Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của vi rút HIV type b

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 1

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Ý nghĩa
AIDS
Acquired Immunodeficiency Syndrome
Amp
Ampicillin
APS
Amonium persulphate
Bp
Base pair
BSA
Bovine Serum Albumin
CBB
Comassie Brillant Blue
DNA
Deoxyribonucleic acid
Dntp
2’-deoxyribonucleoside 5’-triphosphate
ĐC
Đường chạy
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylen Diamin Tetraacetic Acid
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EtBr
Ethidium Bromite
HIV
Human Immunodeficency Virus
IPTG
Isopropylthio-β-D-Galactosidase
Kb
Kilo base
KDa, Da
Kilo Dalton, Dalton
LB
Lauria-betani medium
LBA
Lauria broth containing ampicillin
mRNA
Messeger RNA
OD
Optical density
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 2

PVDF
Polyvinylidene difluoride
RNA
Ribonuclecin Acid

SDS
Sodium dodecyl sulphat
SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphat-Polyacrylamide gel
electrophoresis
TAE
Tris-Acetate-EDTA
Taq
Thermus aquaticus
TBS
Tris Buffered Saline
TE
Tris-EDTA
TEMED
N,N,N’,N’ – Tetramethylenediamine
TTBS
Tween-Tris Buffered Saline
Trx
Thioredoxin
v/p
Vòng/phút
v/v
Thể tích/thể tích
w/v
Trọng lượng/thể tích
X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D
galactopyranosite

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 3


MỞ ĐẦU
Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đương đầu với đại dịch HIV/AIDS.
Virus HIV sau khi xâm nhiễm sẽ làm suy giảm miễn dịch khiến cơ thể không
còn sức đề kháng với mọi bệnh tật, cơ thể suy kiệt dần và dẫn tới tử vong.
HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cướp đi hàng triệu sinh mạng trên thế giới
mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã
hội làm ảnh hưởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia. Kể
từ khi phát hiện bệnh (6/1981) cho tới nay, AIDS đã cướp đi mạng sống của 40,3
triệu người trên thế giới và trở thành một trong những căn bệnh gây chết người
nhiều nhất trong lịch sử nhân loại. Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới
(WHO), HIV/AIDS đang được xếp hàng thứ 3 trong các nguyên nhân gây tử
vong (chiếm 7,5%) ở các nước đang phát triển. Việt Nam hiện đang được xếp
vào danh sách các nước có tỷ lệ nhiễm HIV/AIDS cao trên thế giới, và là nước
có số người nhiễm HIV cao thứ 6 Châu Á. Số lượng người nhiễm HIV/AIDS gia
tăng kéo theo nhu cầu chăm sóc và hỗ trợ ngày càng tăng.
Cho đến nay vẫn chưa có vaccine phòng bệnh, mặt khác thuốc điều trị
HIV/AIDS được sử dụng rất hạn chế vì giá thành quá cao, và sự gia tăng tính
kháng thuốc. Việc chẩn đoán, sàng lọc chính xác các trường hợp dương tính để
có hướng dự phòng và điều trị là một khâu mang tính then chốt trong phòng
chống HIV. Các kit chẩn đoán HIV hiện nay phải nhập ngoại 100% với giá
thành cao, rất khó kiểm soát độ nhạy, độ đặc hiệu, mất công vận chuyển tốn kém

và không chủ động sản xuất để sử dụng trên diện rộng với hàng triệu mẫu máu
cần kiểm tra. Để phù hợp với các phân type HIV lưu hành tại Việt Nam, cần
nghiên cứu sản xuất các kit chẩn đoán dựa trên type virus tại nước ta.
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 4

Với đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên gp120 của
virus HIV phân type B lưu hành tại Việt Nam”; chúng tôi hi vọng có thể phục
vụ cho việc sản xuất các kit chẩn đoán HIV cho bệnh nhân tại Việt Nam có độ
chính xác tuyệt đối và độ nhạy cao.
Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện
Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.














Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 5

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/AIDS
1.1.1. Định nghĩa
AIDS (Acquired Immuno Deficiency Syndrom) là một hội chứng của nhiều
bệnh nhiễm trùng cơ hội (lao, viêm phổi, nấm, ung thư, viêm da, lở loét toàn
thân hoặc suy kiệt - những bệnh này nặng dần lên có thể dẫn đến cái chết), mà
người nhiễm HIV gặp phải do hệ miễn dịch của cơ thể bị tổn thương hoặc bị phá
hủy nặng nề. AIDS được coi là giai đoạn cuối của quá trình nhiễm HIV. Tuy
nhiên, mỗi người khi mắc AIDS sẽ có những triệu chứng khác nhau, tùy theo
loại bệnh nhiễm trùng cơ hội mà người đó mắc phải, và khả năng chống đỡ của
hệ miễn dịch mỗi người [24] [35].
Khi virus HIV xâm nhập vào trong cơ thể người, sẽ gây đáp ứng miễn dịch
thứ phát do mất tế bào lympho T
CD4
(hỗ trợ). Các tế bào CD4 + T-lymphocyte
đóng một vai trò thiết yếu đối với sự hoạt động của hệ thống miễn dịch. Suy
giảm miễn dịch do mất tế bào T
CD4
dẫn đến nhiễm trùng cơ hội và ung thư. Ở
người bình thường, lượng tế bào T
CD4
tương đối cao. Khi virus HIV xâm nhập
thì lượng tế bào này bắt đầu giảm xuống tuy nhiên vẫn giữ ở mức cao, trên 500
tế bào/mm
3
máu. AIDS là tất cả những người nhiễm HIV mà khi tế bào T
CD4
<
200 tế bào/mm

3
máu, dù chưa có triệu chứng lâm sàng. Thời gian trung bình từ
khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS là khoảng 12 - 13 năm. Một khi đã
bị AIDS, nạn nhân thường chết sau 18-24 tháng [4].
1.1.2. Sự xuất hiện của HIV/AIDS
Năm 1959, tại Zaize - châu Phi, lần đầu tiên phát hiện HIV dương tính trong
mẫu máu của bệnh nhân. Tháng 3/1981 nhiều trường hợp ung thư da Kaposi
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 6

được báo cáo ở New York; nguyên nhân của tình trạng này lúc đó chưa được
biết. Tháng 6/1983, Luc Montagnien và Barré Sinousi đã phân lập được virus
gây bệnh và đặt tên là LAV (Lymphadenopathy asoociated virus – virus liên
quan đến bệnh hạch). Năm 1984, Robert Gallot đã phân lập được 1 virus có ái
tính với Lympho T của người nên đặt tên là HTLV type III (Human
lymphotrophic virus type III). Cùng năm đó Levy đã phân lập được 1 virus có
liên quan đến hội chứng suy giảm miễn dịch và đặt tên là ARV (AIDS related
virus). Đến năm 1986, cả 3 được thống nhất gọi là virus gây bệnh suy giảm miễn
dịch trên người, viết tắt là HIV-1. Năm 1985, Barin và cộng sự phân lập được
HIV thứ 2 ở Tây Phi, đặt tên là HIV-2. HIV-2 có những đặc tính rất giống với
virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ viết tắt là SIV cũng ở Tây Phi [12][24].
Trên huyết thanh cất giữ và nay khi thử lại với HIV-1, HIV-2 thì huyết thanh
của người mắc bệnh ở Zaire cất giữ từ năm 1959 đã dương tính với HIV-1. HIV-
1 cũng đã được phân lập trên 1 bệnh phẩm của bệnh nhân ở Zaire cất giữ từ năm
1976. Trên cơ sở nghiên cứu dịch tễ học thì HIV-2 có thể đã có ở Tây Phi từ năm
1966. Như vậy, có thể giả định HIV đã xuất hiện từ những năm 60 của thế kỷ
này hoặc trước đó vài trục năm. Nhưng đến thập kỉ 80 mới bùng phát thành đại
dịch HIV/AIDS [12][20].
1.1.3. Tình hình dịch bệnh

1.1.3.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
Theo UNAIDS, ước tính đến cuối năm 2009, đầu năm 2010; trên thế giới có
khoảng 65 triệu người đã nhiễm HIV/AIDS trong đó, khoảng 25 triệu người đã
chết vì căn bệnh này; 40,3 triệu người đang chung sống với HIV/AIDS. Hàng
năm có khoảng 1,8 triệu người đã tử vong do các bệnh liên quan đến AIDS. Con
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 7

số tử vong lên đến đỉnh điểm khoảng năm 2004, và do sự mở rộng của điều trị
kháng virus, và giảm 19% từ năm 2004 đến năm 2009. Đến đầu năm 2010, có
16.600.000 trẻ mồ côi do AIDS. Khoảng một nửa số người nhiễm HIV ở độ tuổi
25. AIDS là nguyên nhân thứ hai gây tử vong nhiều nhất trong độ tuổi 20-24 trên
thế giới [33].

