Nghiên cứu biểu hiện gen Matrix metalloproteinase9 (MMP9) của người ở E. coli

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------------------

NGUYỄN THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MATRIX
METALLOPROTEINASE-9 (MMP-9) CỦA NGƢỜI Ở
E. COLI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Hà Nội - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS. Lê Thị
Bích Thảo, trưởng phòng Hóa sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, người thầy
đã luôn hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên
cũng như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận
tình giảng dạy và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn
này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cô chú, các anh chị phòng Hóa sinh
Protein đã hướng dẫn tận tình, dạy tôi những kiến thức thực hành trong phòng thí

nghiệm. Đặc biệt là Th.S Bùi Thị Huyền người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi
từng bước từ khi mới bắt đầu thực tập, cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp
đỡ, và cho tôi những lời khuyên quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng
tôi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua. Cuối cùng tôi xin gửi
lời cảm ơn tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận
văn này.
Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn.
Hà Nội, ngày

tháng 12 năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>ii


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu
a.a

Tên Tiếng Anh
Amino acid

Tên Tiếng Việt
Axit amin

Amp+

Ampicilin

Ampicilin

APS

Amonium persulphate

Muối amonium persulphate

bp

Base pair

Cặp bazơ

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit Deoxyribonucleic

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

Deoxynucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coli

Vi khuẩn Escherichia coli

ECM

Extracellular matrix

Chất nền ngoại bào

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Axit ethylenediaminetetraacetic

EtBr

Ethidium bromide

Ethidium bromide

EtOH

Ethanol

Cồn ethanol

IPTG

Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Kb

Kilo base

1000 cặp bazơ (1000 bp)

kD

Kilo Dalton

Kilo Dalton

LB

Luria - Bertani

Môi trường LB

MMPs

Matrix metalloproteinases

Metalloproteinases cơ chất

mRNA

Messenger RNA

RNA thông tin

MT-MMPs

Membrane-type MMPs

MMPs dạng màng

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

RNA ribosome

SDS

Sodium dodecyl sulphate

Sodium dodecyl sulphate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate
polyacrylamide gel
electrophoresis

Điện di biến tính trên gel
polyacrylamide

TAE

Tris-Acetate-EDTA

Tris-Acetate-EDTA

TEMED

N, N, N’, N’-Tetramethyl
Ethylendiamine

N, N, N’, N’-Tetramethyl
Ethylendiamine

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>iii


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................................... i
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................................. iii
MỤC LỤC........................................................................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN...................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ..................................................... vii
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3
1.1.

Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs) ............................................................ 3

1.1.1.

Phân loại và cấu trúc MMPs ..................................................................................... 3

1.1.2.

Chức năng sinh học của MMPs ................................................................................. 9

1.2.

Tổng quan về Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ....................................................... 10

1.2.1.

Cấu trúc gen MMP-9 ............................................................................................... 11

1.2.2.

Cấu trúc protein MMP-9 .......................................................................................... 12

1.2.3.

Sự kích hoạt MMP-9 ................................................................................................ 15

1.2.4.

Chức năng sinh học của MMP-9.............................................................................. 15

1.3.

Tiềm năng ứng dụng của MMP-9 trong y học ................................................................. 17

1.3.1.

Tiềm năng là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán các bệnh về tim mạch .................... 17

1.3.2.

Tiềm năng là chỉ thị sinh học cho các bệnh lý khác ................................................. 20

1.4.

Tình hình nghiên cứu MMP-9 ở Việt Nam ...................................................................... 20

CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 22
2.1.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................................. 22

2.2.

Phương pháp .................................................................................................................... 24

2.2.1.

Tách chiết RNA tổng số ............................................................................................ 24

2.2.2.

Tổng hợp cDNA........................................................................................................ 24

2.2.3.

Nhân gen MMP-9 bằng phản ứng PCR ................................................................... 25

2.2.4.

Phương pháp ghép nối DNA .................................................................................... 26

2.2.5.

Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ..................................... 27

2.2.6.

Tách chiết DNA plasmid .......................................................................................... 28

2.2.7.

Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................................ 29

2.2.8.

Thôi gel bằng kit QIAquick Gel Extraction .............................................................. 29

2.2.9.

Xác định trình tự DNA ............................................................................................. 30

2.2.10.

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho MMP-9 .................................................. 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>iv


2.2.11.

Biểu hiện gen mã hóa cho protein MMP-9 .............................................................. 31

2.2.12.

Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE ................................................ 31

2.2.13.

Kỹ thuật Western blot ............................................................................................... 32

CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 34
3.1.

Kết quả tách dòng gen mã hoá cho MMP-9 ..................................................................... 34

3.1.1.

Tách chiết RNA tổng số ............................................................................................ 34

3.1.2.

Nhân gen mã hoá cho MMP-9 bằng phản ứng PCR ................................................ 34

3.1.3.

Tách dòng và xác định trình tự gen MMP-9 ............................................................ 36

3.2.

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho MMP-9 .......................................................... 43

3.3.

