Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

------

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM
VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

GVHD: Đào Thiện
SVTH: Nhóm 2

1


TP Hồ Chí Minh, Tháng 9/2013
BÀI 1: HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM
QUAN SÁT TIÊU BẢN VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC
Mục tiêu:
-

Chuẩn bị trang thiết bị cần thiết của một phòng thí nghiệm vi sinh vật.
Vận dụng được các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật

I – Cơ sở lý thuyết
1. Các quy tắc an toàn trong phòng thí nghiệm vi sinh vật
• Hiểu đúng nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật.
• Thao tác an toàn trên đối tượng vi sinh vật ở mật độ cao.
• Không ăn uốn, hút thuốc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật
• Mặc áo blouse trong thời gian thực hành.
• Không dùng miệng hút bằng ống hút ( pipette) để định lượng vi sinh vật

hay hóa chất, mà phải dùng quả bóp cao su khi thao tác hút bằng ống hút.
• Hộp Petri đã đổ môi trường hoặc sau nuôi cấy vi sinh vật, không mở nắp,
dùng tay để sờ và dùng mũi để ngửi.
• Khi lỡ tay làm đổ vi sinh vật ra nơi làm việc, dùng khăn hay giấy tẩm cồn
70 độ để lau và lau sạch lại bằng khăn hay giấy tẩm cồn 70 độ khác.
• Khi sử dụng que cấy để gieo cấy vi sinh vật cần phải được khử trùng bằng
cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn tránh vươn vãi ra xung quanh.
• Trước và sau khi thao tác trên vi sinh vật cần lau tay kỹ bằng cồn 70 độ.
Khi thực hiện thao tác này cần phải tránh xa ngọn lửa đèn cồn khi tay còn
ướt.
• Cần ghi chú tên chủng vi sinh vật và ngày tháng thí nghiệm lên các dụng
cụ chứa môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
• Tất cả các chất thải và môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được
hấp khử trùng trước khi đem đổ vào thùng rác. Các dụng cụ nhiễm vi sinh
vật cần được ngâm trong dung dịch sát khuẩn trước khi rửa.
• Không đổ thạch vào bồn rửa và ống thoát nước.
2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm vi sinh vật
2


II – Tiến hành thí nghiệm
1. Làm nút bông
- Sau khi nhận dụng cụ ta phải làm sạch dụng cụ bằng nước.
- Sau đó dùng bông thấm nước làm khô.
 Ngăn ngừa các chất từ môi trường nuôi cấy vào trong miệng và tránh nhiễm tạp từ
miệng vào môi trường.
Bước 1: Dùng tay xé 1 miếng lớp bông hình chữ nhật, gấp các rìa miếng bông vào trong
cho gọn không bị xù.
Bước 2: cuốn chặt lại thành nút sao cho vừa khít ống nghiệm (không quá chặt cũng
không quá lỏng) để:

 Không làm nút bông quá chặt gây vỡ ống nghiệm.
 Không làm nút bông quá lỏng vì dễ bị nhiễm tạp.
2. Bao giấy dụng cụ
Mục đích: Trước khi hấp khử trùng dụng cụ, vật liệu, cần phải tiến hành bao gói kỹ càng
và đúng kỹ thuật để thuận tiện cho công việc khử trùng, tránh hiện tượng nứt vỡ hay bị
tạp nhiễm sau khi hấp.
Trong phòng thí nghiệm vi sinh vật, người ta thường cuốn giấy trên nhiều dụng cụ: ống
nghiệm, đĩa Petri, bình tam giác,…
Bao gói dụng cụ: Sau khi đã làm nút, các dụng cụ phải được bao gói quy cách để đem
hấp.
Bước 1: Đối với ống nghiệm đựng môi trường đã có nút bông, cần dùng giấy bọc chặt
phía đầu nút bông lại.
Bước 2: Chai lọ cũng được bọc chặt phần nút bằng giấy.
Bước 3: Pipette được gói bắt đầu từ phía đầu nhỏ giọt, cuộn giấy dần theo kiểu xoáy trôn
ốc cho tới hết ở phía đầu có nút bông.
Bước 4: Các pipet có thể được gói từ 1 tới vài chiếc
Các đĩa Petri được gói thành chồng, mỗi chồng từ 3-5 chiếc
Các dụng cụ khác, tuỳ theo yêu cầu mà có sự bao gói cho thích hợp. Nếu hấp ở nồi hấp
áp lực thì không được bao gói bằng giấy thấm nước mà phải dùng loại giấy dai, không
thấm nước.

