Nghiên cứu tính sinh miễn dịch của các epitope kháng nguyên HA của virus cúm AH5N1 đã được dự đoán bằng phương pháp tin sinh học

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HỒNG KIM

NGHIÊN CỨU TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA CÁC EPITOPE
KHÁNG NGUYÊN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐÃ ĐƯỢC DỰ
ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01
Phản biện 1: PGS.TS. Trương Thị Xuân Liên
Phản biện 2: TS. Trần Tấn Thành
Phản biện 3: TS. Nguyễn Hữu Hùng
Phản biện độc lập 1: TS. Trần Tấn Thành
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Hữu Hùng

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
GS.TS. Trần Linh Thước

Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2014


Lời cảm ơn
Em trân trọng cảm ơn Thầy GS.TS. Trần Linh Thước, người hướng dẫn
khoa học đồng thời là người hướng dẫn ba chương trình nghiên cứu học thuật
của em tại Trường. Thầy không những đã định hướng đề tài, quan tâm giúp đỡ
vật chất và tinh thần cho luận án của em mà cũng là người dẫn dắt, người thủ
trưởng tinh tế, nhiệt tâm của em trong suốt 12 năm vừa qua.
Cảm ơn PGS.TS Bùi Văn Lệ, chủ nhiệm đề tài KC.04.18 đã cho tôi cơ
hội tham gia và thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài.

Tôi chân thành cảm ơn GS.TS.BS. Đỗ Quang Hà và TS. Juliet Bryant đã
hướng dẫn cho tôi thực hành một số thí nghiệm tại PTN an toàn sinh học cấp II
và PTN an toàn sinh học cấp III. Cảm ơn GS.TS. Jeremy Farrar và Ban quản lý
của Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU) tại Bệnh viện Bệnh
Nhiệt đới TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học và thực hành thí
nghiệm tại đây.


Cảm ơn các anh, chị, em của Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và
Môi trường và Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử - Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi
rất nhiều về cơ sở vật chất, hóa chất, trang thiết bị và động viên tinh thần cho
tôi triển khai hầu hết các thí nghiệm nghiên cứu của luận án.
Cảm ơn Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử của Bộ môn Di Truyền đã
giúp tôi sử dụng một số thiết bị trong quá trình thực hành thí nghiệm của mình.
Cảm ơn Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tâp và làm việc.
Cảm ơn PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương, PGS.TS. Đặng Thị Phương
Thảo, chị Trần Thị Phượng Giang và các chị của Phòng Sau Đại học- Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM đã giúp tôi hoàn thành
hồ sơ của luận án.
Cảm ơn TS. Nguyễn Đức Hoàng, TS. Phan Thị Phượng Trang, TS. Lê
Thị Thúy Ái, Bạn Tuyền, các em Trí Nam, Huy Dũng, Tường Vy, Như Thùy,
Lương Thắng, Hoài Nam, Tuấn Anh đã luôn bên cạnh, giúp đỡ, động viên tôi
hoàn thành luận án.


Cảm ơn hai em Lâm Ánh Nguyệt và Phạm Hồng Ánh đã giúp tôi thực
hiện thí nghiệm tại OUCRU.
Cảm ơn Bác sĩ Long, Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Pasteur TP.HCM

đã hỗ trợ tôi thực hiện một số thí nghiệm của luận án.
Con xin gửi đến các đấng sinh thành: Ba – Má hai bên nội ngoại lời tri ân
và biết ơn sâu sắc. Cảm ơn đại gia đình con ở Cam Ranh đã luôn yêu thương,
động viên con trong suốt 34 năm qua.
Em cảm ơn anh và con đã luôn bên cạnh, chia sẻ những vui buồn, là
nguồn động lực cho em vượt qua những lúc gian nan và sẽ cùng em bước tiếp
trên con đường phía trước.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 13 tháng 12 năm 2014

