ký TLC, phổ IR,
1
H-NMR cho thấy chúng tôi đã tổng hợp thành
công dẫn xuất MBCOS, dẫn xuất không còn lẫn chất gắn 4-methyl benzaldehyde.
3.2.1.3 Dẫn xuất N-dimethylaminobenzyl chitooligosaccharide (DMABCOS)
Tương tự như các dẫn xuất trên, kết quả nghiên cứa điều kiện tổng hợp là:
- pH = 5,0 đạt hiệu suất 62,73% và độ thay thế là 22,89%.
- Nhiệt độ 32
o
C, hiệu suất đạt 64,13%, độ thay thế là 16,78%.
- Tỉ lệ 1g COS và 2g -dimethylamino benzaldehyde đạt độ thay thế
26,2%.
- Thời gian tổng hợp là 24 giờ.
Sắc ký TLC, phổ IR,
1
H-NMR cho kết quả tổng hợp thành công dẫn xuất
DMABCOS ở điều kiện như trên, sản phẩm không còn lẫn chất gắn.

3.2.1.4 Dẫn xuất N-cinnamyl chitooligosaccharide (CCOS)
Kết quả nghiên cứu cho điều kiện tổng hợp dẫn xuất CCOS như sau:
- pH = 4,5 hiệu suất tổng hợp 22,39% và độ thay thế 42,87%.
- Tỉ lệ 1:1, độ thay thế đạt 70,04% hiệu suất là 61,95%.
- Thời gian tổng hợp 24 giờ, nhiệt độ 32
o
C.
18

Để kiểm tra độ tinh sạch cũng như cấu trúc dẫn xuất CCOS, chúng tôi tiến
hành chạy sắc ký TLC và phổ IR,
1
H-NMR, kết quả cho thấy đã tổng hợp thành
công dẫn xuất CCOS, sản phẩm không còn lẫn N-cinnamaldehyde.
3.2.1.5 Dẫn xuất N-(4-hydroxybenzyl) chitooligosaccharide (HBCOS)
Kết quả khảo sát điều kiện tổng hợp dẫn xuất HBCOS như sau:
- pH = 5,0, hiệu suất đạt 43,53% và độ thay thế đạt 90,99%.
- Tỉ lệ COS : 4-hydroxybenzaldehyde là 1:2,5 với hiệu suất 50,57% và độ
thay thế 83,96%.
- Tổng hợp ở nhiệt độ phòng và thời gian là 24 giờ.
Sắc ký TLC, phổ IR,
1
H-NMR cho kết quả chúng tôi đã tổng hợp thành công
dẫn xuất CCOS, không còn lẫn chất gắn.
3.2.2 Nghiên cứu tạo dẫn xuất N,O-aminoethyl chitooligosaccharide (AECOS)
Tương tự như tổng hợp dẫn xuất N-aryl COS, chúng tôi tiến hành khảo sát
điều kiện về hàm lượng NaOH, nhiệt độ cho quá trình tổng hợp dẫn xuất AECOS,
kết quả như sau: 0,2g COS và NaOH 3M cho hiệu suất đạt cao nhất 78%; tổng hợp
đạt hiệu suất cao nhất 85% ở nhiệt độ 50
o

C. Kết quả sắc ký TLC cho thấy sản phẩm
không còn lẫn aminoethyl; từ phổ IR và
1
H-NMR, chúng tôi đã tổng hợp thành công
dẫn xuất AECOS.
19

3.3 Nội dung 3: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa của COS và dẫn xuất
3.3.1 Hoạt tính kháng oxi hóa của COS 1000 – 3000 Da và COS 3000 – 5000
Da
Trong giới hạn các nồng độ được khảo sát thì năng lực khử của COS 1000 –
3000 Da đều cao hơn nhiều so với COS 3000 – 5000 Da. Tại nồng độ 1000 g/ml,
năng lực khử của COS 1000 – 3000 Da cao hơn COS 3000 – 5000 Da 3 lần. Ở nồng
độ chất khảo sát từ 200 g/ml đến 500 g/ml, tỷ lệ gốc tự do DPPH bị trung hòa bởi
COS 1000 – 3000 Da nhiều hơn so với COS 3000 – 5000 Da. Do đó COS 1000 –
3000 Da dùng để tổng hợp các dẫn xuất cho thí nghiệm kháng oxi hóa.
3.3.2 Năng lực khử của chitooligosaccharide và dẫn xuất
Thực nghiệm cho thấy ở nồng độ khảo sát 500 g/ml, năng lực khử của
HBCOS (1,400), MBCOS (0,053) và DMABCOS (0,089) cao hơn COS lần lược là
64; 2,4 và 4 lần. Dẫn xuất AECOS cũng có năng lực khử cao, giá trị mật độ quang ở
nồng độ 500 µg/ml là 0,992.
So sánh năng lực khử của COS và các dẫn xuất với các chất kháng oxy hóa
đối chứng thì có sự chênh lệch tương đối lớn. Trong đó, năng lực khử của AECOS
và HBCOS là mạnh nhất. Ở nồng độ 500 µg/ml, năng lực khử của AECOS bằng
39,91% so với vitamin C và bằng 48,25% so với BHA. Cũng ở nồng độ 500 g/ml,
năng lực khử của HBCOS bằng 60,61% so với vitamin C và bằng 73,26% so với
BHA.
20