3


Các dụng cụ bao gói phải thật khô, sạch, tránh vỡ trong khi hấp. Dụng cụ bao gói xong
phải dán nhãn, đề ngày đem hấp để tiện việc theo dõi, sử dụng.
3. Hấp tiệt trùng dụng cụ
 NỒI HẤP (AUTOCLAVE)
Nguyên lý: Phương pháp sử dụng nồi hấp áp lực dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các
vật bằng hơi nước bão hoà dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển. Khi áp suất tăng, nhiệt

độ cũng tăng theo. Tác dụng phối hợp giữa nhiệt độ cao và áp suất đảm bảo cho việc khử
trùng thực hiện được tốt. Khi hấp, áp lực sẽ tiêu diệt cả tế bào và sinh dưỡng lẫn bào tử
của vi sinh vật .
 CÁCH VẬN HÀNH NỒI HẤP CƠ:
Bước 1: Kiểm tra mực nước ở trong khoảng an toàn
Đổ nước vào nồi hấp với lượng thích hợp (đến vạch chuẩn trên ống thuỷ tinh đặt dưới
phễu rót nước). Nước phải đủ, không nên đổ quá vì khi sôi nước có thể lọt vào ống dẫn
đến áp kế và làm sai lạc chỉ số áp. Nếu đổ ít, hiệu quả khử trùng kém, có thể gây cháy
nồi. Tốt nhất nên dùng nước cất cho vào nồi hấp vì nó sẽ không tạo ra canxi.
Bước 2: Bật công tắc để gia nhiệt trước (10-15 phút).
Bước 3: Đặt các dụng cụ vào buồng hấp.
Các đồ dùng phải bao gói kỹ rồi mới xếp vào nồi hấp. Đồ nặng ở trên. Không nên xếp
dụng cụ quá sát nhau để hơi nước có thể di chuyển dễ dàng .
Bước 4: Kiểm tra và đóng các valve xả và valve an toàn.
Bước 5: Đậy nắp và vặn ốc đối xứng nhau từng đôi một.
Bước 6: Khi đồng hồ áp lực chỉ 0.4-0.5 kg/cm 2 thì xả khí lần 1 cho tới khi đồng hồ áp lực
chỉ 0.1 kg/cm2 hay khi thấy buồng khí xả xuất hiện dòng khí trắng liên tục thì đống valve
xả.
Bước 7: Chờ cho đồng hồ áp lực chỉ 1 atm hay nhiệt độ chỉ 121 0 C tính giờ và canh 15
phút.
Bước 8: Khi đã đủ thời gian khử trùng, đợi áp suất trong nồi hạ dần tới vạch số 0, mở van
thông hơi xả hết khí. Vặn ốc, mở nắp, lấy các đồ dùng đã được khử trùng ra.
4


III - Câu hỏi thảo luận
1. Nêu kỹ thuật chỉnh kính hiển vi khi quan sát trạng thái sống và trạng thái chết
 Khi vi sinh vật ở trạng thái sống:
• Lấy một phiến kính sạch cho 1 giọt nước hay 1 giọt phẩm màu methylene
blue (0.1%). Sau đó cho vi sinh vật hòa tan trong giọt nước hay giọt màu

loãng đó.
• Đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu,
nghiêng một góc <= 45 độ và hạ lá kính xuống để không có bọt khí.
• Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quang sát ở
vật kính 10X, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt
vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh vi
sinh vật rồi dùng nút chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh vi sinh vật. Trên bàn
mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật di chuyển phiến kính đến vùng muốn
quan sát trong thị trường.
• Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X và
điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh.
 Khi vi sinh vật ở trạng thái chết:
• Cố định vi sinh vật bằng cách cho 1 giọt sinh khối vi sinh vật trải đều trên
phiến kính sạch, hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi khô (không còn ướt,
nhưng không được cháy).
• Cho 1 giọt (lớn) phẩm nhuộm đơn (methylene blue 0.1% hoặc
Carbofuchsin 0.1%) lên vết vi sinh vật đã cố định để trong 5 phút.
• Rửa nước bằng đầu xịt của bình tia cho đến khi sạch màu và làm khô bằng
ngọn lửa đèn cồn (có thể dùng giấy mềm để thấm nhẹ nước, nhưng không
dùng giấy mềm để lau).
• Nhỏ 1 giọt dầu cefdre lên vết nhuộm, đưa lên bàn mẫu.
• Nâng tụ quang, mở chắn sáng nhìn từ ngoài, hạ vật kính 100X xuống chìm
vào giọt dầu cefdre.

