Thiết kế vector biểu hiện bước đầu định hướng biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------o0o---------

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN BƯỚC ĐẦU ĐỊNH HƯỚNG BIỆT HÓA
TẾ BÀO GỐC CUỐNG RỐN THÀNH TẾ BÀO GAN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 60420114

Học viên: Lê Bắc Việt
Lớp:

K16-Sinh học

GVHD: TS. Nguyễn Huy Hoàng

Hà Nội, tháng 12 năm 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng – Trưởng
Phòng Hệ gen học chức năng - Viện Nghiên cứu hệ gen, người thầy - người anh
đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những

khó khăn cùng em trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Nguyễn Văn Hạnh và Ths.
Vi Đại Lâm, cán bộ Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ sinh học đã luôn
theo sát giúp đỡ và chỉ bảo cho em trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm.
Qua đây, em cũng rất biết ơn tất cả các cô, các chị thuộc Phòng Hệ gen học
chức năng và Phòng Công nghệ phôi đã chỉ bảo em rất nhiều điều trong thời
gian thực hiện viết luận văn tốt nghiệp.
Em cũng chân thành cảm ơn các thầy, các cô giáo tham gia giảng dạy
tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm
học qua.
Cuối cùng, em xin gửi những lời tri ân tới bố mẹ, những người thân
trong gia đình và bạn bè xung quanh đã chia sẻ những khó khăn thử thách
trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên

Lê Bắc Việt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU .................................................. vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4
1. TẾ BÀO GỐC ............................................................................................................ 4

1.1. Định nghĩa tế bào gốc .......................................................................................... 4
1.2. Các đặc tính của tế bào gốc .................................................................................. 4
1.3. Phân loại tế bào gốc ............................................................................................. 4
1.3.1. Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa.................................................. 5
1.3.2. Phân loại tế bào gốc theo vị trí thu nhận ....................................................... 5
1.3.3. Phân loại khác ................................................................................................ 7
1.4. Lợi ích của tế bào gốc dây rốn so với các nguồn tế bào khác.............................. 8
1.5. Tế bào gốc trung mô (TBGTM) phân lập từ lớp Wharton-Jelly (WJ) dây rốn
(hWJSCs-human Wharton-Jelly Stem Cells) .............................................................. 9
1.5.1. Cấu tạo dây rốn .............................................................................................. 9
1.5.2. Các nghiên cứu về phương pháp phân lập, nuôi và biệt hóa hWJSCs ........ 10
1.5.2.1. Nghiên cứu về các phương pháp phân lập và nuôi cấy hWJSCs .......... 10
1.5.2.2. Các nghiên cứu về biệt hóa hWJSCs..................................................... 12
1.5.3. Các chỉ thị phân tử của hWJSCs.................................................................. 14
1.5.4. Tính ổn định di truyền của TBG và phương pháp xác định tính ổn định di
truyền ..................................................................................................................... 14
1.6 Biệt hóa tế bào gốc bằng chuyển gen .................................................................. 15
1.6.1 Gen HNF-4α ................................................................................................. 16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

1.6.2 Biệt hóa tế bào gốc trung mô bằng chuyển gen ............................................ 17
PHẦN II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 20
2.1 Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................... 20
2.1.1 Nguyên liệu ................................................................................................... 20
2.1.2 Thiết bị .......................................................................................................... 20
2.1.3 Hóa chất ........................................................................................................ 21
2.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 22
2.2.1 Thu nhận và xử lý dây cuống rốn ................................................................. 22

2.2.2 Phân lập tế bào gốc trung mô cuống rốn ...................................................... 24
2.2.2.1 Phương pháp phân lập tế bào ................................................................. 24
2.2.2.2 Phương pháp cấy chuyển tế bào ............................................................. 24
2.2.2.3 Phương pháp nhuộm sắc thể................................................................... 25
2.2.3 Tách chiết RNA tổng số ............................................................................... 25
2.2.4 Định lượng RNA trong mẫu tách chiết ......................................................... 26
2.2.5 Điện di trên gel agarose ................................................................................ 27
2.2.6 Khuếch đại trình tự mã hóa (CDS) của gen HNF-4α bằng RT-PCR ........... 28
2.2.7 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn ........................................................... 29
2.2.8 Nhân dòng trình tự mã hóa của gen HNF-4α và đọc trình tự ....................... 30
2.2.9. Biến nạp vào tế bào E.coli DH5α ................................................................ 31
2.2.10 Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện trong TBGTM ................................ 32
2.2.11 Nhiễm (transfection) vector tái tổ hợp vào TBGTM cuống rốn ................. 33
2.2.12 Kiểm tra khả năng biểu hiện của các chỉ thị trong tế bào gốc .................... 33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN .............................................................. 34
3.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào ................................................................................. 34
3.2 Phân tích nhiễm sắc thể TBGTM ........................................................................ 37
3.3 Tách chiết RNA tổng số ...................................................................................... 39
3.4 Định lượng RNA tổng số .................................................................................... 40
3.5 Đánh giá đặc tính di truyền của TBGTM sau phân lập bằng RT-PCR............... 41
3.6 Khuếch đại trình tự mã hóa (CDS) của gen HNF-4α .......................................... 45
3.7 Nhân dòng trình tự mã hóa của gen HNF-4α và đọc trình tự ............................. 47
3.7.1 Nhân dòng trình tự mã hóa của gen HNF-4α ............................................... 47
3.7.2 Kết quả phân tích trình tự gen ...................................................................... 49
3.8 Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện trong TBGTM ......................................... 50
3.9 Đánh giá hiệu quả của quá trình chuyển gen ...................................................... 51

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 55
4.1 Kết luận ............................................................................................................... 55
4.2 Kiến nghị ............................................................................................................. 55
PHẦN V. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 56
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DNA
RNA
cDNA
Bp
Kb
bFGF
CHT
CT
DMEM/F12
dNTP
EGF
FBS
HSC
hWJSCs
ICM
IVF
ITS
ICSI
TBGTM

