VAI TRÒ của rễ rào cản CON ĐƯỜNG vận CHUYỂN APOPLASTIC TRONG KHẢ NĂNG CHỊU mặn của lúa (oryza sativa l )

VAI TRÒ CỦA RỄ RÀO CẢN CON ĐƯỜNG VẬN CHUYỂN APOPLASTIC
TRONG KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA LÚA (Oryza sativa L.)
Pannaga Krishnamurthy · Kosala Ranathunge ·
Rochus Franke · H. S. Prakash · Lukas Schreiber ·
M. K. Mathew

Tóm tắt

Việc độ mặn của đất gia tăng đã làm giảm năng suất cây trồng đặc biệt là đối với cây
lúa. Chúng tôi đã xem xét mối tương quan giữa sự hình thành rào cản Apopslatic trong
rễ, sự hấp thụ Na+ vào chồi và sự sống của 3 giống lúa nhạy cảm với điều kiện mặn là:
-

Giồng chuẩn kháng: Pokkali.
Giống chịu mặn trung bình: Jaya.
Giống chuẩn nhiễm: IR 20.

Cây lúa sinh trưởng trong nước hoặc trong đất khoảng 1 tháng đều phải chịu từ nhẹ đến
nặng điều kiện Stress mặn. Rào cản Apoplastic được xác định bằng kính hiển vi huỳnh
quang, bằng phương pháp sắc ký khí và bằng phép phổ khối lượng. Ion Na + được tính
bằng trắc quang trên ngọn lửa. Sự Suberin hóa của các rào cản Apoplastic trong rễ của
Pokkali là lớn nhất trong 3 giống lúa trong khi ion Na + tích lũy trong chồi là ít nhất. Sự
stress mặn đã tăng cường cho việc hình thành các rào cản ở cả 2 giống chuẩn nhiễm và
giống kháng, làm tăng cường mã hóa enzyme mRNA sinh tổng hợp suberin cũng được
phát hiện trong 30 phút stress mặn. Các rào cản cũng đã được hình thành ở giống chịu
mặn trung bình sau vài ngày. Nhìn chung, sự gia tăng bán kính các rào cản apoplastic
tương quan với sự giảm hấp thu ion Na + và biểu hiện rõ hơn khi thử thách với độ mặn
cao.
Abbreviations
FW Fresh weight
DW Dry weight

OPR Outer part of the root
CB Casparian band
SL Suberin lamellae


Giới thiệu
Đất mặn là một trong những yếu tố môi trường căng thẳng nhất ảnh hưởng đến năng
suất cây trồng trên toàn thế giới (Rhodales and Lovedy 1990). Lúa là loại cây trồng quan
trọng mà tiềm năng năng suất rất nhạy cảm với độ mặn (Ponnamperuma 1984;Khatun et
al. 1995; Munns and Tester 2008) mặc dù sinh trưởng sinh dưỡng của một số giống hiện
có đã đề kháng cao với stress mặn (Yeo and Flowers 1983; Munns 2002). Các tế bào nuôi
cấy của giống kháng mặn (Pokkali) cho thấy chúng tồn tại/sống được trong môi trường
nuôi cấy (có muối) khi nồng độ Na+ trong tế bào chất thấp do sự giảm tính thấm của
màng tế bào và tích lũy Na + trong không bào (Kader and Lindberg 2005; Anil et al.
2007a). Trong các loài thực vật thông thường , lượng Na + đi vào chồi được điều khiển
theo phương thức phụ thuộc nồng độ Ca2+ (Anil et al. 2005). Trong chồi , việc duy trì một
lượng thấp Na+ ngoại bào là yếu tố quyết định cho sự sống (Oertli 1968; Flowers et al.
1991; Anil et al. 2005). Cây trồng duy trì mức độ thấp nồng độ Na + trong tế bào chất
bằng cách cô lập ion Na+ vào trong nội bào ( không bào) (Ohta et al. 2002; Fukuda et al.
2004; Yamaguchi and Blumwald 2005; Anil et al. 2007a) và khoang ngoại bào (Anil et
al. 2005) từ trong tế bào chất. Ở hầu hết các loại cây trồng, quá trình vận chuyển Na + từ
rễ vào mô gỗ theo con đường đi từ tế bào đến tế bào (con đường tế bào chất) liên quan
đến sự vận chuyển vào mô gỗ (Taiz and Zeiger 1998; Munns 2002). Tuy nhiên, trong lúa
quá trình vận chuyển đó đã tìm thấy một dòng chảy to lớn khác ở ngoại bào (con đường
Apoplast hay gian bào) để vận chuyển Na+ vào trung trụ (Yeo et al. 1987; Yadav et al.
1996; Garcia et al. 1997; Gong et al. 2006) dòng chảy đó được điều chỉnh bởi nồng độ
Ca2+ ở mức độ khác nhau của các giống lúa khác nhau (Anil et al. 2005). Tuy nhiên,
những tài liệu hỗ trợ cho kết luận này đều được lấy từ những nghiên cứu về cây trồng
thủy canh.
Cây trồng đã phát triển những cơ chế và khả năng khác nhau để chịu được những áp

lực của môi trường. Tuy nhiên cả hai sự thích nghi về giải phẩu và sinh lí đều trong điều
kiện bất lợi. Hệ thống rễ đặc biệt bị ảnh hưởng bởi stress phi sinh học vì nó tiếp xúc trực
tiếp với môi trường đất. Vì vậy, nhiệm vụ đặc biệt của rễ là dựa vào đai Casparian và chất
nền suberin hiện diện trong rễ nội và ngoại bì để hạn chế ảnh hưởng (Perumulla and
Peterson 1986; Enstone et al. 2003; Ma and Peterson 2003). Đai casparian được đặt
nghiên về hai bên vách lồi tế bào, vách sơ cấp được tẩm chất với lignin và suberin
(Schreiber et al. 1999). Chất nền suberin hình thành trên mặt trong của vách tế bào sơ
cấp cũng như vách tế nào thứ cấp. Chức năng chính của đai Casparian là ngăn chặn
những dòng vật chất không chọn lọc vượt qua từ con đường apoplastic mang theo nước
và ion khoáng vào bên trong trung trụ (Ma and Peterson 2003). Chất nền suberin hình
thành từ thành tế bào sơ cấp làm cản trở sự di chuyển của nước và ion khoáng qua màng
sinh chất vào trong trung trụ (Steudle and Peterson 1998). Điều đó chứng tỏ rằng đai
casparian không phải hoàn toàn không thấm nước và ion khoáng (Ranathunge et al.
2005). Không có nhiều nghiên cứu thực hiện để hiểu rõ sự hình thành và chức năng rào
cản của con đường vận chuyển apoplastic để đáp ứng với khủng hoảng mặn trong cây
lúa.
Những nỗ lực đã được thực hiện nhằm hiểu rõ hơn về cấu trúc và thành phần hóa học
của thành tế bào chuyên biệt trong các loài cây trồng khác (Zeier and Schreiber 1997,
1998; Schreiber et al. 1999). Trong một nghiên cứu so sánh lúa với bắp, tác giả đã chỉ ra
rằng những giống lúa hiện có thấm nước qua con đường apoplastic thấp hơn ở rễ bắp
nhưng có sự tương quan về số lượng lớn đa nếp gấp suberin của lúa với bắp (Schreiber et
al. 2005b). Chỉ có một vài nỗ lực đã được thực hiện để hiểu làm thế nào các thành phần