5


• Nhìn vào thị kính, điều chỉnh ốc chỉnh thô từ từ cho đến khi thoáng thấy
vật thì điều chỉnh ốc chỉnh tinh để trông rõ vật.
2. Sau khi thao tác với vi sinh vật, người ta thường dùng cồn 70 độ để tiệt khuẩn

-

tay và nơi làm việc mà không dùng cồn 90 độ hay 60 độ, giải thích?
Vì cồn 90 độ đậm đặc nên bay hơi nhanh so với cồn 70 độ. Và chính vì cồn 90 độ
đậm đặc nên sẽ làm thành tế bào của vi khuẩn, vi sinh vật đông lại, tạo thành một

-

lớp àng cứng bảo vệ nên sẽ mất tác dụng.
Còn cồn 60 độ thì hơi loãng nên không hiệu quả.
Do đó người ta sẽ dùng cồn 70 độ để tiệt khuẩn tay và nơi làm việc.

oo
BÀI 2: KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

Mục tiêu:
-

Phân biệt được môi trường nuôi cấy và phân tích.
Pha chế được các loại môi trường cơ bản.
Áp dụng các phương pháp tiệt trùng môi trường, dụng cụ.

I – Cơ sở lý thuyết
1. Dinh dưỡng vi sinh vật
Môi trường dinh dưỡng vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác
nhau.thành phần dinh dưỡng này tùy thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật.
6


Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ, có cấu tạo từ các nguyên tố là

C, H, O và N.
Ngoài ra các nguyên tố thiết yếu,trong các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa
lượng: S, P; các nguyên tố vi lượng như : Fe, Cu, Mg, Zn, K, Ca, Cl, Bo....vì thế trong
thành phần dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm
nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, vi sinh vật sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ thể
thực vật, động vật hoặc vi sinh vật.
Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0.05-0.2%, nấm mốc
và nấm men khoảng 3-15%. Ngoài ra còn có nồng độ phù hợp của các gốc kiềm purin,
pirimidin hoặc các vitamin,…

2. Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường nơi cung cấp đầy đủ các thành phần về dinh dưỡng (nguồn nitơ, nguồn
carbon, khoáng đa-vi lượng, chất sinh trưởng…) cho sự phát triển của vi sinh vật. Tùy
theo mục đích mà thành phần, hàm lượng các chất trong môi trường là khác nhau. Môi
trường có thể được phân loại theo:
a) Theo cấu trúc: lỏng, rắn, bán rắn
b) Theo thành phần: tổng hợp, tự nhiên, bán tổng hợp
c) Theo công dụng: tiền tăng sinh, tang sinh, chọn lọc, phân biệt, chọn lọc-phân biệt,
thử nghiệm sinh hóa, đông khô thương phẩm

II – Tiến hành thí nghiệm
1. Pha chế môi trường Cao thịt - pepton:

7


Bước 1: Cân 5g agar + 125ml nước cất. Đun sôi cho đến khi tan hết (dung dịch 1).
Bước 2: Hòa tan 0.75g cao thịt + 2.5g pepton + 1.25g NaCl vào 125ml nước cất (dung
dịch 2)
Bước 3: Cho dung dịch 2 vào dung dịch 1 đang sôi, khuấy đều, tắt bếp.

Bước 4: Phân phối vào các dụng cụ chứa, đậy kín bằng nút bông và nắp giấy, dán nhãn
và đem đi hấp tiệt trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút.

2. Pha chế môi trường DRBC_ Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol.
Bước 1: Lấy 7.5g môi trường DRBC đã pha sẵn hòa tan vào 250ml nước cất
Bước 2: Phân phối vào các dụng cụ chứa, đậy kín bằng nút bông và nắp giấy, dán nhãn
và đem đi hấp tiệt trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút.
III - Câu hỏi thảo luận
1. Trong kỹ thuật nuôi cấy vsv, mỗi loài hoặc mỗi nhóm vsv khác nhau, tại sao
-

cần phải pha chế các loại chất khác nhau và hàm lượng cũng khác nhau?
Mỗi loài hoặc mỗi nhóm có điều kiện cho quá trình dị hóa, đồng hóa khác nhau; các

-

quá trình sinh lý sinh hóa; nhu cầu dinh dưỡng và đặc điểm sinh trưởng khác nhau.
Do mục tiêu nghiên cứu.