Biểu hiện gen MMP-9 ở vi khuẩn E. coli BL21(DE3) .................................................... 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>v


DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng

Tiêu đề

Bảng 1.1

Phân loại Matrix metalloproteinases

4

Bảng 1.2

Vai trò của MMPs

9

Bảng 1.3

Trang

Đa hình gen liên quan tới sự biểu hiện tăng của MMP-9
và bệnh tim mạch

18

Bảng 2.1

Trình tự các cặp mồi

22

Bảng 2.2

Hóa chất và enzyme

23

Bảng 2.3

Máy móc và thiết bị

23

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng PCR

25

Bảng 2.5

Thành phần phản ứng nối ghép

26

Bảng 2.6

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

28

Bảng 2.7

Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>vi


DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Hình

Tiêu đề

Trang

Hình 1.1

Đặc điểm cấu trúc của một số phân nhóm MMPs

8

Hình 1.2

Vị trí các yếu tố phiên mã trên promoter của gen mã hóa cho MMP-9

11

Hình 1.3

Cấu trúc ba chiều của MMP-9

14

Hình 3.1

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách RNA tổng số

34

Hình 3.2

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ cDNA mã hóa cho MMP-9

36

Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA plasmid các dòng
khuẩn lạc
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI
Kết quả điện đi kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc đã
chọn lọc

37
38
39

Hình 3.6

Kết quả xác định trình tự gen MMP-9

39

Hình 3.7

Kết quả so sánh trình tự protein MMP-9

42

Hình 3.8

Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện của gen mã hóa cho MMP-9

44

Hình 3.9

Kết quả điện di kiểm tra đoạn gen và vector sau khi xử lý bằng
enzyme giới hạn

45

Hình 3.10

Sơ đồ enzyme giới hạn NcoI và EcoRI của vector MMP9-pCR2.1

46

Hình 3.11

Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp cho biểu hiện MMP-9

47

Hình 3.12

Kết quả biểu hiện protein điện di trên gel polyacrylamide 12.5%

48

Hình 3.13

Kết quả kiểm tra protein biểu hiện bằng phản ứng Western blot
với kháng thể kháng MMP-9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN

/>vii

49


MỞ ĐẦU
Ngày nay, quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa làm thay đổi hàng loạt các
yếu tố môi trường, tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khoẻ con người. Đồng
thời áp lực cuộc sống và công việc cũng góp phần không nhỏ ảnh hưởng xấu tới con
người làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh lý nghiêm trọng như tiểu đường, các bệnh về
tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh hay các bệnh về xương khớp…
đe dọa tới tính mạng con người. Tuy nhiên, với những tiến bộ mới của y học hiện
nay có thể giúp chẩn đoán sớm và đưa ra nhiều phương pháp điều trị hiệu quả, góp
phần kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân. Trong đó,
phương pháp chẩn đoán sớm sử dụng chỉ thị sinh học (biomarkers) để tiên lượng sẽ
hỗ trợ bác sĩ đưa những phương pháp điều trị thích hợp.
Genomics và proteomics là các kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong chẩn
đoán sớm. Nghiên cứu về các gen và protein có chức năng liên quan đến những biến
đổi trạng thái bệnh lý khác nhau đang được chú trọng đầu tư ở nhiều quốc gia trên
thế giới. Trong số các protein được quan tâm, Matrix metalloproteinases (MMPs) là
một họ protein endopeptidases kẽm được điều hoà chặt chẽ, có thể bất hoạt các
protein ngoại bào đồng thời tái tạo lại các mô liên kết ở cả trạng thái bình thường
như sự phát triển phôi, sinh sản và tái tổ hợp mô cũng như trạng thái bệnh sinh như
ung thư di căn, viêm mãn tính, các bệnh về tim mạch, tổn thương mô cũng như rối
loạn về thần kinh (Klein and Bischoff, 2011). Do đó, MMPs được coi là chỉ thị sinh
học trong chẩn đoán, tiên lượng và kiểm tra các bệnh khác nhau như bệnh tiểu
đường, bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh và nhiễm trùng
(Galliera et al, 2014).
Họ matrix metalloproteinases gồm sáu phân nhóm, trong phân nhóm
gelatinase MMP-9 (gelatinase B) có các chức năng chủ yếu trong việc phá vỡ mạng

lưới ngoại bào, có thể phá huỷ nhiều loại protein ngoại bào bao gồm gelatin,
collagen type IV và nhiều protein màng. MMP-9 được điều hoà chủ yếu ở mức độ
phiên mã và sau dịch mã bằng sự kích hoạt của zymogen và sự ức chế của chất ức

-1-


chế nội sinh TIMP-1. Đã có nhiều nghiên cứu về MMP-9, đặc biệt là tiềm năng làm
chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm các bệnh lý như tim mạch, viêm (Halade et al,
2013), loạn dưỡng cơ Duchene (Nadarajah et al, 2011), ung thư tuyến tiền liệt
(Gong et al, 2014) … Vì vậy, MMP-9 ngày càng được chú trọng nghiên cứu ứng
dụng làm nhân tố chỉ thị cho chẩn đoán trước và trong giai đoạn điều trị bệnh.
Với mục tiêu đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu biểu
hiện gen Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) của ngƣời ở E. coli” nhằm tạo ra
được protein tái tổ hợp matrix metalloproteinase-9 của người để phục vụ cho các
nghiên cứu tạo kháng thể kháng MMP-9, hỗ trợ chẩn đoán bằng các phương pháp
sinh học hiện đại như thấm miễn dịch, hoá mô miễn dịch, Western Blot.