hóa học của rào cản con đường apoplastic thay đổi để đáp ứng với áp lực của môi trường.
Người ta thấy rằng cây đậu thầu dầu (Ricinus communis L.) tăng cường các rào cản vận
chuyển apoplastic của chúng trong rễ để đáp ứng với stress NaCl (Schreiber 2005a et al.),
Trong khi sự phát triển của các đai Casparian đã được nhận ra để đáp ứng với độ mặn
trong bắp và bông (Reinhardt và Rose 1995; Kawahara et al 2004). Điều đó cũng đã
được chứng minh rằng các rào cản để mất oxy và Fe 2+ hấp thu làm rễ tăng tiếp xúc với

acid hữu cơ và sulphide (Armstrong and Armstrong 2001, 2005). Không có nhiều những
hiểu biết về phản ứng của rào cản apoplastic với những áp lực khác nhau trong lúa. Kể từ
khi dòng chảy được biết là con đường chính vận chuyển Na + đến chồi (Yeo et al. 1987;
Anil et al. 2005; Gong et al. 2006) đặc tính của các apoplastic hình thành rào cản trong rễ
bổ sung thêm một giả định quan trọng. Khi sinh trưởng trong đất, hầu hết cây trồng đều
phát triển đai Casparian đóng vai trò quan trọng trong điều tiết sự hấp thu nước và ion
khoáng (Perumulla et al. 1990;Damus et al. 1997; Enstone and Peterson 1998) nhưng đặc
tính hóa học và một nghiên cứu chi tiết so sánh cây trồng thủy canh và cây trồng trong
đất đã cho thấy điều này không hoàn toàn đúng.
Suberin là một bio-polymer gồm một chất béo và một vòng thơm (Kolattukudy 1984)
với hợp chất béo góp phần lớn vào đặc tính cản trở của nó (Schreiber et al. 1999). Các
enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp suberin gồm elongases, hydroxylases và
peroxidases (Bernards et al 2004;. Franke et al 2005;.. Hofer et al 2008). Tuy nhiên,
những biểu hiện và sự sắp xếp của chúng trong điều kiện căng thẳng đã không được mô
tả rộng rãi.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các rào cản kỵ nước trong ba giống
thuộc nhóm indica là: Pokkali, sinh trưởng ở khu vực ven biển; Jaya, giống được nghiên
cứu chống chịu tốt với điều kiện mặn và IR 20 giống mẫn cảm với điều kiện mặn. Sự
khác biệt cụ thể giữa các giống trong việc hình thành rào cản và thành phần, tương quan
với tổng số chồi có Na+ được quan sát. Khi tiếp xúc với stress mặn, gen tổng hợp nhanh
chóng hình thành, qui định rào cản apoplastic phát triển trong nội và ngoại bì khoảng vài
ngày.
Phương tiện và phương pháp.
PHƯƠNG TIỆN
Cây trồng và quá trình tăng trưởng.
Hạt của nhóm giống Indica (Oryza sativa L. cv. Pokkali, Jaya and IR20) thu được từ trạm
nghiên cứu khu vực, V.C Farm (Mandya, Karnataka, Ấn Độ) đã nảy mầm trong bóng tối
trong 3-4 ngày trên khăn giấy ướt ở 27°C. Đối với lúa trồng thủy canh, cây giống được
chuyển đến container 10-l với dung dịch dinh dưỡng theo công thức Hoagland (Epstein
1972). Cây con tăng trưởng trong một tháng (sau nảy mầm) với hệ thống sục khí liên tục

ở 250C chiếu sáng ở 400–500 µmol m-2s-1 sử dụng ánh sáng huỳnh quang (Philips,
Kolkotta, India) trong một chu kì 12h ngày và đêm. Dung dịch dinh dưỡng được thay
hàng tuần. Đối với lúa trồng trong đất, các hạt giống đã nảy mầm được lựa chọn và gieo
trong cốc (250 ml) chứa đất (đá ong đỏ / Alfisols) và một lớp cát trơ. Phía đáy chậu có
đục lỗ để rễ dễ dàng xuyên qua cát và đi vào dung dịch dinh dưỡng. Trước đó cây con
được trồng trong đất cát khoảng 2-3 tuần và tưới theo công thức dinh dưỡng Hoagland 4
lần/tuần. Sau đó, cốc chứa cây trồng được gỡ bỏ cẩn thận những lớp cát và đặt trên khay
cũng tưới bằng dung dịch Hoagland khoảng 3-4 ngày trước khi áp dụng stress. Rễ cây ló
ra khỏi cốc và ngập hết trong dung dịch dinh dưỡng khi tiến hành stress. Pokkali là giống