RT – PCR
TBG
WJ
E.coli
Taq
UV
CDS
TAE
OD
NST
hUCM

Deoxyribonucleic acid
Ribonucleic acid
Complement deoxyribonucleic acid
Base pair
Kilo base
Basic fibroblast growth factor
Collagenase / hyaluronidase trypsin
Collagenase/ trypsin
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham 12 medium
Deoxyribonucleotide Triphosphate
Epidermal growth factor
Fetal bovine serum
Hemapoietic stem cell
Tế bào gốc phân lập từ lớp Wharton’s jelly dây rốn người
Inner cell mass
In vitro fertilization
Insulin – transferin - selenium
Intracytop plasmide sperm injecti

Tế bào gốc trung mô
Reverse-transcription Polymerase chain reaction
Tế bào gốc
Wharton’s jelly
Escherichia coli
Thermus aquaticus
Ultra violet (tia cực tím)
Coding sequence (trình tự mã hóa)
Tris-axit axetic-EDTA
Optical density (mật độ quang)
Nhiễm sắc thể
human Umbilical Cord Matrix

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU
Hình 1

Cấu tạo của dây rốn

Hình 2

Cấu trúc vector biểu hiện pCMV-GFP

Hình 3

Mẫu dây rốn trước khi xử lý

Hình 4

Phân lập mảnh mô dây rốn trên đĩa nuôi

Hình 5

Tế bào bắt đầu mọc từ đĩa nuôi không bổ sung FBS

Hình 6

Tế bào phát triển thành những mảng song song, cuộn xoắn và gối lên nhau

Hình 7

Tế bào mọc kín đĩa nuôi

Hình 8

Nhiễm sắc thể ở lần cấy chuyền thứ 2

Hình 9

Điện di đồ tách chiết RNA tổng số

Hình 10

Điện di đồ RT-PCR mẫu TBGTM sau phân lập (A) và đối chứng dương –
tế bào gốc ung thư gan (B)

Hình 11

Điện di đồ RT-PCR khuếch đại CDS của gen HNF-4α

Hình 12

Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pTZ57R/T tái tổ hợp bằng EcoRI

Hình 13

Trình tự được đọc bằng mồi vector (T7 promoter và T7 terminator)

Hình 14

Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pCMV-GFP tái tổ hợp bằng NheI và
EcoRI

Hình 15

Điện di đồ RT-PCR mẫu nuôi cấy 4 tuần sau chuyển gen

Bảng 1

Trình tự oligonucleotide các mồi được sử dụng

Bảng 2

Thành phần phản ứng RT-PCR khuếch đại CDS gen HNF-4α

Bảng 3

Thành phần phản ứng gắn nhân dòng CDS gen HNF-4α

Bảng 4

Thành phần phản ứng cắt với enzyme NheI và EcoRI

Bảng 5

Kết quả đo mật độ quang (OD) của các mẫu RNA tách chiết

Bảng 6

Thống kê biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong tế bào gốc

Bảng 7

Sự biểu hiện của các chỉ thị phân tử trong TBGTM sau các lần cấy chuyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

MỞ ĐẦU
Tế bào gốc (TBG) là tế bào tiềm năng trong cơ thể. Khả năng biệt hóa
cho phép TBG có thể phân chia phát triển thành tất cả các loại tế bào chuyên
hóa. Với đặc điểm này, TBG có thể được khai thác với nhiều ứng dụng.
Nhiều nghiên cứu ứng dụng TBG trong lĩnh vực y sinh học đã được thực
hiện nhằm điều trị các bệnh nan y khác nhau như: tiểu đường, liệt do chấn
thương tuỷ sống, suy tim do tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý
gen…. Đặc biệt, trong chuyên khoa huyết học, TBG có thể điều trị trên 70 loại

bệnh lý huyết học khác nhau liên quan đến tổn thương cơ quan tạo máu, một số
bệnh di truyền bẩm sinh về chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu….
TBG còn được sử dụng trong các chuyên ngành khác như: thẩm mỹ, trong
nghiên cứu dược lý [39,40]. Nói cách khác, TBG mở ra một hướng phát triển,
biện pháp chữa trị mới với những căn bệnh đến giờ vẫn vô phương cứu chữa,
thắp sáng hy vọng về tiềm năng y học của kỹ thuật tái sinh.
Trước đây, nguồn TBG sử dụng cho các nghiên cứu chủ yếu là TBG phôi
[1]. Nhưng vì phải lấy các TBG này từ phôi cho nên phần lớn các Giáo hội công
giáo và chính trị gia đã phản đối gay gắt vì cho rằng đây là vấn đề xâm phạm
đến đạo đức, niềm tin tôn giáo [1]. Để tìm hướng giải quyết mới cho vấn đề
này, các nhà khoa học đã tìm ra TBG từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó có
TBG từ người trưởng thành. TBG trưởng thành là TBG đa năng, có khả năng
biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau. Tuy nhiên, việc thu thập TBG gặp
phải khó khăn khi lượng tế bào thu được rất ít, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe,
già và khó biệt hóa [2]. Người ta cũng đã tìm thấy một loại TBG đa năng trong
dây rốn của trẻ sơ sinh (TBG nhũ nhi), đây được cho là một phát hiện quan
trọng vì có thể thu thập TBG từ dây rốn - vốn được coi là một loại rác thải y tế
[2].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