Hình 1.1: Sơ đồ phân bố số lượng người nhiễm HIV/AIDS trên thế giới 2009
Tổng số người nhiễm HIV hàng năm vào khoảng 2,5 triệu. Mỗi ngày có gần
13.000 người nhiễm HIV trong đó có 50% là phụ nữ, 50% là thanh thiếu niên độ
tuổi 15-24. Đặc biệt, theo báo cáo của Liên hợp quốc: Trong những năm trở lại
đây, phụ nữ đang trở thành đối tượng có HIV ngày càng nhiều hơn nam giới, và
nguy cơ mắc HIV ở phụ nữ ngày càng lớn hơn nam giới [33].
Các khu vực khác trên thế giới như Tây, Trung, Đông Âu, Trung Á và Bắc Mỹ
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 8

có tỉ lệ nhiễm mới là tương đối ổn định trong vòng 5 năm trở lại đây. Ở Châu Á có
khoảng 1 triệu người nhiễm mới mỗi năm; chiếm 20% số trường hợp nhiễm mới
trên toàn thế giới [15] [22].

Hình 1.2 : Sơ đồ số lượng người đang sống chung với HIV từ năm 1990-2009
trên thế giới

1.1.3.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
Tính đến ngày 31/12/2010, đại diện Cục Phòng chống HIV/AIDS Việt Nam
cho biết: Số trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống là 183.938 người. Số bệnh nhân
AIDS hiện tại là 44.938 người. Số người nhiễm HIV đã tử vong là 49.477 trường
hợp [37]. Tính riêng trong 9 tháng đầu năm 2010, toàn quốc đã phát hiện được
9.128 người nhiễm HIV, 3.841 bệnh nhân AIDS và 1.498 người tử vong do AIDS.
Việt Nam ước tính đến năm 2011 có khoảng 311.500 người bị nhiễm căn bệnh thế
kỷ này [33].
Số lượng người nhiễm HIV/AIDS tập trung chủ yếu ở các thành phố lớn và điển
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 9

hình là thành phố Hồ Chí Minh với 42.454 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống,
tiếp theo là Hà Nội với 16.830 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống, Thái Nguyên
với 5.206 trường hợp nhiễm HIV hiện còn sống….[1] [2]. Cho đến hết 11/2010, đã
có trên 74% số xã, phường và 97,8% số quận/huyện trong toàn quốc đã có số người
nhiễm HIV/AIDS [3].
Phương thức lây truyền HIV ở nước ta chủ yếu là qua đường tình dục và tiêm
chích ma túy. Phân tích hình thái nguy cơ lây nhiễm cho thấy, trong số những
người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 9 tháng đầu năm 2010 có 49% bị
nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10%
không rõ đường lây [2][3].

Hình 1.3: Ước tính số trường hợp nhiễm HIV/AIDS tại TP.HCM và Việt Nam từ
2006-2010
1.1.4. Dịch tễ học

1.1.4.1. Đƣờng lây
Cho đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện HIV có trong: tinh dịch, chất nhờn
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 10

âm đạo, máu, các yếu tố đông máu, huyết tương, nước bọt, nước tiểu, dịch não tủy,
nước mắt và sữa mẹ. Tuy nhiên chỉ có 3 phương thức lây truyền được xác định là:
- HIV qua đường tình dục khác giới chiếm 71%, qua đường tình dục đồng giới
(nam) chiếm 15%. Nguy cơ lây nhiễm HIV tăng lên khi có bệnh lý gây viêm
nhiễm ở bộ phận sinh dục, có vết sây xát xảy ra khi giao hợp hoặc có quan
hệ tình dục với nhiều người.
- Lây truyền qua đường máu: Do truyền máu và các sản phẩm của máu, ghép
tạng… không kiểm soát được HIV, do dùng chung bơm, kim tiêm (nguy cơ
cao với người tiêm chích ma túy), do dùng chung kim châm cứu, kim xăm da
v…v…
- Lây truyền từ mẹ sang con: Người mẹ nhiễm HIV có thể truyền cho con
trong thời kỳ mang thai, trong khi đẻ và cũng được xác nhận có thể lây sau
khi đẻ do trẻ bú sữa mẹ.
Ngoài các phương thức lây truyền như trên, hiện nay chưa xác định được các
phương thức lây khác như đường hô hấp, qua muỗi hoặc côn trùng đốt, hôn, dùng
chung bát đũa……. [5].
1.1.4.2. Cơ chế sinh bệnh
HIV có ái tính chủ yếu với tế bào lympho T
CD4
. Ngoài ra HIV còn có thể xâm
nhập vào nhiều loại tế bào khác nhau như: Lympho bào B, đại thực bào, tế bào
nguồn, tế bào hình sao, tế bào xơ non…v v… HIV gây hủy diệt các tế bào T
CD4
, do

vậy dẫn đến suy giảm miễn dịch bao gồm cả miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch
thể. Các rối loạn chính trong đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS
gồm:
- Giảm tế bào lympho T toàn phần, đặc biệt là CD4 giảm nặng, tỷ lệ
CD4/CD8 giảm (< 1).
- Giảm chức năng các tế bào miễn dịch: giảm hoặc mất đáp ứng da, giảm khả
năng tăng sinh tế bào đối với các chất gây phân bào và kháng nguyên, giảm
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 11