cao cây nhưng cho năng suất thấp trong khi Jaya và IR20 là giống bán lùn và cho năng
suất cao. Chiều dài rễ của các giống Pokkali, Jaya và IR20 lần lượt là 19, 16 và 13 cm.
Giao thức stress mặn.
Cây trồng trong dung dịch dinh dưỡng Hoagland được 1 tháng với giá thể đã được stress
mặn bằng 1 trong 2 cách sau: 200 mM NaCl trong môi trường có chứa nồng độ Ca 2+ thứ
tự (0; 0,03; 0,04; 0,4 và 4 mM) khoảng 2 ngày hoặc với 50 và 100 mM NaCl trong môi
trường chứa 4 mM Ca2+ khoảng 1 tuần. Nồng độ Ca 2+ được xác định dựa vào số lượng
CaCl2 thêm vào môi trường ở pH=5.8. Ước tính tổng trung bình Ca 2+ thiếu trong ngoại
sinh bào cộng với CaCl2 đều dưới 2 mM. Kèm theo 2 ngày hoặc 1 tuần stress mặn, số cây
còn giữ lại hơn 1/3 diện tích lá mở, không quăn lại được sử dụng để ước tính tỷ lệ sống
sót trong các giống lúa.
Ước tính tổng Na+ trong chồi.
Cây trồng tiếp xúc với stress mặn được thu hoạch và rửa kỹ với nước cất để loại
bỏ bề mặt ô nhiễm Na+. Các chồi được tách ra từ rễ và để khô ở 50 ° C trong 3-4 ngày.
Các mô khô đã được nghiền thành bột trong nitơ lỏng. Bột này được thủy phân bằng cách
bỏ nó trong 5 ml axit nitric đậm đặc qua 1 đêm. Trộn thêm 5 ml hỗn hợp diaxit nitrat và
perchlorate theo tỉ lệ 10: 4 (v / v) để thủy phân hoàn toàn khoảng 2 giờ trên bồn cát.
Dung dịch thủy phân được lên thể tích đến 25ml bằng nước cất. Các cấp Na + trong mẫu
acid thủy phân đại diện cho tổng Na+ trong mô rễ và được tính bằng cách sử dụng một

quang kế hơ trên ngọn lửa.
Dung dịch Apoplasic được giải phóng từ các đoạn chồi bằng cách sử dụng phương
pháp mô tả (Anil et al. 2005) với những thay đổi nhỏ. Các chồi tươi được thu hoạch và
cắt ngang vào trong khoảng 1cm và lắc nhẹ khoảng 1 giờ trong 50ml nước cất. Na + cân
bằng trong dung dịch apoplastic được đo bằng quang kế hơ trên một ngọn lửa. Chúng tôi
đã trình bày trước đó bằng cách sử dụng acid pyrene trisulphonic (PTS) như một vạch chỉ
thị Apoplastic, acid này phục hồi gần như tất cả các Na + ít ô nhiễm từ các khoang khác
(Hình. 3, Anil et al. 2005).
Giải phẫu rễ và kính hiển vi
Lấy ngẫu nhiên rễ lúa được trồng thủy canh trong điều kiện stress mặn có kiểm
soát sau đó cắt ngang thành từng lát thật nhỏ. Cắt ngang từ chóp rễ vào với các khoảng
cách 10, 20, 30, 50, 100 and 200 mm. Sau đó đem quan sát dưới kính hiển vi Axioplan
(Zeiss, Oberkochen, Germany) với ánh sáng thường. Để quan sát được các đai Casparian,
đem những phần cắt nhuộm màu với 0.1% berberine hemisulfate khoảng 1 giờ và thêm 1
giờ nữa với 0.5% (w/v) aniline blue (Brundrett et al. 1988). Phần đã được nhuộm màu
đem quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang sử dụng ánh sáng xanh (filters: excitation
450–490 nm, dichroic mirror 510 nm, emission LP 520; Zeiss). Để quan sát được các lá
suberin đem những lát cắt nhuộm màu với Fluorol Yellow 088 (Brundrette et al. 1991)
cũng quan sát dưới kính hiển vi nhưng bằng ánh sáng tia cực tím (excitation Wlter BP
365, dichroic mirror FT 395, emission LP 397; Zeiss).


Phân tích hóa học của suberin rễ.
Sự cách ly thành tế bào, phản ứng ester hóa và sự đồng nhất những monome
suberin 1 tháng tuổi của rễ lúa sinh trưởng trong đất và thủy canh được đem ra mô tả như
trước đây (Zeier and Schreiber 1997; Schreiber et al. 2005b). Suberin hóa nội bì ( nội bì
cùng với trụ giữa) và phần ngoài của rễ (OPR; 4 lớp tế bào trong dãy: miền lông hút,
ngoại bì, cương mô và 1 lớp tế bào thể vỏ chưa biến đổi) từ cả 2 vùng I và II được phân
lập dưới kính hiển vi sử dụng kẹp sau khi xử lí enzym rễ với 1% (v/v) cellulase
(Celluclast, Novo Nordisk, Denmark) và 1% (v/v) pectinase (Trenolin, Erbslöh,

Germany). Phản ứng ester hóa của thành tế bào, giải phóng monome suberin được thực
hiện theo như Kolattukudy and Agarwal (1974). Phép phân tích sắc ký khí và phép đo
phổ khối lượng của các dẫn xuất thoái hóa được thực hiện chi tiết như mô tả của Zeier
and Schreiber (1997, 1998). Kết quả phân tích suberin được thể hiện trên cơ sở tổng
trọng lượng khô của các gốc phân lập sử dụng cho sự khử polyme.
Phân tích RT-PCR bán định lượng.
Tổng số RNA đã được phân lập từ lá, thân và rễ (đỉnh, giữa và đáy) của lúa trồng thủy
canh, giống Pokkali 1 tháng tuổi sinh trưởng trong điều kiện có sự kiểm soát và stress
mặn ở rễ vào các thời điểm khác nhau (từ 0 đến 8 giờ) với 200 mM NaCl sử dụng TRIreagent (Sigma–Aldrich, St Louis, MO, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kỹ thuật
RT-PCR được tiến hành bằng cách cho 1 gam RNA vào 100 đơn vị virus gây bệnh sao
chép ngược bạch cầu ở chuột Molony (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. The
cDNA thus obtained was subjected to a 25-cycle PCR reaction with the following
conditions: 3 min at 94°C followed by 25 cycles of 60 s at 94°C, 60 s at 55°C and 80 s at
70°C, and finally 5 min at 70°C. The constitutively expressed Actin was used as a
control. The primer sequences and predicted amplicon sizes were 5 ’CGCCTCACCTTCGATAACAT-3’ (forward) and 5’-CACTCGCAGTCCATTCTTCA3’ (reverse) for Os01g63540 (CYP86A9 Os) (960 bp), 5’-T
CGTAATCTTCTCCGCCATC-3’ (forward) and 5’-GATGTAGGCGAGC TCGTACC-3’
(reverse) for Os03g12030 (CER6) (821 bp), and 5’-CCTCTTCCAGC CTTCCTTC
AT-3’ (forward) and 5’-ACGGCGATAACAGCTCC TCTT-3’ (reverse) for Actin-1
(Os03g50890) (400 bp).
Phân tích thống kê.
Dữ liệu được phân bố bình thường và đã được trình bày trong các bẳng số liệu như
các giá trị trung bình SE. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức P <0,01 và P <0,05 giữa ba
giống với số lượng suberin ước tính bằng cách student’s t test.
Kết quả.
Sự hấp thu Na+ và sự sống giữa các giống lúa.
Chúng tôi sử dụng 2 phương thức stress mặn là ở nồng độ 200 mM NaCl và 50
hoặc 100 mM NaCl. Trong trường hợp trước đây, chúng tôi cũng đã thay đổi các nồng độ
Ca 2+ trong môi trường. Ở nồng độ 200 mM NaCl, giống mẫn cảm IR20 không thể duy

