NGHIÊN cứu tạo KHÁNG THỂ đơn DÒNG KHÁNG ALPHA FETOPROTEIN NGƯỜI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ

PHAN NGỌC TIẾN

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN
DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN
NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ

PHAN NGỌC TIẾN

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN
DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN
NGƯỜI
Chuyên ngành: Sinh lý học
Mã số: 62 72 04 05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. PHẠM ĐÌNH LỰU

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2009


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của
riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì
công trình nào khác.

PHAN NGỌC TIẾN

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời camđđoan

Trang


Mục lục
Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3
1.1 Kháng thể ..............................................................................................3
1.2 Kháng thể đơn dòng ...........................................................................15

1.3 Đại cương về Alpha-fetoprotein ...........................................................28
Chương 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............40
2.1 Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein người ...................40
2.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ
chuột Lou......................................................................................................53
2.3 Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng AFP người đã
được tạo ra trong đònh lượng nồng độ AFP huyết thanh.......................57
Chương 3: KẾT QUẢ..........................................................................................65
3.1 Kết quả tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng Alphafetoprotein ...................................................................................................65
3.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ
chuột Lou...................................................................................................79
3.3 Kết quả ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng AFP
người
đã được tạo ra trong đònh lượng nồng độ AFP huyết thanh................85
Chương 4: BÀN LUẬN.....................................................................................101
KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ ...........................................................................119
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ..............................121
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..............................................................................122
PHỤ LỤC 1 ..........................................................................................................135
PHỤ LỤC 2 ..........................................................................................................138


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ab: Antibody
Ag: Antigen
AFP: Alpha-fetoprotein
AFP-L: hệ thống đònh lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng
AFP của chuột LOU
FTi3-1-A8: lần thực hiện kỹ thuật hoà hợp tế bào lần thứ 3, đóa nuôi
cấy thứ 3, vò trí giếng A8

FTi3-3-B4-H6: lần thực hiện kỹ thuật hoà hợp tế bào lần thứ 3, đóa
nuôi cấy thứ 3, vò trí giếng A8, vò trí giếng H6 có tế bào sau khi pha
loãng giới hạn
Ig: Immunoglobulin
KN: Kháng nguyên
KT: Kháng thể
MARG1: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma1 của chuột
cống
MARG2a: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2a của chuột
cống
MARG2b: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2b của chuột
cống
MARG2c: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2c của chuột
cống
MARL: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ lamda của chuột cống
MARK: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ kappa của chuột cống


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Các đặc tính của các lớp kháng thể ...........................................13
Bảng 1.2: Các đặc tính của các lớp kháng thể của chuột cống LOU ...16
Bảng 1.3: Các dòng tế bào ung thư để tạo tế bào lai ................................21
Bảng 1.4: Các giá trò nồng độ AFP huyết thanh xác đònh bằng kỹ thuật
MEIA ở các đối tượng bệnh lý và ở người bình thường .................37
Bảng 1.5: Tương quan giữa mức tăng AFP máu mẹ với nguy cơ thai bò dò
tật .............................................................................................................................38
Bảng 2.6: Sơ đồ nồng độ AFP chuẩn từ 0-500ng/ml .....................................55
Bảng 2.7: Sơ đồ nồng độ thấp từ 0-5ng/ml của AFP chuẩn .......................56
Bảng 2.8: Sơ đồ thứ tự mẫu huyết thanh đònh lượng AFP bằng AFP-L ....60

Bảng 2.9: Sơ đồ thứ tự mẫu huyết thanh đònh lượng AFP bằng hệ thống
đònh lượng AFP của hãng MaximBiotech .................................................62
Bảng 3.10: Kết quả mật độ quang của đóa nuôi cấy 1 ..............................67
Bảng 3.11: Kết quả mật độ quang của đóa nuôi cấy 2 ...............................68
Bảng 3.12: Kết quả mật độ quang của đóa nuôi cấy 3 ...............................69
Bảng 3.13: Kết quả mật độ quang của đóa nuôi cấy 4 ..............................70
Bảng 3.14: Kết quả đònh isotype của các kháng thể trong các giếng
có các tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng AFP, sử
dụng kháng nguyên AFP của Viện Pasteur Tp.HCM ..............................72
Bảng 3.15: Kết quả các đơn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể
đơn dòng kháng AFP ....................................................................................73
Bảng 3.16: Kết quả phản ứng của các kháng thể đơn dòng với
AFP của hãng Calbiochem ...........................................................................79
Bảng 3.17: Kết quả mật độ quang (DO) tương ứng với nồng độ AFP
của AFP-L.......................................................................................................80
Bảng 3.18: Kết quả mật độ quang (DO) tương ứng với những giá trò
thấp của nồng độ AFP, của AFP-L..........................................................83