-

2. Tại sao môi trường thạch đĩa cần phải được úp ngược sau khi làm nguội?
Kiểm tra được chất lượng thạch đổ.
Không để nước đọng trên nắp rớt xuống làm hỏng khuẩn lạc nuôi cấy.
Hạn chế một phần tạp nhiễm trong thời gian nuôi cấy do phần đáy nặng có xu hướng

-

úp từ trên xuống nên đậy kín đĩa thạch.
Dễ dàng khi cầm nắm, vận chuyển đĩa thạch mà không bi rơi nắp bất ngờ làm ngoại

nhiễm.
3. Giải thích tại sao môi trường nuôi cấy cần nên được làm nguội khoảng 45-55 0C
trước khi chúng được rót vào đĩa Petri?
8


-

Thạch quá nóng dễ dàng làm nứt hoặc vỡ đĩa Petri.
Nếu đổ đĩa (đổ môi trường) lúc agar có nhiệt độ cao thì khi để nguội sẽ có nhiều nước
đọng lại trên thành, trên nắp đĩa dễ tạo môi trường cho vi sinh ngoài không khí xâm
nhập vào làm hỏng môi trường.

oo

BÀI 3: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT

Mục tiêu:
-

Thực hiện các kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật
Thực hiện các kỹ thuật phân lập vi sinh vật

I – Cơ sở lý thuyết
1. Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật
Mục đích của việc gieo cấy vi sinh vật để nhân giống vi sinh vật; phát hiện sự có mặt của
vi sinh vật trong các mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nước, đất....)
cần phân tích; nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lí, sinh hóa của đối tượng vi sinh
vật mục tiêu.
 Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

Dùng que cấy vòng và làm theo trình tự các bước sau:

9


-

Ống nghiệm được cầm ở tay trái, tay phái cầm que cấy, ngón út và lòng bàn tay
của tay phải dùng để mở và giữ nút bông. Sau khi khử trùng que cấy, mở nút

-

bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa.
Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm hay bình tam giác và nhúng
vào canh trường lấy một ít canh trường chứa vi sinh vật mà không để đầu que cấy

-

chạm vào thành bình và miệng ống nghiệm .
Đầu que cấy có dính vi sinh vật được giữ ở không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn

-

cồn.
Dùng tay trái lấy ống nghiệm mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi
đưa que cấy vào bên trong ống nghiệm nhúng vào canh trường và khuấy nhẹ que

-

cấy.

Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm và nút bông rồi đậy lại.
Để các ống nghiệm vào giá, đốt que cấy trên đèn cồn ngay trước khi trả về giá để

que cấy.
 Cấy giống từ ống nghiệm thạch nghiêng hay môi trường lỏng sang ống nghiệm
thạch nghiêng
- Thường sử dụng que cấy vòng. Các bước tiến hành giống kỹ thuật cấy giống từ
môi trường lỏng sang môi trường lỏng, nhưng chỉ khác ở bước 4. Sau khi lấy
được sinh khối vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiến hành đưa đầu que cấy vào
trong ống nghiệm và cấy ria theo đường dzích dzắc từ đáy ống lên.
 Cấy đâm sâu trên ống nghiệm thạch đứng
Người ta sử dụng que cấy thẳng để đâm sâu vào trong môi trường thạch đứng. Các
bước tiến hành cũng tương tự như mục trên, nhưng có điểm khác như sau:
-

Quay ngược ống môi trường cho miệng ống nghiệm xuống dưới để tránh việc

-

nhiễm khuẩn lúc gieo cấy.
Đưa ống nghiệm có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến gần đáy
ống nghiệm.

2. Phân lập vi sinh vật

10


Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên ở dạng quần xã gồm nhiều quần thể các loài vi sinh vật.
Việc phân lập loài nhất định trong quần xã vi sinh vật dựa vào khả năng phân tách các tế

bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc.
Hầu hết các phương pháp phân lập và thuần chủng vi sinh vật đều dựa trên một số kỹ
thuật pha loãng để phân tách tế bào vi sinh vật kết hợp điều kiện nuôi cấy chọn lọc để tạo
ưu thế tăng trưởng cho chủng quan tâm. Hiện nay, có các kỹ thuật phổ biến sau:
 Kỹ thuật hộp ria
- Là kĩ thuật phân tách hỗn hợp vi sinh vật bằng cách ria trên bề mặt đĩa thạch sao
cho các tế bào riêng lẻ ra nhau. Sau khi được ủ trong thời gian , mỗi tế bào sẽ
tăng trưởng thành một khuẩn lạc riêng biệt. Khuẩn lạc này hình thành do sự sính
-

sản, phân chia từ một tế bào ban đầu.
Trong kĩ thuật ria, có nhiều cách ria khác nhau và không có kỹ thuật nào hoàn hảo
tuyệt đối. Hiệu quả của kỹ thuật phần lớn phụ thuộc vào người cấy. Sau đây là
một số kỹ thuật ria thường dùng:
o Kỹ thuật ria chữ T
o Kỹ thuật ria liên tục
o Kỹ thuật ria 4 góc
o Kỹ thuật ria ria