trì được trong hơn 2 ngày. Nồng độ 100 mM NaCl là hợp lý, và chúng tôi đã thử nghiệm
trong 1 tuần. Hình (1a) cho thấy sự hấp thu Na + vào chồi của cả ba giống được stress
mặn trong 2 ngày với nồng độ 200 mM NaCl và 4 mM Ca 2+ . Mức độ hấp thu lớn nhất là
IR20 và ít nhất là Pokkali, Jaya ở mức độ vừa phải. Đáng ngạc nhiên là cây trồng thủy
canh hấp thụ Na+ nhiều hơn cây trồng trong đất ở cả 3 giống. Sự sống thì ngược lại,
Pokkali có tỉ lệ sống cao nhất và IR20 có tỉ lệ sống thấp nhất. Một lần nữa cho thấy, lúa
trồng trong đất sinh trưởng tốt hơn so với các giống lúa tương ứng trồng trong môi
trường thủy canh.
Trong một nghiên cứu trước đây liên quan đến Pokkali và Jaya, chúng tôi đã ghi
nhận Ca2+ thay đổi phụ thuộc vào sự hấp thu Na + và sự sống của cây trồng. Trong nghiên
cứu này (hình. 1b) chứng minh rằng sự hấp thu Na + giảm tương ứng với sự gia tăng Ca2+
trong cả ba giống trong khoảng milimol. Đường biểu diễn với những điểm nút đã được
rút ra thông qua các dữ liệu cho IR20 và Pokkali. Có thể ghi nhận rằng, ở bất kỳ nồng độ
Ca 2+ nào thì sự hấp thu Na + đều theo trình tự IR20> Jaya> Pokkali và lúa trồng thủy
canh hấp thu Na+ nhiều hơn so với trồng trong đất. Lượng Na + trong Pokkali giảm lên tới
~3 lần: từ 10-20 mg (g-1DW) còn 3-7 mg (g-1DW) ở cả lúa trồng trong đất lẫn trong thủy
canh, tương ứng với tăng calcium. Trong khi giống IR 20 giảm từ 23-30mg (g -1DW) còn
14-23mg (g-1DW) ở cả lúa trồng trong đất lẫn trong thủy canh. Tương tự lượng Na + trong
chồi cũng giảm ở giống Jaya.
Chúng tôi đã nghiên cứu những hạn chế, xử lí stress kéo dài ở nồng độ 50 và 100
mM NaCl với 2 giống Pokkali và IR20. Hình (1c) cho thấy sự thay đổi Na + hấp thu trong
hai giống. IR20 tích lũy nhiều Na+ trong chồi hơn so với Pokkali cả ở hai nồng độ 50 và
100 mM NaCl. Một lần nữa, cây lúa trồng thủy canh hấp thu Na + nhiều hơn so với lúa
trồng trong đất. Ngược lại, sự sống của Pokkali là tốt hơn đáng kể so với IR20 cả trong
đất lẫn trong thủy canh mặc dù trong thủy canh chúng sinh trưởng kém hơn so với trong
đất (Hình 1d).
Chúng tôi nhận thấy rằng, tỷ lệ sống sót tương quan nghịch với Na + apoplastic .
Hình (2a) mở rộng phân tích này với một số bổ sung, IR20; lúa trồng trong đất; và xử lí
mặn khoảng 1 tuần. Không phân biệt giống, môi trường phát triển hoặc xử lí mặn, hình.
(2a) cho thấy mối tương quan giữa sức sống với sự giảm hàm lượng Na + apoplastic. Các

dữ liệu kết hợp cũng phù hợp với lượng đáp ứng với 50% sức sống ở 2.08 0.067 mg Na +
(g-1 FW).
Hình (2b) cho thấy rằng giống IR20 chịu stress mặn 1 tuần ở nồng độ 100 mM
NaCl tiết ra nhiều tinh thể muối trên bề mặt mép lá, phiến lá (hình. 2b, B) và tai lá (hình.
2b, E). Nhưng hiếm thấy ở giống Pokkali (Hình. 2b, D) và có ít ở giống Jaya (Hình. 2b,
C).


Hình 1: Sự khác biệt về
Na hấp thu và sức sống của 3
giống lúa khác nhau. Tỉ lệ sống
của các giống lúa 1 tháng tuổi
trồng trong điều kiện mặn dưới
điều kiện trồng trong đất và
trong thủy canh. Lúa trồng trong
điều kiện mặn được rửa sạch, sấy
khô và dùng acid thủy phân để
tính nồng độ Na+ bằng phương
pháp trắc quang trên ngọn lửa.
1.a) Sự thay đổi trong sự
hấp thu Na+ vào chồi và sức sống
của lúa trồng trong đất và thủy
canh stress mặn ở nồng độ 200
mM NaCl và 4 mM Ca2+ khoảng
2 ngày.
+
1.b) Hàm lượng Na trong chồi tương ứng với sự gia tăng hàm lượng Ca 2+ của lúa
trồng trong đất và thủy canh. Lúa được stress mặn với 200 mM NaCl khoảng 2 ngày.
1.c,d) Sự hấp thụ Na+ vào chồi (hình c) và sức sống (hình d) của lúa trồng trong
đất và trong thủy canh stress mặn ở nồng độ 50 và 100 mM NaCl và 4 mM Ca 2+ khoảng 1

tuần. Giống đối chứng 100% sống sót, số liệu được đại diện bằng các giá trị trung bình ,
n=6 là đường biểu diễn di qua các điểm trong hình 1.b
+


