hướng dẫn THỰC HÀNH môn độc CHẤT học ĐỘNG vật và THỰC PHẨM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
BỘ MÔN THÚ Y

GIAO TRÌNH

HƢỚNG DẪN THỰC HÀNH MÔN
ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM
Food and Animal Toxicology
AN 407C

Ly Thi Lien Khai, PhD

Cần Thơ, 3/2015


THỰC HÀNH

ĐỘC CHẤT HỌC ĐỘNG VẬT VÀ THỰC PHẨM
Unit 1
Bài .1 Detection of the borax residues in fresh meat and animal
products .
Xác định sự hiện diện của hàn the trong thịt và các sản phẩm của
thịt.
1. Trang thiết bị và dụng cụ
- Lò nung, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật.
- Bình tam giác, đũa thủy tinh, ống nghiệm, cốc thủy tinh, ống đong,
phểu thủy tinh, đĩa Petri, ống hút, chậu thủy tinh, nhiệt kế, cối, chày, dao, kéo,
và một số dụng cụ khác…
2. Hóa chất: Cồn, nước cất, HCl, H3BO3, H2SO4, CaCl2, CaO, methyl
orange, phenolphtalein, malnitol …
3. Mẫu vật thí nghiệm:

Mẫu vật được lấy từ các chợ và siêu thị tại TP. Cần Thơ bao gồm: thịt
bò, thịt heo, cá biển, chả lụa.
4. Điều chế giấy thử hàn the
- Cắt tờ giấy lọc thành những mãnh có kích thước 6 x 1cm.
- Hòa tan 1gram Curcumin vào 100ml cồn 96o lắc mạnh bình tam giác
trong 5 phút, sau đó nhúng các mãnh giấy lọc vào dung dịch, sau đó lấy ra
đem sấy khô (40oC), ta được giấy thử hàn the.
Chú ý bảo quản giấy thử hàn the chỗ tối tránh ánh sáng.
5. Tạo bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the (AOAC,1995)
- Pha dung dịch acid boric chuẩn:
+ H3BO3 1%: pha 1gram H3BO3 vào 100ml nước cất.
+ H3BO3 2%: pha 2gram H3BO3 vào 100ml nước cất.


+ H3BO3 4%: pha 4gram H3BO3 vào 100ml nước cất.
+ H3BO3 8%: pha 8gram H3BO3 vào 100ml nước cất.
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: lấy 11 ống nghiệm loại 15ml, đánh số
từ 0-10. Lần lượt hút 0,00ml; 0,5ml; 1ml; 2ml; 2,5ml; 3,5ml; 4,5ml; 5ml
H3BO3 1% cho vào 8 ống nghiệm có số thứ tự tương ứng 0-7, kế đến cho lần
lượt 5ml H3BO3 2%; 5ml H3BO3 4%; 5ml H3BO3 8% vào các ống nghiệm 8;
9;10. Sau đó pha loãng đến 10ml tất cả các dung dịch trong ống nghiệm bằng
nước cất và cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 0,7 ml HCl đặm đặc. Các dung dịch
này sẽ tương ứng với nồng độ H3BO3 là: 0,00; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,5%;
0,7%; 0,9%; 1%; 2%; 4%; 8%.
Nhúng lần lượt các tờ giấy thử hàn the đã được đánh số từ 0-10 vào
trong dung dịch tương ứng với số thứ tự trên từng ống nghiệm. Sau đó lấy tờ
giấy thử ra để ráo và đem sấy ở nhiệt độ 30-40oC.
4. Đọc bảng so màu giấy thử hàn the