Bảng 3.19: Kết quả nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh đònh
lượng bằng hệ thống đònh lượng AFP-L...................................................85
Bảng 3.20: Giá trò trung bình nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh
bằng hệ thống đònh lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng
kháng AFP của chuột Lou...........................................................................86
Bảng 3.21: Kết quả DO tương ứng với nồng độ AFP chuẩn của hãng
Maxim Biotech .................................................................................................87
Bảng 3.22: Kết quả nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh đònh
lượng
bằng hệ thống đònh lượng AFP cuả hãng Maxim Biotech....................88
Bảng 3.23: Giá trò trung bình nồng độ nồng độ AFP trong các mẫu

huyết thanh đònh lượng bằng hệ thống đònh lượng AFP cuả hãng
Maxim Biotech .................................................................................................89
Bảng 3.24: Kết quả nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh đònh
lượng
bằng hệ thống đònh lượng AFP của hãng Abbott ..................................90
Bảng 3.25: Giá trò trung bình nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh đònh
lượng bằng hệ thống đònh lượng AFP của hãng Abbott........................91
Bảng 3.26 a: Bảng kết quả nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh
của
hai hệ thống đònh lượng AFP-L và Maxim Biotech ..................................92
Bảng 3.26 b: Bảng so sánh kết quả nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết
thanh của hai hệ thống đònh lượng AFP-L và Maxim Biotech................93
Bảng 3.27: Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh u
gan
của hai hệ thống đònh lượng AFP-L và Maxim Biotech ..........................94
Bảng 3.28: Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh của
hai hệ thống đònh lượng AFP-L và Abbott ...............................................95


Bảng 3.29 a: Bảng kết quả nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết thanh u
gan của hai hệ thống đònh lượng AFP-L và Abbott.................................97
Bảng 3.29 b: Bảng so sánh kết quả nồng độ AFP (ng/ml) trong mẫu huyết
thanh u gan của hai hệ thống đònh lượng AFP-L và Abbott ....................97
Bảng 4.30: Các dòng tế bào ung thư để tạo tế bào lai ............................101
Bảng 4.31: Chuột LOU/C và allotype của chuỗi nhẹ kappa ........................106
Bảng 4.32: So sánh với các hệ thống đònh lượng AFP ..............................111


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ
Trang

Hình 1.1: Sự di chuyển của các lớp kháng thể trên điện di protein ............3
Hình 1.2: Cấu trúc lónh vực của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ ..........................5
Hình 1.3: Cấu trúc các phân tử kháng thể......................................................7
Hình 1.4: Cấu trúc phân tử AFP người ...........................................................29
Hình 1.5: Cấu trúc phân tử AFP và Albumin người .....................................29
Hình 3.6: Tạo khối u tế bào lai ở ổ bụng chuột ...........................................74
Hình 3.7: Tạo dòch báng ổ bụng chuột .............................................................74
Hình 3.8: Điện di protein dòch báng ổ bụng chuột lần 1................................75
Hình 3.9: Điện di protein dòch báng ổ bụng chuột lần 2................................75
Hình 3.10: Điện di protein dòch báng ổ bụng chuột lần 3..............................76
Hình 3.11: Máy sắc ký ........................................................................................77
Hình 3.12: Kháng thể đơn dòng kháng AFP được bảo quản........................78
Biểu đồ 3.1: Đường biểu diễn kết quả sắc ký ...........................................77
Biểu đồ 3.2: Giá trò trung bình nồng độ AFP của hai hệ thống đònh lượng
AFP-L và Maxim Biotech ở nhóm người bình thường ...........................98
Biểu đồ 3.3: Giá trò trung bình nồng độ AFP của hai hệ thống đònh lượng
AFP-L và Maxim Biotech ở nhóm người có HBsAg (+) ........................99
Biểu đồ 3.4: Giá trò trung bình nồng độ AFP của ba hệ thống đònh lượng
AFP-L, Maxim Biotech và Abbott ởû nhóm người viêm gan siêu vi B
cấp ...................................................................................................................100
Biểu đồ 4.5: Kết quả sắc ký ái lực dùng kháng thể đơn dòng kháng
kháng
thể đơn dòng chuột cống........................................................................108
Sơ đồ1.1: Sản xuất kháng thể đơn dòng.........................................................15
Đồ thò 3.1: Đồ thò nồng độ AFP chuẩn và DO tương ứng của AFP-L......81
Đồ thò 3.2: Đường cong chuẩn của hệ thống đònh lượng AFP-L.................82