-2-


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs)
Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases phụ

thuộc kẽm, đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như sự tạo phôi, tăng sinh
tế bào, tái tạo mô, làm lành vết thương, sự hình thành mạch, … Năm 1962, MMPs

lần đầu tiên được phát hiện bởi Jerome Gross và Charles M. Lapiere khi nghiên cứu
sự suy thoái của collagen xoắn bậc ba trong biến thái của đuôi nòng nọc (Gross and
Lapiere, 1962). Năm 1968, enzyme này lần đầu tiên được phân lập từ tế bào da
người ở dạng không hoạt động là proMMP (còn được gọi là zymogen MMP) (Eisen
et al., 1968). Sau đó MMPs được tìm thấy ở động vật không xương sống và thực
vật. Đến năm 1990 một nhóm nghiên cứu khác đã phát hiện ra cơ chế điều hòa các
enzyme MMPs ở dạng không hoạt động (Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990).
1.1.1. Phân loại và cấu trúc MMPs
 Phân loại
Phân lớp metalloproteases là một họ protein endopeptidases bao gồm các
enzyme xúc tác phụ thuộc vào kẽm (William and Robert, 1998). Matrix
metalloproteinase (MMPs) thuộc phân họ matrixin kẽm Metalloprotease M10
(Nagase et al., 2006; Sbardella et al., 2012), có cơ sở dữ liệu trên MEROPS
( />Sau khi hoàn thành việc giải mã trình tự bộ gen người vào năm 2003 thì
MMPs được xác định gồm 24 gen mã hóa cho toàn bộ MMPs ở người. Thành viên
trong họ MMPs giống nhau khoảng 40% về cấu trúc chính. Khoảng hơn 20 loại
MMPs khác nhau được phát hiện và phân loại dựa vào vị trí trên nhiễm sắc thể và
dựa vào các loại chất nền. Mặc dù các tên gọi từ MMP-1 đến MMP-28 được sử
dụng để phân loại, nhưng một số MMP vẫn chưa được xác định. Danh sách MMPs
được thể hiện trong hệ thống Bảng 1.1 (Zitka et al., 2010).

-3-


Bảng 1.1. Phân loại Matrix metalloproteinases (Zitka et al., 2010)
MMP
MMP-1

Metalloproteinase
Collgenase (type I,

interstitial)

kDa

EC

43

EC 3.4.24.7

Locus

Chất nền

11q22-

Collagens (I,II,III,VIII và X); gelatin; aggrecan; L-selectin;

q23

IL-1β proteoglycanes;entactin; ovostatin; MMP-2, MMP-9

Gelatinase A 72kDa
MMP-2

Gelatinase type IV
Collagenase
Stromelysin-1

Collagens (I,IV,V,VII,X,XI và XVI); gelatin; elastin;

66

EC3.4.24.24 16q13

MMP-1; MMP-9, MMP-13
Collagens (III,IV,V và IX); gelatin; aggrecan; perlecan;

46

MMP-3

fibronectin; aggrecan; MBP; osteonectin; laminin-1;

EC3.4.24.17 11q23
Proteoglykanase

decorin; laminin; elastin; casein; osteonectin; ovostatin;
antactin; plasminogen; MBP; IL-1β; MMP-2/TIMP-2;
MMP-7; MMP-8; MMP-9; MMP-13
Collagens (IV và X); gelatin; aggrecan; decorin; elastin;

MMP-7

Matrilysin

20

EC3.4.24.23

11q21-

fibronectin; laminin; entactin; casein; transferrin; MBP;

q22

plasminogen; β4-integrin; MMP-1; MMP-2; MMP-9;
MMP-9/TIMP-1

MMP-8

Neutrophil
collagenase

58

EC3.4.24.34

11q21-

Collagens (I,II,III,V,VII,VIII và X); gelatin; aggrecan;

q22

fibronectin

-4-


MMP-9

Gelatinase B

92

EC3.4.24.35

MMP-10

Stromelysin-2

46

E3.4.2.2

MMP-11

Stromelysin-3

44

No match

45

EC3.4.24.65

MMP-12

Macrophage
metaloelastase

20q11.2- Collgens (IV,V,VII,X và XIV); gelatin; entactin; aggrecan;
q13.1

elastin; fibronectin; osteonectin; plasminogen; MBP; IL-1b

11q22.3- Collagens ( III-V); gelatin; casein; fibronectin; vitronecin;
q23

laminin; ectactin; MBP; fibrinogen; fibrin;plasminogen

22q11.2

Unknow (có thể là casein)

11q22.2- Colagen IV; gelatin; elastin; caein; fbronectin; vitronectin;
q22.3
11q2.3

laminn; ectactin; MBP; fibrinogen; fibrin; plasminogen
Collagens (I,II,III,IV,IX,X và XIV); gelatin; plasminogen;

MMP-13

Collagenase-3

55

No match

MMP-14

MT1-MMP

54

No match

MMP-15

MT2-MMP

61

No match

MMP-16

MT3-MMP

55

No match

8q21

Collagens III; gelatin; casein; fibronectin; MMP-2

MMP-17

MT4-MMP

54

No match

12q24

Unknow

MMP-18

Collagenase-4

No match

Unknow Collagens(I,II,III,VIII và X); gelatin; aggrecan

MMP-19

RASI-1

No match

12q14

aggrecan; perlecan; fibronectin; osteonetin; MMP-9

14q11-

Collagens (I-III); gelatin; casein; fibronectin; laminin;

q12

vitronectin;entactin; proteoglycans; MMP-2; MMP-13

16q12.2q21

-5-

Fibronectin; entactin; laminin; perlekan; MMP-2

Gelatin; aggrecan; fibronectin


MMP-20

No match

Unknow Amelogrenein; aggrecan

MMP-21*

No match

1p36.3

Unknow

MMP-22*

No match

1p36.3

Unknow

MMP-23*

No match

Unknow Unknow

No match

20q11.2

Unknow

No match

16p/3.3

Pro-gelatinase A; fibrin; fibronectin; collagen IV; gelatin

No match

Unknow Gelatin I; P1; fibrinogen; fibronectin; vitronectin

No match

17q11.2

MMP-24*
MMP-25

MMP-26
MMP-28

Enamelysin

MT5-MMP
Leokolysin/MT6MMP
Endometase,
matrilysin-2
Epilysin

Casein

(*: Gen MMP được tìm thấy trên nhiễm sắc thể nhưng chức năng và cấu trúc của chúng chưa được xác định)