Đọc bảng so màu giấy thử hàn the

1

Hàm lượng “ít”
0,1-0,4%
2
3
4

Hàm lượng “vừa”
0,5-0,9%
5
6
7
8

0,0

0,1

0,5

0,2

0,4

0,7

0,9

1,0

Hàm lượng “nhiều”
1-8%
9
10
11

2,0

4,0

8,0

% H3BO3

Bảng so màu ước lượng hàm lượng hàn the

Bảng so màu ƣớc lƣợng hàm lƣợng hàn the
theo thang điểm.
5. Phương pháp quan sát mẫu theo cảm quan
- Trạng thái:
+ Độ đàn hồi: dùng đầu ngón tay ấn vào bề mặt khối thịt, nếu độ đàn
hồi trở lại ngay là thịt tươi, nếu bề mặt thịt từ từ trở lại là thịt bắt đầu ôi, nếu
thịt lỏm xuống là thịt ôi.
+ Quan sát thịt ướt hay khô.


- Màu sắc: thịt tươi thường có màu đỏ hồng, nếu:
+ Màu tái, rỉ nước, nhão, do thịt giết mổ lúc thú sốt.

+ Sậm màu, săn cứng, do thịt giết mổ lúc thú mệt.
+ Tái, vắt ra nước, do gia súc chết lâu rồi mới sẽ thịt.

Hình 2. Điều kiện bảo quản thịt tại tại siêu thị (15-18°C).

Picture 1. Beef with borate.

Picture 1. Beef with borate.

Picture 2. Beef without borate.

Picture 2. Beef without borate.

Picture 3. Pork with numerous level of borate


-Mùi vị:
+ Thịt tươi thường có mùi vị bình thường.
+ Thịt ôi: có mùi thối, hơi khét.
+ Mùi khác thường: thịt có ướp hóa chất, kháng sinh, heo nọc…
Ngoài ra khi chúng ta dựa vào cách thức bảo quản tại cơ sở bán chúng ta
cũng có thể đánh giá được phần nào chất lượng thịt.

6.. Phương pháp phân tích định lượng hàn the
Theo phương pháp bảng so màu ước lượng
(AOAC,1995).

hàm lượng hàn the

Nêu nhận định về tác hại của hàm lựơng hàn the vừa phân tích đối với sức

khỏe người tiêu dùng.
Phương pháp xác định hàn the (Borax) trongTP.
Cần que thử, cồn 960 , HCl 4N
Cách làm: cân 10 g mẫu, nghiền nát thêm 20 ml nước cất và 5 ml HCl 4N.
Sau đó dùng que thử nhún ngậm sâu vào dd mẫu cần thu63, sấy khô.
Đọc kết quả, định lượng dựa vào thang điểm ước lượng hàm lượng hàn the có
trong TP.

Bài 2. Khảo sát dƣ lƣợng kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm,
Sữa.
Detection of the anitibiotic residues in fresh meat, poultry and
milk.
Khảo sát dƣ lƣợng kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm,
Dùng phƣơng pháp FPT (Four Plate Test) (Heitzman, 1994)
Các chủng VK: Bacillus cereus, E. coli.
Môi trường: NA (BHI, hay TSA), PCA.
Đĩa petri đường kính 90mm.
Mẫu 100g thịt nạc , bảo quản lạnh. Nếu chưa xét nghiệm ngay phải bảo quản 18oC.


Bảng 1. Vi khuẩn nuôi cấy 35oC/24h, (5x10 4CFU/ml)
Kháng sinh
Chủng VK
MT kiểm tra, pH
chuẩn
Penicillin
B. subtilis
No 10663, 6,2
Tetracycline
B. cereus

NA, 6
Flumequin
E. coli
PCA, 6

ĐK nuôi cấy
30oC/18h
30oC/18h
30oC/18h

Cách pha chế mt kiểm tra dư lượng kháng sinh:
Môi trường đã pha và hấp vô trùng, nguội 45oC cho 1 thể tích huyễn
dịch vk (bào tử) đổ 5 ml mt vào đĩa petri.
Mẫu thịt kiểm tra cắt miếng tròn, nhỏ dày 2mm, đường kinh 8mm bằng
cây gắp mẫu vô trùng chuẩn.
Mỗi đĩa đặt 6-8 lát mẫu thịt/ đĩa (Oboegbulem và fidelis, 1996). Ở giữa
đĩa đặt 1 đĩa kháng sinh chuẩn.
Ủ đĩa ở nhiệt độ thích hợp và sau 18-24h đọc kết quả: Nếu vòng vô
khuẩn ≥ 2mm kết luận mẫu thịt dương tính: có tồn dư kháng sinh