Đồ thò 3.3: Đường biểu diễn DO tương ứng với những giá trò thấp của
nồng

độ AFP của AFP-L ........................................................................................84
Đồ thò 3.4: Đường cong chuẩn của hệ thống đònh lượng AFP của hãng
Maxim Biotech..................................................................................................87
Đồ thò 4.5: Đường cong chuẩn của hệ thống đònh lượng AFP-L...............110


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng đã được hai nhà khoa học
Georges

Kohler

và

César

Milstein

trình

bày

năm

1975

[1],[23],[25],[30],[57],[98] kỹ thuật này nhằm tạo ra tế bào lai từ hai tế
bào, tế bào lymphô B sản xuất kháng thể kháng với kháng nguyên

đã được chọn trước, và tế bào ung thư với đặc tính phát triển vô hạn.
Từ một tế bào lai sẽ tạo ra một dòng tế bào có đặc tính phát triển
vô hạn và sản xuất ra dòng kháng thể có cùng đặc tính kháng lại
kháng nguyên đã được mẫn cảm trước. Kháng thể đơn dòng có tính
đồng nhất cao và rất đặc hiệu với kháng nguyên [30], [57], [98].
Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới đã tạo ra nhiều dòng tế
bào ung thư khác nhau để thực hiện kỹ thuật hợp nhất tế bào, và dòng
chuột thuần chủng để sản xuất kháng thể đơn dòng [39],[98]. Các nhà
khoa học tại trường đại học UCL (Universite Catholique de Louvain) đã tạo ra
dòng tế bào ung thư IR983F và dòng chuột cống LOU để sản xuất các
kháng thể đơn dòng [39].
Nhờ vào kỹ thuật sản xuất ra kháng thể đơn dòng từ đó đến
nay đã tạo ra rất nhiều kháng thể đơn dòng kháng các kháng nguyên
khác nhau, từ đó có nhiều ứng dụng trong nhận diện, đònh lượng kháng
nguyên, và đặc biệt trong chẩn đoán và điều trò.
Alpha-fetoprotein là một glycoprotein, có trọng lượng phân tử
khoảng 68.000 dalton, được tổng hợp ở gan phôi thai và túi noãn hoàng,
nồng độ AFP bình thường trong dòch ối và huyết thanh bào thai người rất
cao (trong dòch ối là 10g/ml; trong huyết thanh bào thai là 1-3mg/ml).
Alpha-fetoprotein có trong huyết thanh người sau sinh và người trưởng
thành ở nồng độ rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml [47],[64].
Trong bệnh lý ung thư tế bào gan nguyên phát, Alpha-fetoprotein
tăng rất cao trong huyết thanh, và việc đònh lượng AFP huyết thanh có ý


2

nghóa lâm sàng quan trọng giúp chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển
của ung thư tế bào gan nguyên phát[7],[8],[29],[32],[35],[48],[84]. Ngoài ra
trong sản khoa việc đònh lượng Alpha-fetoprotein cùng với các xét nghiệm

khác để giúp chẩn đoán dò tật thai nhi [28],[46],[82], [89],[95],[96].
Thực tiển Việt Nam việc tạo ra kháng thể đơn dòng kháng Alphafetoprotein người có ý nghóa quan trọng, vì từ kháng thể đơn dòng này
có thể đònh lượng Alpha-fetoprotein trong huyết thanh, và với kỹ thuật
này sẽ tạo ra nhiều kháng thể đơn dòng kháng các kháng nguyên khác
nhau ứng dụng trong chẩn đoán và điều trò, giúp cho nghiên cứu y sinh
học, miễn dòch học, thú y…
Từ những vấn đề nêu trên, nghiên cứu thực hiện tạo ra kháng
thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein với kỹ thuật lai từ dòng tế bào
ung thư IR983F và tế bào lymphô B chuột cống LOU, để có thể ứng
dụng trong việc đònh lượng Alpha-fetoprotein.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:
1. Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein người.
2. Đánh giá chất lượng kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein
người đã được tạo ra.
3. Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein
người đã được tạo ra trong đònh lượng Alpha-fetoprotein huyết thanh.