-6-


 Cấu trúc
MMPs là những protein có cấu trúc tương đồng nhau, có thể chia thành 6
nhóm chính: collagenases, stromelysins, matrilysins, gelatinases, MT-MMPs
(Membrane-type MMPs) và MMPs không có nhóm chỉ định. Dựa vào nghiên cứu
tinh thể học và cộng hưởng từ có thể xác định được cấu trúc của nhiều MMPs.
MMPs là endopeptidases phụ thuộc kẽm và canxi, được tổng hợp dưới dạng

proMMPs và được tiết ra ngoài tế bào nhưng ở dạng bất hoạt (trừ MT-MMPs)
(Zitka et al., 2010). Hầu hết các MMPs có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng
propeptide, vùng xúc tác (CAT) và vùng hemopexin-like (HPX) (Page-McCaw et
al., 2007; Ndinguri et al., 2012).
Vùng signal peptide nằm ở đầu gần vùng propeptide, là đoạn peptide chứa
khoảng 17-20 amino acid (a.a), có vai trò trong đáp ứng tín hiệu tiết. Vùng signal
peptide có ở tất cả các MMPs trừ MMP-17 (William and Robert, 1998).
Vùng propeptide gồm khoảng 80 a.a, chức năng của vùng này tạo ra các
zymogen, vùng propeptide khi bị phân cắt sẽ kích hoạt proMMP (Zitka et al.,
2010).
Vùng hemopexin-like (hay còn được gọi là vùng C-terminal) có cấu trúc
tương tự với protein họ hemopexin, gồm khoảng 200 a.a. Vùng này có diện tích bề
mặt tương đối lớn cho các tương tác giữa protein với protein. Chức năng của vùng
này chưa được biết rõ (Zitka et al., 2010).
Vùng xúc tác gồm khoảng 170 a.a, với 2 ion kẽm (Zn2+) và 2 hoặc 3 ion
canxi (Ca2+) trong trung tâm hoạt động. Ion Zn2+ đầu tiên nằm ở vị trí hoạt động
tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác. Ion Zn2+ thứ hai (kẽm cấu trúc) và ion Ca2+
cách ion Zn2+ xúc tác một khoảng 12 nm. Chức năng của các ion Ca2+ là ổn định
cấu trúc của vùng xúc tác (Massova et al., 1998; Zitka et al., 2010).

-7-


Hình 1.1. Đặc điểm cấu trúc của một số phân nhóm MMPs (Gong et al., 2014)
Trong đó: SP (vùng signal peptide), Pro-domain (vùng propeptide có nhóm thiol
[SH]), Catalytic domain (vùng xúc tác có vị trí liên kết Zn2+), Hinge (bản lề),
Hemopexin-like (vùng hemopexin), F (fibronectin type II), Fr (vị trí nhận diện
furin),

Transmembrane

(vùng

chuyển

màng)

hoặc

GPI

(liên

kết

glycosylphosphatidylionositol), Cys (vùng cysteine), IgG-like (vùng tượng tự
Immunoglobulin)

-8-


1.1.2. Chức năng sinh học của MMPs
Vai trò chính của MMPs là phân hủy và loại bỏ các phân tử chất nền ngoại
bào (extracellular matrix-ECM) từ các mô (Nagase et al., 2006; Ogura et al., 2014).
Các nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng sự phân hủy chất nền ngoại bào hoặc các phần
tử bề mặt tế bào làm thay đổi tương tác giữa cơ chất-tế bào và tế bào-tế bào. Khi các
nhân tố sinh trưởng được tạo thành, chúng liên kết với ECM làm cho các nhân tố
sinh trưởng này có khả năng nhận diện thụ thể tế bào. Một số phân tử không phải
chất nền ngoại bào cũng là cơ chất tiềm năng của MMPs (Nagase et al., 2006).
Trong điều kiện sinh lý bình thường MMPs bị kiểm soát chặt chẽ bởi các chất ức

chế nội sinh TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases). Do vậy, sự mất cân
bằng giữa MMPs và TIMPs có thể làm tăng hoạt động của phân tử MMPs dẫn đến
trạng thái bệnh lý nào đó. MMPs còn tham gia vào nhiều quá trình sinh học và bệnh
lý (Bảng 1.2) như ung thư di căn, viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, các bệnh về
tim mạch… (William and Robert, 1998; Klein and Bischoff, 2011; Jones, 2014).
Bảng 1.2. Vai trò của Matrix metalloproteinases (William and Robert, 1998)
Trạng thái bình thường