3.3.3 Hoạt tính kháng gốc DPPH của chitooligosaccharide và dẫn xuất

Trong khoảng giới hạn nồng độ khảo sát, hiệu suất bắt gốc tự do DPPH ở
nồng độ 200 g/ml và 1000 g/ml của BCOS lần lượt là 7,48% và 33,36%; của
CCOS là 4,01% và 16,54%; của DMABCOS là 39,14% và 85,27%; của MBCOS là
20,20% và 76,73%. AECOS và HBCOS lần lượt có hiệu suất bắt gốc DPPH đạt
83,08% và 77,19% ở nồng độ 100 g/ml; 90,93% và 79,73% ở nồng độ 500 g/ml.
Giá trị IC50 của CCOS và BCOS không xác định được trong khoảng giới
hạn của nồng độ khảo sát. Kết quả cho thấy, ngoài CCOS và BCOS, giá trị IC50
của COS là lớn nhất 655,90. IC50 của các dẫn xuất còn lại đều nhỏ hơn, IC50 của
AECOS nhỏ hơn 10,8 lần, của DMABCOS là 1,9 lần, của HBCOS là 89,8 lần và
của MBCOS là 1,2 lần.
3.4 Nội dung 4: Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa lipid, protein màng, bảo
vệ DNA của COS và dẫn xuất
3.4.1 Khảo sát khả năng gây độc của COS 1000 – 3000 Da và dẫn xuất đối với
dòng tế bào HT1080
3.4.1.1 Tế bào được nuôi trong điều kiện có huyết thanh
Kết quả thí nghiệm MTT cho thấy, trong điều kiện có huyết thanh, COS và
đa số các dẫn xuất đều không gây độc cho tế bào ở tất cả các nồng độ khảo sát. Ở
những nồng độ cao như 500 ppm hay 1000 ppm, mật độ tế bào có giảm nhưng
không nhiều. Riêng dẫn xuất AECOS, gây độc cho tế bào ở nồng độ từ 250 ppm trở
lên (mật độ tế bào còn lại dưới 50%).
21

3.4.1.2 Tế bào được nuôi trong điều kiện không có huyết thanh
Tương tự như trong trường hợp có huyết thanh, trong trường hợp không có
huyết thanh cũng chỉ có AECOS là gây độc cho tế bào ở nồng độ từ 250 ppm trở
lên. COS và các dẫn xuất còn lại đều không gây độc cho tế bào ở các nồng độ khảo
sát.
Từ kết quả MTT của cả hai điều kiện nuôi cấy có huyết thanh và không có
huyết thanh, chúng tôi có thể kết luận độ gây độc của COS và dẫn xuất đối với dòng
tế bào HT1080 đều ở mức thấp. Do vậy, có thể sử dụng các chất thử nghiệm với các

nồng độ đã khảo sát cho các thí nghiệm khác trên tế bào HT1080.
3.4.2 Hiệu quả kháng oxi hóa lipid của chitooligosaccharide và dẫn xuất
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hầu hết ở tất cả các nồng độ khảo sát hoạt tính
của dẫn xuất đều cao hơn so với COS. Hiệu quả kháng oxi hóa lipid màng của
HBCOS và MBCOS cao nhất ở nồng độ 50 ppm, đạt 94,11% và 60,98%. Hiệu quả
kháng oxi hóa lipid của DMABCOS cao nhất ở nồng độ 100 ppm, đạt 55,10%. Ở
những nồng độ cao, hiệu quả kháng oxi hóa của các chất thử nghiệm đều giảm.
3.4.3 Hiệu quả kháng oxi hóa protein màng của chitooligosaccharide và dẫn
xuất
Khả năng kháng oxi hóa protein tế bào cao nhất của COS và AECOS đạt
được ở nồng độ 100 g/ml là 42,22% và 84,71%; HBCOS và MBCOS đạt được ở
nồng độ 50 g/ml là 62,07% và 55,56%; DMABCOS đạt được ở nồng độ 10 ppm là
54,55%. Tại nồng độ 1 ppm, AECOS có thể ức chế trên 50% sự oxi hóa protein và
22

HBCOS cũng có thể ức chế 50% sự oxi hóa protein ở nồng độ 23,13 ppm. Như
vậy, dẫn xuất tổng hợp được có hoạt tính kháng oxi hóa protein cao hơn so với COS
ban đầu. Tuy nhiên, ở những nồng độ cao, chất thử nghiệm lại có hiệu quả kháng
oxi hóa protein kém hơn.
3.4.4 Khả năng bảo vệ DNA bộ gen
3.4.4.1 Khảo sát nồng độ H
2
O
2
và Fe
2+
để phá hủy toàn bộ DNA genome có nồng
độ xác định
Để xác định khả năng kháng oxi hóa DNA, trước tiên cần phải xác định nồng
độ H