3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁNG THỂ
1.1.1 Cấu trúc:
Từ globulin miễn dòch (Immunoglobulin = Ig) chính xác hơn
gammaglobulin, vì phần lớn các kháng thể có khả năng di chuyển trong
điện trường tới vùng γ, một số kháng thể đi đến vùng β hay ở vùng α
2 globulin [1],[23].

Hình 1.1: Sự di chuyển của các lớp kháng thể trên điện di protein
[23]
1.1.1.1 Cấu trúc kháng thể[1],[23],[25],[30],[48],[58]:
Nhờ các công trình của Porter và Edelman đã xác đònh được
cấu trúc của một phân tử kháng thể, ví dụ IgG1. Kháng thể (KT) gồm
có 2 chuỗi nặng giống nhau và 2 chuỗi nhẹ giống nhau nối lại với nhau
bằng những cầu nối 2S giữa các chuỗi.
Sơ đồ cấu trúc của một phân tử KT có được là nhờ vào các thí
nghiệm sau:


4

Tác dụng của dimercaptoethanol là phá các cầu 2S, từ một
IgG có trọng lượng phân tử 150000D thu được 2 đôi đa peptit: một được
gọi là chuỗi nặng (H = heavy chain) có khoảng 450 axit amin (TLPT =
50000D) và một chuỗi nhẹ (L = light chain) với 212 axit amin (TLPT =
25000D).
Tác dụng của papain, men này cắt chuỗi nặng ở chỗ axit
amin thứ 224 trên 2 cầu 2S nối các chuỗi nặng với nhau và cho 2 mảnh
giống nhau gọi là Fab (Fragment antibody binding) và 1 mảnh Fc (Fragment
crystallisable).
Tác dụng của pepsin, men này cắt chuỗi nặng ở gần axit
amin 234 bên dưới cầu nối 2S và ở những chỗ khác giữa các axit amin
294 và 333. Kết quả là thu được một mảnh lớn gọi là F(ab’)2 và nhiều
polypeptit khác cũng như mảnh pFc’ tương ứng với khu vực tận cùng của
chuỗi.
Tên gọi cho các mảnh khác nhau của Ig thu được ở các thí
nghiệm trên như sau:

- Fab: là một nửa chuỗi nặng nối với cả chuỗi nhẹ bằng
một cầu 2S, do Ig bò papain cắt ở ngay trên vùng bản lề, nên chỉ mang
một vò trí KT.
- F(ab’)2: có được dưới tác dụng của pepsin, gồm 2 Fab với
phần bản lề nên thành một mảnh lớn hơn 2 lần Fab và có chứa 2 vò trí
KT.
- Fc: là nửa sau của 2 chuỗi nặng còn nối với nhau bằng
cầu nối 2S giữa chuỗi.
- pFc’: mảnh này gồm những peptit có được do tác dụng của
pepsin, với toàn khu vực CH3 đằng sau axit amin thứ 333 trên chuỗi nặng.
- Fd: tương ứng với phần đầu của chuỗi nặng, có được bằng
cách khử và alkyl hóa mảnh Fab để loại bỏ chuỗi nhẹ.


5

- Fv: mảnh này tương ứng với các phần thay đổi của chuỗi
nặng và chuỗi nhẹ(VH + VL).

Hình 1.2: Cấu trúc lónh vực của chuỗi nặng và chuỗi
nhẹ[30]
1.1.1.2 Lónh vực của các kháng thể
Là cấu trúc được thấy đi thấy lại nhiều lần trong các Ig
cũng như trong một số protein khác. Trên khoảng 130 axit amin, một cầu
nối 2S bên trong chuỗi, tạo ra một cấu trúc vòng từ 60 đến 70 axit amin
gọi là lónh vực (domain).