TBG dây rốn cũng có đầy đủ tính chất của một TBG đa năng như TBG
tủy xương (TBG tủy xương thuộc loại TBG trưởng thành) [11]. Hiệu quả ứng
dụng trong lâm sàng cao hơn vì việc thu thập TBG dây rốn khá dễ dàng, an
toàn, không ảnh hưởng đến sức khỏe của mẹ và con, có thể chủ động kiểm soát
tình trạng nhiễm các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C qua
việc xét nghiệm trước sinh đối với sản phụ,… ( Bên cạnh
đó, tế bào gốc có khả năng biệt hóa và khả năng tự làm mới. Biệt hóa là khả

năng tạo ra các tế bào chuyên hóa trong cơ thể trong khi tự làm mới là quá trình
duy trì tính gốc không đổi qua các thế hệ tế bào [3][35]. Nhờ đó, biệt hóa tế bào
gốc thành các dạng tế bào chuyên hóa khác đang là hướng nghiên cứu có tiềm
năng ứng dụng cao. Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống
rốn thành tế bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân viêm gan
và ung thư gan [4,5]. Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình
biệt hóa thành từ TBGTM cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ
hơn. Bên cạnh những tác nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào
gốc như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth
factor) [41], một số yếu tố phiên mã, ví dụ như gen HNF-4α, cũng đang được
tập trung nghiên cứu. Từ đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Thiết kế
vector biểu hiện bước đầu định hướng biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế
bào gan” để hoàn thiện quy trình thiết kế vector biểu hiện và chuyển vector vào
tế bào gốc cuống rốn bước đầu biệt hóa thành tế bào gan phục vụ cho các
nghiên cứu sau này. Để hoàn thành được đề tài này, chúng tôi cần thực hiện
những mục tiêu như sau:
1. Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mẫu cuống rốn.
2. Nhân dòng trình tự mã hóa gen HNF-4α ở người và tái tổ hợp trong
vector biểu hiện trong tế bào động vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

3. Kiểm tra khả năng biểu hiện của HNF-4α trong TGBTM sau chuyển
gen
Cuối cùng, nghiên cứu được thực hiện trích kinh phí từ đề tài “Derivation
of hepatocyte-like cells from human umbilical cord matrix stem cell by HNF-4α
transfection” do quỹ TWAS, và đề tài nghiên cứu cơ sở cấp cho TS. Nguyễn
Văn Hạnh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TẾ BÀO GỐC
1.1. Định nghĩa tế bào gốc
Tế bào gốc là tế bào có khả năng biệt hóa và khả năng tự làm mới. Biệt
hóa là khả năng tạo ra các tế bào chuyên hóa trong cơ thể trong khi tự làm mới
là quá trình duy trì tính gốc không đổi qua các thế hệ tế bào [3,6]. Nhờ vậy, chỉ
một lượng rất nhỏ các TBG tại các cơ quan trong cơ thể có thể cung cấp liên tục
các tế bào mới thay thế, bổ sung cho các tế bào già yếu hoặc tổn thương cho cơ
thể.
1.2. Các đặc tính của tế bào gốc
TBG có hai đặc tính chính:
Tính tự làm mới (self_renewal): Tế bào đó có khả năng tiến hành một số
lượng lớn chu kì phân bào nguyên nhiễm, mà vẫn duy trì trạng thái không biệt
hóa.
Tính tiềm năng không giới hạn (unlimited potency): TBG có khả năng
biệt hóa thành bất kì kiểu tế bào trưởng thành nào, trên thực tế đặc tính này chỉ
đúng với các tế bào gốc toàn năng hoặc vạn năng, tuy nhiên một TBG đa năng
(hay tế bào tiền thân) cũng nhiều khi được gọi là TBG.
1.3. Phân loại tế bào gốc
Dựa vào các tiêu chí khác nhau mà có những cách phân loại TBG khác
nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

1.3.1. Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa
TBG toàn năng (totipotential stem cell): chúng có tiềm năng cao nhất vì
có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào của cơ thể. TBG toàn năng là hợp tử hay
blastomere (phôi bào).
TBG vạn năng (pluripotential stem cell): là những tế bào có khả năng biệt
hóa thành hầu hết các mô của cơ thể, tiềm năng biệt hóa kém hơn TBG toàn
năng, có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào ngoại trừ tế bào phôi (TBG toàn
năng). TBG vạn năng là khối tế bào bên trong của blastocyst.
TBG đa năng (mutipotential stem cell): dùng để chỉ những tế bào có khả
năng biệt hóa thành nhiều tế bào khác, thường là những TBG thu nhận từ cơ thể
trưởng thành, TBG nhũ nhi cũng là những TBG đa năng.
Ngoài ra, còn có một số TBG một vài tiềm năng, cũng như đơn năng. Ví
dụ: TBG tủy xương tạo ra các loại tế bào máu và cơ chất dưỡng bào (Mast cell
precursor) chỉ cho ra dưỡng bào.
1.3.2. Phân loại tế bào gốc theo vị trí thu nhận
Theo quan điểm của các nhà khoa học Shinya Yamanaka (Đại học Kyoto
của Nhật) và James Thompson (Đại học Wisconsin của Mĩ), TBG được chia
thành năm nhóm chính:
1. TBG phôi (ES - Embryonic stem cell )
ES là TBG thu nhận từ phôi giai đoạn tiền làm tổ - Blastocyst, hầu hết là
các TBG vạn năng. Có thể thu nhận ES từ lớp sinh khối bên trong (ICM), các tế
bào mặt trong của lớp dưỡng bào trophoblast, các tế bào mầm sinh dục (EG) và
gần đây, người ta còn tiến hành thu nhận các TBG từ phôi sớm (trước
blastocyst). Việc thu nhận TBG từ phôi ít nhiều sẽ gặp khó khăn vì liên quan
đến vấn đề về luân lý và pháp lý (phôi người).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