Trần Thị Hồng Kim


Mục lục

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. ix
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. DỊCH BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 Ở GIA CẦM VÀ Ở NGƯỜI .......... 4
1.1.1. Bệnh cúm do virus cúm A/H5N1 ..................................................................... 4
1.1.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới ....................................................... 4
1.1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam ........................................................ 5
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ...................................... 5
1.2.1. Phân loại và danh pháp ..................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc di truyền và tiến hóa ........................................................... 7
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH DO
VIRUS CÚM A/H5N1 ........................................................................................ 10
1.3.1. Phòng ngừa virus cúm A/H5N1 bằng vắc-xin ............................................... 10

1.3.2. Điều trị bệnh do virus cúm ............................................................................. 12
1.4. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở VẬT CHỦ ĐỐI VỚI KHÁNG NGUYÊN VIRUS
CÚM...................................................................................................................... 13
1.4.1. Kháng nguyên và miễn dịch nguyên .............................................................. 13
1.4.2. Đáp ứng miễn dịch ở vật chủ đối với kháng nguyên virus cúm ...................... 13
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮC-XIN THẾ HỆ MỚI PHÒNG
CÚM A. ................................................................................................................ 18
i


Mục lục
1.5.1. Các nghiên cứu phát triển vắc-xin thế hệ mới phòng cúm A trên thế giới ..... 18
1.5.2. Các vắc-xin phòng cúm gia cầm A/H5N1 đang được nghiên cứu và
ứng dụng tại Việt Nam ..................................................................................... 19
1.6. NGUYÊN LÝ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN
DỊCH CỦA KHÁNG NGUYÊN Ở VẬT CHỦ. .............................................. 21
1.6.1. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên thông qua
đáp ứng miễn dịch dịch thể ở vật chủ ....................................................................... 22
1.6.2. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên thông qua
đáp ứng miễn dịch tế bào ở vật chủ .......................................................................... 23
1.7. DỰ ĐOÁN EPITOPE KHÁNG NGUYÊN VIRUS CÚM A/H5N1
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC NHẰM ỨNG DỤNG TRONG
PHÁT TRIỂN VẮC-XIN ................................................................................... 27
1.7.1. Epitope ............................................................................................................ 27
1.7.2. Dự đoán epitope kháng nguyên virus cúm A/H5N1 bằng phương pháp
Tin Sinh học .............................................................................................................. 28
1.8. CẢI THIỆN TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA EPITOPE VÀ PHƯƠNG
PHÁP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ BẢO VỆ CỦA VẮC-XIN PHÒNG CÚM
A/H5N1 ................................................................................................................ 32
1.8.1. Cải thiện tính sinh miễn dịch của epitope ...................................................... 32

1.8.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả bảo vệ của vắc-xin phòng cúm A/H5N1...... 34
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 37
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 37
2.1.2. Vâ ̣t liê ̣u sinh ho ̣c ............................................................................................. 38
2.1.3. Hóa chất – Môi trường ................................................................................... 43
ii


Mục lục
2.2. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP VÀ KIỂM TRA TÍNH SINH MIỄN DỊCH
CÁC EPITOPE KHÁNG NGUYÊN HA CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐÃ
ĐƯỢC DỰ ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC ...................... 47
2.2.1. Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên epitope dự đoán từ
kháng nguyên HA dưới dạng peptide tái tổ hợp ....................................................... 49
2.2.2. Tạo các chủng E. coli biểu hiện epitope tế bào B và epitope tế bào T
dưới dạng các peptide tái tổ hợp ............................................................................... 52
2.2.3. Phương pháp tinh chế, định lượng và phân tích độ sạch của kháng nguyên .. 56
2.2.4. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch chuột với các kháng nguyên
thu nhận được ............................................................................................................ 58
2.2.5. Phương pháp ELISA gián tiếp để đánh giá tính sinh miễn dịch của
các epitope tế B ......................................................................................................... 59
2.2.6. Phương pháp ELISPOT để đánh giá tính sinh miễn dịch của các
epitope tế T ............................................................................................................... 61
2.2.7. Phương pháp kiểm tra khả năng trung hòa kháng nguyên HA
virus cúm A/H5N1 của kháng huyết thanh kháng epitope bằng thử nghiệm
ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) ................................................................................ 63
2.2.8. Phương pháp kiểm tra khả năng trung hòa độc lực virus cúm A/H5N1
bằng kỹ thuật vi trung hòa ......................................................................................... 64
2.2.9. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .......................................................... 67