Fig. 2 a) Sự khác biệt về sức sống của cả 3 giống lúa dưới điều kiện thí nghiệm
trong nghiên cứu về mối tương quan giữa Na + và Apoplast trong chồi. Các dữ liệu kết
hợp cũng phù hợp với lượng đáp ứng với 50% sức sống ở 2.08 0.067 mg Na + (g-1 FW)
(đường biểu diễn). Mỗi điểm đại diện bằng các giá trị trung bình của 6 thí nghiệm độc
lập.
b) tinh thể muối trên bẹ lá, phiến lá và tai lá của lúa trồng thủy canh stress mặn với
100 mM NaCl khoảng 1 tuần (A) Control IR20, (B) Stress IR20 cho thấy tinh thể muối
trên bẹ lá và phiến lá, (E) Stress IR20 cho thấy tinh thể muối trên tai lá, (C) Stress Jaya,
(D) Stress Pokkali.

Giải phẫu rễ: sự phát triển của các bọng khí, đai Casparian và lá suberin
Không có nhiều những thay đổi quan trọng về hình thái và giải phẫu ở các giống
lúa được stress mặn 2 ngày với nồng độ (200 mM NaCl). Tuy nhiên, ở nồng độ 100 mM
NaCl stress mặn trong 1 tuần lại gây ra những thay đổi đáng kể ở cả hình thái rễ lẫn sự
phát triển của rào cản kỵ nước. Chúng tôi trình bày dữ liệu cho 2 giống Pokkali và IR 20
trồng thủy canh trong điều kiện có stress mặn với nồng độ 100 mM NaCl và không stress
mặn trong 1 tuần.
Chóp rễ được quan sát dưới vùng sáng ở những khoảng cách cắt nhất định. Ở
giống đối chứng, sự biến thể của vỏ và sự hình thành bọng khí bắt đầu ở khoảng cách
30mm đối với giống Pokkali (hình.3a, 1) và 50 mm với giống IR 20 (hình.3a, 5). Bọng
khí phát triển hoàn toàn ở khoảng 100mm tính từ chóp rễ ở giống Pokkali (hình.3a, 3).


Trong khi đó cũng ở khoảng cách 100mm tính từ chóp rễ phần vỏ vẫn còn nguyên ( bọng
khí chưa hình thành) ở giống IR20 (hình.3a, 6). Sau 1 tuần stress mặn ở nồng độ 100 mM

NaCl bọng khí được nhìn thấy ở khoảng cách gần hơn ở cả hai giống. Số rễ phụ cũng
tăng ở cả 2 giống.
Berberine-aniline blue được sử dụng để nhuộm màu đai Casparian (CBs) trong nội
và ngoại bì. Đối chứng của cả 2 giống đều không có đai Casparian nội bì tính từ khoảng
cách 20mm cách chóp rễ (Hình.3b, 1, 3) nhưng lại xuất hiện ở điểm 30 mm cách chóp rễ
(Hình.3b, 5, 7). Như đã nhìn thấy bằng huỳnh quang xanh lá, có 1 điểm giống như đai
Casparian được nhìn thấy trong thành nội bì của giống Pokkali nó liên tục ở khoảng cách
30 mm (Hình.3b, 5). Trong khi ở IR 20 rất ít tế bào phát triển đai này (Hình.3b, 7). Trong
cả 2 giống, đai Casparian đều phát triển tốt ở khoảng cách ngoài 50mm cách chóp rễ.
Ngược lại với đối chứng, lúa đã stress mặn hình thành và phát triên tốt 1 dãy đai
Casparian nội bì ở khoảng cách 20mm cách chóp rễ của cả 2 giống Pokkali và IR 20
(Hình.3b, 2, 4). Ở khoảng cách 30mm CBs đã nổi bật hơn và vùng nội bì II đã được nhìn
thấy rõ ràng hơn trong đó một số tế bào đã phát triển những lá suberin (Hình.3b, 6, 8).
Sự phát triển của CBs ngoại bì tương tự như trong nội bì. Ở giống đối chứng,
không tìm thấy CBs nào khoảng 10 (Fig. 3c, 1, 3) hoặc 20mm cách chóp rễ (Fig. 3c, 5,
7). Ở khoảng cách 30mm huỳnh quang xanh lá xuyên qua thành tế bào cho thấy sự phát
triển sớm CBs của giống Pokkali (Fig. 3c, 9) trong khi đó không có đai nào được tìm thấy
ở giống IR 20 (Fig. 3c, 11). Sau khi tiến hành stress mặn, CBs ngoại bì phát triển gần
chóp rễ hơn ở cả 2 giống và hoàn thiện hơn so với giống đối chứng. Sự khác biệt nổi bật
giữa các giống, với Pokkal đai CBs được xác định phát triển gần hết chiều dài của vách
nội bì ở khoảng 10 mm cách chóp rễ (Fig. 3c, 2), trong khi giống IR20 CBs rất nhỏ hầu
như không thể nhìn thấy (Fig. 3c, 4). Toàn bộ CBs ngoại bì được nhìn thấy ở cả 2 giống ở
khoảng cách 20 và 30 mm cách chóp rễ (Fig. 3c, 6, 8, 10, 12). Tuy nhiên, cường độ phát
quang CBs của Pokkali lớn hơn nhiều so với IR 20 (Fig. 3c, 6, 10, 8, 12).


Fig. 3: Sự phát triển của các bọng khí và đai Casparian trong rễ lúa
3,a) Sự phát triển của bọng khí (1–6). Mặt cắt ngang của rễ lúa 1 tháng tuổi trồng
trong thủy canh. Ảnh của lát cắt ở khoảng cách 30 mm (1, 4) 50 mm (2, 5) và 100 mm (3,
6) cách chóp rễ của giống Pokkali và IR 20 đối chứng.

