Nguyên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (pangasius hypophthalmus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

VƯƠNG BẢO THY

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT

TP. HỒ CHÍ MINH, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

VƯƠNG BẢO THY

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số: 62540201

Phản biện độc lập 1: GS.TS. ĐẶNG THỊ THU
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG

Phản biện 1: GS.TS. TRẦN THỊ LUYẾN
Phản biện 2: PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Phản biện 3: PGS.TS.LÊ VĂN VIỆT MẪN
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. TS. TRẦN BÍCH LAM
2. GS.TSKH.VS. LƯU DUẨN

Tp. Hồ Chí Minh – 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Tác giả luận án

Vương Bảo Thy


LỜI CẢM ƠN
Ngành công nghiệp enzyme phát triển ngày càng mạnh, mở ra những cơ hội và
thách thức lớn, đặc biệt là enzyme từ nguồn phế liệu nội tạng ngành chế biến cá tra ở
nước ta. Trước hiện trạng đó, vấn đề nghiên cứu cấp thiết được đặt ra và sau không ít
những khó khăn, trở ngại nhưng với sự nỗ lực của bản thân cùng sự hỗ trợ của Thầy
Cô, gia đình, đồng nghiệp và bạn bè, luận án đã hoàn thành.
Tôi xin gửi lời tri ân sấu sắc đến Thầy, Cô hướng dẫn khoa học là TS. Trần Bích
Lam và GS.TSKH.VS. Lưu Duẩn – những người đã tận tình hướng dẫn, định hướng và
hỗ trợ tôi rất nhiều từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài cho đến tận ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cửu Long- nơi tôi
đang công tác giảng dạy- đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm,

Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM- Quý Thầy, Cô
trong Bộ môn Sinh hóa, phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM- Quý Thầy, Cô Bộ môn
Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Cần Thơ luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
làm thí nghiệm với điều kiện tốt nhất.
Tôi sẽ luôn nhớ ơn Ban Giám Đốc Công ty TNHH Thủy Sản Hùng Vương- Vĩnh
Long, các anh chị phòng KCS – đã nhiệt tình hỗ trợ tôi toàn bộ nguyên liệu thí nghiệm
trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như tinh thần hợp tác triển khai nghiên
cứu ứng dụng tại nhà máy.
Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp- Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm
Trường Đại học Cửu Long, Đại học Công nghệ Sài Gòn cùng bạn bè đã hỗ trợ tôi rất
nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình và ba mẹ - chính gia
đình là nguồn động lực giúp tôi kiên trì vượt qua mọi khó khăn, quyết tâm hoàn thành
luận án.
Luận án này là món quà vô giá tôi xin trân trọng dành tặng cho Gia đình, Thầy
Cô – những người luôn yêu thương, bên cạnh tôi trong cuộc sống cũng như trong sự
nghiệp.
TPHCM, ngày 15 tháng 01 năm 2015
VƯƠNG BẢO THY


TOM TAẫT LUAN AN
Cỏ tra (Pangasius hypophthalmus) l mt trong nhng sn phm thy sn xut
khu ch lc ca nc ta. Theo d bỏo ca VASEP (Hip hi Ch bin v Xut
khu Thy sn Vit Nam) n nm 2020 sn lng cỏ tra nguyờn liu khong 1,8
triu tn thỡ riờng phn ni tng cỏ tra c tớnh khong 100.000 tn/nm, õy l
ngun nguyờn liu di do, nhiu tim nng thu nhn cỏc enzyme tiờu húa. Do
ú, lun ỏn Nghiờn cu thu nhn enzyme tiờu húa t ni tng cỏ tra (Pangasius
hypophthalmus) ó c thc hin nhm xỏc nh c im phõn b, tớnh cht ca