đáp ứng độc tế bào do giảm chức năng tế bào CD8 và tế bào NK (tế bào giết
tự nhiên).
- Tăng gamma globulin
- Tăng phức hợp miễn dịch, tăng các tự kháng thể và một số protein khác
trong huyết thanh.
- Giảm đáp ứng kháng thể nguyên phát đối với các kháng nguyên mới tiếp xúc
lần đầu.
- Giảm gamma interferon [5].
Hậu quả của các rối loạn đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS là
bệnh nhân bị các bệnh nhiễm trùng cơ hội (thường do các vi khuẩn, virus, nấm, ký
sinh trùng sinh sản trong tế bào) hoặc mắc các loại ung thư đặc biệt (Sarcoma
Kaposi). Thời gian trung bình từ khi nhiễm HIV đến khi tiến triển thành AIDS
khoảng 10 – 12 năm. Sự tiến triển rất khác nhau giữa các bệnh nhân, phụ thuộc vào
cơ thể bệnh nhân, yếu tố virus và tác dụng của điều trị. Mỗi giai đoạn bệnh liên
quan chặt chẽ đến số lượng tế bào CD4 [5].
Bảng 1.1: Số lượng tế bào T
CD4+
trong máu ở các giai đoạn nhiễm bệnh
Giai đoạn

Lƣợng tế bào T
CD4+
trong máu
Bình thường
450 – 1280 tế bào/mm
3
máu
Có suy giảm miễn dịch
< 400 tế bào/mm
3
máu
Suy giảm miễn dịch trầm trọng
(chuyển sang AIDS)
< 200 tế bào/mm
3
máu

1.1.4.3. Các giai đoạn của quá trình nhiễm HIV/AIDS
Tiến triển từ nhiễm HIV đến AIDS là một quá trình kéo dài. Do vậy các biểu
hiện lâm sàng rất phức tạp và tùy thuộc các giai đoạn khác nhau. Năm 1986, CDC
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 12

(Center Diseases Control and Prevention) – Hoa Kỳ đã phân loại quá trình nhiễm
HIV/AIDS thành các giai đoạn [10].
- Giai đoạn 1: Giai đoạn sơ nhiễm (hay giai đoạn cửa sổ);
- Giai đoạn 2: Nhiễm HIV không kèm triệu chứng (giai đoạn thầm lặng);
- Giai đoạn 3: Nhiễm HIV có triệu chứng (giai đoạn hội chứng hạch dai dẳng);
- Giai đoạn 4: Giai đoạn AIDS. Trong giai đoạn này chia thành 2 thời kỳ:

Phức hợp cận AIDS và AIDS thực sự.
1.2. Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immune deficiency virus –
HIV)
1.2.1. Nguồn gốc HIV
Hiện nay, hầu hết các nhà khoa học cho rằng virus HIV có nguồn gốc từ virus
SIV (virus gây nội dịch không kèm triệu chứng ở nhiều loài khỉ tại Châu Phi).
Khảo sát tiến hành năm 1999 tại Đại học Alabama nhận thấy rằng HIV-1 rất giống
SIV tinh tinh (SIVcpz); và virus này đã có lúc vượt qua được giới hạn loài để đi từ
tinh tinh sang người. Họ đưa ra kết luận rằng tinh tinh hoang dã đã bị nhiễm cùng
lúc 2 chủng SIV khác nhau, 2 chủng này “giao phối “ và sinh ra 1 chủng virus thứ
3, chủng tứ 3 này có thể đã được lây sang những con tinh tinh khác, và điều đáng
chú ý hơn, là chủng này có khả năng gây nhiễm cho người và gây ra AIDS [32].
Sau 17 năm nghiên cứu thực địa tại các vùng Đông, Tây, Xích đạo châu Phi, các
nhà khoa học đã chứng minh có ít nhất có 40 loài khỉ khác nhau bị nhiễm với 40
type SIV khác nhau; 3 nhóm HIV-1 và 8 phân type HIV-2 khác nhau là kết quả của
11 biến cố nhảy sang loài khác, trong đó có sự tham gia của 8 loài khỉ mặt xanh và
3 tinh tinh đối với tất cả các trường hợp gây nhiễm ở người. Họ cũng kết luận rằng
3 nhóm HIV-1 (M, N và O) đều phát xuất từ SIV tìm thấy ở loài tinh tinh
chimpanzee, và mỗi nhóm đại diện cho 1 biến cố "nhảy" (crossover) riêng rẽ từ loài
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 13

tinh tinh sang người [32]. HIV-2 tương ứng với SIVsm, là 1 chủng của SIV tìm
thấy ở loài khỉ mặt xanh (sooty mangabey), là loài khỉ bản địa vùng Tây Phi. Type
HIV-1, có độc lực mạnh hơn, gây đại dịch nhiều hơn. Tuy nhiên, chủng virus này
vẫn còn có một số khác biệt với HIV ở nhiều điểm quan trọng [12][18].