3,b) Đai Casparian trong nội bì (1–8). mặt cắt ngang được nhuộm với berberine
aniline blue và được quan sát dưới quang phổ xanh. Đầu mũi tên chỉ đai Casparian nội bì.
Đối chứng (1, 5) stressed Pokkali (2, 6) ở khoảng cách 20 mm và 30 mm. Đối chứng (3,
7) và stressed IR20 (4, 8) 20 mm và 30 mm.
3,c) Đai Casparian trong nội bì (1–12) được nhuộm màu bằng berberine aniline
blue. Mặt cắt ở khoảng cách 10 mm (1, 2), 20 mm (5, 6) và 30 mm (9, 10) của đối chứng
và stressed Pokkali. Mặt cắt ở khoảng cách 10 mm (3, 4), 20 mm (7, 8), và 30 mm
(11,12) cách chóp rễ của đối chứng và stressed IR20. Đầu mũi tên chỉ đai Casparian nội
bì. Những con số chỉ khoảng cách cách chóp rễ. ae aerenchyma, co cortical cells, rh
rhizodermis. Bars 100 m (b), 50 m (c).

Các chất phát huỳnh quang ưa mỡ Fluorol yellow 088 (FY) nhuộm những lá
Suberin (SL) một màu vàng đậm. Ở giống đối chứng, không thấy những phát quang vàng
trong nội bì của 1 trong 2 giống ở khoảng 20 mm cách chóp rễ (Fig. 4a, 1, 3). Ở khoảng
cách 30 mm có thể nhìn thấy chất phát quang màu vàng rất nhạt trong giống Pokkali (Fig.
4a, 5) trong khi đó ở IR20 có thể nhìn thấy chất phát quang vàng sáng rõ rệt hơn trong
một số tế bào (Fig. 4a, 7). Ở khoảng cách 50 mm, sự lắng đọng của SL được nhìn thấy
trong một vài tế bào nội bì của giống Pokkali (Fig. 4a, 9) nhưng xuất hiện nhiều trong tế
bào nội bì của giống IR20 (Fig. 4a, 11). Cường độ phát quang của SL trong nội bì tăng
dọc theo rễ hướng về phía gốc (Fig. 4a). Trong cả 2 giống, sự phát quang vàng sáng cho
thấy sự phát triển tốt của những lá suberin nội bì là ở khoảng cách 100 mm cách chóp rễ,
trong khi ở gần cực mô gỗ có vài đoạn tế bào không nhìn thấy có SL (Fig. 4a, 13, 15).
Ngược lại với giống đối chứng, lúa stress mặn ở khoảng cách 20 mm những lá
suberin được hình thành bên trong vách nội bì. Tuy nhiên, trong Pokkali sự phát quang
của chúng chỉ là màu vàng nhạt nhưng nó đã cho thấy một sự phát triển sớm của những lá
suberin (Fig. 4a,2). Trong khi ở IR20, những lá suberin nội bì phát triển tốt hơn và ăn
màu sáng hơn (Fig. 4a, 4). Ở 30 mm, khoảng 25% tế bào đã phát triển lá suberin ăn màu
sáng hơn ở giống Pokkali (Fig. 4a, 6). Trong khi nhưng lá này hình thành hoàn thiện hơn

ở IR 20 với một vài đoạn tập trung bên cạnh mô gỗ (Fig. 4a,8). Ở khoảng cách 50 mm
cách chóp rễ những lá suberin nội bì đã được hoàn thiện hơn ở cả 2 giống (Fig. 4a, 10,
12) nhưng có nhiều đoạn tế bào ở Pokkali lá suberin không được thấy rõ ràng hơn so với
IR 20. Ở khoảng 100 mm, lá suberin đã phát triển đầy đủ và được nhìn thấy rõ trong nội
bì của cả 2 giống Pokkali và IR20 (Fig. 4a, 14, 16). Cũng như độ tuổi của rễ, độ dày của
SL xuất hiện trong nội bì tăng là do sự hình thành của Suberin thứ cấp.
Trong đối chứng, không có lá suberin ngoại bào được nhìn thấy ở khoảng 20 mm
cách chóp rễ của một trong hai giống (Fig. 4b, 1, 3). Tuy nhiên, ở 30 mm đa số tế bào
biểu bì đã hình thành sớm những lá suberin đối với Pokkali nhưng chỉ một vài tế bào ở IR
20 có hình thành SL (Fig. 4b, 5, 7). SL ăn màu đậm được nhìn thấy trong tất cả tế bào
biểu bì của Pokkali ở khoảng 50 và 100 mm cách chóp rễ (Fig. 4b, 9, 13), trong khi sự
phát triển của SL có phần loang lỗ hơn và chỉ hiện diện trong 1 vài tế bào trong vùng
khảo sát ở IR20 (Fig. 4b, 11, 15). Sự khác biệt nổi bật trong sự phát triển lá suberin giữa
giống đối chứng và giống stress mặn. Những lá trong lớp ngoại bì bắt đầu hình thành ở
khoảng 20 mm cách chóp rễ ở cả 2 giống khi stress mặn (Fig. 4b, 2, 4). Ở 30 mm, huỳnh
quang vàng sáng hơn cho thấy sự hình thành của SL đã hoàn tất và liên tục trong cả hai
giống (Fig. 4b, 6, 8). Cường độ phát quang của lá Suberin tăng dọc theo chiều dài của rễ
hướng vê phía nền ở 50 mm (Fig. 4b, 10, 12) và 100 mm cách chóp rễ (Fig. 4b, 14, 16).