Đĩa KS chuẩn

Mẫu thịt

Bài 3. Phân lập- định danh nấm Aspergillus flavus, A. fumigatus có
trong thức ăn gia súc – Khảo sát độc lực của aflatoxin trên vịt con
Isolation of Aspergillus flavus, A. fumigatus from feed. Aflatoxin
examination in laboratory animal –baby duck.

Giống Aspergillus

Khuẩn lạc
Aspergillus
fumigatus

Khuẩn lạc Aspergillus niger

Khuẩn lạc
Aspergilus flavus

Bào tử
Aspergilus
1

Hình 2. Khuẩn lạc Aspergillus niger

Hình 3. Khuẩn lạc Aspergillus fumigatus

Khuẩn lạc Aspergillus fumigates


Sau khi xác định thức ăn có nấmđể kiểm tra các nấm Aspergillus quan sát được có
chứa độc tố aflatoxin không dùng mẫu thức ăn nầy cho vịt con ăn xem các biểu hiện
bệnh lỳ lâm sàng trên vịt thí nghiệm. Theo dõi trong 3-5 ngày. Ghi kết quả và so với
triệu chứng ngộ độc nếu có biểu hiện bệnh lý.

Bài 4
Khảo sát sự ngộ độc do các chất độc từ thực vật – Nitrate
Determine the nitrate concentration in vegetables, plant for animal feed,

and human
Chất độc nitrate thường thấy có hàm lượng nhiều, phổ biến nhất là thực vật hay
nước, nước thảy chăn nuôi và hóa chất.
Ngộ độc cấp tính khi nitrate chứa trong cỏ ở nồng độ > 1% (cỏ khô) hay 1.500 ppm
trong nước.
Ở nồng độ 2.000ppm nitrate trong nước cho bò ăn 10% P /17 ngày không gây ngộ
độc cấp tính. Nhưng liều 3.000ppm cho bò ăn 3 ngày làm bò chết do nhiễm độc cấp
tính (Dollahite và Rowe, 1974). Nồng độ 2-4% gây độc cấp tính cho đv nhai lại.
Triệu chứng: xảy ra 30’-4h sau khi bò uống hay ăn cỏ nhiễm nitrate từ 5-8 ngày. Bò
chảy nước bọt, ói, tiêu chảy và đau bụng. Bò đi tiểu nhiều do nước nhiễm nitrate,
thiếu oxy huyết. Bò khó thở, mạch ỵếu, máu có màu nâu hay socola. Run cơ, suy
kiệt, mất điều vận. Bò không di chuyển nếu ép buộc mới cử động. Vật chết trong 1224h.
Chẩn đóan: máu có màu nâu do tạo ra methemoglobin, trị methylene blue 2mg/1 lb
P, cho uống dung dịch 2-4%.
Xét nghiệm nồng độ nitrate từ chất chứa trong dạ dày, dạ cỏ, huyết tương, nước tiểu,
cỏ, nước.
Phương pháp kiểm tra nitrate có trong nước hay thực vật là lá rau, cây, cỏ
Cho 0.5g diphenylamine vào 20ml nước.
Thêm acid sulfuric cho đến 100ml. Làm lạnh và giữ trong chai màu nâu
Hòa Stock solution v/v 80% sulfuric acid chất thử
Nhỏ 1 giọt chất thử trên bề mặt cắt của mẫu cây, lá cần kiểm tra.
Màu chuyển từ màu xanh lá cây  xanh dƣơng: +  mẫu chứa > 2%
nitrate.