II – Tiến hành thí nghiệm
Phân lập vi sinh vật – Kỹ thuật cấy ria trên đĩa thạch
Sử dụng các đĩa petri đã được chuẩn bị từ bài 2: petri chứa môi trường cao thịt- pepton và
Czapek-Dox hoặc DRBC đã hấp khử trùng. Các petri chứa môi trường Czapek –Dox
dùng để phân lập vi khuẩn. các petri chứa môi trường Czapek-Dox hoặc DRBC dùng để
phân lập nấm men hay nấm mốc.
Bước 1: Làm lỏng môi trường bằng lo vi sóng. Lắc đều.
Bước 2: Mở đĩa petri gần đèn cồn và đổ môi trường nuôi cấy ra các đĩa petri.
11

Chờ môi trường đặc lại.
Bước 3: Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ.
Bước 4: Nhúng que cấy và canh khuẩn (nước mía) để lấy giống.
Bước 5: Cấy giống vi khuẩn vào đĩa petri. Cấy giống gần đèn cồn.
Bước 6: Tay trái mở nắp petri, tay phải cầm que cấy ria trên bề mặt thạch.
Bước 7: Khử trùng que cấy sau khi cấy ria xong.

III – Câu hỏi ôn tập
1. Người ta phân lập vi sinh vật từ môi trường tự nhiên dựa trên những nguyên
tắc gì?
Các nguyên tắc:
Dựa vào khả năng phân tách các tế bào ra thành riêng lẻ trên môi trường chọn lọc
Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc
riêng lẻ, tách biệt nhau.
2. Trong một nhà máy lên men bia, do sơ ý về kỹ thuật, người ta đã làm mất một
giống nấm men có khả năng chịu được nồng độ ethanol cao. Hãy đề xuất các
bước tiến hành phân lập giống men có đặc tính trên để thu hồi và tàng trữ nó.
Ta lấy 1 mẫu bã lên men bia (xác bia) (có thể đem quan sát trên kính hiển vi) rồi đem
phân lập nấm men bia mà mình mong muốn. sau đó cấy trong môi trường thích hợp, nhân
giống, bảo quản, tàng trữ và sử dụng.
Nấm men khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng. tế bào
có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi. khuẩn lạc cho màu trắng sữa
Phân lập nấm men, cấy vào môi trường thích hợp như khoai tây hay môi trường
Sabouraud dùng phương pháp cấy trên đĩa petri.
Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự:
12


•
•

•
•




Để đĩa petri lên bàn
Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật ( nấm men).
Tay trái hé mở nắp petri vừa đủ để cho que cấy vào.
Nhẹ nhàng và nhanh chóng lấy que cấy lên mặt thạch theo 1 trong kiểu sau:
theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
theo những đường song song.
theo 4 hình chữ chi ở 4 góc.

Dùng pipet cấy lên lượng khá nhiều giống, có 2 cách:
Cách 1:
 Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 0.1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống
nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 50 độ.
 Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường.
 Để thạch vào đĩa petri đã khử trùng.
 Xoay tròn đĩa petri cho thạch trảng đều ở đáy hộp.
 Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp.
Cách 2:
 Hút 0.1 ml dịch cấy, nhỏ vào đĩa petri có môi trường đặc.
 Dùng que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa.
 Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tùy loài vi sinh vật
3. Trình bày phương pháp phân lập vi sinh vật bằng kỹ thuật cấy ria và kỹ thuật
pha loãng kết hợp với cấy trải?
 Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri:
 Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có được vi sinh vật

cần phân lập.
 Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. sau mỗi đường ria
liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp
theo.
 Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
 Kỹ thuật cấy ria trên ống nghiệm thạch nghiêng.
 Kỹ thuật pha loãng kết hợp với cấy rải:
Kỹ thuật pha loãng mẫu:
Mẫu thực phẩm có thể ở dạng rắn hoặc lỏng.
13