cỏc enzyme tiờu húa t ni tng cỏ tra v xut phng phỏp chit tỏch, tinh sch,
to ch phm enzyme cú giỏ tr s dng cao t ph liu. Nghiờn cu ó ỳc kt
c nhng kt qu mi nh sau:
1- Phõn tớch enzyme trong cỏc c quan ni tng ca cỏ tra xỏc nh rng cỏc
enzyme tiờu húa tp trung nhiu nht gan ty vi hot lipase 674,02 U/g
cht khụ, protease 84,28 U/g cht khụ v amylase 419,69 U/g cht khụ.
2- iu kin tt nht trớch ly enzyme tiờu húa t gan ty cỏ tra: t l nguyờn
liu/dung mụi 1/2(w/v) vi dung mụi trớch ly l dung dch m Tris-HCl
0,05N, pH8, nhit 50C, thi gian 1 gi.
3- S dng phng phỏp lc mng cú th thu nhn ch phm lipase t gan ty
cỏ tra theo qui trỡnh: ln lt lc dch trớch enzyme qua mng MF 1àm v
0,1àm, lc mng UF 10 kDa thu enzyme vi t l pha loóng dch enzyme
thụ 1/3, ỏp sut lc 6 psi, thi gian lc 120 phỳt. Hiu sut thu hi lipase sau
lc UF 90,6%, tinh sch 2,07 ln. Ch phm cú hot lipase: 22,22
U/ml, hot tớnh riờng lipase: 52,70 U/mg protein.
4- sn xut ch phm enzyme, tt nht l s dng phng phỏp kt ta bng
ethanol theo t l vi dch trớch enzyme l 3/1 (v/v). Ch phm cú hot
lipase: 587,85 U/g, hot riờng lipase: 16,91 U/mg protein, hot
protease: 49,26 U/g, hot riờng protease 1,42 U/mg protein. Hiu sut thu
nhn ch phm 8,3% so vi nguyờn liu ban u (w/w).
5- ó xut phng phỏp tinh sch protease v lipase t gan ty cỏ tra: t dch
trớch ly enzyme thụ, kt ta enzyme bng mui amoni sunfate 60% bóo hũa,


thẩm tích bằng màng cellophane 12 kDa loại muối. Dùng cột sắc ký trao đổi
ion DEAE-cellulose thu phân đoạn chứa hai enzyme protease và lipase. Tách
riêng protease và lipase qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
Protease tinh sạch có hoạt độ riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh sạch 22,41
lần, hiệu suất thu hồi 23,67%. Lipase tinh sạch có hoạt độ riêng 509,71 U/mg
protein, độ tinh sạch 37,95 lần, hiệu suất thu hồi 40,08%.

6- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease từ gan tụy cá
tra: là một serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao của serine,
aspartic và glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 550C, kích
thích khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cu2+, Zn2+, với cơ chất
BSA có Km = 897mg/L và Vmax = 15,7 mg/L.phút.
7- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của lipase từ gan tụy cá tra:
là một lipase có hoạt độ cao và ổn định, phân tử lượng 57 kDa, có tỷ lệ cao
nhất là aspartic và glutamic, pH tối ưu 8, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 500C,
tăng hoạt độ khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cd2+, Zn2+, hoạt
động tốt nhất ở nồng độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị
trí 1,3 của glyceride, với cơ chất triolein có Km = 1,381mg/L và Vmax = 0,063
mg/L.phút.
8- Chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng sản xuất
pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt tỷ lệ Namin/ Ntổng lần lượt là
22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển
Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân các loại
protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có thể sử dụng
làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng chống suy dinh
dưỡng ở trẻ em.
Nghiên cứu đã đóng góp dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tuyến tụy cá tra
(Pangasius hypophthalmus) đồng thời góp phần giải quyết thực tế sản xuất của
ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá. Kết quả nghiên
cứu là đóng góp lý thuyết và thực tiễn cho ngành công nghiệp thủy sản của Việt
Nam.


.................................................................................................................. I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................IV
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. V
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................VI

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 4
1.1 Hệ enzyme tiêu hóa .......................................................................................... 4
1.1.1 Protease .................................................................................................. 4
1.1.2 Lipase ..................................................................................................... 6
1.1.3 Tình hình nghiên cứu về enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn ......... 15
1.1.4 Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ cá tra ........................................ 18
1.1.4.1 Cá tra ........................................................................................... 18
1.1.4.2 Phế liệu nội tạng- nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng ................ 19
1.2 Phƣơng pháp thu nhận và tinh sạch enzyme tiêu hóa ............................... 21
1.2.1 Phương pháp thu nhận enzyme bằng kỹ thuật kết tủa ........................ 21
1.2.2 Phương pháp thu nhận enzyme bằng công nghệ lọc màng ................. 21
1.2.3 Phương pháp trích ly và tinh sạch enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá....... 23
1.3 Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa ............................................................... 25
1.3.1 Ứng dụng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme ............................................. 25
1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá .......... 27
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 32
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 32
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 33
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng
cá tra (Pangasius hypophthamus) .................................................................. 33
2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trích ly enzyme từ nội tạng cá tra ................ 34
2.2.3 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật lọc màng ... 35
2.2.4 Phương pháp nghiên cứu thu nhận enzyme bằng kỹ thuật kết tủa ...... 37
2.5.5 Phương pháp nghiên cứu tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký........ 38
2.2.6 Phương pháp xác định một số tính chất của protease gan tụy ............ 41
2.2.7 Phương pháp xác định một số tính chất của lipase gan tụy .................. 42