Bài 5. Xác định độc tố vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Bacteria toxins detection by molecular technique
Sample collection : diarrhea feces samling from pilet/poultry


+ Isolation of Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)

.+ Determination of toxic genes STb from ETEC caused piglet diarrhea
by PCR analysis – Electrophoresis
+ Determination of these toxins in animal laboratory-mice
+ Results analysis.

Khảo sát vi khuẩn gây bệnh trên gia súc, gia cầm - Vi khuẩn
Escherichia coli
Là nhóm vsv tồn tại trong đường tiêu hóa, trở thành nhân tố gây bệnh cho
người và động vật khi có điều kiện thuận lợi.

Qua bài thực tập giúp sinh viên nắm vững kỹ thuật và thao tác mổ
khám, định bệnh, xác định nguyên nhân nghi bệnh
- Chẩn đóan chính xác nguyên nhân gây ngộ độc là do độc tố của vsv.
- Có thể thực hành đưa ra phát đồ Phòng trị ngộ độc
- Khám bằng ngũ quan, sờ nắn, mổ khám bệnh tích.
- Học và nắm vững toxin của vsv gây bệnh và chết trên con vật mổ khám
bằng cách lấy mẫu:
+ Nuôi cấy phân lập
+ Định danh xác định chủng VK gây bệnh
+ Xác định các gene độc lực
+ Khi đã phát hiện VK E. coli trên mẫu bệnh có độc lực, muốn biết
chính xác độc tố đó đã gây bệnh và làm chết con vật tiến hành thí nghiệm
tiếp theo trên động vật thí nghiệm
+Tiêm độc tố vào động vật thí nghiện cảm thụ. Do đó cần biết rõ : loại
độc tố và động vật cảm thụ, cách tiêm, đƣờng tiên truyền.
+ Quan sát diễn tiến bệnh thí nghiện trên động vật thí nghiệm: ghi
nhân, hình ảnh minh họa.
+ Thu thập mẫu bệnh, tiến hành phân lập để xác định lại xem có đúng
VK tiêm thử nghiệm đã làm động vật thí nghiệm bệnh và chết, cách tiến
hành như mẫu bệnh phẩm đã phân tích ở trên.

-

Thực hành trên bệnh tiêu chảy heo/trên gà bệnh do ETEChay (hay
bất cứ bệnh nào nhóm thực tập có thể thực hiện đƣợc bài thực tập của
mình cho kết quả đúng và đủ.
1. Lấy mẫu phân heo con tiêu chảy/ gà bệnh sau khi quan sát lâm sàng xác
định do E. coli nhóm ETEC
2. Phân lập- Định danh theo qui trình thường qui đã học cho E. coli.
Mẫu bệnh phẩm là phân, cấy trực tiếp trên MC, quan sát hình thái
khuẩn lạc đậc trưng của vk trên MC. Định danh bằng phản ứng sinh
hóa.
Chọn và cấy thuần ≥ 10 khuẩn lạc đề tiến hành bước tiếp theo xác định
gene đợc tố


Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC
Bang 2. Các phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E. coli (Cowan, 2003)
Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn

KIA

Indole

MR

VP

Citrate

DĐ

+

+

+

-

-

+

-

+

-

+

-

+

+

+

-

+

-

-

+

+

-

+

-

+

-

-

+

+

+

Glu

Lac

H2S

Gas

E. coli

+

+

-

Citrobacter

+

+

Klebsiella

+

Enterobacter

+

Glu: Glucose
Lac: Lactose
proskauer
MR: Methyl red
(+): dương tính;
(-): âm tính

VP: Voges
DĐ: di động;

Phản ứng sinh hóa định danh vi khuẩn E. coli
3. Xác định gene độc tố của VK, do dùng động vật thí nghiệm là chuột
bạch nên độtc tố gây bệnh có trong E. coli nhạy cảm trên chuột là STb
(STa, STb) theo quy trình chi tiết sau:


QUY TRÌNH THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR XÁC ĐỊNH GENE ĐỘC
LỰC (ST: STa, STb) CỦA VI KHUẨN E. coli trong nhóm ETEC
1. Tách chiết DNA từ chủng vi khuẩn
Vi khuẩn E. coli ETEC sau khi được định danh bằng phản ứng huyết
thanh học được nuôi cấy trên môi trường TSA để tiến hành ly trích DNA.
Sau khi tăng sinh vi khuẩn trên TSA ở 37oC, 24 giờ, thu sinh khối cho
vào eppendorf chứa 1 ml nước tinh khiết không chứa DNA, hòa tan rồi đun sôi
cách thủy ở 100oC trong 10 phút.
Tiến hành ly tâm huyễn dịch trong eppendorf sau khi đun cách thủy với
vận tốc 10.000 vòng trong 15 phút. Sau khi ly tâm, thu lấy dịch trong bên trên
phần cặn lắng, đây chính là DNA template cho quá trình PCR. Trữ DNA
template ở -20oC.
2. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Để xác định gene mã hóa các độc lực STa, STb của vi khuẩn E. coli ,

kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định các đoạn gene mã hóa các thành phần
này như bảng 1.
Bảng 3: Thành phần hỗn hợp cho một phản ứng PCR (Promega, USA)
Hóa chất
Master mix 2X

Thể tích (µl)
12,5

Mồi xuôi

0,5

Mồi ngược

0,5

DNA template

2,0

Nước tinh khiết

9,5

Tổng thể tích

25

Đối với mẫu đối chứng âm, thay thế DNA template bằng nước cất vô

trùng; đối với mẫu đối chứng dương: sử dụng DNA template của vi khuẩn E.
coli đã xác định dương tính với các gene độc lực trên.
Trình tự nucleotide và chu trình nhiệt của các đoạn primer xác định các
gene độc lực Sta, STb của vi khuẩn E. coli được trình bày qua Bảng 2.


3. Điện di và nhuộm sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose 1,5%: cân 1,5 g thạch cho vào 100 ml dung dịch
TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch. Để thạch nguội khoảng 70oC rồi đổ
khuôn tạo bản gel.
Sau khi gel đã đông đặc, đặt bản gel vào máy điện di có dung dịch đệm
TAE 1X, dùng micropipette cho các sản phẩm PCR vào các giếng thạch.
Chạy điện di các sản phẩm PCR ở hiệu điện thế 100v trong vòng 60
phút.
Sau khi kết thúc điện di, nhuộm bản gel bằng dung dịch ethidium bromide (10
mg/ml) trong 30 phút rồi rữa bằng nước cất trong 15 phút. Sau đó, quan sát và
chụp ảnh gel đã nhuộm dưới tia UV.
Xem xét sự hiện diện của các vạch gene trên ảnh chụp của bản gel để
xác định sự hiện diện gene mã hóa các độc lực LT, STa, STb, EAST1, eae.
4.
Tiêm truyền cho động vật thí nghiệm là chuột bạch theo quy trình
hướng dẫn của GVHD của PTN.
5.
Theo dõi ghi nhân kết quả - Mổ khám hay lấy mẫu phân tiêu chảy nếu
chuột không chết đem nuôi cấy phân lập
6.
Phân lập -Xác định Vk E. coli.