Bước 1: Cân 10g ( hoặc 25g) hoặc hút 10 ml ( hoặc 25 ml) mẫu vào bình tam giác đã có
90 ml ( hay 225 ml) SPW.
Bước 2:Nếu là mẫu rắn thì đồng nhất mẫu bằng máy. Dập mẫu hay xay mẫu trong cốc vô
trùng tối đa 2.5 phút.
Bước 3: Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta được mẫu có độ pha loãng
1/10.
Kỹ thuật cấy trải:
 Là kỹ thuật pha loãng theo bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các mức pha loãng
khác nhau và chuyển 0.1 ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi trường
thạch. Sau thời gian ủ , mỗi tế bào sẽ phát triển thành khuẩn lạc.
 Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng và chuyển 0.1 ml dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.
 Nhúng đầu thanh gạt ( que trải) thủy tinh vào cồn 70 độ , hơ qua ngọn lửa để khử
trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
 Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu
thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện
xoay đĩa 1 vài lần, mỗi lần khoảng ½ chi vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải
dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.

 Rút thanh gạt khỏi đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

oo

14


BÀI 4: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
Mục tiêu:
-

Thực hiện được thí nghiệm lấy mẫu phân tích
Thực hiện được kỹ thuật hộp trải và hộp đổ

I – Cơ sở lý thuyết
Kỹ thuật hộp trải
Là kỹ thuật pha loãng theo bậc 10 dịch chứa vi sinh vật thành các mức pha loãng khác
nhau và chuyển 0,1ml dịch ở các mức pha loãng lên bề mặt môi trường thạch. Sau thời
gian ủ, mỗi một tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc.
Chú ý: Người ta cũng thường dung kỹ thuật này để nuôi cấy, phân lập hay phân tích tổng
số nấm men, nấm mốc,…
II – Tiến hành thí nghiệm
 Kỹ thuật hộp trải : Sử dụng các đĩa Petri chứa môi trường Cao thịt-Pepton và
Czapek-Dox đã hấp khử trùng. Các Petri chứa môi trường Cao thịt-Pepton dung để
phân lập vi khuẩn. Các Petri chứa môi trường Czapek-Dox dung để phân lập nấm
men hay nấm mốc.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Dùng micropipette và đầu tip vô trùng hút 0,1ml dịch vi sinh vật lên bề mặt môi
trường thạch đĩa trong không gian vô trùng
Bước 2: Nhúng đầu que trang trong cốc thủy tinh chứa cồn 70 o , đốt trên ngọn lửa đèn

cồn để khử trùng. Để đầu que trải nguội trong không gian vô trùng (gần ngọn lửa đèn
cồn).
Bước 3: Mở đĩa Petri, dung que trang gạt đều giọt vi sinh vật trên bề mặt thạch. Dùng
que trang gạt xoay đều trên bề mặt thạch. Trong khi gạt, xoay đĩa Petri tới lui 3 – 4 lần,
mỗi lần ½ chu vi cho vi sinh vật được trải đều khắp trên bề mặt môi trường
15


Bước 4: Rút que trang ra khỏi đĩa, đậy đĩa, gói giấy và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
theo từng đối tượng vi sinh vật mục tiêu.
BÀI 5: LÊN MEN ETHANOL
Mục tiêu:
-

Thực hiện quá trình lên men ethanol
Nhận biết các dấu hiệu lên men ethanol

I – Cơ sở lý thuyết
Rượu ethanol là một loại sản phẩm lên men đường phổ biến của nhiều nhóm vi sinh vật.
Song tác nhân lên men chủ yếu là nấm men, đặc biệt là loài Saccharomyces cervisiae.
Nhiều loài vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí tùy tiện cũng có khả năng tạo thành rượu như là
một sản phẩm chủ yếu hay một sản phẩm phụ của quá trình lên men hexose và pentose.
Quá trình lên men ethanol nhờ nấm men là cơ sở của việc sản xuất các loại rượu, bia, cồn
và glycerin. Quá trình này còn được ứng dụng trong sản xuất bánh mì (làm nở bột mì) và
một số loại nước giải khát.
1. Cơ chế quá trình lên men ethanol
Tinh bột

Dextran

Glucose
EMP

Pyruvate

Acetaldehyde
pH 4-5

Ethanol
Khi phân hủy đường trong điều kiện kỵ khí, vi sinh vật chuyển hydro từ NADH đến
acetaldehyde tạo thành rượu ethanol để tái tạo NAD +. Sản phẩm tạo thành là ethanol và
CO2. Phương trình phản ứng:
NADH
16