Fig. 4: Sự hình thành lá suberin (SL) trong rễ lúa
a) SL trong nội bì (1–16). Mặt cắt được cắt ngang từ rễ lúa 1 tháng tuổi trồng thủy
canh được nhuộm màu với FY088 và được quan sát bằng tia UV. Đầu mũi tên cho thấy
sự hình thành của SL. Mặt cắt được cắt ở khoảng cách 20 mm (1, 2), 30 mm (5, 6), 50
mm (9, 10) and 100 mm (13, 14) cách chóp rễ của đối chứng và stress mặn Pokkali.
Tương tự, mặt cắt được cắt ở khoảng cách 20 mm (3, 4), 30 mm (7, 8), 50 mm (11, 12)
and 100 mm (15, 16) cách chóp rễ của đối chứng và stress mặn IR20.
b) SL trong ngoại bì (1–16). Mặt cắt được cắt ở khoảng cách 20 mm (1, 2), 30 mm
(5, 6), 50 mm (9, 10) and 100 mm (13, 14) cách chóp rễ của đối chứng và stress mặn
Pokkali. Tương tự, mặt cắt được cắt ở khoảng cách 20 mm (3, 4), 30 mm (7, 8), 50 mm

(11, 12) and 100 mm (15, 16) cách chóp rễ của đối chứng và stress mặn IR20. Số chỉ
khoảng cách cách chóp rễ, ex exodermis, en endodermis, pc passage cells, sl
sclerenchyma. Bars = 100m (a), 50 m (b)


Sự hình thành của Suberin trong rễ: ảnh hưởng của khủng hoảng mặn
Suberin được phân tích từ nội bì (E) và một phần ngoài của rễ (OPR) ở lúa1 tháng
tuổi cả giống đối chứng và stress mặn từ cả hai hình thức trồng trong đất và thủy canh.
Rễ được chia thành hai 2 vùng. Vùng I bao gồm một nửa là vùng phát triển chóp rễ và
vùng II gồm một nửa trưởng thành hơn với rễ hướng về phía gốc. Sau đó, mỗi nửa được
cắt để tách trung trụ với nội bì từ các lớp tế bào bên ngoài chứa ngoại bì.
Cả Suberin béo và thơm đều thấp trong nội bì khu I và tương đối ít biến đổi giữa
các giống (Fig. 5a, b). Mặt khác, ở khu II có một lượng lớn Suberin béo, thơm và lớn hơn
ở khu I (Fig. 5a, b). Trong khu I, OPR có lượng Suberin lớn hơn 1,5- 2 lần so với nội bì.
Sự khác biệt về giống được phát hiện ở tất cả các khu ngoại trừ phần nội bì ZI (zone I), ở
giống chuẩn kháng Pokkali, chuẩn nhiễm Jaya hình thành suberin nhiều hơn so với giống
mẫn cảm IR20. Sự khác biệt giữa Pokkali và IR20 có ý nghĩa ở mức P <0,05 trong tất cả
các trường hợp trừ Suberin béo trong nội bì ZI và Suberin thơm trong cả 2 phần nội bì.
Cũng tương tự đối với lúa trồng trong đất và trồng thủy canh nhưng số lượng suberin béo
hình thành ở lúa trồng trong đất cao hơn đáng kể trong tất cả các phần (Fig. 5a). Lượng
Suberin thơm của lúa trồng trong đất cao hơn trong thủy canh, mặc dù khác biệt không
đáng kể mấy về mặt ý nghĩa (Fig. 5b). Mối tương quan giữa số lượng suberin ở rễ và Na +
tích lũy trong chồi của lúa đối chứng trồng thủy canh được thê hiện trong Fig. 5c. Mặc dù
chỉ có 3 điểm dữ liệu nhưng đó rõ ràng là hai thông số tương quan tiêu cực trong một mối
quan hệ gần tuyến tính.
Suberin trong tất cả các mẫu thử nghiệm đã được bao gồm hai loại chính, béo và
suberin thơm (Fig. 5a, b). Suberin thơm được hình thành chủ yếu là do các axit coumaric
và ferulic, trong khi suberin béo được cấu thành từ một loạt các hợp chất hóa học khác
nhau (axit béo, rượu, diacid, hydroxy acid, 2-hydroxy acids và hydroxy acids; Fig. 5d).
Axit béo và hydroxy acid là lớp chất chính trong cả hai vùng rễ của OPR (Fig. 5d) và nội

bì (bổ sung Fig. 1a) của giống Pokkali, tương tự chúng cũng được hình thành trong 2
giống còn lại. Sự khác biệt về số lượng trong thành phần suberin được nhìn thấy giữa các
giống chủ yếu phát sinh từ những biến đổi trong hai lớp chất hóa học này, 2 lớp chất này
đều có mặt với số lượng lớn trong Pokkali. Đối với một giống nhất định, mẫu rễ từ lúa
trồng trong đất có số lượnghydroxy acid và acid béo lớn hơn so với rễ từ lúa trồng thủy
canh (dữ liệu trình bày cho giống Pokkali trong 5 ngày Fig. 5d , Bổ sung Fig. 1a). Chiều
dài chuỗi thay đổi từ C-16 đến C-30, nhưng rất ngắn (C-16 và C-18) và rất dài chuỗi (C26 và C-30) axit béo được nhô lên trong OPR và nội bì của các vùng rễ. Mặc dù chiều dài
chuỗi trung gian (C20-24) đã được phát hiện, chúng đã hiện diện trong một vài phút (bổ
sung Fig. 1b, c).


Fig. 5: Sự hình thành lá suberin (SL) trong rễ lúa
a, b) Khối lượng của Suberin béo (a) và suberin thơm (b) hình thành từ nội
bì (E) và một phần ngoài gần thành tế bào của rễ (OPR) được phân lập từ rễ lúa 1
tháng tuổi sau khi ester hóa với BF3/methanol. Rễ sinh trưởng trong nước hoặc
trong đất. Trước khi phân tích, rễ đã được tách thành 2 vùng. Vùng I bao gồm một
nửa là vùng phát triển chóp rễ và vùng II gồm một nửa trưởng thành hơn với rễ
hướng về phía gốc.
c) Mối tương quan giữa tổng Na+ trong chồi và số lượng suberin ở rễ (ZII
OPR) của lúa trồng thủy canh. Pokkali (vòng tròn), Jaya (hình vuông), IR20 (hình
tam giác).
d) Lớp monome suberin béo hình thành từ OPR được phân lập từ rễ
Pokkali trồng trong thủy canh và trong đất. Khối lượng được tính trong g vách tế
bào polymer theo mg trọng lượng khô phân lập từ thành tế bào. Dữ liệu đại diện
cho các giá trị trung bình SE ba lần lặp lại. Dấu hoa thị chỉ ra sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê ở mức * P = 0,05; ** P = 0,01 (t test) giữa các giá trị từ các điều
kiện sinh trưởng khác nhau (thủy canh và trong đất).