2
O
2
và Fe
2+
thích hợp để phá hủy toàn bộ DNA bộ gene. Kết quả điện di DNA
được xử lý với H
2
O
2
0,2mM và Fe
2+
10mM trên gel agerose 1% cho thấy toàn bộ
DNA bộ gene đều bị phân mảnh, băng điện di kéo vệch và biến mất khi so sánh với
mẫu DNA đối chứng.
3.4.4.2 Đánh giá khả năng bảo vệ DNA của các dẫn xuất
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
- AECOS 1 – 3kDa có khả năng bảo vệ DNA tốt nhất ở nồng độ 50 ppm,
mức độ nguyên vẹn của DNA được bảo vệ bởi dẫn xuất đạt 56,23%.
- Ở nồng độ 5 ppm, DMABCOS 1 – 3kDa có khả năng giữ nguyên vẹn
DNA bộ gen đến 75,06%.
- Nồng độ HBCOS 1 – 3kDa có khả năng bảo vệ DNA tốt nhất là 10 ppm,
giữ nguyên vẹn DNA bộ gen.
23

- Dẫn xuất MBCOS 1 – 3kDa có khả năng bảo vệ DNA bộ gen nguyên
vẹn, từ nồng độ 5 ppm đến 50 ppm, mức độ nguyên vẹn của DNA có thể
đạt được 100%.
3.5 Nội dung 5: Thử nghiệm hoạt tính ức chế matrix metalloproteinase
(MMP) của COS và một số dẫn xuất

3.5.1 Hoạt tính ức chế MMP của COS 1000 – 3000 Da và COS 3000 – 5000 Da
Căn cứ vào số liệu thống kê đường kính vòng phân giải ở các dãy nồng độ xử
lý so với vòng phân giải của mẫu chứng dương (mẫu collagenase không được xử lý
với COS), nhận thấy COS phân đoạn 3000 - 5000 Da có hoạt tính ức chế
collagenase mạnh hơn phân đoạn COS 1000 – 3000 Da, phân đoạn COS 1000 –
3000 Da hầu như không có hoạt tính. Do vậy, phân đoạn COS 3000 – 5000 Da được
chọn để tổng hợp dẫn xuất theo các điều kiện tối ưu đã xác định ở mục 3.2.
3.5.2 Hoạt tính ức chế matrix metalloproteinase của dẫn xuất tổng hợp từ
phân đoạn COS 3000 – 5000 Da
Kết quả cho thấy, trong 5 dẫn xuất N-aryl chitooligosaccharide được khảo
sát, chỉ có 3 dẫn xuất CCOS, DMABCOS và HBCOS là có hoạt tính ức chế đối với
hoạt tính thủy phân của collagenase. Hai dẫn xuất CCOS và HBCOS có hoạt tính tỉ
lệ thuận với nồng độ xử lý trong khi DMABCOS thì ngược lại. Nhìn chung, hầu
như các dẫn xuất đều có hoạt tính ức chế collagenase cao hơn so với COS ban đầu.
Trong đó, CCOS là dẫn xuất có hoạt tính mạnh nhất khi ức chế 30,39% hoạt tính
của collagenase ở nồng độ 1000 g/ml. Hai dẫn xuất còn lại có hoạt tính thấp hơn,
24

với hoạt tính ức chế cao nhất chỉ đạt 13,60% khi xử lý HBCOS ở nồng độ 1000
g/ml. Do vậy, dẫn xuất CCOS được chọn để khảo sát hiệu quả ức chế MMP đối
với tế bào HT1080 in vitro.
3.5.3 Hoạt tính ức chế matrix metalloproteinase từ tế bào HT1080 của dẫn
xuất N-cinnamyl chitooligosaccharide (CCOS)
3.5.3.1 Khảo sát khả năng gây độc của COS 3000 – 5000 Da và CCOS 3000 –
5000 Da đối với dòng tế bào HT1080
Tế bào được nuôi trong điều kiện có huyết thanh, kết quả cho thấy dẫn xuất
CCOS không làm giảm đáng kể mật độ tế bào, mật độ tế bào luôn trên 80% ở tất cả
những nồng độ khảo sát.
Đối dới tế bào được nuôi trong điều kiện không có huyết thanh, kết quả cho
thấy mật độ tế bào khi xử lý với CCOS đều trên 80% ở tất cả các nồng độ khảo sát.

Như vậy, vì dẫn xuất CCOS 3000 – 5000 Da không làm giảm đáng kể mật
độ tế bào HT1080 ở tất cả các nồng độ khảo sát, chúng tôi có thể kết luận dẫn xuất
này không gây độc cho tế bào HT1080.
3.5.3.2 Khả năng ức chế MMP-2 và MMP-9 của CCOS 3000 – 5000 Da xác định
bằng phương pháp Zymography
MMPs đóng vai trò quan trọng trong sự thoái biến sinh lý ECM, sữa chữa
mô, hình thành mạch và trong các điều kiện bệnh lý phân giải vượt mức ECM như
viêm mãn tính, viêm khớp, ung bướu và di căn. Hình 3.1 cho thấy CCOS 3000-
5000Da ức chế MPP-2 và MPP-9 cao hơn COS 3000- 5000Da.