NAD+


C6H12O6

CH3COCOOH

CH3CHO

C2H5OH + CO2 + 113,4 Kj

2. Quy trình lên men cơm rượu
Nếp trắng

Nếp lức

(Ngâm 30-60 phút)

Vo gạo

Vo gạo
Nấu
Để nguội (35-40oC)
Phối trộn

Nghiền mịn

Men ngọt

Ủ (30oC, 3-4 ngày)
Sản phẩm cơm rượu
II – Tiến hành thí nghiệm
 Lên men cơm rượu
Bước 1: Vo gạo nếp trắng hay nếp lứt (đã được ngâm 30-60 phút), thêm nước và đưa lên
bếp nấu.
Bước 2: Khi cơm sôi, vặn bếp điện nhỏ lại và lót lên bếp 1 miếng amiante để âm cho tới
khi cơm chin.
Bước 3: Xới cơm ra một cái thau nhựa sạch, để nguội nơi lặng gió.
Bước 4: Khi cơm nếp nguội đến 35-40oC (ấm ấm), ta rắc bột nấm men vào với tỷ lệ 3540 tỷ tế bào / 1Kg cơm nếp và đảo đều bằng bao tay nylon hay đũa tre. Lưu ý: không nên
đảo quá nhiều lần làm nhão cơm thì lên men sẽ không đạt.
Bước 5: Để cơm nếp đã gieo men vào trong vật chứa từ 2/3 – 3/4 thể tích (tùy theo hình
thù của vật chứa) và bịt lại bằng màng bao PVC (màng mỏng dung để bao đĩa thức ăn).
17


Bước 6: Ủ ở 30oC, 3 – 4 ngày sẽ cho sản phẩm cơm rượu.

III – Câu hỏi ôn tập
1. Trong kỹ thuật lên men cơm rượu, tại sao ta phải để 1/4 - 1/3 thể tích trống
trong vật chứa cơ chất lên men?
Trong kỹ thuật lên men cơm rượu, ta phải để 1/4 - 1/3 thể tích trống trong vật chứa cơ
chất lên men vì khi phân hủy đường trong điều kiện kỵ khí, vi sinh vật chuyển hydro từ
NADH đến acetaldehyde tạo thành rượu ethanol để tái tạo NAD +. Sản phẩm tạo thành là
ethanol và CO2 sẽ làm tăng thể tích vật chứa cơ chất, ta phải để trống thể tích nhằm tránh
làm biến dạng vật chứa cơ chất.
2. Ngoài phương pháp cảm quan, người ta còn dung phương pháp hóa học để
định tính ethanol. Nêu phương pháp đó.
Phương pháp hóa học: xác định ethanol bằng các phản ứng sau:
-

Phản ứng tạo iodoform
Phản ứng oxy hóa ethanol bằng KMnO4
Phản ứng oxy hóa ethanol bằng K2Cr2O7
Phản ứng ester hóa ethanol

oo

18


BÀI 6: LÊN MEN LACTIC
Mục tiêu:
-

Thực hiện quá trình lên men lactic
Nhận biết dấu hiệu lên men lactic

I – Cơ sở lý thuyết
Cacbohydrat là nhóm các hợp chất không chứa N, chúng là nguồn cung cấp năng lượng
chủ yếu cho đa phần các loại vi sinh vật. Cacbohydrat trong tự nhiên thường tồn tại dưới
dạng đường đơn , đường đôi, oligo hay đường đa có phân tử lượng lớn. không phải mọi
vi sinh vật đều có thể sử dụng được đường đa, loài nào có thể tổng hợp được enzyme
ngoại bào đặc hiệu của loại đường đa đó thì mới có thể sử dụng được chúng.
Dù vi sinh vật có sử dụng được đường đa, chúng phải phân cắt đường đa thành đường
đơn, sau đó chuyển vào trong tế bào. Lúc này, đường sẽ phân giải theo hai con đường, hô
hấp hiếu khí hay hô hấp kị khí còn gọi là lên men.
Con đường hô hấp hiếu khí sẽ phân giải và oxi hóa đường thành CO 2 và H2O đồng thời
giải phóng 38 ATP. Con đường hô hấp kị khí sẽ phân giải đường không hoàn toàn các
acid hữu cơ hoặc rượu, este.. đồng thời giải phóng ít năng lượng hơn so với hô hấp hiếu
khí.
1. Cơ chế lên men lactic
Khi thủy phân đường trong điều kiện kỵ khí, VSV lactic chuyển hydro từ NADH sang
pyruvate tạo thành acid lactic để tái tạo NAD+
C6H12O6