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC VÀ TỔNG HỢP DI TRUYỀN CÁC EPITOPE
ĐÃ ĐƯỢC DỰ ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TIN SINH HỌC ............... 68
3.1.1. Tổng hợp hóa học các epitope tế bào B và epitope tế bào T đã được
dự đoán từ kháng nguyên HA .................................................................................... 68
3.1.2. Thiết kế và tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên epitope dự đoán
iii


Mục lục
từ kháng nguyên HA dưới dạng peptide tái tổ hợp ................................................... 68
3.1.3. Biểu hiện, thu nhận và tinh chế epitope tế bào B và epitope tế bào T
dưới dạng các peptide tái tổ hợp ................................................................................ 75
3.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA CÁC EPITOPE TẾ BÀO B,
TẾ BÀO T ĐÃ ĐƯỢC TỔNG HỢP .................................................................. 92
3.2.1. Tính sinh miễn dịch của các epitope tế bào B và epitope tế bào T
được tổng hợp hóa học .............................................................................................. 85
3.2.2. Tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên là các epitope tế bào B
được tổng hợp di truyền dưới dạng các peptide tái tổ hợp ....................................... 97
3.2.3. Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên là các epitope tế bào T
được tổng hợp di truyền dưới dạng peptide tái tổ hợp ............................................. 94
3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH TRUNG HÒA KHÁNG NGUYÊN HA VÀ
TRUNG HÒA ĐỘC LỰC VIRUS CÚM A/H5N1 CỦA KHÁNG HUYẾT
THANH KHÁNG CÁC EPITOPE TỔNG HỢP ............................................ 97
3.3.1. Đánh giá hoạt tính trung hòa kháng nguyên HA của kháng huyết thanh
bằng thử nghiệm HI ................................................................................................... 97
3.3.2. Đánh giá hoạt tính trung hòa độc lực virus của kháng huyết thanh
kháng peptide tái tổ hợp bằng thử nghiệm vi trung hòa ......................................... 102
3.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH TRUNG HÒA KHÁNG NGUYÊN HA
VÀ TRUNG HÒA ĐỘC LỰC VIRUS CỦA KHÁNG HUYẾT THANH

TỪ HỖN HỢP EPITOPE TIỀM NĂNG ....................................................... 103
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 107
4.2. ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................ 109
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................... 110
iv


Mục lục
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 111
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
aa

Acid amin

ANNs

Artificial Neural Network (mạng nơron nhân tạo)

APS

Ammonium Persulfate

bp

base pair

BSA

Bovine Serum Albumin (huyết thanh bò)

CPE

Cytopathic effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào)

cRNA

complementary Ribonucleic Acid

CTL

cytoxic T-cell lymphocyte

dH2O

distilled water (nước cất)

dNTP

deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

ELISPOT

Enzyme-linked immunosorbent spot

GST

Gluthathione-S-tranferase

HA

Haemagglutinin

HI

Haemagglutinin Inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu)

HMMs

Hidden Markov Models (mô hình Markov ẩn)

IFN

Interferon gamma

IL

Interleukin
vi


IPTG

Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside

Kanr

Kanamycine resistance (kháng Kanamycine)

kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Môi trường Luria–Bertani

MCS

Multiple Cloning Site

MDCK

Madin-Darby Canine Kidney (tế bào thận chó)

mRNA

messenger RiboNucleic Acid

OPD

O-Phenylene Diamine

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PMSF

Phenyl methyl sulphonyl fluoride

RNA

Ribonucleic acid

SDS – PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis

TCID50

50% Tissue Culture Infective Dose (liều hủy hoại 50% số
giếng tế bào nuôi cấy)