Bảng 4: Trình tự nucleotide và chu trình nhiệt các primer đƣợc sử dụng để xác định các gene

độc lực của E. coli ETEC
Độc tố

STa
(estA)

STb
(estB)

Size
(bp)

Trình tự

GCTAATGTTGGCAATTTTTATTTCTGTA
AGGATTACAACAAAGTTCACAGCAGTAA

2
3
11 12

94
94
50 (52)
70
70
94
94
55
72

72
94
50 (52)
70
70

190

GCCTATGCATCTACACAATC
TGAGAAATCGACAATGTCCG

1
10

Nhiệt độ (oC)

279

4

5

6

7

8

Thời
gian

(phút)
3
0:30
0:45
1:30
10
3
1
1
1
5
0:30
0:45
1:30
10

Chu
kỳ

Tham khảo

1
25

Franck et al., 1998

1
1
30
1

Vu-Khac H et al.,
2007

25
1

9

500 bp
279 bp

Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định gene STb (279 bp) của vi khuẩn E. coli
ETEC
Giếng 1: Ladder (100bp)
Giếng 7: ST62a (+)
Giếng 2: Possitive control STb (+)
Giếng 8: ST32a (+)
Giếng 3: Negative control STb (-)
Giếng 9: ST69a (-)
Giếng 4: ST65a (-)
Giếng 10: ST61b (+)
Giếng 5: ST68d (-)
Giếng 11: ST61g (-)
Giếng 6: ST60-1 (+)
Giếng 12: ST65a (-)

13

Phƣơng pháp xác định tính đề kháng với kháng sinh của các chủng ETEC
Kiểm tra tính đề kháng của ETEC với các loại kháng sinh được tiến hành theo phương
pháp khuếch tán trên thạch của Bauer et al (1966).
Tính nhạy cảm kháng sinh được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
theo phương pháp Bauer (1966), kết quả đo đường kính vô khuẩn dựa trên tiêu chuẩn
của viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm (CLSI, 2012) đối với 7 loại kháng
sinh thông dụng trong thú y do công ty Nam Khoa sản xuất.
Môi trường MHA thử kháng sinh đồ được đổ vào đĩa petri vô trùng (25ml/đĩa). Bề
mặt đĩa được làm khô trong tủ sấy trước khi sử dụng.
Huyễn dịch vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách cấy ria những khuẩn lạc đã được thử
phản ứng sinh hóa và định danh lên môi trường NA ủ ở 37oC/24h, sau đó dùng que cấy
chấm một ít khuẩn lạc hòa tan vào 2ml nước muối sinh lý 9o/oo. Lắc đều bằng vortex rồi
điều chỉnh độ đục vi khuẩn để đạt mật độ 108 CFU/ml (so với ống chuẩn Mc Farland
0.5).
Đĩa kháng
sinh
Que tăm
bông

Môi trường
MHA

Ủ 37oC/24h

Canh
khuẩn

Bảng tiêu
chuẩn

Đo đường
kính
vòng vô
khuẩn

Phƣơng pháp thực hiện kháng sinh đồ (Bauer,1966)

14


Sử dụng tăm bông vô trùng nhúng vào huyễn dịch vi khuẩn nhằm dàn đều vi khuẩn
lên bề mặt môi trường MHA, trước đó ép tăm bông vào thành ống nghiệm để tăm bông
không quá ướt. Để khô bề mặt thạch, dùng kẹp vô trùng gắp đĩa kháng sinh đặt trên bề
mặt thạch. Sau đó, đem đi ủ ấm ở 37oC trong 24 giờ rồi đọc kết quả.
Kết quả kháng sinh đồ được so sánh với bảng tiêu chuẩn của CLSI (2012) phân
biệt thành 3 mức độ nhạy cảm (susceptible-viết tắt S), trung gian (intermediate-viết tắt I)
và đề kháng (resistant-viết tắt R).