Trạng thái bệnh

Sự phát triển

Phá hủy mô

Làm tổ của phôi

Viêm khớp dạng thấp

Phát triển phôi thai

Thoái hóa khớp

Sự phát triển thần kinh

Ung thư di căn

Loại bỏ tấm sụn tăng trưởng

Chứng thối loét vì nằm liệt giường

Sự phát triển xương

Viêm loét dạ dày

Hình thành men răng

Viêm loét giác mạc

Sự tiêu gốc răng

Bệnh nha chu
Bệnh xơ hóa

Sự sinh sản
Chu kỳ niêm mạc tử cung

Bệnh xơ gan

Vỡ nang buồng trứng

Bệnh xơ hóa phổi

Tan thể vàng

Chứng xơ cứng tai

-9-


Mở cổ tử cung

Xơ vữa động mạch

Co hồi tử cung sau sinh

Bệnh đa xơ vữa

Sự phát triển tuyến vú
Co hồi tuyến vú
Vỡ màng ối
Suy giảm cơ chất

Duy trì sự cân bằng
Phục hồi hệ xương

Bệnh dãn nở cơ tim

Chu trình nang lông

Bong biểu bì bọng nước

Chữa lành vết thương

Phình động mạch chủ

Sự tạo mạch
Apoptosis
Tái tạo tế bào thần kinh
Chức năng đại thực bào
Chức năng bạch cầu trung tính

1.2.

Tổng quan về Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)
Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) thuộc phân nhóm gelatinases, có kích

thước khoảng 92 kDa, protein MMP-9 (EC 3.4.24.35) còn có các tên gọi khác là
collagenase type IV 92 kDa, gelatinase 92 kDa và gelatinase B. MMP-9 lần đầu tiên
được phát hiện vào năm 1974 bởi Sopata và Dancewicz khi tinh chế một protease từ
bạch cầu trung tính của người có khả năng biến tính collagen (gelatins) (Sopata and
Dancewicz, 1974). Hoạt tính phân giải gelatin và collagen (type IV và V) của
protease này được nhận biết từ môi trường nuôi cấy xương thỏ (Murphy et al.,
1981) và bạch cầu trung tính của người (Murphy et al., 1982), protease này được
xác định thuộc họ MMPs có kích thước khoảng 90-110 kDa. Các hoạt tính tượng tự
của phân tử protease có kích thước 82-97 kDa cũng được phát hiện ở bạch cầu trung
tính của lợn (Murphy et al., 1989). Hàng loạt các nghiên cứu đã chứng minh có hai
loại protease với kích thước 72 kDa và 92 kDa có khả năng phân hủy collagen type
IV, V và gelatin thuộc họ MMPs. Tại hội nghị “The Destin Beach matrix
- 10 -


metalloproteinases” năm 1989 quy ước protease có kích thước 92 kDa này là MMP9 (William and Robert, 1998).
1.2.1. Cấu trúc gen MMP-9
Ở người, gen mã hóa cho MMP-9 có vị trí trên nhiễm sắc thể 20q11.2-q13.1,
có kích thước 7654 bp, gồm 13 exon xen giữa 12 intron. Kích thước mỗi exon có
thể dao động từ 104 bp (exon 12) đến 280 bp (exon 9) và kích thước mỗi intron
khoảng 96 bp (intron 11) đến 1800 bp (intron 12) (William and Robert, 1998).
Promoter của MMP-9 khoảng 2.2 kb, giống với MMP-1 và MMP-3 hơn là MMP-2
bao gồm: Hộp TATA ở vị trí -29, không có hộp CCAAT, một liên kết Sp1 với hộp
GC ở vị trí -563 và Sp1 cũng liên kết với hộp GT ở vị trí -54, yếu tố kìm hãm TGFβ ở vị trí -474, yếu tố AP-1 ở vị trí -79 và -533, ba liên kết PEA3/Ets có vị trí ở giữa
khoảng -599 và -531, yếu tố NF-κB ở vị trí -600 và -328, có hai yếu tố AP-2 và một

đoạn (CA)n (Hình 1.4) (Van den Steen et al., 2002; Farina and Mackay, 2014).

Hình 1.2. Vị trí các yếu tố phiên mã trên promoter của gen mã hóa cho MMP-9
(Farina and Mackay, 2014)
Trong đó: E2 BS ( E2 protein), NF-κB (nuclear factor-kappa binding), Sp1 (specific
protein-1), ETS (E26 transformation specific), (CA)n (vùng CA lặp lại), AP-1 (activator
protein-1), GTbox và TATA box (hộp GT và hộp TATA)
Quá trình phiên mã của MMP-9 được kiểm soát bởi nhiều yếu tố gồm: yếu tố
phiên mã E-26 (Ets), NF-κB, PEA3, AP-1, Sp1 và (SAF)-1. Est là một họ các yếu
tố phiên mã gắn liền với một loạt các chức năng sinh học như biệt hóa tế bào, di cư
tế bào, tăng sinh, quá trình apoptosis và hình thành mạch. NF-κB có khả năng liên
kết với κB DNA trên promoter hoặc enhancer của gen để điều hòa biểu hiện gen.
- 11 -


Theo báo cáo của Bond và cộng sự thì MMP-9 có mức biểu hiện tăng trong các tế
bào cơ trơn ở mạch máu thông qua yếu tố NF-κB (Bond et al., 2001). Khi NF-κB bị
ức chế thì nồng độ MMP-9 trong các tế bào cơ trơn và đại thực bào giảm (Bond et
al., 2001; Grimm et al., 2006). Hai vị trí liên kết với yếu tố AP-1 nằm trên vùng
promoter có chức năng kích hoạt MMP-9 khi nồng độ protein AP-1 tăng nhanh.
Yếu tố Sp1 gắn với promoter của MMP-9 để kích hoạt sự phiên mã. Sự ức chế của
Sp1 dẫn đến giảm biểu hiện MMP-9. Ngoài ra, các yếu tố phiên mã này còn tương
tác để điều hòa biểu hiện MMP-9 (Yabluchanskiy et al., 2013).
1.2.2. Cấu trúc protein MMP-9
MMP-9 là một metallo-enzyme đa vùng, vị trí xúc tác bao gồm một vùng
liên kết kim loại tách biệt với vùng hoạt động bằng ba chuỗi fibronectin liền nhau,
thuận lợi cho phân hủy cơ chất có kích thước lớn như elastin và biến tính collagens.
Trong vùng xúc tác, các a.a Asp309, Asn319, Asp232, Tyr320 và Arg3076 đóng
vai trò quan trọng trong gắn gelatin. Enzyme này duy trì hoạt động bằng vùng propeptide đầu N PRCGXPD, có gốc cysteine liên kết với ion Zn2+. Đầu C của MMP-9
chứa một vùng hemopexin-like kiểm soát sự liên kết cơ chất, tương tác với chất ức