Hình1.4: Nguồn gốc các type HIV
1.2.2. Vài nét về virus HIV

Virus HIV là 1 retrovirus; thuộc họ retroviridae. HIV thuộc nhóm Lentivirus.
Mang đặc điểm của retrovirus
- Là loại RNA virus có enzyme phiên mã ngược mà bản chất là DNA
polymerase phụ thuộc vào RNA. Enzyme phiên mã ngược này cho phép
tổng hợp DNA kép trong tế bào retrovirus thâm nhập.
- DNA mới được tạo ra đều có những đoạn tự lặp lại, có kích thước khác nhau
được gọi là đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ vậy mà gắn được một cách ổn định
trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ và trở thành một tiền virus (provirus).
Tiền virus này sẽ như một gen của tế bào và truyền sang cho thế hệ khác khi
có sự phân bào, hoặc được phiên mã thành RNA thông tin, tổng hợp protein
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 14

của virus để hình thành một virus hoàn chỉnh [10].
Mang đặc điểm của Lentivirus
- Phát triển chậm.
- Không biến đổi tế bào nhưng lại làm tiêu hủy tế bào.
- Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [10].
1.2.3. Phân loại và phân type
HIV là 1 virus có tính thay đổi cao, đột biến dễ dàng. Điều này có nghĩa là ngay
trong cơ thể của 1 người bị nhiễm cũng có nhiều chủng HIV. Dựa trên những điểm
tương tự về di truyền, ta có thể phân loại vô số các chủng virus khác nhau đó thành
type, nhóm và phân type.

Hình1.5: Sơ đồ phân type virus HIV
Có 2 type HIV [21]:
 HIV-1: Là loại virus chủ yếu gây nên đại dịch AIDS trên toàn thế giới; và
được phân thành 4 nhóm.
 HIV-2: tập trung ở Tây Phi và hiếm khi được tìm thấy ở nơi khác. HIV-2 có

8 phân type; bao gồm: A, B, C, D, E, F, G, H.
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 15

Cả 2 type đều lây truyền qua quan hệ tình dục, qua đường máu, và từ mẹ sang
con; đều gây bệnh cảnh lâm sàng AIDS khá giống nhau và khó phân biệt. Tuy
nhiên, HIV-2 không dễ lây như HIV-1, và thời gian kể từ lúc mới bắt đầu nhiễm
cho đến khi xuất hiện bệnh ngắn hơn trường hợp HIV-1. HIV-1 gây nên đại dịch
trên toàn thế giới; khi nhắc đến HIV mà không đề cập đến loại virus, thì chỉ chung
HIV-1 [21].
Các chủng HIV-1 có thể được phân thành 4 nhóm: nhóm “M” (major= chính);
nhóm “O” (outlier= ngoài rìa); nhóm “N” (new= mới hoặc non- M non- O); và
nhóm P (một chủng mới, có quan hệ rất gần với virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ
được phát hiện ở người phụ nữ Cameroon vào năm 2009). Nhóm O dường như chỉ
xuất hiện tại vùng Tây Phi, còn nhóm N cực kỳ hiếm, chỉ mới được phát hiện năm
1998 tại Cameroon. Trên 90% các trường hợp nhiễm HIV-1 đều thuộc nhóm M.
Trong HIV-1 nhóm M, có ít nhất là 9 phân type (subtype hoặc clade). Những phân
type đó là A, B, C, D, F, G, H, J và K [12] [22].
Đôi khi 2 virus thuộc 2 phân type khác nhau cùng hiện diện trong tế bào của
người nhiễm và chúng hoà trộn các chất liệu di truyền để tạo thành 1 virus lai
(hybrid) mới. Những chủng nào gây nhiễm được cho người khác sẽ được gọi là
CRFs (các thể tái tổ hợp lưu thông = circulating recombinant forms). Hiện nay đã
phát hiện có đến 30 CRF [22].
Các phân type HIV -1, CRF được phân bố không đều trên thế giới, trong đó các
phân type B và C phân bố rộng rãi nhất. Phân type C chủ yếu gặp tại miền đông và
Nam Châu Phi, Ấn độ và Nepal và gây ra các vụ dịch HIV nặng nề nhất; khoảng
một nửa các trường hợp nhiễm hiện nay là do phân chủng này.
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 16