I

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme ....................... 43
2.3 Các phƣơng pháp phân tích .......................................................................... 43
2.4 Công thức tính toán ....................................................................................... 45
2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................. 45
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................. 46
3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra ..................................... 46
3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra ........................ 46
3.1.2 Sự phân bố của lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng
........................................................................................................................ 47
3.2 Khảo sát quá trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô .............................. 51
3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly ............................. 51
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ........................................................... 54
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly .......................................................... 56
3.3 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp lọc màng ......... 59
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi và
độ tinh sạch lipase sau lọc UF........................................................................ 64
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase sau lọc UF............................................................................. 66
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase sau lọc UF .................................................................................... 68
3.4 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp kết tủa ............ 71
3.4.1 Kết tủa bằng amoni sunfate ................................................................. 71
3.4.2 Kết tủa bằng ethanol ........................................................................... 74
3.4.3 Kết tủa bằng aceton ............................................................................. 76
3.4.4 Kết tủa bằng isopropanol .................................................................... 78
3.4.5 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzym từ các tác nhân kết tủa
........................................................................................................................ 79
3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra ......... 85
3.5.1 Thử nghiệm quá trình tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex

........................................................................................................................ 85
3.5.2 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose kết hợp sắc
ký lọc gel Sephadex ....................................................................................... 86
3.5.2.1 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose ... 86
3.5.2.2 Kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex -G75 hoặc Sephadex-G100 ... 88

II


3.5.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng protease ......... 91
3.5.3 Xác định một số tính chất của protease gan tụy tinh sạch .................... 92
3.5.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt theo thời gian của
protease ..................................................................................................... 92
3.5.3.2 Ảnh hưởng của pH độ bền pH theo thời gian của protease ......... 94
3.5.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ của protease ... 96
3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease ......... 97
3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy ............................... 97
3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra .......... 99
3.6.1 Tinh sạch lipase gan tụy bằng sắc ký lọc gel Sephadex ...................... 99
3.6.2 Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAEcellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex ................................................... 100
3.6.2.1 Sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose ......................................... 100
3.6.2.2 Kết hợp với sắc ký lọc gel Sephadex -G75/ Sephadex-G100 .... 103
3.6.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase ........... 105
3.6.3 Xác định một số tính chất của lipase gan tụy tinh sạch ...................... 108
3.6.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt theo thời gian của lipase
................................................................................................................ 108
3.6.3.2 Ảnh hưởng của pH độ bền pH theo thời gian của lipase .......... 110
3.6.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ lipase ............ 111
3.6.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của lipase ........... 112
3.6.3.5 Xác định thành phần acid amin của lipase gan tụy .................... 113

3.6.3.6 Ảnh hưởng của muối mật đến hoạt độ lipase gan tụy ............... 114
3.6.3.7 Ảnh hưởng của loại cơ chất đến hoạt độ lipase gan tụy ............ 115
3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra ...................... 116
3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất pepton ........................... 116
3.7.2 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong hỗ trợ tiêu hóa ............................. 118
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ ..121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

III


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
ck

Chất khô

cknl

Chất khô nguyên liệu

cp

Chế phẩm

ĐTS

Độ tinh sạch

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

HĐ

Hoạt độ

HĐR

Hoạt độ riêng

HĐL

Hoạt độ lipase

HĐRL

Hoạt độ riêng lipase

HĐP

Hoạt độ protease

HĐRP

Hoạt độ riêng protease

HĐA

Hoạt độ amylase

HĐRA

Hoạt độ riêng amylase

HSTH

Hiệu suất thu hồi

MF

Micro filtration (vi lọc)

nl ướt

Nguyên liệu ướt

nl khô

Nguyên liệu khô

mg pr

mg protein

S.A

Amoni sunfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfat- Polyacryamide gel

THĐ

Tổng hoạt độ

THĐL

Tổng hoạt độ lipase

UF

Ultra filtration (siêu lọc)