TEMED

Tetramethylethylenediamine

TNF

Tumor Necrosis Factor

SVMs

Support Vector Machines (máy học hỗ trợ)

WHO

World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Vai trò, chức năng các phân đoạn gen virus cúm A/H5N1 ........................... 8
Bảng 1.2. Tình hình sản xuất vắc-xin dựa trên các trình tự bảo tồn của virus
cúm ở một số công ty lớn trên thế giới .......................................................................... 19
Bảng 1.3. Các epitope dự đoán được đánh giá tính sinh miễn dịch bởi đề tài
KC.04.18 ...................................................................................................................... 31

Bảng 2.1. Các mồi được sử dụng trong luận án .......................................................... 39
Bảng 2.2. Các epitope dự đoán được tổng hợp hóa học ............................................. 41
Bảng 2.3. Cách tính kết quả TCID50 trong phản ứng vi trung hòa. ............................ 65
Bảng 3.1. Các epitope bảo tồn nhận diện bởi tế bào B và tế bào T được tổng hợp
hóa học để kiểm tra tính sinh miễn dịch. ...................................................................... 68
Bảng 3.2. Các plasmid tái tổ hợp đã được tạo dòng trong luận án ............................ 74
Bảng 3.3. Các epitope tế bào B và T đã được tổng hợp hóa học và tổng hợp
di truyền để kiểm tra tính sinh miễn dịch trong luận án. .............................................. 82

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sự phân bố dịch cúm A/H5N1. ..................................................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc virus cúm A (A) và ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử (B) ............ 7
Hình 1.3. Các đáp ứng miễn dịch thích ứng của vật chủ đối với kháng nguyên
virus cúm ..................................................................................................................... 16
Hình 1.4. Quy trình ELISPOT điển hình. ..................................................................... 25
Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pVFT và plasmid pGEX-fljB. ................................................ 39
Hình 2.2.Các thang chuẩn DNA được sử dụng trong luận án .................................... 42
Hình 2.3.Các thang chuẩn protein được sử dụng trong luận án ................................ 42
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các nội dung nghiên cứu trong luận án ............................. 48
Hình 2.5. Sơ đồ minh họa các bước tạo dòng plasmid tái tổ hợp ............................... 49
Hình 3.1. Kết quả thu nhận plasmid (A), PCR thu gen hab (B) và sản phẩm PCR
plasmid tái tổ hợp pVFT- hab (C) ................................................................................. 69
Hình 3.2. Kết quả so sánh trình tự gen hab của plasmid tái tổ hợp pVFT-hab
với trình tự gen mã hóa epitope tế bào B liên tục HaBc.. ............................................ 70
Hình 3.3. Kết quả phân tích sản phẩm PCR của plasmid pVFT-(hab)3
bằng cặp mồi hab-3-F/hab-3-R và cặp mồi gst-F/T7-ter .......................................... 71
Hình 3.4. Kết quả phân tích plasmid pVFT-fljB-hab ly trích từ dòng

E. coli/pVFT-fljB-hab bằng phản ứng PCR và giải trình tự đoạn fljB-hab. .............. 72
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pVFT-fljB-(hab)3
bằng PCR khuẩn lạc (A) và PCR plasmid (B).. ........................................................... 73
Hình 3.6. Kết quả sàng lọc dòng E. coli DH5α mang plasmid pVFT-fljB-(habdc)3
bằng PCR khuẩn lạc (A) và PCR plasmid (B) ............................................................. 73
Hình 3.7. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuẩn lạc tuyển chọn
ix