Hình1.6: Phân bố các phân type HIV-1 M theo vùng địa lý ( 2008 )
Về mặt lịch sử, phân type B là phân type thường gặp nhất tại châu Âu, châu Mỹ,
Nhật, và châu Úc. Hiện nay ít nhất 25 % những trường hợp mới nhiễm tại châu Âu
là do các phân type mới khác. Ở Việt Nam, 97% số người nhiễm HIV là do virus
phân type CRF01_AE; còn lại là các phân type B; và một phần rất nhỏ các type
khác [32].
1.2.4. Đặc điểm của virus HIV
1.2.4.1. Đặc điểm về hình thái
Virus HIV có dạng hình cầu, đường kính 80-120nm. Hạt virion có hình dạng
khối đa diện, với 20 mặt tam giác đều, đối xứng [10].
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 17


Hình1.7: Cấu trúc virus HIV
Từ ngoài vào trong cấu tạo virus gồm 3 lớp:
- Lớp vỏ: Là một màng lipid kép có những gai nhú khoảng 72 cái (theo lý
thuyết Gelderblom). Gai nhú là một glycoprotein có độ dài 9-10 nm và chiều
rộng 14nm có trọng lượng phân tử 120 kDa, vì vậy được đặt tên là protein
gp120. Gắn với gai nhú màng ngoài lipid kép là các glycoprotein xuyên
màng có trọng lượng phân tử 41kDa và ký hiệu là gp41 [12].
- Protein nền (matrix protein): ngay sát lớp vỏ có một lớp protein nền được tạo
thành từ các phân tử protein p17 [10].
- Lõi capsid: lõi hình trụ hơi lệch tâm cũng có một vỏ bọc protein (P24) , trong
nhân có bộ gen gồm hai sợi RNA có gắn enzyme sao mã ngược, một phân tử
RNA thông tin và các protein khác là P7 và P9 [10][12].

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 18


Hình 1.8: Vị trí các protein trong virus HIV
1.2.4.2. Cấu trúc gen và chức năng
Vật chất di truyền của HIV là sợi 2 RNA đơn (+) giống nhau. Mỗi sợi dài 8,5 –
9,5 kb; có khoảng 9200 cặp bazơ với hai nhóm gen: nhóm gen cấu trúc và nhóm
gen điều hòa sinh trưởng [10].

Hình 1.9: Cấu trúc genome của virus HIV-1
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 19

Nhóm gen cấu trúc
 gag (group-specific antigen): mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu nhóm gồm
các protein cấu trúc bên trong : p17 (protein nền MA, tương tác với gp41);
p24 (protein lõi CA); p6 (protein lõi, gắn với Vpr); p7 (nucleocapsit NC,
gắn với ARN p1 và p2) [10].
 pol (polymerase): mã hóa cho các enzyme: protease (p10: phân cắt
polyprotein Gag và Gag-Pol), Reverse transcriptase (p66 và p51: có bản chất
là DNA polymerase phụ thuộc RNA và protein p66 có hoạt tính Rnase H) và
Integrase (cài xen provirus vào nhiễm sắc thể tế bào chủ) [10].
 env (envelope): mã hóa cho các protein vỏ gp120 (protein vỏ SU, giúp virus
gắn xâm nhập vào tế bào chủ); gp41 (protein xuyên màng TM, đóng vai trò
chính trong quá trình dung hợp tế bào) [10].
Nhóm gen điều hòa
 tat: mã hóa cho protein tat (Trans Acivator of Transcription – yếu tố hoạt

hóa phiên mã), có vai trò quan trọng trong sự tăng cường phiên mã[14].
 rev: mã hóa cho protein rev (Regulator of Expression of Virion proteins –
yếu tố điều hòa sự biểu hiện các protein của virus), tăng cường biểu hiện các
RNA không được cắt nối và các RNA cắt nối một lần. Rev được tích lũy
trong nhân và chuyển virus từ pha tổng hợp protein sớm sang pha tổng hợp
protein muộn bằng cách gắn với yếu tố RRE (Rev Response Element : yếu tố
phản ứng Rev) có trong các bản sao RNA virus không được cắt nối và được
cắt nối một lần [10][14].
 nef : mã hóa cho protein nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hòa
âm), ức chế hoặc tăng cường sự tái bản virus, phụ thuộc vào chủng và loại tế
bào. Trong các tế bào nhiễm, nef sẽ thay đổi con đường vận chuyển
endosome, qua đó giảm sự biểu hiện các protein CD4, MHC I và MHC II ở
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 20