V

Thể tích

v/v

Tỷ lệ tính theo thể tích

w/v

Tỷ lệ tính theo khối lượng/thể tích

IV

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tính đặc hiệu cơ chất của lipase ................................................................... 13
Bảng 1.2: Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase ..................................... 14
Bảng 1.3: Phân tích khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra .................. 20
Bảng 3.1: Tỷ lệ khối lượng các thành phần nội tạng cá tra(Pangasius hypophthamus) 46
Bảng 3.2: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong nội tạng cá tra ............................. 47
Bảng 3.3: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong gan tụy cá tra ............................. 48
Bảng 3.4: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong ruột cá tra ................................... 48
Bảng 3.5: Hoạt độ enzym lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu ................. 50
Bảng 3.6: Kết quả thu được sau quá trình ly tâm ........................................................... 61
Bảng 3.7: Kết quả thu được sau quá trình lọc MF.......................................................... 61
Bảng 3.8: Kết quả thu lipase trong dòng retentate sau lọc UF thay đổi theo tỷ lệ
pha loãng ....................................................................................................... 65
Bảng 3.9: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành...................... 66
Bảng 3.10: Kết quả thu được trong dòng retentate theo thời gian lọc............................ 68
Bảng 3.11: Thất thoát lipase theo dòng permeate ở các chế độ khảo sát ....................... 69
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme lipase sau lọc UF ................ 70
Bảng 3.13: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra ................. 82
Bảng 3.14: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra .................................... 90
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ protease gan tụy cá tra ......... 96
Bảng 3.16: Kết quả phân tích thành phần acid amin protease tinh sạch ........................ 97
Bảng 3.17: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra ...................................... 105
Bảng 3.18: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ lipase gan tụy cá tra ........... 112
Bảng 3.19: Kết quả phân tích thành phần acid amin lipase tinh sạch .......................... 113
Bảng 3.20: Hàm lượng nitơ tổng và nitơ amin của các pepton .................................. 117
Bảng 3.21: So sánh hoạt độ protease, lipase của chế phẩm enzyme và Enzyplex ....... 118

V

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng
trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) ............................................................ 5
Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) .............................. 8
Hình 1.3: Hình tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng ................................................... 9
Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất .......................... 10
Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase .......................................................... 11
Hình 1.6: Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí của enzyme lipase .................... 13
Hình 1.7: Cá tra (Pangasius hypophthamus)................................................................ 19
Hình 2.1: Nội tạng cá tra ............................................................................................ 32
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng protein trích ly 50
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ protease .............. 51
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ lipase .................. 51
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein trích ly ............................. 53
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ protease ................................. 53
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ lipase..................................... 54
Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein trích ly ........................... 55
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ protease .............................. 56
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ lipase ................................... 56
Hình 3.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hiệu suất thu hồi lipase sau lọc MF .. 63
Hình 3.11: Ảnh hưởng của áp suất đến độ phân riêng protein trong dịch enzyme ...... 65
Hình 3.12: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease ......................................................................................................... 70
Hình 3.13: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase ............................................................................................................. 71
Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease ................................................................................................................ 73
Hình 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase .................................................................................................................... 73

Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease ................................................................................................................ 75
Hình 3.17: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase .................................................................................................................... 75
Hình 3.18: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease ......................................................................................................... 76

VI


Hình 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase ............................................................................................................. 77
Hình 3.20: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch protease ......................................................................................... 78
Hình 3.21: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch lipase ............................................................................................. 78
Hình 3.22: Chế phẩm enzyme tiêu hóa thu nhận theo phương pháp kết tủa ............... 80
Hình 3.23: Qui trình công nghệ thu nhận chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra……... 83
Hình 3.24: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 dung dịch enzym sau thẩm tích .......... 85
Hình 3.25: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 ................................... 86
Hình 3.26: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAEcellulose với dãy nồng độ NaCl .................................................................................. 86
Hình 3.27: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAEcellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl ........................................................... 87
Hình 3.28: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100............ 88
Hình 3.29: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75.............. 89
Hình 3.30: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE ........................................................ 91
Hình 3.31: Qui trình tinh sạch protease gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme……. . 92
Hình 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease .......................................... 93
Hình 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease tinh sạch theo thời
gian ................................................................................................................................ 93
Hình 3.34: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease ................................................. 94

Hình 3.35: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease tinh sạch theo thời gian ............ 95
Hình 3.36: Đồ thị Lineweaver- Burk của protease tinh sạch trên cơ chất BSA.......... 97
Hình 3.37: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 từ enzym sau thẩm tích ....................... 99
Hình 3.38: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 ................................. 100
Hình 3.39: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose
với dãy nồng độ NaCl ................................................................................................. 101
Hình 3.40: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose
với gradient nồng độ dung dịch NaCl ........................................................................ 102
Hình 3.41: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100.............. 103
Hình 3.42: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75................ 104
Hình 3.43: Kết quả điện di trên gel SDS- (PAGE) ................................................... 106
Hình 3.44: Qui trình tinh sạch protease/ lipase gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme
..................................................................................................................................... 107
Hình 3.45: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase .......................................... 108
Hình 3.46: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian ..... 109