Bảng 3.3: Đường kính vòng vô khuẩn đối với kháng sinh khảo sát (CLSI, 2012)
Kháng sinh

Hàm lượng (µg)

Nhạy

Nhạy
gian

Ampicillin

10

≥17

14-16

≤13

Ceftazidime

30

≥21

18-20

≤17

Colistin

10

≥17

12-16

≤11

Gentamicin

10

≥15

13-14

≤12

Norfloxacin

10

≥17

13-16

≤12

Tetracycline

30

≥15

12-14

≤11

≥16

11-15

≤10

Bactrim

1,25/23,75

trung Kháng

Phƣơng pháp xác định gene kháng kháng sinh của các chủng ETEC gây tiêu chảy
heo con phân lập đƣợc
Gene kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli được xác định bằng phương
pháp PCR. Trình tự nucleotide của các cặp mồi và chu trình nhiệt phản ứng PCR được
trình bày ở Bảng 3.3. Phương pháp xác định các gene kháng kháng sinh gây tiêu chảy
heo con được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Tách chiết DNA vi khuẩn bằng phương pháp nhiệt (Costa et al., 2010)
Các chủng ETEC đề kháng kháng sinh được nuôi cấy trên môi trường NA ở
37oC/24 giờ, sau đó thu lấy vừa đủ sinh khối vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa 500 µl

15


nước cất khử ion, trộn đều tạo huyễn dịch vi khuẩn. Mẫu được đun sôi 100 oC trong 10
phút, ly tâm ở 10.000 vòng. Thu lấy phần dịch nổi là DNA của chủng vi khuẩn sang
eppendorf mới trữ ở nhiệt độ -20oC.
Bảng 3.6. Trình tự nucleotide các cặp mồi xác định các gene kháng kháng sinh của
chủng ETEC sử dụng trong phản ứng PCR
Gene
kháng

kháng
sinh

Trình tự nucleotide của mồi (5'3')

Độdài
(bp)

Nguồn tham
khảo

857

Maynard
(2003)

888

Harel (1991)

GAGTATTCAACATTTTCGT
blaTEM

ACCAATGCTTAATCAGTGA
GTGAAACCCAACATACCCC

tetA
GAAGGCAAGCAGGATGTAG

Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các gene kháng kháng sinh.

Dùng micropipette hút lần lượt nước cất khử ion, master mix, primer cần thực hiện
theo thể tích cần phân tích, cho tất cả vào eppendorf rồi đem ly tâm nhẹ để tất cả các
thành phần được trộn đều. Sau đó cho thêm DNA mẫu cần kiểm tra sự hiện diện của
gene đề kháng. Cuối cùng, đặt những PCR tip vào máy PCR, cài đặt chương trình nhiệt
khuếch đại đoạn gene cần thực hiện.
Bước 3: Chạy điện di sản phẩm PCR và xác định sự hiện diện của gene kháng kháng
sinh.
Mẫu đối chứng dương: chứa chủng vi khuẩn với gene đã biết.
Mẫu đối chứng âm: không chứa mẫu DNA.
Tất cả những mẫu thực hiện đều phải được thực hiện trong nhiệt độ lạnh.
Điện di agarose:

16


Gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X 100ml, lắc đều và đun hòa tan.
Sau đó để nguội khoảng 50-65oC đổ gel vào khuôn đã cài lược (comb) và đặt trên mặt
phẳng. Khuôn gel khi đặc lại sẽ được đặt vào bể điện di, rót dung dịch đệm vào cho ngập
gel.
Cách thực hiện:
Dùng micropipette hút 10 µl mỗi sản phẩm PCR và 1 µl dung dịch đệm, 6 µl thang
chuẩn cho vào từng giếng thạch.
Khởi động máy điện di: Bật công tắc, dòng điện trong bể sẽ chạy từ cực (-) sang
cực (+) với hiệu điện thế 50V.
Đọc kết quả điện di: các đoạn DNA dịch chuyển về một hướng tạo thành làn và
trên làn đó các vạch (band) DNA khác nhau phân bố ở các vị trí khác nhau tương ứng
với kích thước của chúng. Sản phẩm dương tính được nhận diện qua kích thước tương
ứng trên agarose nhuộm ethidium bromide (EtBr) Nhuộm gel trong dung dịch EtBr
khoảng 30 phút, sau đó rửa bằng nước cất trong 15 phút. Đọc kết quả bằng máy minitransilluminator (Jircas, Nhật). Mẫu dương tính sẽ hiện vạch (band) trên máy.