Nguồn phôi cho thu nhận TBG hiện tại chủ yếu từ công nghệ IVF hay

ICSI. Bằng một trong hai kỹ thuật này, từ các tinh trùngvà trứng, phôi được
nuôi, ủ rồi thu nhận TBG ở giai đoạn cần thiết. TBG phôi cũng có thể thu được
từ phôi chuyển nhân, chuyển gen, hay phôi tạo dòng hoặc nhân bản.
2. TBG nhũ nhi
TBG nhũ nhi thường được thu nhận từ các mô của thai bỏ, hay các
phần phụ của thai nhi sau khi sinh như máu dây rốn, dây rốn (màng lót
quanh mạch máu, lớp Wharton’s jelly (lớp WJ), màng lót dây rốn), nước ối,
mô nhau thai, máu nhau thai [7,8,9].
Nguồn TBG thu từ những phần bỏ sau khi sinh như máu dây rốn, dây
rốn, nước ối hay nhau thai chủ yếu là các TBG tạo máu và các TBG trung
mô (TBGTM). Các TBG nhũ nhi thường có tiềm năng biệt hóa ở mức độ đa
năng hay vài tiềm năng, hoặc là các tế bào tiền thân.
3. TBG trưởng thành
TBG trưởng thành là các tế bào được thu nhận từ cơ thể trưởng thành.
Cho đến này, có ngày càng nhiều TBG trưởng thành được xác định. Trong
đó, TBG tủy xương được quan tâm và biết rõ hơn cả, tủy xương được xác
định là nơi cư ngụ của TBG tạo máu, đây là nguồn TBG quan trọng trong cơ
chế điều hòa số lượng tế bào máu. Ngoài ra tủy xương còn chứa TBGTM.
Nguồn tế bào này có tính mềm dẻo cao, chúng có thể biệt hóa, hay chuyển
biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau [10].
4. TBG vạn năng cảm ứng (iPS – TBG vạn năng cảm ứng)
Đây là loại TBG do chính con người tạo ra, nhờ kỹ thuật thao tác gen. Về
nguyên tắc, bất kì tế bào sinh dưỡng (somatic cell) nào đều có thể trở thành iPS,
nhờ chúng được cảm ứng bằng phương pháp chuyển gen in vitro, thông qua một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

vector retrovirus. Khi được kích hoạt, các tế bào sinh dưỡng sẽ khởi động cơ
chế tái thiết lập chương trình bộ gen hay sự khử biệt hóa.

iPS có các ưu điểm hơn hẳn TBG phôi và TBG trưởng thành như: Có
tiềm năng như là các TBG phôi, không vi phạm đạo lý và pháp lý, dễ dàng thu
nhận (có thể tạo ra từ bất kì mô nào đó của cơ thể), thao tác dễ dàng, ít tốn thời
gian, không cần lượng mẫu lớn trên bệnh nhân, cấy ghép không gây phản ứng
miễn dịch .
Việc cảm ứng tế bào đã biệt hóa thành TBG được thực hiện bằng các
phương pháp như sử dụng dịch chiết hay dung hợp tế bào, kĩ thuật chuyển gen.
5. TBG ung thư (CSC)
Được coi là nguồn gốc của khối u và chúng chỉ có trong các khối u. Các
CSC có khả năng tự làm mới và dễ dàng phát triển thành bất kì tế bào nào của
quần thể khối u, chúng có khả năng tăng sinh, hỗ trợ sự tăng sinh tiếp tục của
quần thể tế bào ác tính. Các đặc tính của tế bào phát sinh khối u có hai đặc tính
song hành với hai đặc tính của TBG bình thường .
Các CSC được tạo ra bởi các đột biến từ các TBG bình thường. Tuy
nhiên, môt vài dòng cho thấy rằng CSC cũng tạo ra từ các tế bào tiền thân bị đột
biến [36]. Các tế bào tiền thân này (cũng còn gọi là các tế bào khuếch đại
chuyển – TAC) có thể có khả năng khuếch đại nhưng chúng lại không có khả
năng tự làm mới như TBG [37]. Để tạo thành CSC, tế bào tiền thân phải có sự
tích tụ các đột biến gây nên sự lặp lại, tạo đặc tính làm mới.
1.3.3. Phân loại khác
TBG còn có thể chia theo các nhóm sau đây:
TBG phôi (Embryonic stem cell _ES): được thu nhận từ giai đoạn của
phôi nang (blastocyst) chúng là khối các tế bào bên trong, còn gọi là lớp sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

khối bên trong (inner mass cell_ICM) của phôi nang. TBG phôi có khả năng
phân chia vô hạn trong nuôi cấy và biệt hóa thành các tế bào khác nhau từ ba
lớp phôi. Do vậy, đây là nhóm tế bào vạn năng (pluri potential stem cell) [11].

Tế bào mầm (tế bào gốc sinh dục - Embryonic germ cell_EG): được thu
nhận từ rãnh sinh dục (genital ridge), chúng có tính vạn năng (pluripotent). Các
EG có một số khác biệt so với tế bào ES, các tế baò này được thu nhận tại vị trí
là tiền thân của cơ quan sinh dục sau này [11][34].
TBG ung thư biểu mô phôi (Embryonic carcinoma_EC): có bản chất
giống như các TBG phôi, được thu nhận đầu tiên từ khối u trong tinh hoàn và
buồng trứng ở một số chủng chuột. EC có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào
khác [11][34].
TBG trưởng thành: là loại tế bào chưa chuyên hóa, chúng được tìm thấy
hầu hết ở những mô chuyên biệt trong cơ thể trưởng thành (trong tủy xương,
máu, giác mạc, võng mạc, tủy răng, gan, da, dạ dày và tụy…). Các tế bào này có
thể tự đổi mới và biệt hóa thành những tế bào chuyên biệt [11][34].
1.4. Lợi ích của tế bào gốc dây rốn so với các nguồn tế bào khác
Hiện nay, các nhà khoa học chứng minh rằng dây rốn là nguồn cung cấp
TBG lý tưởng nhất, sỡ dĩ như vậy vì TBG này có rất nhiều ưu điểm vượt trội
[1]:
1. Dễ thu nhận và xử lý TBG, không gây bất kỳ ảnh hưởng gì đến sức khỏe
của cả mẹ và con. Thu hoạch và cất giữ tế bào gốc dây rốn không vi phạm đạo
đức như TBG phôi.
2. Có thể chủ động kiểm soát tình trạng các bệnh truyền nhiễm như HIV,
viêm gan B, viêm gan C… đối với các mẫu TBG bằng các xét nghiệm trước
sinh đối với sản phụ.
3. Về phương diện tuổi phát triển, TBG dây rốn là TBG nhũ nhi, còn rất trẻ
nên khả năng phân chia tốt và số lượng tế bào thu được trực tiếp hoặc sau tăng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

sinh in vitro là rất lớn. Các TBG dây rốn không còn là các TBG phôi do vậy
không còn khả năng tạo ra khối u ác tính như TBG phôi. Đồng thời có thể thu