VII


Hình 3.47: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ lipase .................................................. 110
Hình 3.48: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian .............. 111
Hình 3.49: Đồ thị Lineweaver- Burk của lipase tinh sạch trên cơ chất triolein ........ 113
Hình 3.50: Ảnh hưởng của muối mật (NaTC) đến hoạt độ lipase tinh sạch ............. 114
Hình 3.51: Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt độ lipase tinh sạch .............................. 115
Hình 3.52: Sự tương quan giữa hàm lượng nitơ amin và thời gian thủy phân.......... 117
Hình 3.53: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme với Enzyplex trên
một số protein thực phẩm .......................................................................................... 119
Hình 3.54: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme so với Enzyplex đối
với một số loại dầu thực vật ........................................................................................ 119

VIII


1

MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cùng với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ enzyme trở thành ngành mũi nhọn
được phát triển nhanh trên thế giới. Trong đó, nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các
loài cá được đặc biệt quan tâm trong vài thập kỷ vừa qua. Do cá sống trong môi
trường nhiệt độ thấp nên để duy trì sự sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối
mạnh. Ưu điểm của các enzyme cá là có hoạt độ cao hơn tại các giá trị nhiệt độ thấp
hơn so với enzyme tương ứng từ động vật máu nóng.
Trong các enzyme nội tạng cá, lipase ngày càng được quan tâm do có khả năng
ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm. Một số lipase từ nội tạng cá đã
được thế giới nghiên cứu như lipase cá mập, cá tuyết, cá mòi, cá hồi, cá tráp, cá ngừ
vây xanh, cá đối, cá rô...Riêng lipase cá tra (Pangasius hypophthalmus), hiện nay
chưa có nghiên cứu nào được công bố. Trong khi đó, về lý thuyết, ở cá tra có mô mỡ
rất phát triển so với các loại cá da trơn khác, như vậy ở loài cá này enzyme lipase
phải đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất. Vì vậy việc nghiên cứu
tính chất của lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học và cần đặc biệt quan tâm. So
với lipase thì protease nội tạng cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài như protease cá
mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu…Tuy nhiên,
về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay, ngoài một số khảo sát chung về protease nội
tạng, chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan tụy cá tra. Vì thế,
cần thiết phải có những công trình nghiên cứu chuyên sâu, cung cấp đầy đủ dẫn liệu
khoa học về hệ enzyme tiêu hóa ở cá tra.
Mặt khác, trong ngành công nghiệp chế biến cá tra tại Việt Nam, phi lê cá chiếm
khoảng 30%, phần còn lại là phế phụ phẩm, trong đó, phần nội tạng chiếm khoảng
5-6% trọng lượng cơ thể cá. Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất

khẩu Thủy sản Việt Nam) đến năm 2020 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8
triệu tấn thì riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, đây là nguồn nguyên
liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa ứng dụng trong y học,
công nghệ thực phẩm.


2

Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (Pangasius
hypophthalmus)” nhằm góp phần giải quyết các vấn đề trên.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các enzyme tiêu
hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus).
Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn nội tạng cá
tra sẵn có để đưa vào ứng dụng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ quan nội
tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập trung vào enzyme
lipase và protease.
Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu đặc điểm phân bố của các enzyme
protease, lipase và amylase trong các cơ quan nội tạng; thu nhận, tinh sạch và xác
định tính chất của lipase và protease từ nội tạng của cá tra (Pangasius
hypophthalmus).
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên cứu thực
nghiệm hóa sinh học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và tổng hợp tài
liệu.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1. Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra
2. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra
3. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra
4. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
5. Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa


3

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, phân tích
chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius
hypophthalmus), đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng về hệ enzyme tiêu
hóa từ nội tạng cá tra.
Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease và lipase từ gan tụy
cá tra; đưa ra điều kiện trích ly và phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme gan tụy
cá tra bằng phương pháp lọc màng và phương pháp kết tủa; đề xuất phương pháp
tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra.
Ý nghĩa thực tiễn
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh sạch các enzyme
tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng của ngành chế biến cá tra, góp phần làm phong
phú thêm nguồn thu các chế phẩm enzyme nói chung và protease, lipase nói riêng.
Chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra bước đầu khảo sát ứng dụng có hiệu quả cao
trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa. Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ
thực tế sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn
phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra của Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 122 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan 28
trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14 trang; Chương 3: Kết

quả và bàn luận 75 trang; Kết luận và kiến nghị 2 trang, 150 tài liệu tham khảo.
Trong luận án có 24 bảng, 62 hình và đồ thị.