blaTEM
500 bp

blaTEM

857 bp

Sản phẩm PCR của gene blaTEM sau quá trình điện di
(M: DNA marker. Ne: đối chứng âm blaTEM, PC: đối chứng dương blaTEM
blaTEM (+): giếng 1,4,5 (chủng K88); Giếng 2 (chủng K99); Giếng 3 (chủng 987P)

17


Phƣơng pháp xác định độc lực của các chủng E. coli phân lập đƣợc trên chuột bạch
Chuẩn bị: Chuồng nuôi của chuột được thiết kế để dễ dàng theo dõi, các chuồng nuôi
chuột, vỏ trấu lót nền chuột được sát trùng cẩn thận. Nước uống cho chuột được
autoclave để tiệt trùng, nguồn thức ăn cho chuột được cung cấp từ nguồn sạch, chất
lượng.
Phương pháp chuẩn bị canh khuẩn để tiêm truyền: được mô tả theo Picard et al.,
(1999):
Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSA ở 37OC trong 24 giờ sau đó được chuyển
qua môi trường TSB (pH: 7,3) để nuôi tăng sinh trong 4 giờ, trong quá trình nuôi cấy có
lắc kích thích tăng sinh của vi khuẩn. Lấy 2 ml dung dịch trên đem ly tâm ở 2,500
vòng/phút trong 10 phút, hút bỏ phần dung dịch bên trên, phần lắng dưới đáy được rửa
sạch 2 lần với dung dịch Ringer’s Solution. Phần vi khuẩn lắng dưới đáy sẽ được pha
loãng với dung dịch Ringer’s Solution đến khi đạt nồng độ 109 CFU/ml (MacFarland
0,5). Dung dịch này sử dụng làm canh khuẩn để tiêm truyền cho chuột bạch.
Phương pháp tiêm truyền và theo dõi kết quả
Tiêm truyền: Chuột bạch được nuôi thích nghi trong vòng 72 giờ, trước khi tiêm truyền,

mỗi chuột bạch được đo thân nhiệt, nhịp tim, nhịp thở để kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý
bình thường của chuột bạch.
Vị trí tiêm truyền: Tiêm canh khuẩn trên vào xoang bụng của chuột bạch. Với liều lượng
0,2 ml/chuột hay tùy nhóm quyết định.
Theo dõi kết quả: Cho chuột ăn uống bình thường và theo dõi những biểu hiện triệu
chứng, thân nhiệt của chuột sau khi tiêm mỗi giờ trong vòng 6 giờ sau khi tiêm, rồi 18
giờ, 24 giờ, mỗi ngày, cho đến ngày thứ 3-5 (Picard et al., 1999).
Những chuột chết, mổ khám quan sát các cơ quan có những bệnh tích điển hình như mắc
bệnh tự nhiên. Lấy máu tim, gan, lách, thận để nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn. Nếu
cho kết quả dương tính là cơ sở để đánh giá độc lực kiểm tra (Picard et al., 1999)
Kết quả khảo sát
Các chuột chết được mổ khám đều có các bệnh tích điển hình: bụng chướng, gan sưng,
tụ huyết, ruột xuất huyết. Gan/ thận, lách hay máu tim khi nuôi cấy trên môi trường MC
đều phân lập lại được vi khuẩn E. coli.

18


Phân chuột sệt màu xám

Phân chuột lỏng màu vàng

Phân chuột lỏng màu vàng

Bụng phình to

Gan sƣng, tụ huyết

19

Phổi sƣng, xuất huyết; lách tụ huyết; dạ dày và ruột chứa đầy hơi

6. A field trip for sampling and classification of toxins in foods, environments
and animals.

20