chế và tạo điều kiện thuận lợi cho các liên kết bề mặt. Vùng liên kết O-glycosyl
nằm giữa giúp cho MMP-9 linh động hơn, ngoài ra vùng này còn tham gia vào
nhiều quá trình như kiểm soát đặc hiệu cơ chất cũng như quá trình xâm nhập của
MMP-9, quá trình tương tác với TIMP và định vị trên bề mặt tế bào. Vùng này tạo
điều kiện cho hoạt động của MMP-9 với các đại phân tử, tháo rỡ và phân tách
collagen bằng các enzyme khác, cho phép MMP-9 là chất phân hủy trung gian (Van
den Steen et al., 2002; Vandooren et al., 2013; Farina and Mackay, 2014).
Đặc điểm vùng cấu trúc protein của MMP-9:
 Vùng xúc tác: Trong vùng này a.a Glu402 và ion Zn2+ là các yếu tố cần thiết
để thực hiện chức năng trong khi a.a Lue397 và Ala406 đóng vai trò quan trọng
trong hoạt động xúc tác nói chung, Asp410, Pro415 tăng hoạt động phân hủy
- 12 -


colagen type V và gelatin (O’Farrell and Pourmotabbed, 2000), sự thay thế Gly cho
Glu415 giúp MMP-9 phân hủy được collagen (O’Farrell et al., 2006). Vùng
propeptide có chứa “công tắc cysteine” (cysteine switch) liên kết với ion Zn2+ ức
chế hoạt động xúc tác của MMP-9.
 Vùng Hemopexin-like: Đặc trưng của vùng là cấu trúc cộng hóa trị khá đặc
biệt, trong đó Cys516 và Cys704 tạo thành một cầu nối disulfide, cầu nối này tham
gia vào vùng chức năng nhưng không cần thiết cho quá trình bài tiết của MMP-9
(Dufour et al., 2011; Khan et al., 2012). Vùng hemopexin-like tương tác với cơ chất
để oligomer hóa và khi tương thích với cơ chất như heme thì vùng này có khả năng
kích hoạt MMP-9. Cầu nối disulfide trong chuỗi fibronectin rất cần cho sự bài tiết
của MMP-9 (Farina and Mackay, 2014).
 Vùng O-glycosyl (vùng bản lề - hinge): là vùng giống collagen type V, đặc
trưng bởi 64 a.a liên kết với 22 gốc proline, 6 gốc glycine và từ 12-14 liên kết Oglycosidic. Vùng này có chức năng định hướng cho hoạt động của vùng hemopexinlike, rất quan trọng trong tương tác với protein ngoại sinh (các cơ chất của MMP-9)
(Van den Steen et al., 2006; Farina and Mackay, 2014). Nếu loại bỏ vùng này sẽ
giảm độ đặc hiệu của MMP-9 với các đại phân tử cơ chất bao gồm cả gelatin
(Vandooren et al., 2013).

- 13 -


Hình 1.3. Cấu trúc ba chiều của MMP-9 (Ndinguri et al., 2012)
Trong đó: vùng xúc tác [CAT] màu vàng; liên kết/bản lề [linker/hinge] màu xanh da
trời; vùng hemopexin [HPX] màu đỏ; Fibronectin type II [FN(II)] màu xanh lá cây.
MMP-9 là protein được sản sinh từ các tế bào keratinocytes (Wilhelm et al.,
1989), bạch cầu đơn nhân và đại thực bào phôi (Mainardi et al., 1984), PMN
leukocytes (Mainardi et al., 1980) và một số tế bào di căn hay xâm nhiễm (Lyons et
al., 1991), được tiết ra dưới dạng zymogen 92 kDa. MMP-9 tồn tại ở cả dạng đơn
phân, nhị phân đồng dạng được liên kết bằng cầu disulfide. Tuy nhiên chúng cũng
tồn tại ở dạng nhị phân không đồng dạng với protein 25 kDa. Đại thực bào và các tế
bào bị xâm nhiễm chỉ sản xuất MMP-9 ở dạng đơn phân. Sau quá trình cải biến sau
dịch mã như hình thành liên kết disulfide, glycosyl hoá và loại bỏ vùng, MMP-9 có
3

dạng

hoạt

tính

khác

nhau

là

64,

67

và

82

kDa

( Cho đến nay phân tử MMP-9 ở dạng 64
và 67 kDa vẫn chưa xác định được chính xác phân tử proMMP-9 ở vị trí nào và
hoạt tính thế nào. Riêng phân tử MMP-9 có kích thước 82 kDa là do đã loại bỏ
vùng proMMP-9 và trải qua quá trình glycosyl hoá. Khi sản xuất MMP-9 ở E. coli,
- 14 -