6

Đối với chuỗi nặng của Ig thì sự hình thành lónh vực nói
trên được thấy 4 lần với IgG, IgA, IgD và 5 lần với IgM, IgE và 2 lần
với các chuỗi nhẹ.
- VH (variable heavy) là “vùng thay đổi của chuỗi nặng”
- CH1, CH2, CH3 và cả CH4 (constant heavy) là “vùng hằng
đònh của chuỗi nặng” rất khác nhau không chỉ cho mỗi một lớp và cả
cho các dưới lớp, với IgG1 có 3 dưới lớp là C γ11, Cγ12, Cγ13, hay với
IgM có 4 dưới lớp Cµ1, Cµ2, Cµ3, Cµ4.
Đối với chuỗi nhẹ là:
- VL (variable light) là “vùng thay đổi của chuỗi nhẹ”, chuỗi
Kappa (Vκ) và chuỗi Lamda (Vλ).
- CL (constant light) là “vùng hằng đònh của chuỗi nhẹ” với
Cκ và Cλ.
Trong cấu trúc sâu hơn:
Trong chuỗi nặng
- Vùng thay đổi VH 110 axit amin (từ 107 đến 112) có 3 vùng
cực kỳ thay đổi gọi là CDR (Complementary Determinating Region), vùng
mang tính chất bổ sung với epitôp KN.
- Vùng tương đối hằng đònh gọi là vùng khung FR
(Framework Region), trình tự axit amin của vùng này ít thay đổi hơn.
- CH1, tiếp nối với VH, là lónh vực hằng đònh nên trình tự
axit amin không thay đổi, có thể có thay đổi vài axit amin quyết đònh các
allotype.
- Vùng bản lề, là axit amin nằm giữa CH1 và CH2, có
mang các cầu nối 2S giữa chuỗi nặng, vùng này có tính mềm dẻo, cho
phép chúng gập mở được theo một góc thay đổi để kết hợp với KN.
- CH2 và CH3, tiếp với CH1 và cũng như CH1 chỉ có một
số thay đổi allotype cho một số dưới lớp.
Trong chuỗi nhẹ

7

Cũng như đã thấy ở chuỗi nặng. Các vùng cực kỳ thay
đổi nằm đối diện ngay với vùng tương ứng của VH tạo nên vò trí kết
hợp KN.
Cκ hay Cλ, 2/3 chuỗi nhẹ là Kappa và 1/3 là Lamda ở trong
tất cả các lớp kháng thể.
1.1.2 Các lớp kháng thể hay isotype: Dựa vào cấu trúc và bản
chất của kháng thể mà người ta chia ra làm 5 lớp: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
[1],[25],[30].

Hình 1.3: Cấu trúc các phân tử kháng thể [30]
1.1.2.1 IgG


8

Cả 4 dưới lớp của IgG có một cấu trúc rất gần nhau nên hệ
số lắng đều 7S, TLPT chung 146000, TLPT của IgG3 là 170000, đều có 3
lónh vực hằng đònh cho mỗi chuỗi nặng, và tỉ lệ carbon hydrat thấp (2
đến 3 %).
Nồng độ chung của IgG trong máu khoảng 11 g/l, trong đó IgG1
chiếm 66%, IgG2: 23%, IgG3: 7% và IgG4: 4% .
1.1.2.2 IgM
IgM màng (mIgM, hoặc sIgM) có trên các tế bào lymphô B, là
monome mà phần đuôi là các axit amin đặc biệt từ 556 đến 597 gồm
một phần kỵ nước xuyên qua màng.
IgM được tiết ra ngoài thì gồm một chuỗi nặng với 4 lónh vực
hằng đònh và rất giàu carbon hydrat (12%). Phân tử IgM là một pentame

(5 đơn vò) với một cầu nối 2S thành vòng ở cuối Cµ3 và một vòng
thứ hai ở cuối Cµ4 và cuối cùng một chuỗi nối J (joining chain). IgM có
TLPT cao (970000 D), hệ số lắng là 19S, và nồng độ trong huyết thanh
1,2g/l.
1.1.2.3 IgA
IgA huyết thanh gồm IgA1 (80%) và IgA2 (20%) ở dạng monome
(TLPT 160000 D) hoặc dime, loại dime nối với nhau bằng chuỗi nối J.
Nồng độ IgA trong máu 2,4g/l.
IgA tiết ra ngoài cũng có 2 dưới lớp IgA1 và IgA2, có TLPT
400000 với hệ số lắng là 11S. IgA gồm 2 đơn vò kết hợp với nhau nhờ
một mảnh nối J, cả tổ hợp được bao bởi một mảnh tiết (SP = secretory
piece), do các tế bào biểu mô niêm mạc tổng hợp riêng rồi gắn vào
phân tử IgA dime khi chúng đi qua niêm mạc.
1.1.2.4 IgD
Lượng IgD trong huyết thanh rất thấp mà vai trò cũng chưa rõ.
Người ta thường thấy IgD ở trên bề mặt của tế bào lymphô B liên kết