Phân tích Suberin ở giống stress mặn cho thấy có sự cảm ứng hình thành suberin ở

giống stress mặn khoảng 1 tuần. Chỉ giống kháng Pokkali và giống nhạy cảm IR20 được
chọn thí nghiệm. Có sự gia tăng trong số lượng suberin béo tương ứng với sự gia tăng
stress mặn trong cả ngoại và nội bì, nhưng sự gia tăng này cao hơn nhiều ở E-ZI
(endodermis-zone I) và OPR-ZII trong cả hai giống (Fig. 6a). Trong OPR-ZII với 100
mM NaCl, tăng khoảng 2 lần từ 9-16g ( mg-1DW) đối với Pokkali và từ 6-12g ( mg-1DW)
đối với IR20. Suy ra hàm lượng Suberin trong OPR-ZII của Pokkali lớn hơn nhiều so với
IR20 nhưng Suberin trong E-ZI của cả 2 giống thì gần bằng nhau (Fig. 6a).
Tương tự suberin béo, Suberin thơm cũng được quan sát trên cả 2 giống stress
mặn. Có sự gia tăng đáng kể số lượng Suberin thơm trong E–ZII và OPR (ZI, ZII) của cả
2 giống được xủ lí với 100 mM muối (Fig. 6b). Tuy nhiên, Một hiệu ứng tương tự cũng
được quan sát thấy trên sự lắng đọng của suberin thơm với stress mặn ở cả hai giống
được sử dụng. Có sự gia tăng đáng kể trong số lượng thơm trong E-ZII và OPR (ZI, ZII)
của rễ ở cả hai giống sau khi điều trị 100 mM muối (Fig. 6b). Tuy nhiên, số lượng này
hầu như vẫn không thay đổi trong nội bì vùng chóp rễ (E-ZI) (Fig. 6b). Lượng suberin
thơm trong Pokkali cao hơn đáng kể so với IR20 ở vùng ngoại bì OPR-ZII (Fig. 6b).
Axit béo và hydroxy acid là lớp chính trong tất cả vùng rễ của cả 2 giống (Fig. 6c,
bổ sung Fig. 2a, c). Có sự gia tăng đột ngột số lượng hydroxy acid với sự gia tăng stress
mặn Fig. 6c, bổ sung Fig. 2a, c). Độ dài của chuỗi acid béo gồm C-16, 18, 24, 26 và C28
tăng tương ứng với stress mặn trong OPR và nội bì của giống Pokkali (Fig. 6d, bổ sung
Fig. 2b). Tương tự, cũng tăng trong OPR (Bổ sung Fig. 2d) và nội bì của IR20. Không có
sự gia tăng đáng kể số lượng suberin ở rễ của bất kỳ giống nào trong ba giống khi stress
mặn với 200 mM NaCl khoảng 2 ngày.
Biểu hiện của gen tổng hợp suberin
RT-PCR analysis on total RNA from both control and stressed plants was carried
out for one P450 (CYP86A9) and one elongase (CER6). The salt-tolerant Pokkali was
chosen for this experiment and the plants were stressed with 200 mM NaCl from 0 to 8 h.
Figure 7a shows the tissue-specific expression of both P450 (CYP86A9) and elongase
(CER6). P450 was abundantly expressed in the apical and middle part of the roots while
there was very little expression in stem and basal parts of the roots. High expression of
elongase was seen in the leaf and stem while moderate expression was seen in the apical

and middle parts of the roots. Figure 7b demonstrates induction of gene expression of
both P450 and elongase at 30 min (0.5 h) after the salt stress, followed by a decline to
control levels over 4 h.
THẢO LUẬN
Cây trồng hình thành nhiều cơ chế để tồn tại được trong môi trường mặn. Ở cấp độ
cây trồng, sự hấp thu Na+ vào chồi do rễ quy định, trong khi trong chồi apoplast được giữ
ở mức thấp bởi cơ chế đệm (Oertli 1968; Flowers et al. 1991; Anil et al. 2005). Ở cấp độ
tế bào, sự tích lũy osmolyte được hình thành dưới điều kiện stress mặn (Bohnert et al.
1995; Hasegawa et al. 2000). Ngoài ra, sự giảm tính thấm của màng sinh chất kết hợp với
Na+ tích lũy trong không bào giúp làm tan Na + tế bào chất (Kader and Lindberg 2005;


Anil et al. 2007a). Một số hoặc tất cả các cơ chế này đã được chứng minh có hiệu quả ở
cả cây trồng ưa mặn và cây trồng bị ảnh hưởng mặn. Tuy nhiên, duy trì Na + tế bào chất
25 mM là điều không hoàn toàn mà trong khoảng 1.7 đến 311 mM (Flowers and
Hajibagheri 2001; Carden et al. 2003; James et al. 2006; Kronzucker et al. 2006). Một
loạt các kĩ thuật như 3 nòng H+-, K+-, và Na+- vi điện cực chọn lọc (Carden et al. 2003),
tia X vi phân (Flowers and Hajibagheri 2001), thuốc nhuộm huỳnh quang nhạy cảm Na+
(Kader and Lindberg 2005; Anil et al. 2007a) và phân tích đánh dấu (Kronzucker et al.
2006) được sử dụng để tính mức độ Na + tế bào chất. Trong khi có thể hiểu rằng một số
biến đổi có thể là do sự khác biệt trong kĩ thuật đo lường, điều đó chứng tỏ rằng nhiều
khả năng mức độ Na+ trong tế bào chất thay đổi tùy thuộc vào hệ thống cây trồng. Tuy
nhiên, khi thực hiện nghiên cứu, so sánh giữa giống kháng và giống mẫn cảm cho thấy
giống kháng duy trì mức độ Na + tế bào chất thấp hơn giống mẫn cảm (Flowers and
Hajibagheri 2001; Carden et al. 2003; Kader and Lindberg 2005; James et al. 2006; Anil
et al. 2007a). Sự di động Na+ ngang qua màng sinh chất là được trung gian vận chuyển.
Các quan sát cho thấy rằng, Na + đi vào thường kèm theo sự suy giảm K + do sự cạnh tranh
giữa hai ion công suất cao với hệ thống vận chuyển có ái lực thấp (Schroeder et al. 1994).
Tuy nhiên, nhân bản vô tính kênh K+ như KAT1 và AKT1 và kênh chọn lọc cao K+/Na+
(Anderson et al. 1992; Sentenac et al. 1992), so sánh với các kênh Kv ở động vật có vú.

Có thể hiểu rằng các kênh khác là không chọn lọc (Mäser et al. 2001).