được nhiều loại TBG bao gồm các TBG trong máu dây rốn (chứa nhiều TBG
tạo máu) và các TBGTM và TBG biểu mô từ màng dây rốn, lớp WJ.
4. TBG từ dây rốn có thể lưu trữ lâu dài để sử dụng điều trị cho chính người
có dây rốn ấy hoặc người thân trong gia đình họ hoặc cho người khác. Xác định
trước được kháng nguyên bạch cầu người (human leukocyte antigen– HLA) và
các đặc điểm khác của mẫu TBG từ trước để họ xem có phù hợp với người
bệnh cần điều trị bằng TBG hay không, từ đó có thể lấy ngay ra để sử dụng cho
điều trị mà không mất thời gian tìm kiếm và xét nghiệm cho tế bào.
5. Các TBG thu được từ dây rốn và nhau thai biểu hiện HLA ở mức thấp và
ít bị đào thải trong cấy ghép. Đây là nguồn TBG quan trọng trong việc thay thế
tủy xương khi không thể tìm được người cho có HLA phù hợp.
Cuối cùng, có thể nhận thấy dây rốn là nguồn TBG lý tưởng xét về khả năng
biệt hóa. TBG dây rốn thuộc loại đa tiềm năng, chúng có thể biệt hóa thành các
loại tế bào như : tế bào máu, tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào sụn, tế bào mỡ,
tế bào gan,…[3].
1.5. Tế bào gốc trung mô (TBGTM) phân lập từ lớp Wharton-Jelly (WJ)
dây rốn (hWJSCs-human Wharton-Jelly Stem Cells)
1.5.1. Cấu tạo dây rốn
Dây rốn là đoạn kết nối giữa rốn của thai nhi và nhau thai bám ở thành tử
cung của người mẹ, có vai trò là cầu nối giữa người mẹ và em bé để vận chuyển
chất dinh dưỡng từ người mẹ chuyển qua đứa trẻ.
Dây rốn thường có chiều dài 50 cm và dày 2 cm, có một tĩnh mạch và hai
động mạch bao quanh bởi các mô nhầy hay gelatin, còn gọi là lớp WJ và được
bọc bởi màng ối. Có thể xác định ba vùng khác nhau của lớp WJ: vùng dưới
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

màng ối, chất nền Wharton, và lớp mô bao quanh các mạch máu. Vùng chất nền
Wharton gồm các phân tử collagen loại I, III, VI nằm ở trong những khoảng

không gian có hình dạng giống như rãnh. Xung quanh rãnh này là các phân tử
collagen loại VI, laminin và heparin sulfate proteoglycan. Các khoảng không
gian chứa đầy chất nền Wharton có dạng rãnh được bao quanh bởi các tế bào
chất nền là các nguyên bào sợi cơ mảnh có dạng ống biểu hiện vimentin, desmin
và actin cơ trơn. Dây rốn giai đoạn sớm chỉ có vimentin và desmin. Cấu trúc và
thành phần của dây rốn giúp bảo vệ các mạch máu khỏi bị nén và cũng có thể
hỗ trợ quá trình trao đổi giữa máu dây rốn và dịch ối (hình 1).

Hình 1. Cấu tạo của dây rốn
Các nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng dây rốn là một nguồn giàu TBG. Có
hai loại TBG đã được xác định trong dây rốn: TBGTM từ lớp WJ, tĩnh mạch,
các vùng xung quanh và giữa các động mạch, vùng dưới màng ối và máu của
dây rốn; TBG tạo máu từ máu dây rốn [8].
1.5.2. Các nghiên cứu về phƣơng pháp phân lập, nuôi và biệt hóa hWJSCs
1.5.2.1. Nghiên cứu về các phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy hWJSCs
Với mục đích nghiên cứu là phát triển các phương pháp thích hợp nhất để
phân lập TBGTM có nguồn gốc từ dây rốn người (hUCM-human umbilical cord
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

matrix). Parvin Salehinejad và cộng sự đã thực hiện bốn nhóm phương pháp để
phân

lập

hWJSCs.

Bao

gồm

ba

nhóm

enzyme:

collagenase/hyaluronidase/trypsin (CHT), collagenase/trypsin (CT) và trypsin
(Trp) và một nhóm nuôi cấy mảnh mô nhỏ (Exp). Ở cả bốn nhóm, đều phân lập
được các tế bào hUCM nhưng số lượng tế bào, khả năng tăng sinh, sự biểu hiện
các chỉ thị… của các tế bào bị cô lập ở các phương pháp là khác nhau.
Phân tích Flow cytometry (dòng tế bào) cho thấy CD44, CD73, CD90 và
CD105 được thể hiện trong tất cả các nhóm, trong khi CD34 và CD45 không
được thể hiện. Các chỉ thị của TBGTM như CD73, CD90 được biểu hiện khác
nhau trong các nhóm khác nhau: CD90 biểu hiện cao nhất ở nhóm CT và Exp;
CD73 biểu hiện cao nhất ở nhóm Exp.
Về khả năng tăng sinh, nhóm Exp có khả năng tăng sinh cao nhất. Với
các nhóm enzyme, các tế bào không tiếp tục tăng sinh sau khoảng 30 ngày nuôi
cấy, nhưng ở nhóm Exp, tế bào có thể kéo dài thời gian tăng sinh tới 80 ngày.
Về thời gian phân lập, chỉ sau 2 – 3 tiếng đồng hồ đã có thể phân lập
được TBG ở phương pháp enzyme, trong khi đó phương pháp Exp phải mất đến
2 – 3 tuần mới quan sát thấy có tế bào mọc ra. Số lượng tế bào ban đầu thu được
nhiều nhất ở nhóm CT (0,5-1 × 104 tế bào/cm lớp WJ), ít hơn ở CHT (0,25 ×
104 tế bào/cm lớp WJ), và ít nhất ở nhóm Trp (1 × 103 tế bào/cm lớp WJ).
Hình thái tế bào giữa nhóm phân lập bằng enzyme và phân lập bằng nuôi
cấy mảnh mô cũng có sự khác nhau. Quần thể tế bào trong nhóm Exp có tính
đồng nhất cao với các tế bào giống nguyện bào sợi chiếm ưu thế. Ở phương
pháp enzyme, quần thể tế bào không đồng nhất, gồm các tế bào giống nguyên
bào sợi với độ dài, ngắn khác nhau và cả các tế bào tròn nhỏ.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

Kết quả ở nghiên cứu trên cho thấy, phương pháp Exp tốn nhiều thời gian
nhưng hiệu quả phân lập TBG là cao nhất. Đối với phân lập bằng enzyme, tùy
vào mục đích phân lập để lựa chọn hỗn hợp enzyme thích hợp.
1.5.2.2. Các nghiên cứu về biệt hóa hWJSCs
Như đã nói ở trên, TBG từ dây rốn nói chung và hWJSCs có rất nhiều ưu
điểm, hiệu quả cao trong ứng dụng trong lâm sàng, vì vậy đã có rất nhiều
nghiên cứu về khả năng biệt hóa đa dòng của hWJSCs.
Năm 2009, tạp chí Cytotherapy (tạp chí chính thức của Hiệp hội quốc tế
về liệu pháp tế bào) cho biết nhóm nghiên cứu thuộc đại học Shantou, Quảng
Đông, Trung Quốc tiến hành cảm ứng TBGTM để biệt hóa thành các tế bào
giống tế bào gan bằng cách bổ sung yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF) và
yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi - 4 (FGF - 4) trong quá trình nuôi cấy.
Phân tích reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) đã
được thực hiện để xác định biểu hiện mRNA của của ba chỉ thị tế bào gan:
ALB, AFP và CK-18. Kết quả cả 3 chỉ thị trên đều biểu hiện. Western blot cũng
được sử dụng để khẳng định cho kết quả này. Phân tích Flow cytometry cho
thấy hWJSCs dương tính với các dấu hiệu TBGTM (CD105, CD90, CD73,
CD29, CD44, CD59) và không biểu hiện các chỉ thị CD45, CD34. Phương pháp
nhuộm PAS (Periodic acid–Schiff) và khảo nghiệm hấp thu LDL (Low-density
lipoprotein) cũng được thực hiện để đánh giá khả năng lưu giữ glycogen và hấp
thu lipoprotein của tế bào biệt hóa. Kết quả cho thấy các tế bào nhuộm màu đỏ
tươi với tỷ lệ phần trăm là 82,9%, tế bào có thể hấp thu LDL với tỷ lệ cao
85,8% [12].
Như vậy, hWJSCs đã được biệt hóa thành công thành tế bào có chức
năng và đặc điểm sinh học giống tế bào gan trong điều kiện in vitro.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

Trong nghiên cứu của mình, Ariff Bongso và Chui-Yee Fong đã thiết lập
một số quy trình biệt hóa thành tế bào xương, tế bào cơ tim, tế bào mỡ và tế bào
sụn [11,13,14,15]:
Biệt hóa tế bào xương: Cấy chuyền tế bào đến lần 2 và ủ trong môi
trường tạo xương: DMEM – LG chứa 10% FBS, 50 µg/ml ascorbate -2
phosphate, 10-8 M dexamethasone vào 10 mM β – glycerophosphat. Môi
trường biệt hóa được thay ba ngày một lần, các tế bào sau khi biệt hóa
hoàn toàn (dựa vào hình dạng), tiến hành nhuộm hóa mô hay hóa mô
miễn dịch [41].
Biệt hóa tế bào cơ tim: Xử lí với 5 – azacytidine, ủ các TBGTM 24
giờ trong môi trường DMEM 3 μM 5 – azacytidine. Chuyển sang môi
trường DMEM 10% FBS để ngăn cản sự chết tế bào do sự tiếp xúc quá
lâu của 5 – azacytidine. Duy trì tế bào ở môi trường DMEM 10% FBS từ
3 ngày đến 5 tuần. Để có được môi trường điều kiện tế bào cơ tim, phải
chuẩn bị bằng cách nuôi cấy tế bào cơ tim chuột 7 ngày tuổi trong môi
trường DMEM với 4,5 g/l glucose, và 10% FBS trong khoảng 72 giờ,
môi trường được thu nhận và li tâm khoảng 800 vòng trong 10 phút ở
nhiệt độ phòng, cuối cùng dịch nổi được lọc để sử dụng như môi trường
điều kiện cho TBGTM.
Biệt hóa tế bào tạo sụn: Cấy chuyền tế bào 2 lần và ủ trong môi
trường tạo sụn: DMEM-LG không huyết thanh có 1x insulin – transferin
– selenium (IST) + premix (Gibco), 10 ng/ml transforiming growth factor
(TGF) (Peprotech) [38].
Biệt hóa tạo mỡ: Cấy chuyền tế bào đến lầm 2 và ủ ấm trong môi
trường tạo mỡ (DMEM và 1g/l glucose) chứa 10% FBS, 50 μg/ml