dòng E. coli DH5α/pGEX-fljB-(hati)3. .......................................................................... 74
Hình 3.8. Kết quả biểu hiện và tinh chế protein GST-(HaBc)3 bằng SDS-PAGE (A)
và (C) và lai Western với kháng thể kháng GST (B) ..................................................... 75
Hình 3.9. Phân tích sự biể u hiện protein dung hợp GST-H:1,2-HaBc bằng
SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B). ...................................... 76
Hình 3.10. Kết quả tinh chế protein dung hợp GST-H:1,2-HaBc bằng
SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B).. .................................... 77
Hình 3.11. Phân tích kết quả thu nhận và tinh chế peptide tái tổ hợp H:1,2-HaBc
bằng SDS-PAGE. ......................................................................................................... 78
Hình 3.12. Kết quả phân tích sự biểu hiện protein dung hợp GST-H:1,2-(HaBc)3
bằng SDS-PAGE (A) và lai Western với kháng thể kháng GST (B). .......................... 79
Hình 3.13. Kết quả SDS-PAGE phân tích và thu nhận peptide tái tổ hợp
H:1,2-(HaBc)3 từ protein GST-H:1,2-(HaBc)3 được xử lý bằng TEV protease. ......... 79
Hình 3.14. Kết quả biểu hiện protein GST-H:1,2-(HaBdc)3 của chủng E. coli
BL21 (DE3)/pVFT-fljB-(habdc)3 bằng điện di SDS-PAGE (A) và lai Western
với kháng thể kháng GST (B). ...................................................................................... .80
Hình 3.15. Kết quả thu nhận H:1,2-(HaBdc)3 bằng điện di SDS - PAGE (A)
và lai Western với kháng thể kháng GST (B). .............................................................. 81
Hình 3.16. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện các epitope tái tổ hợp (HaTi)3 bằng
điện di SDS-PAGE (A, C) và lai Western với kháng thể kháng GST (B, D) ................ .82
Hình 3.17. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện kháng nguyên epitope

tế bào B của kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope HaBc (A) và HaBdc (B) ..... 87
Hình 3.18. Hình ảnh quan sát kết quả thử nghiệm ELISPOT của ba epitope
bảo tồn nhận diện bởi tế bào T.. .................................................................................. 88
Hình 3.19. Kết quả ELISPOT định lượng số tế bào đơn nhân tiết IFN- phân lập
từ lách chuột tiêm các epitope và ủ với các epitope tổng hợp hóa học ..................... 89
x


Hình 3.20. Kết quả ELISA kiểm tra sự hiện diện của kháng thể nhận diện
epitope HaBc của các kháng huyết thanh chuột được tiêm kháng nguyên HaBc
và kháng nguyên (HaBc)3............................................................................................. 90
Hình 3.21. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện epitope HaBc (A) và
peptide tái tổ hợp H;1,2-HaBc (B) của các kháng huyết thanh chuột được tiêm
kháng nguyên HaBc, H;1,2-HaBc, GST-H:1,2 ............................................................. 91
Hình 3.22. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện kháng nguyên HA
virus cúm A/H5N1 của các kháng huyết thanh chuột được tiêm H:1,2-(HaBc)3 (A)
và H:1,2-(HaBdc)3 (B).. ................................................................................................ 93
Hình 3.23. Kết quả ELISPOT phát hiện tế bào đơn nhân tiết cytokin INF-
phân lập từ lách chuột được tiêm peptide GST-H:1,2-(HaT1)3 khi được ủ với
epitope HaT1 (A) và peptide GST-H:1,2-(HaT1)3 (B) ................................................ 95
Hình 3.24. Kết quả ELISPOT định lượng số tế bào đơn nhân tiết IFN- phân lập
từ lách chuột tiêm các epitope tế bào T tổng hợp hóa học và epitope tế bào T
tổng hợp di truyền ....................................................................................................... 95
Hình 3.25. Kết quả HI so sánh khả năng trung hòa kháng nguyên HA
virus cúm A/H5N1 (A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của
kháng huyết thanh chuột được tiêm epitope và peptide tái tổ hợp của epitope
tế bào B.......................................................................................................................... 98
Hình 3.26. Kết quả HI kiểm tra khả năng trung hòa kháng nguyên HA từ hai
chủng virus cúm A/H5N1 (A/Vietnam/CL26/2004(H5N1)
và A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006) của kháng huyết thanh chuột