4

CHÖÔNG 1

TOÅNG QUAN

1.1 Hệ enzyme tiêu hóa
Trong số các enzym tiêu hóa từ nội tạng cá thì ngoại trừ enzym pepsin từ dạ dày
cá đã được các tác giả trên thế giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính
chất và đưa vào ứng dụng, các hiểu biết cho đến nay về hệ enzyme tiêu hóa từ tụy
tạng cá vẫn còn khá hạn chế [1]. Trong khi đó, nguồn nguyên liệu nội tạng cá tra
cần nghiên cứu thu nhận enzyme không bao gồm dạ dày cá nên trong phạm vi đề tài
này chúng tôi sẽ không đề cập đến pepsin. Các enzym tiêu hóa khác chủ yếu được
sản xuất ở tuyến tụy.
Ở động vật bậc cao các enzyme tiêu hóa của tuyến tụy (pancreatin) được tiết ra
từ các tế bào ngoại tiết của tuyến tụy, gồm chủ yếu là lipase, protease và amylase.
Đến nay, chỉ có enzyme tuyến tụy của lợn, bò được sản xuất dưới dạng chế phẩm để
đưa vào ứng dụng. Các dạng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme rất phổ biến, ngoài ra
cũng có các chế phẩm mặc dù gồm vài enzyme nhưng hoạt động ưu thế trên một
loại cơ chất. Điển hình như: pancreatic protease là chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin
và chymotrypsin. Pancreatic lipase là chế phẩm hỗn hợp có chứa cả esterase,
protease, amylase và các zymogen [1].
Ngoài chế phẩm hỗn hợp, một số enzyme tuyến tụy cũng đã được thu nhận dưới
dạng tinh sạch như trypsin, chymotrypsin, lipase tụy.
1.1.1 Protease
Protease tuyến tụy bao gồm chủ yếu là trypsin và chymotrypsin, chúng thuộc

nhóm serine-protease, có nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, có
vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các protease
tuyến tụy thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ
chất tương đối rộng [2].
Trypsin [E.C.3.4.21.4]
Nghiên cứu trypsin của lợn cho thấy đây là một chuỗi polypeptide có 249 acid
amin, trọng lượng phân tử 22.680 - 23.400 Da. Trypsin thủy phân liên kết peptide
giữa gốc carboxyl của lysine và arginine với nhóm amine của các acid amin khác.
pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp là 7,8 - 9,5. Nhiệt độ thích


5

hợp cho hoạt động của trypsin trong khoảng 30 - 400C, ở nhiệt độ này và pH 8,5 - 9
trypsin có khả năng thủy phân mạnh các cơ chất như casein, hemoglobin hay
gelatin. Ion Ca2+ được xem như là chất bảo vệ cho enzyme khỏi bị biến tính và bảo
vệ chống lại sự tự phân protein. Ngược lại, Cu2+, Ag2+, Hg2+ có tác dụng ức chế
enzyme. Ngoài ra trypsin còn bị ức chế bởi các chất kháng-trypsin tự nhiên có trong
tuyến tụy, đậu tương, đậu ván, các cây họ đậu, mướp đắng. Trung tâm hoạt động
của trypsin có thứ tự các acid amin -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro- [2].

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng
trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) [3]
Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1]
Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường có pH kiềm
nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự như trypsin. Chymotrypsin
hoạt động trong điều kiện pH 7 - 9 và pH tối ưu là 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5,4;
pH 5 không thuận tiện cho hoạt động của chymotrypsin nhưng ở pH này
chymotrypsin lại bền vững hơn trong môi trường pH 8. Chymotrypsin là một chuỗi
polypeptide có 245 acid amin, trọng lượng phân tử 22.500 Da. Chymotrypsin hoạt

động như một endopeptidase phân cắt mạch polypeptide thành các peptide ngắn và
tác dụng trên những liên kết mà trypsin không phân cắt. Những liên kết này được


6

tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin có nhân thơm như tyrosine, tryptophan,
phenylalanine với nhóm amine của acid amin khác [2].
Sự khác nhau giữa trung tâm liên kết của trypsin và chymotrypsin
Trypsin và chymotrypsin thuộc nhóm serine protease, trung tâm hoạt động của
chúng giống nhau, trung tâm liên kết tương tự nhau ngoại trừ khác nhau ở một acid
amin. Ở trypsin có một gốc lysine ở đáy túi liên kết, ở chymotrypsin có gốc tyrosine
ở đáy túi liên kết thay vào vị trí của lysine. Do sự khác nhau này, cơ chất protein
hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là arginyl và lysyl mới có thể kết hợp với
trung tâm hoạt động của trypsin để thủy phân liên kết peptide. Ở chymotrypsin, cơ
chất protein hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là tyrosyl, phenylalanyl và
tryptophanyl mới có thể kết hợp với trung tâm hoạt động của chymotrypsin [2].
Sự tƣơng đồng về cấu trúc của trypsin và lipase tuyến tụy
Trung tâm hoạt động của trypsin là chuỗi pentapeptide Gly-Asp-Ser-Gly-Gly,
tương đồng với trung tâm hoạt động của lipase tụy với chuỗi pentapeptide Gly-XSer-X-Gly. Mặt khác, lipase tụy sẽ bị mất hoạt độ khi có mặt các chất kìm hãm
serine-protease