ascorbate – 1 phosphate, 10

-7

M dexame thasone và 50 μg/ml indo

methacin [41].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

1.5.3. Các chỉ thị phân tử của hWJSCs
hWJSCs biểu hiện các chỉ thị của TBG, gồm chỉ thị của các loại tế bào
ES, EG, các tế bào tiền chất thần kinh hay TBG thần kinh, biểu hiện actin và
vimentin cơ trơn, các chỉ thị cho nguyên bào sợi cơ, nestin, enolase chuyên biệt
thần kinh (NSE) và protein sợi thần kinh đệm (glia Fibrillary xitic protein –
IGFAP), c-kit, oct-4, Tra-1,60; biểu hiện các mức thấp của telomerase và cũng
hình thành các cấu trúc tương tự các thể phôi khi nuôi cấy [11].
Qua phân tích bằng Flow cytometry, người ta thấy chúng có biểu hiện
mức cao các chỉ thị chất nền (CD44, CD105), chỉ thị integrin (CD29-CD51) và
chỉ thị TBGTM như: CD105 (SH2), CD73 (SH3, SH4), CD90 nhưng không
biểu hiện các chỉ thị của dòng tạo máu (CD34, CD45). Chúng có khả năng tăng
sinh in vitro mạnh, và có thể cảm ứng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác: Đó
là các tế bào cơ tim (cardiomyocyte) bằng cách xử lý với 5 – azacytidine hay
nuôi các TBG đó trong môi trường cơ tim, kết quả được chứng nhận là thành
công khi chúng biểu biểu hiện các chỉ thị tế bào cơ tim là N – cadtherin và
troponi tim I....hWJSCs còn có thể biệt hóa thành các tế bào mỡ, sụn và xương
bằng các yếu tố biệt hóa phù hợp [11,16].
1.5.4. Tính ổn định di truyền của TBG và phƣơng pháp xác định tính ổn
định di truyền

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro các tế bào lắng xuống đáy bình, bám
vào bề mặt đáy để sinh trưởng và sinh sản bằng phân bào, như vậy mặt tiếp xúc
coi như điều kiện cần thiết cho tế bào sinh sản. Chúng thường phát triển thành
lớp tế bào trật tự cho tới khi bám hết giá thể chúng ngừng sinh sản và không di
động được do lực ức chế tiếp xúc bề mặt. Trái lại tế bào ung thư có thể phát
triển và sinh sản trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng sệt hoặc dạng huyền phù
và tạo thành các quần thể tế bào vô trật tự hoặc nhiều lớp chồng lên nhau trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

giá thể. Điều đặc biệt là các tế bào ung thư không chịu tác động của lực ức chế
tiếp xúc, chúng có thể di động chiếm một không gian nào đó cho đến khi chúng
ngừng sinh sản. Như vậy, in vivo cũng như in vitro tế bào lành của các mô chịu
tác động của lực ức chế tiếp xúc cũng như lực định vị, trái lại tế bào ung thư
không chịu tác động của các lực đó. Điều này có thể là do thay đổi trong tính di
truyền cũng như trong cấu trúc và tính chất của màng sinh chất của các tế bào
ung thư đặc biệt là trong cấu trúc của các receptor màng đóng vai trò nhận biết
và đánh dấu. Do đó, có thể quan sát hình thái và độ bám dính để đánh giá tính
ổn định di truyền trong quá trình tăng trưởng của TBG.
Về bộ máy di truyền, có sự khác biệt giữa tế bào lành và tế bào ung thư:
tế bào lành thường giữ bộ thể nhiễm sắc ổn định là 2n, trong khi đó các tế bào
ung thư thường có bộ thể nhiễm sắc dị bội (heteroploide) với các sai lệch rất đa
dạng về số lượng và cấu trúc. Hình thái nhiễm sắc của tế bào nhân chuẩn quan
sát được ở trung kỳ nguyên phân thường có dạng hình chấm hoặc hình que và
thường có kích thước vào khoảng 0,2 – 3 μm đường kính và 0,2 – 50 μm chiều
dài. Tuy nhiên ở các mô khác nhau của cùng một cơ thể, có thể biến đổi hình
dạng và kích thước để thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển.
Nhiễm sắc thể ở người, cái bé nhất là nhiễm sắc thể số 21 và 22 có kích thước L
= 1,5 μm; còn chiếc lớn nhất là nhiễm sắc thể số 1 có L = 10 μm. Nhuộm nhiễm

sắc thể với thuốc nhuộm Giemsa và quan sát hình thái, đếm số lượng của nhiễm
sắc thể cũng là một phương pháp đánh giá tính ổn định di truyền thường được
sử dụng.
Tế bào lành còn khác biệt với tế bào ung thư trong nhiều đặc tính sinh lý
khác như chỉ số mitos (số tế bào đang phân bào trên 1000 tế bào quan sát được
với kính hiển vi thường), phân bào có hạn định nếu môi trường nuôi cấy được
cấy chuyền đổi mới…[17].
1.6 Biệt hóa tế bào gốc bằng chuyển gen
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