9

với mIgM, do đó IgD có thể giữ chức năng thụ thể (receptor) của quá
trình biệt hóa và trí nhớ tế bào.
1.1.2.5 IgE
Nồng độ của IgE trong huyết thanh rất thấp 0,0001g/l, IgE cố
đònh trên các tế bào ưa kiềm và tế bào mast nên có vai trò quan trọng
trong dò ứng và quá mẫn tức thì.
IgE có 4 lónh vực hằng đònh, với TLPT 190000 và hệ số lắng
là 8S.
1.1.3 Các nhóm quyết đònh kháng nguyên của kháng thể
Nếu coi kháng thể như là kháng nguyên thì chúng có 3 type khác

nhau về quyết đònh kháng nguyên hay còn gọi là dấu ấn kháng nguyên.
1.1.3.1 Nhóm quyết đònh isotype
Các nhóm quyết đònh isotype, xác đònh bằng kháng thể
kháng isotype, được thấy ở mọi cá thể trong cùng một loài. Chúng hình
thành trong quá trình biệt hóa các loài nên được coi là đặc thù của
mỗi loài. Có thể có được các kháng thể kháng isotype người bằng
cách tiêm cho con vật (thỏ) Ig đa hay đơn dòng của người.
1.1.3.2 Nhóm quyết đònh allotype
Người ta thấy có những đặc điểm kháng nguyên ở một số
cá thể trong cùng một loài, do có khác biệt từ 1 đến 3 axit amin ở
chuỗi CH và CL. vật thí nghiệm có thể có được kháng thể kháng
allotype tinh khiết sau khi mẫn cảm với huyết thanh cùng loài rồi hấp thụ
nó với các kháng thể kháng isotype.
Cách đặt tên các hệ thống allotype: lấy chữ đầu của lớp
kháng thể và thêm con số của dưới lớp, tiếp sau đó là chữ m viết tắt
cho từ dấu ấn (marker) như sau:
Hệ thống Gm là allotype của IgG. Các đặc tính này nằm ở
phần CH của các dưới lớp IgG1, IgG2 và IgG3 cho nên người ta gọi là
G1m, G2m và G3m. Không có allotype nào ở IgG4.


10

Hệ thống Km. Chuỗi nhẹ Kappa có 3 tính trạng Km1, Km2, Km3.
1.1.3.3 Nhóm quyết đònh idiotype
Theo đònh nghóa ban đầu thì tính chất KN này là đặc thù của
quá trình mẫn cảm xảy ra ở con vật đã có sản xuất KT. Oudin ở viện
Pasteur Paris đã thu được kháng thể kháng idiotype đầu tiên: gây mẫn
cảm thỏ chống Salmonella và thu được kháng thể đầu gọi là Ab1 (KT số
1) kháng Salmonella. Rồi ở con thỏ thứ 2, dùng chính kháng thể số 1 ấy

để mẫn cảm và thu được KT số 2 (Ab2) hay là kháng-kháng Salmonella.
KT số 2 này chỉ nhận biết:
- KT số 1 của con vật thứ nhất sau khi đã mẫn cảm.
- Không nhận biết huyết thanh của con vật thứ nhất khi chưa
mẫn cảm.
- Không nhận biết huyết thanh của những con vật khác dù
cũng đã được mẫn cảm với Salmonella.
Niels JERNE (1974) đã đề xuất lý thuyết mạng lưới idiotype
(idiotype và kháng idiotype).
Nếu việc đưa một KN vào trong cơ thể mà gây ra một đáp
ứng Ab1 quá mức thì sẽ được cân bằng bởi sự sản xuất Ab2. Mạng
lưới idiotype đã giải thích đáp ứng miễn dòch và sự điều hòa của đáp
ứng miễn dòch.
1.1.4 Kháng thể đa dòng và đơn dòng
Từ dòng chỉ tất cả các tế bào xuất phát từ một tế bào .
1.1.4.1 Kháng thể đa dòng. Bình thường một đáp ứng miễn dòch là
một đáp ứng đa dòng, trong đó người ta thấy là các kháng thể gồm
có:
- Các lớp và dưới lớp kháng thể khác nhau: IgM, IgG,…
- Hai allotype nếu cá thể là dò hợp tư.û
- Các tính đặc hiệu khác nhau đối với cùng một KN: do nhận
biết các êpitốp khác nhau.