bề mặt tế bào nhiễm. Những thay đổi này có thể bảo vệ các tế bào nhiễm
HIV khỏi sự giám sát miễn dịch [14].
 vif : mã hóa protein vif (Virion Infectivity Factor – yếu tố lây nhiễm của
virus), làm tăng tính thâm nhập của virus vào các tế bào chủ tự do và giúp
ngăn cản sự xâm nhập của các enzyme tế bào chủ kìm hãm sự tái bản virus
vào các virion mới hình thành [10].
 vpu : mã hóa protein vpu (Viral Protein U : protein U của virus), có tác dụng
tăng cường sự giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm sự biểu hiện của CD4,
MHC I trên bề mặt tế bào [10].
 vpr: mã hóa protein vpr (Viral Protein R : protein R của virus), có tác dụng
tăng cường sự tái bản virus trong các tế bào ban đầu, là tín hiệu định vị nhân
[14][21].
1.2.5. Chu trình sống của virus HIV
Sau thời gian bị nhiễm virus, những tế bào bị nhiễm virus sẽ di chuyển đến tổ

chức lympho ngoại vi, tại đây virus nhân lên nhanh chóng. Quá trình này diễn ra
qua các giai đoạn theo sơ đồ vòng đời của virus HIV (Hình 1.10), bao gồm các giai
đoạn:
Giai đoạn bám và gắn kết vào mặt tế bào: HIV bám vào bề mặt tế bào cảm thụ
nhờ sự phù hợp giữa thụ thể đặc hiệu tế bào gp120 của virus. Trong đa số các
trường hợp, các thụ thể này là các phân tử CD4 của tế bào lympho T hỗ trợ hoặc
một số tế bào khác như bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào và 1 số tế bào dòng
lympho [10][12].
Giai đoạn xâm nhập và chui vào tế bào: Nhờ phân tử CD4 và các đồng thụ thể
CCR5 với đại thực bào và CXCR4 với tế bào lympho T, virus được hòa màng vỏ
của HIV với màng tế bào và xâm nhập vào tế bào chủ [10].
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 21


Hình 1.10: Vòng đời của virus HIV
Giai đoạn cởi bỏ vỏ và tiến hành sao chép ngược: Enzyme Reverse Transcriptase
sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA kép từ khuôn RNA genome virus. DNA
kép được tạo ra từ sự phiên mã ngược (provirus-tiền virus) dài hơn RNA genome.
Mỗi đầu có trình tự U3-R-U5, được gọi là đoạn lặp dài ở đầu chuỗi (LTR: long
terminal repeat). LTR chứa hầu hết các tín hiệu điều hòa phiên mã, chứa một
promoter, một đoạn tăng cường (enhancer), các tín hiệu kết thúc phiên mã và tín
hiệu gắn đuôi polyA. Quá trình sao chép ngược này có thể bị lỗi và dẫn đến xuất
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 22

hiện các đột biến. Những đột biến như vậy có thể gây ra sự kháng thuốc [10][12].
Giai đoạn nhân lên: Nhờ các tín hiệu định vị nhân, DNA chuỗi kép chui vào nhân

tế bào qua lỗ nhân. Dưới tác dụng của enzyme Integrase và sự có mặt của đoạn
LTR, DNA chuỗi kép sẽ được gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. DNA virus
được tích hợp này sau đó có thể nằm yên không hoạt động trong giai đoạn tiềm
tàng của quá trình xâm nhiễm HIV.Tiền virus cũng có thể phiên mã để tạo thành
RNA genome và các mRNA dùng trong quá trình tạo thành virus mới.Trong quá
trình phiên mã, nhờ RNA-pol II của tế bào, tiền virus được tích hợp sẽ được phiên
mã thành các bản sao RNA. Bản phiên mã ban đầu có chiều dài gần bằng RNA
monomer (khoảng 9,3kb). Sau đó một phần được gắn đuôi polyA ở đầu 3’ và gắn
mũ methylguanin ở đầu 5’ tạo thành các mRNA để dịch mã tạo các protein, phần
còn lại không được gắn mũ và đuôi polyA sẽ đóng vai trò làm RNA genome của
virus con cháu [12].
Giai đoạn nảy chồi: Từ các thành phần đã được tổng hợp, các hạt HIV mới được
lắp ráp bắt đầu ở màng sinh chất của tế bào chủ. Protein env (GP160) bắt đầu được
glycosyl hóa ở màng lưới nội chất có hạt và được vận chuyển vào phức hệ Golgi.
Tại đây, chúng tiếp tục được glycosyl hóa và phức hợp trimer của gp160 được hình
thành trước khi bị enzyme Protease của tế bào chủ trong bộ máy Golgi phân cắt
thành 2 glycoprotein vỏ gp41 và gp120 và được vận chuyển đến màng sinh chất.
Các polyprotein gag và gag-pol cũng liên kết với bề mặt bên trong của màng sinh
chất, đồng thời cũng gắn với RNA genome của HIV khi hạt virus bắt đầu nảy chồi
ra từ tế bào vật chủ. Trong hoặc sau khi nảy chồi, Protease của HIV sẽ phân cắt các
polyprotein gag và gag-pol thành các enzyme và protein cấu trúc của HIV. Giai
đoạn phân cắt có thể bị ức chế bởi Protease. Các thành phần cấu trúc khác nhau sau
đó được lắp ráp lại tạo thành hạt HIV trưởng thành [12].
Giai đoạn trưởng thành: Các hạt virus nảy chồi giải phóng khỏi tế bào và tiếp tục
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 23