1.6.1 Gen HNF-4α
Gần đây, một số nghiên cứu biệt hóa các tế bào gốc cuống rốn thành tế
bào gan đã mở ra hy vọng cho hàng trăm triệu bệnh nhân xơ gan và ung thư gan
[4,5]. Đặc biệt, năm 2010, Ren và cộng sự đã công bố nghiên cứu phân lập tế
bào TBGTM từ cuống rốn và tiến hành biệt hóa thành tế bào gan [18]. Tuy
nhiên, cho đến nay, cơ chế chính xác của quá trình biệt hóa thành từ TBGTM
cuống rốn thành tế bào gan vẫn cần phải được làm rõ hơn. Bên cạnh những tác
nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào gốc như dexamethasone
hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth factor), một số yếu tố phiên
mã, ví dụ như gen HNF-4α, cũng đang được tập trung nghiên cứu.
Hepatocyte nuclear factor 4 (HNF-4) được xác định có nguồn gốc từ hoạt
tính trong dịch chiết thô từ gan chuột, nó gắn với các DNA cần thiết cho quá
trình phiên mã của 2 gen đặc trưng cho gan là transthyretin (TTR) và
apolipoprotein C3 (APOC3). Sau quá trình nhân dòng và tinh sạch protein,
HNF4 được phát hiện như một thành viên của siêu họ receptor trong nhân
NR2A1 thuộc những yếu tố phiên mã ligand-dependent [19]. HNF-4 là một
trong những receptor thuộc nhân tế bào có tính bảo thủ rất cao và được tìm thấy
trong hầu hết cơ thể động vật, từ động vật biển cho đến cơ thể người [20].

Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF-4α) là một receptor trong nhân tế
bào được mã hóa bởi gen HNF-4α [21,22], đồng thời cũng là gen đầu tiên thuộc
nhóm HNF-4 được tìm thấy, nó cư trú trên nhiễm sắc thể 20q13.1-13.2. Về mặt
cấu trúc, gen HNF-4α bao gồm tất cả 10 exon và 9 intron, đặc biệt nó chứa 2
promoter P1 và P2. Về mặt kích thước, HNF-4α cố độ lớn lên tới hơn 70 kb
(hg19 chr20:43,029,924-43,060,029), trong đó trình tự không mã hóa intron
chiếm đến gần 98%, còn lại 10 exon chỉ có độ dài 1339 bp mã hóa cho 442 axit
amin [23]. Protein HNF-4α được biểu hiện ở trong gan, thận, ruột non, ruột kết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

và tuyến tụy, trong đó biểu hiện trong gan chiếm đa số [24]. Đặc trưng biểu hiện
của HNF-4α có thể tham khảo tại địa chỉ Nuclear Receptor Atlas (NURSA).
Là một thành viên trong nhóm HNF-4 nên HNF-4α cũng là một yếu tố
phiên mã liên kết với DNA cần thiết cho quá trình phiên mã cho các gen đặc
trưng. Protein được mã hóa bởi gen này kiểm soát sự biểu hiện của khoảng 100
gen trong đó có hepatocyte factor 1-alpha, một yếu tố phiên mã điều hòa sự biểu
hiện của một gen liên quan đến gan [25]. Gen này đóng một vai trò quan trọng
trong sự phát triển của gan, thận, tuyến ruột. HNF-4α đã được chứng minh có
thể hoạt động như một gen điều phối trong các tác nhân phiên mã trong quá
trình định hướng biệt hóa thành tế bào gan [26]. Những nghiên cứu này cho
thấy trong hệ thống nuôi cấy tế bào gốc, sự biểu hiện nâng cao của HNF-4α có
thể là một sự đảm bảo cho sự cảm ứng biệt hóa thành tế bào gan và các chức
năng của tế bào giống như tế bào gan. Nhờ đó, các tế bào có biểu hiện tổng hợp
HNF-4α sẽ kích hoạt các gen đặc hiệu định hướng tế bào gan và tăng cường
trạng thái biệt hóa của TBGTM [27]. Về việc ứng dụng tác nhân HNF-4α để
biệt hóa tế bào gốc cuống rốn thành tế bào gan, cho đến nay vẫn chưa có một
công bố chính thức nào trên toàn thế giới.

1.6.2 Biệt hóa tế bào gốc trung mô bằng chuyển gen
Tế bào gốc trung mô thuộc nhóm tế bào gốc đa năng có khả năng biệt hóa
thành nhiều kiểu tế bào trưởng thành có chức năng như tế bào tim, tế bào thần
kinh, tế bào tủy xương, tế bào cơ, tế bào mỡ, tế bào gan….. Hiện nay, trên thực
tế, để tiến hành biệt hóa tế bào gốc trung mô, bên cạnh những phương pháp khá
phổ biến sử dụng tác nhân môi trường trong các môi trường biệt hóa tế bào gốc
như dexamethasone hay yếu tố sinh trưởng như FGF (fibroblast growth factor)
[41], một số yếu tố phiên mã, trong đó có gen HNF-4α, cũng đang được tập
trung nghiên cứu. Bản chất của phương pháp sử dụng yếu tố phiên mã trong biệt
hóa tế bào gốc đó là đưa vùng mã hóa cDNA của yếu tố phiên mã này vào trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>

tế bào gốc để thực hiện quá trình biểu hiện protein thông qua những dòng vector
biểu hiện tế bào động vật. Yếu tố phiên mã sau khi được biểu hiện trong tế bào
sẽ tham gia điều tiết biểu hiện của hàng loạt những gen khác có liên quan đến sự
phát triển của tế bào chức năng đang được định hướng biệt hóa.

Hình 2. Cấu trúc vector biểu hiện pCMV-GFP
Những vector được sử dụng chủ yếu trong việc biểu hiện ở tế bào động
vật là vector adenovirus và một loạt những vector thuộc dòng vector pSV và
pCMV. Trong số những vector biểu hiện này, dòng vector pCMV được sử dụng
phổ biến nhất do nó có promoter CMV (cytomegalovirus) có khả năng điều tiết
biểu hiện trình tự mã hóa cDNA rất mạnh. Trong nghiên cứu này, dựa theo
những đặc điểm vùng promoter, terminator, vùng đa nhân dòng (multi cloning
site) và các vị trí origin, chúng tôi đã sử dụng vector pCMV-GFP (hình 2) trong
việc chuyển cDNA của gen HNF-4α vào tế bào gốc định hướng biệt hóa thành
tế bào gan. Vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai sẽ được nhân bản trong E.coli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>