như

diisopropylphosphofluoridate

và

diethyl-p-nitrophenyl

phosphate. Từ minh chứng trên, lipase tụy được xem như thuộc nhóm serineprotease. Các phân tích cấu trúc gần đây cho thấy ở lipase tụy hiện diện cấu trúc
Ser…His…Asp, cấu trúc này có mặt ở tất cả các serine protease mặc dù các thành
phần acid amin còn lại khác nhau. Cấu trúc tương đồng ở trung tâm hoạt động của
serine protease và lipase tụy như sau [4].
SERINE PROTEASE
Trypsin chuột

QGDSGGPVVC

Chymotrypsin chuột

MGDSGGPLVC

LIPASE
Lipase tụy lợn

VHVIGHSLGSHAA

Lipase tụy chó

VQLIGHSLGAHVA

Lipase tụy ngựa

VHIIGHSLGSHAA

Lipase tụy người

VHVIGHSLGAHAA

1.1.2 Lipase tụy [E.C.3.1.1.3]


7

Các enzyme lipase hay các acylglycerol acylhydrolase (E.C. 3.1.1.3) được định
nghĩa như là các enzyme thuỷ phân các liên kết ester giữa các acid béo mạch dài và
glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu-nước. Các enzyme lipase thủy phân
triacylglycerol (TAG) không tan trong nước thành các diacylglycerol, các
monoacylglycerol phân cực hơn cũng như các acid béo và glycerol hỗ trợ cho quá
trình hấp thu và chuyển hoá qua màng. Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động
tối thích cho hầu hết các lipase nằm trong khoảng 7 – 9, các lipase hoạt động trong
khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 65oC, nhưng thông dụng nhất là từ 30 – 45oC [5].
Nhiều chuỗi acid amin của lipase tụy đã được tìm ra như: lipase tụy của người,
bò (Bos tauru), chuột (Rattus norvegi-cus), chó (Canis familiaris), lợn (Cavia
orcellus), thỏ (Oryctolagus cuniculus), ngựa (Equus caballus). Cấu trúc tinh thể của
một số lipase cũng đã được nghiên cứu như: lipase tụy của người, bò (Bos Taurus),
lợn (Sus scrofa), chuột (Rattus norvegicus) [4].
Tính chất của lipase tụy
Cấu trúc
Trong những lipase đã biết, không có trình tự acid amin đặc trưng nào cho mọi
lipase. Trái lại, trình tự của chúng rất khác biệt. Điểm giống nhau của tất cả các
lipase là một đoạn nhỏ gồm 5 acid amin Gly-X-Ser-X-Gly (trong rất hiếm trường
hợp, glycine bị thay thế bằng những acid amin khác). Trình tự này nằm gần trung
tâm hoạt động và sau này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng chuỗi pentapeptide này để
định danh những protein là lipase [6].
Mặc dù có sự khác biệt lớn trong trình tự acid amin, tất cả lipase đều có một
kiểu cấu trúc tương tự nhau gọi là gấp nếp β có liên quan đến cơ chế xúc tác của nó.
Cấu trúc này lần đầu tiên được giới thiệu khi so sánh cấu trúc 3 chiều của enzyme
có trình tự acid amin khác nhau và so sánh khi chúng gắn với cơ chất. Cấu trúc gấp

nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có chuỗi β2
ngược chiều. Các chuỗi β3 đến β8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn . Sự khác
biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên gấp nếp β, sự hiện diện của nhóm phụ và
cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất [7].


8

Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các nghiên cứu cho
thấy vùng hoạt động của enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu
trúc di động [8]. Theo Winkler, F.K. và cộng sự, cấu trúc di động cần di chuyển trên
bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc hoạt động của enzyme với trung
tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất. Cấu trúc tinh thể của lipase hay cấu trúc
dạng phức đã tạo điều kiện cho việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase.
Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di
động chuyển từ đóng sang mở [9]. Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các
lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt
để có thể liên kết với lipid [10].

Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) [11]
Cấu trúc di động
Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề mặt
liên pha nước và cơ chất. Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt động
của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó. Khi chuyển sang
dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham gia
phản ứng. Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm sáng
tỏ nhiều hơn. Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động. Nắp
có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng nắp,
phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi protein;

9

khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng diện
tích bề mặt kỵ nước, tăng khả năng liên kết với cơ chất. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
rằng cấu trúc phần nắp còn ảnh hưởng đến hoạt độ và tính chọn lọc của lipase. Ví
dụ, cùng trong một nhóm lipase, lipase tụy người và lipase tụy heo, nhưng 2 lipase
lại cho thấy tính đặc hiệu khác nhau. Lipase tụy người chỉ có hoạt độ cao với
triglyceride, trong khi lipase tụy heo còn thể hiện hoạt độ của phospholipase và
galactolipase. Điểm khác nhau chính trong cấu trúc của 2 enzyme này là kích thước
rất nhỏ của nắp trên lipase tụy heo (5 acid amin). Đột biến gene gây ra những biến
đổi trên cái nắp đã cho thấy tầm ảnh hưởng của cái nắp đến tính chọn lọc đối với
triglyceride, phospholipid và galactolipid. Đột biến trên nắp của lipase này sẽ làm
thay đổi chiều dài mạch của cơ chất mà nó tương thích [12].
Phức lipase
Lipase tụy có cấu trúc phức với nhóm phụ là protein hay lipid. Lipase tụy chứa 2
phần gắn với nhau bằng một khớp linh động, đầu N của phần protein xúc tác có
kích thước lớn và đầu C của gấp nếp β có kích thước nhỏ hơn. Nó liên quan đến
hoạt độ của lipase trong những điều kiện môi trường sinh lý trong cơ thể. Trong ống
tiêu hóa, triglyceride được hòa với phospholipid, acid béo, protein và muối mật có
tác dụng như chất nhũ hóa. Muối mật sẽ ngăn cản sự hấp phụ của lipase tụy trên cơ
chất lipid nếu không có sự hỗ trợ của một protein được tiết ra cùng với dịch tụy,
colipase. Colipase là một phân tử protein vừa có tính ưa nước vừa có tính kỵ nước,
nó có thể gắn lipase vào bề mặt phân chia pha và ổn định hoạt độ của lipase trên đó.
Khi liên kết với đầu C của lipase, colipase sẽ làm lộ phần cấu trúc kỵ nước ở mặt
đối diện và giúp enzyme tiếp xúc với bề mặt liên pha [13]. Liên kết với colipase
không gây ra sự thay đổi về hình dạng của phân tử lipase nhưng một cách gián tiếp,
nó tác động đến cái nắp trên lipase, làm nó mở ra và mở ra phần kỵ nước giúp tăng
cường hoạt động trên bề mặt liên pha nước-lipid [14].
Cơ chế xúc tác của lipase

Trung tâm hoạt động
Trung tâm hoạt động của lipase gồm ba gốc acid amin: serine; aspartate hay
glutamate và một histidine.


10

Hình 1.3: Vùng tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng.
Nhóm kỵ nước màu trắng, nhóm ưa nước màu vàng, các nhóm mang điện tích
dương màu xanh và các nhóm mang điện tích âm màu đỏ [15]
Sự hoạt hóa enzyme lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ
chất ở dạng hạt nhũ (miccelar substrates), do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp (lid)
của enzyme. Sự tác động này tương đối khác nhau tuỳ loại cơ chất [15]
Hình 1.4 mô tả cơ chế tác động của lipase theo Jaeger và cộng sự (1999)

Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất [16]
Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang dạng
enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất. Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn,
(2) định hướng, (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa. Phần
còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo ra
dạng trung gian (Ea*S). Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái
nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành
oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester. Một hình tứ


11

diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và
nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính. Proton trên
histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester. Liên kết ester này sau đó bị

cắt đứt và một liên kết cộng hóa trị trung gian mới được hình thành giữa acid béo
mới giải phóng với serine. Bước 2 của quá trình là việc deacyl hóa enzyme nhờ
phân tử nước đến thủy phân liên kết cộng hóa trị trên. Trong bước này, proton từ
nước sẽ chuyển đến serine trên tạo thành ion hydroxide. Ion này sẽ gắn với nguyên
tử carbon của carbonyl trên cơ chất [17].
Acyl hóa Ea*S

Ea*Ac+P1 và đề acyl hóa Ea*Ac

Ea*+P2

(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hóa kết bám)
Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi lipase được mô tả ở hình 1.5

Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase [17]
1) Sự kết gắn lipid, hoạt hoá nhóm serine ưa nhân bởi histidine lân cận và O-Ser
tấn công ưa nhân vào nguyên tố C-carbonyl của cơ chất.
2) Dạng tetrahydral chuyển tiếp hình thành, với nguyên tử O được ổn định bởi hai
nhóm NH-peptid, histidine phóng thích một proton đến phần alcohol của cơ chất.