gây nhiễm cho những tế bào mới [10].
1.1.6. Glycoprotein vỏ gp 120 của virus HIV

Gp120 là tên của các glycoprotein hình thành các gai nhô ra khỏi một hạt virus
HIV; và có 3 chức năng: Tìm các thụ thể thích hợp cho sự xâm nhập của virus; gắn
hạt virus với tế bào; trợ giúp và chỉ dẫn sự tiêm các vật liệu virus, trong đó chức
năng chính là liên kết với thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào người [15].
Gp120 có kích thước khoảng 1500 nucleotide (1,5kb), và được tổng hợp từ
khoảng 500 acid amin. 3 phân tử gp 120 kết hợp như các heterdimer với một phân
tử glycoprotein xuyên màng (gp 41), tạo thành một cấu trúc trimer để hình thành
gai vỏ. Vị trí liên kết CD4 của gp 120 bao gồm 400-430 acid amin [15].

Hình 1.11: Mô hình 1 gai trên bề mặt virus HIV
GP 120 có bản chất glycoprotein, được mã hóa bởi gen vỏ env. Gen env được
dịch mã trong màng lưới nội chất có hạt từ các mRNA đã được cắt nối thành một
polyprotein (gp 160). Tại đây, phân tử polyprotein mới hình thành được glycosyl
hóa một phần và được vận chuyển đến bộ máy Golgi, nơi chúng sẽ bị protease của
tế bào chủ (furin) cắt ra thành các phân tử SU (gp120) và TM (gp41) [12].
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 24


Hình1.12: Quá trình tổng hợp gp120 trong tế bào
Glycoprotein gp120 không có domain xuyên màng. Trình tự mã hoá gp120 ở
những chủng HIV khác nhau có biến đổi cao. Sự biến đổi này có thể do biến đổi
sắp xếp ở 5 domain siêu biến (V1-V5); 5 domain siêu biến này tương ứng nằm ở
các vị trí từ acid amin thứ 128-152; từ 182-195; từ 300-330; từ 395-415; từ 460-
467 [21].

Hình 1.13: gp120 có 5 domain siêu biến (V1-V5)
Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học 25

Trong đó vùng siêu biến thứ 3, gọi là vòng V3 đặc biệt quan trọng. Vùng này
khoảng 30 amino acid được tạo bởi cầu nối disulfide giữa 2 Cystein sau cùng. Là
một domain trung hòa kháng thể, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính
hướng của virus. Vùng V3 cùng với các trình tự bảo thủ vẫn chưa được bộc lộ khi
liên kết với CD4 và là yếu tố quyết định chủ yếu của tính thay đổi thụ thể
chemokin. Trong vùng V3 này, ngoài vùng bảo tồn gồm 5 aminoacid nằm trên đỉnh
vòng, các aminoacid còn lại thường thay đổi tạo nên các kháng nguyên khác nhau
trên bề mặt của virus, điều này gây khó khăn cho hệ miễn dịch trong việc sản xuất
ra các kháng thể đặc hiệu kháng các dạng khác nhau của virus HIV [13].
GP 120 có 4 vùng tương đối ổn định được gọi là C1 đến C4; tương ứng nằm ở
vị trí từ acid amin 33-60; từ 87-126; từ 231-276; từ 460-467. Những vùng này đóng
vai trò duy trì các cấu trúc cơ bản của virus [21].
Gp 120 được biết đến là một protein bị đường hóa nặng nhất, chứa tới 50% là
cacbohydrat. Các phân tử đường đóng vai trò là các “ mũ” trên các gai gp 120, sẽ
bảo vệ gp 120 thoát khỏi sự phát hiện của hệ miễn dịch. Vì vậy, nó rất dễ biến đổi
và lẩn tránh hệ miễn dịch của con người [17][19].

Hình 1.14: Tạo phức hợp gp120-CD4-đồng thụ thể