11

- Các mức độ ái tính khác nhau.
1.1.4.2 Kháng thể đơn dòng. Một kháng thể đơn dòng có những
đặc tính :
- Chỉ là một lớp (hoặc dưới lớp kháng thể) ví dụ IgG1

- Chỉ có một loại chuỗi nhẹ,ï ví dụ lamda
- Chỉ có một allotype
- Chỉ có một tính đặc hiệu nhận biết một êpitốp riêng biệt
- Một mức độ ái tính.
Kháng thể đơn dòng là do sự phát triển lành tính, hay ác tính
(bệnh đa u tủy) của một tế bào lymphô B. Tất cả các kháng thể do
một dòng tiết ra đều có một cấu trúc hóa học giống nhau với cùng
một tốc độ di chuyển trong điện trường.
1.1.5 Chức năng của kháng thể
1.1.5.1 Các đặc tính có trên mảnh Fab: Vò trí chức năng kháng thể
(kết hợp vơiù kháng nguyên)
Chỉ có mảnh Fv gồm cả vùng VH của chuỗi nặng và vùng VL
của chuỗi nhẹ, là tham gia vào chức năng kháng thể. Các axit amin tại 3
vùng cực kỳ thay đổi đã tạo ra 2 vò trí chức năng kháng thể.
Người ta đã đo được các chiều của vò trí này (paratốp) là bằng
34Ao, 8Ao, và 12Ao, như vậy có thể nhận 5 đến 6 phân tử đường hay 5
đến 6 axit amin, tương ứng với một nhóm quyết đònh kháng nguyên
(êpitốp).
Trong sự kết hợp KN-KT chỉ có các liên kết không đồng hóa trò
tham gia, khoảng các d giữa KN và KT thường rất nhỏ:
- Cầu nối hydro
- Lực hút tónh điện 1/d2
- Lực Van der Waals 1/d7
- Lực kỵ nước
Phản ứng KN-KT là có thể đảo ngược


12

Dù các lực liên kết trên ít năng lượng nhưng sự kết hợp của

nhiều các lực đã tạo một lực liên kết mạnh với hằng số ái tính là 10-7
đến 10-11l.mole-1.
1.1.5.2 Quá trình giáng hóa
Tốc độ giáng hóa phụ thuộc vào CH2 của các lớp và dưới
lớp khác nhau của Ig. Các IgG có thời gian bán phá hủy là 21 ngày,
các lớp khác IgA, IgM có một thời gian bán phá hủy ngắn hơn: 5 đến 7
ngày.
1.1.5.3 Di chuyển qua nhau thai
Tất cả các IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 đều di chuyển được qua
nhau thai.
1.1.5.4 Hoạt hoá bổ thể
IgG và IgM, đều có một thụ thể với C1q, trở nên hoạt
động khi KT kết hợp với KN. Thụ thể này nằm trên vùng CH2 của IgG.
Chỉ cần một phân tử IgM là đủ để hoạt hóa bổ thể nhờ có 2 vò trí
gần nhau. Ngược lại phải cần 2 phân tử IgG đủ gần thì mới kết hợp
được với bổ thể.
1.1.5.5 Cố đònh trên tế bào
- Bạch cầu ưa kiềm và các tế bào mast có các thụ thể với:
IgE: nhờ thụ thể có ái tính mạnh (FcεR).
IgG: cố đònh được trên tế bào nhờ thụ thể có ái tính yếu
(FcγR).
- Các bạch cầu ưa axit có thụ thể (FcεII) với IgE có ái tính yếu
- Đại thực bào và tế bào mono tuần hoàn trong máu có thụ thể
với Fc chủ yếu là của IgG3 và IgG1. Nhờ đó tạo ra được hiện tượng
opsonin hóa khi các KT này cố đònh lên trên tế bào hay vi khuẩn.
- Các tế bào K có khả năng thực bào nếu IgG được cố đònh
trên một tế bào hay trên một vi sinh vật, tạo ra quá trình ADCC (Antibody
Dependent Cellular Cytotoxicity = độc tế bào phụ thuộc kháng thể).