NADH
CH3COCOOH

NAD +
CH3 –CHOH –COOH +Q

Căn cứ vào sản phẩm sinh ra , quá trình lên men lactic được chia làm hai kiểu:
- lên men lactic đồng hình
- lên men lactic dị hình
19

2. Lên men sữa chua
Sữa chua len men từ sữa tươi. Sữa chua có hàm lượng acid lactic cao nên protein sữa
không tiếp tục bị phân giải nữa, mà bị đông tụ. bên cạnh đó còn tạo ra các sản phẩm phụ
diacetin, ester và các acid hữu cơ bay hơi.
Có thể sản xuất bằng phương pháp lên men tự nhiên và phương pháp cấy giống thuần
khiết.
II – Tiến hành thí nghiệm
 Quy trình công nghệ lên men sữa chua:
Sữa tươi

Phụ gia

Làm ấm
Cấy men
Rót hộp

Sữa bột
Men giống
Hũ nhựa

Ủ
Bảo quản
Sản phẩm

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu và các phụ liệu.
Bước 2: Xác định hàm lượng chât khô của sữa bằng Brix kế.
Bước 3: Tính toán hàm lượng các chất phụ gia và sữa bột cần phối chế
(điều chỉnh độ Brix > 16% và thêm các phụ gia khác…)
20

Bước 4: Duy trì nhiệt độ canh trường ở 40-45oC.
Bước 5: Sau khi khuấy đều men vào sữa, xác định pH điểm đầu,rót dịch sữa vào hũ nhựa.
Bước 6: Ủ ở 40oC trong 5 – 6 giờ.
Bước 7: Sau 6h lên men, xác định pH ở điểm cuối
Bảo quản sữa chua trong tủ lạnh ở 2-4oC.
III – Câu hỏi ôn tập
1. Mục tiêu của việc đo hàm lượng chất khô trong dịch sữa nguyên liệu?
Vật chất khô chủ yếu bao gồm mỡ sữa, protein, đường lactose, khoáng và các vitamin.
Sữa có lượng vật chất khô cao sẽ có giá trị dinh dưỡng cao. Vật chất khô trong sữa thấp
nghĩa là sữa có giá trị dinh dưỡng thấp. Nếu vật chất khô rất thấp, điều đó có nghĩa là sữa
đã bị pha thêm nước.
Vì thế, ta phải xác định hàm lượng các chất trong sữa nhằm:
-

Đáp ứng yêu cầu theo từng đối tượng tiêu dung
Đảm bảo đúng chất lượng đã đề ra
Thanh tra kiểm tra yêu cầu kiểm nghiệm

Mặt khác, đối với riêng quá trình lên men sữa chua, thì việc đo hàm lượng chất khô trong
dịch sữa nguyên liệu sẽ làm tránh hiện tượng tách lớp khi lên men.
2. Tại sao phải ủ dịch lên men ở 40-43oC?
Nhiệt độ lên men tối ưu với sữa chua là 42-43oC
Ở nhiệt độ này, thích hợp cho vi khuẩn lactic dễ dang hoạt động ,các vi khuẩn lactic sẽ
phân chia và nhân lên rất nhanh, lên men tạo ra axit lactic làm cho sữa chua lên, protein
trong sữa (gọi là cazein) kết tủa làm sữa chuyển sang trang thái đặc, như vậy quá trình lên
men sẽ xảy ra nhanh chóng va dễ dàng.
3. Nếu thay đổi nhiệt độ lên men thì chất lượng sản phẩm có thay đổi không và
thông số nào sẽ thay đổi theo?
21

Nhiệt độ lên men không ổn định sẽ làm thay đổi tỷ lệ chủng vi sinh vật  ảnh hưởng
tới chất lượng sản phẩm. Nhiệt độ lên men phụ thuộc vào tỷ lệ chủng.
Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tang lên sẽ tăng tốc độ sinh trưởng của
vi sinh vật vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất
sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và vi sinh vật sẽ tăng trưởng nhanh hơn. Lúc nhiệt độ
tăng đến một lúc nhất định thì nhiệt độ càng tăng, tốc độ sinh trưởng càng giảm. Khi
nhiệt độ tăng quá cao, thì vi sinh vật sẽ chết hoặc gây ra sự biến tính của enzyme.

oo

22