MMP-9 tái tổ hợp của người ở dạng đơn chuỗi, không glycosyl hoá có 707 a.a sẽ có
kích thước là 78.458 kDa.
1.2.3. Sự kích hoạt MMP-9
MMP-9 thường được tiết dưới dạng không hoạt động là zymogen, vì thế khi
tham gia vào các quá trình tế bào thì proMMP-9 sẽ được kích hoạt. Hầu hết các chất
kích hoạt tự nhiên liên quan đến proMMP-9 chưa được biết rõ, nhưng các minh
chứng cho thấy thông qua một số cơ chế khác nhau như phản ứng oxy hóa các gốc
tự do, S-nitrosylation và kích hoạt allosteric, sự kích hoạt xảy ra khi proMMP-9 kết
hợp với gelatin hoặc collagen type IV, kết quả là vùng propeptide bị cắt bỏ một
phần tạo thành phân tử MMP-9 có hoạt tính (Vilen et al., 2013).
MMP-9 được kích hoạt bằng một loạt các enzyme như: trypsin, cathepsin G,
kallikrien, elastase, chymase, neutrophil elastase và các MMP-1, -2, -3, -7, -10, -13
và -26 (Van den Steen et al., 2002). MMP-3 kích hoạt proMMP-9 tại hai vị trí phân
cắt. Tại vị trí Glu40 – Met41 (nằm giữa vùng propeptide) tạo ra protein trung gian

kích thước khoảng 86 kDa, đồng thời trong lần phân cắt này gây ra sự thay đổi
trong proMMP-9 tại vị trí Arg87 – Phe88 (vị trí này dễ bị ảnh hưởng), dẫn đến lần
phân cắt thứ hai của MMP-3. Kết quả tạo ra protein MMP-9 ở dạng hoạt động có
kích thước 82 kDa. Một kiểu kích hoạt proMMP-9 khác bởi MMP-26 tại vị trí
Ala93-Met94 của preproMMP-9 tạo thành phân tử có hoạt tính. Nghiên cứu trước
đây cho thấy enterokinase một protease serine liên kết màng, phân cắt proMMP-9
tại vị trí Lys65- Ser66 và trypsin-2 kích hoạt proMMP-9 ở tỷ lệ phân tử rất thấp
1:1000 (Vilen et al., 2008).
1.2.4. Chức năng sinh học của MMP-9
MMP-9 tham gia vào rất nhiều quá trình sinh lý học và bệnh lý học như:
- Sự làm tổ của phôi: các lá nuôi phôi xâm nhập vào lớp biểu mô tử cung, quá
trình này đòi hỏi sự phân hủy và tái tạo lại các thành phần ECM. Một số bằng
chứng cho thấy gelatinase B/MMP-9 có thể là MMP quan trọng trong quá trình này.
MMP-9 là MMP chủ yếu được tiết ra từ các tế bào lá nuôi phôi của chuột và của
người trong nuôi cấy, gây nhiễu chức năng của kháng thể kháng lại gelatinase B khi
- 15 -


phân hủy các thành phần ECM trong quá trình phát triển của lá nuôi phôi (William
and Robert, 1998). Cả MMP-2 và MMP-9 đóng vai trò then chốt trong nuôi cấy
phôi người, đây là hai enzyme chính giới hạn tốc độ tái tạo ECM trong quá trình
cấy ghép. Tuy nhiên, sự tăng hoạt động của MMP-2 và MMP-9 có liên quan đến
môi trường tử cung không thuận lợi như viêm nội mạc tử cung. Do đó, sự thành
công của quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào sự cân bằng chặt chẽ giữa kích hoạt và
ức chế hai enzyme này (Liu et al., 2006; Yoshii et al., 2013). MMP-9 có thể đóng
vai trò quan trọng cho sự hình thành mạch, được giải phóng dưới dạng hoạt tính
sinh học từ yếu tố tăng trưởng nội mạch. Quá trình này được hình thành bằng sự
phân hủy trực tiếp các protein ở màng nền của mạch máu (Bergers et al., 2000).
- Sự hình thành xương: các xương dài phát triển từ các khối trung mô, sau đó
từ các tế bào sụn phân hóa tạo thành mô hình sụn. Mô hình biến đổi thành xương

qua quá trình xương hóa sụn. Quá trình này đòi hỏi sự hỗ trợ của mạch máu, phân
hủy mô sụn, lắng đọng và sau đó là tái tạo khuôn xương. Sự phân hủy sụn và tái hấp
thu xương được thực hiện bởi các tế bào đặc biệt có nguồn gốc từ các tế bào tiêu
huyết và tế bào hủy xương (William and Robert, 1998; Provot and Schipani, 2005).
Các tế bào này có mức biểu hiện cao gelatinase B (MMP-9), ở vị trí tái tạo xương
và trong suốt quá trình từ màng bao sụn thành xương sụn trước khi khởi đầu quá
trình xương hóa (William and Robert, 1998). Khi MMP-9 bị thiếu gây ra sự rối loạn
phát triển xương, cụ thể làm chậm quá trình xương hóa do thiếu sự hình thành mạch
máu trong các đĩa tăng trưởng (Vu et al., 1998), và giảm tế bào hủy xương (Engsig
et al., 2000).
- MMP-9 có khả năng chế biến cytokine và chemokine: giống như MMP-2,
MMP-9 phân cắt interleukin (IL)-8, kích hoạt IL-1β và biến đổi yếu tố tăng trưởng
β. Bằng cách sử dụng các kỹ thuật proteomics, vai trò hoạt động của MMP-9 trong
phát tán integrin β2 từ các đại thực bào đã được chứng minh và làm sáng tỏ. MMP2 bị ức chế bởi TIMP-2 còn MMP-9 bị ức chế bởi TIMP-1. MMP-2 tồn tại ở khắp
nơi trong các điều kiện sinh lý bình thường, nhưng MMP-9 chủ yếu xuất hiện trong
bạch cầu trung tính, nơi nó được lưu trữ dưới dạng hạt và được phát tán nhanh
- 16 -