13

Bảng 1.1: Các đặc tính của các lớp kháng thể
Các đặc tính của các lớp kháng thể[23]
Các lớp
IgG
150.000
0

Phân tử lượng
Chuỗi phụ
Nồngđđộ
huyết
thanh
12
(mg/ml)
Tỉ lệ trong tổng
globulin miễn dòch 80
(%)

IgA
160.000
J và S

IgM
900.000
J

IgD
180.000

0

IgE
200.000
0

1.8

1

0-0,04

0,00002

13

6

0,2

0,002

Nội mạch Nội mạch Nội
& d.kẽ
& d.tiết
mạch
Phân bố
Thời gian bán hủy
23
5,5

(ngày)
++
0
Qua nhau thai
+
++
Có trong sữa
+
0
Hoạt hóa bổ thể
0
Gắn lên thụ thể Fc ++
+
Khả năng ngưng kết +
Hoạt tính chống siêu
+++
+++
vi
Hoạt tính chống vi
+++
++
khuẩn
Hoạt tính chốngđđộc
+++
0
tố
0
Hoạt tính gây dò ứng + ?
1.1.6 Gen của kháng thể[1],[23], [57]

Trên tb
Bề mặt mast,
lympho
tb
ái
kiềm

5

2,8

2,0

0
0
+++
0
+++

0
0
0
0
0

0
0
0
++
0

++

0

0

+++

0

0

0

0

0

0

0

+++

Các kháng thể rất đa dạng về tính đặc hiệu. Chỉ từ một số gen
nhưng các gen này đã tổ hợp với nhau một cách ngẫu nhiên mà tạo ra
các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ kappa và lamda, rồi việc ghép ngẫu nhiên
một chuỗi nặng với một chuỗi nhẹ, như vậy làm tăng nhiều lần khả

14

năng có được KT đa dạng. Các gen của kháng thể nằm trên 3 nhiễm
sắc thể khác nhau 2, 14, 22.
1.1.6.1 Gen của chuỗi nặng
1.1.6.1.1 Gen mã cho vùng VH. Trên Nhiễm sắc thể 14, có từ
200 đến 2000 gen mã cho VH khác nhau, 16 gen D và cuối cùng là 9 gen
JH.
1.1.6.1.2 Gen mã cho vùng hằng đònh. Sau các gen của vùng biến
đổi trong chuỗi nặng. Tiếp theo là các gen của các lớp và dưới lớp
các Ig khác. Tế bào lymphô B có thể tổng hợp các chuỗi µ vàδmàng.
Sau khi có kích thích KN thì tế bào lymphô B ban đầu dùng gen µ sản
xuất IgM tiết rồi chuyển đổi thành IgG, IgA hay IgE.
1.1.6.2 Gen mã cho chuỗi nhẹ kappa
Những gen này nằm trên nhiễm sắc thể 2 và bao gồm
khoảng 200 gen VK mã cho các axit amin từ 1 đến 96 của vùng VK, và
vài gen JK cho các axit amin tiếp sau 97 đến 107 và có một gen CK.
1.1.6.3 Gen mã cho các chuỗi nhẹ lamda
Nằm trên nhiễm sắc thể 22 các gen này gồm 200 gen Vκ, 4 gen
J và 6 gen C.
1.1.6.4 Tính đa dạng của các globulin miễn dòch
Có 3 cơ chế để giải thích tính đa dạng của các kháng thể
1.1.6.4.1 Sự kết hợp ngẫu nhiên các gen khác nhau một bên là V,
D và J và một bên là các chuỗi nặng và nhẹ. Khả năng tái tổ hợp
có sẵn trong tế bào cho ra 107 đến 108 đặc tính kháng thể khác nhau.
1.1.6.4.2 Tái tổ hợp có biến đổi (Thay đổi nucleotid lúc ghép nối
hoặc ghép thêm nucleotid)
1.1.6.4.3 Thay đổi do đột biến

15

1.2 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG:

Sơ đồ 1.1: Sản xuất kháng thể đơn dòng [30]