chóng sau khi bị kích thích. MMP-9 còn được biểu hiện trong rất nhiều các loại tế
bào khác là các tế bào bị gây cảm ứng (viêm) bởi tác nhân kích thích, nó tăng lên
trong các dòng tế bào u ác tính và có liên quan đến khả năng di căn của chúng
(Klein and Bischoff, 2011).
- Ngoài ra MMP-9 còn tham gia vào rất nhiều quá trình: làm lành vết thương,
viêm khớp dạng thấp, các bệnh về hệ thống thần kinh trung ương, xơ nang, giãn phế
quản, bệnh thận đa nang, viêm màng thận và Alzheimer (William and Robert,
1998), ung thư biểu mô tế bào vảy (Vilen et al., 2013), các bệnh về tim mạch
(Yabluchanskiy et al., 2013), bệnh hen suyễn, phổi tắc nghẽn mãn tính và viêm
đường hô hấp (Ma et al., 2014)…
Các nghiên cứu về MMP-9 đã, đang và sẽ tiếp tục phát triển do MMP-9 đóng

vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý. Tìm hiểu rõ cơ chế hoạt
động của MMP-9 có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán sớm và điều trị bệnh.
1.3.

Tiềm năng ứng dụng của MMP-9 trong y học

1.3.1. Tiềm năng là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán các bệnh về tim mạch
MMP-9 tham gia vào nhiều quá trình sinh học và bệnh học. Theo một cuộc
khảo sát mới nhất năm 2013 đã tìm kiếm được hơn 13000 bài báo liên quan đến
MMP-9 trên PubMed. Các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng về MMP-9 trong
10 năm trở lại đây tập trung theo hai hướng chính: Tác động trực tiếp đến quá trình
tái tạo tim mạch (nhồi máu cơ tim, chứng viêm, vỡ tâm thất trái và các chất ức chế
MMP-9) và tác động gián tiếp lên các bệnh viêm nhiễm (xơ vữa động mạch, viêm
khớp dạng thấp, ung thư, bệnh nha chu, tiểu đường và chứng phình mạch). Đặc biệt,
tiềm năng ứng dụng của MMP-9 rất khả quan trong chẩn đoán lâm sàng các bệnh về
tim mạch (Halade et al., 2013). Rất nhiều các nghiên cứu đã đánh giá tiềm năng là
chỉ thị sinh học của MMP-9 trong các bệnh lý về tim mạch như:
Nghiên cứu lâm sàng toàn diện đầu tiên của Blankenberg và cộng sự liên
quan đến nồng độ MMP-9 trong huyết tương được xác định là chỉ thị sinh học dự
- 17 -


báo nguy cơ tử vong của các bệnh nhân tim mạch, có liên quan tới các protein như
IL-6, hs-CRP và fibrinogen (Blankenberg et al., 2003). Squire và cộng sự (2004) đã
chứng minh rằng sự tăng nồng độ MMP-9 tương quan với tăng thể tích tâm thất trái
và cung cấp cái nhìn rõ hơn về tái tạo tâm thất trái sau nhồi máu cơ tim ở người
(Squire et al., 2004). Một nghiên cứu đã đánh giá mức tăng nồng độ MMP-9 và hsTnT (High-Sensitivity Troponin T) ở bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp (Acute
coronary syndromes, ACS). Kết luận nồng độ MMP-9 tăng cao và sớm hơn so với
hs-TnT và có giá trị chẩn đoán cao hơn cho bệnh nhân ACS ở giai đoạn sớm, nhưng
không phải cho ACS ở giai đoạn muộn (Kobayashi et al., 2011). Gần đây nhất là

nghiên cứu của Fertin và cộng sự đã khảo sát 112 mối quan hệ giữa 52 chỉ thị sinh
học với sự phục hồi tâm thất trái. Trong đó, các chỉ thị tham gia vào quá trình luân
chuyển ECM hoặc kích hoạt hormone thần kinh là: MMP-9, peptide collagen và Btype natriuretic peptide (nội tiết tố thần kinh). Đây được xem là những chỉ thị nổi
bật để dự đoán những bất lợi trong quá trình hồi phục của tâm thất trái sau nhồi máu
cơ tim (Fertin et al., 2012).
Đáng chú ý, một số đa hình trong gen đã được chứng minh có ảnh hưởng đến
quá trình biểu hiện MMP-9. Sự thay đổi mức độ biểu hiện protein MMPs có liên
quan đến sự biến đổi về mặt di truyền. Sự biến đổi trong gen MMP-9 có thể dẫn đến
sự thay đổi kiểu hình của protein và gây ra những nguy cơ của bệnh mạch vành
(Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Đa hình gen liên quan tới sự tăng biểu hiện của MMP-9 và bệnh tim
mạch (Yabluchanskiy et al., 2013)
Bệnh

Đa hình gen

Chứng tăng huyết áp

-1562C/T, R279Q, 836GA

Chứng xơ vữa động mạch

-1562C/T, R279Q, số lượng đoạn lặp (CA)n >22

Nhồi máu cơ tim

-1562C/T, R279Q, R668Q
- 18 -