được tiêm peptide tái tổ hợp........................................................................................ 100
Hình 3.27. Minh họa các vị trí của các epitope tế bào B và epitope tế bào T trên
cấu trúc 3D của phân tử HA (mã số PDB: 1JSM). .................................................... .101
Hình 3.28. Kết quả vi trung hòa kiểm tra khả năng trung hòa hai chủng virus cúm
xi


A/H5N1 (A/Vietnam/CL26/2004(H5N1) và A/H5N1/Chicken13/Vietnam/LA/2006)
của kháng huyết thanh chuột đượctiêm kháng nguyên tái tổ hợp............................... 103
Hình 3.29. Hiệu giá kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu và hiệu giá kháng thể
trung hòa virus cúm A/Vietnam/CL26/2004(H5N1) của kháng huyết thanh chuột
được tiêm các kháng nguyên peptide tái tổ hợp và hỗn hợp kháng nguyên
tiềm năng*, (* r-(HaT1)3 + r-(HaBc)3 + r-(HaBdc)3). .............................................. 104

xii


Lời mở đầu

Virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho
ngành chăn nuôi gia cầm, đồng thời ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng con người
trên thế giới từ năm 2003 đến nay. Kể từ khi được phát hiện, virus cúm gia cầm
A/H5N1 đã gây chết người trên bình diện rộng ở Hồng Kông năm 1997. Các nhà khoa
học đã chứng minh virus cúm A/H5N1 có thể biến đổi gen liên tục, có thể xuất hiện
chủng đột biến có khả năng truyền nhiễm từ người sang người và gây ra đại dịch.
Tiêm phòng vắc-xin là liệu pháp y học chính nhằm khống chế đại dịch cúm gia
cầm H5N1 cũng như ngăn chặn virus lây nhiễm trên người. Cho đến nay, có nhiều loại
vắc-xin phòng cúm H5N1 đã được phát triển và sử dụng như vắc-xin bất hoạt, vắc-xin
nhược độc và vắc-xin virus tái tổ hợp. Tuy nhiên, virus cúm A/H5N1 có khả năng biến
đổi kháng nguyên bề mặt liên tục và nhanh chóng, tạo ra nhiều chủng mới có thể kháng

lại hiệu quả bảo hộ của các vắc-xin đang lưu hành. Do đó, các phương pháp mới để
phát triển vắc-xin vẫn tiếp tục được nghiên cứu nhằm cải thiện các loại vắc-xin hiện có,
khắc phục vấn đề hàng năm phải tạo vắc-xin mới cho các chủng virus cúm mới, đồng
thời nhằm nghiên cứu tạo ra một loại vắc-xin đa trị có khả năng phòng ngừa được
nhiều chủng virus cúm khác nhau.
Một trong các hướng tiếp cận đang được quan tâm hiện nay là phát triển vắc-xin
phổ rộng, dựa trên các epitope bảo tồn của hai kháng nguyên bề mặt quan trọng HA và
NA của virus cúm A. Epitope là một vùng nhỏ trên bề mặt cấu trúc kháng nguyên có
khả năng tương tác với các phân tử của hệ thống miễn dịch của vật chủ để gây đáp ứng
miễn dịch. Epitope được phân thành epitope tế bào B (nhận diện bởi tế bào B) và
epitope tế bào T (nhận diện bởi tế bào T). Ưu điểm chính của vắc-xin dựa trên epitope
là khả năng gây đáp ứng miễn dịch với cấu trúc kháng nguyên tối thiểu; do vậy, nếu
chứa đầy đủ các epitope cần thiết, vắc-xin sẽ kích thích phản ứng miễn dịch chuyên
biệt trong khi tránh được những ảnh hưởng không mong muốn.

1


Lời mở đầu

Cùng với sự phát triển của ngành Tin Sinh học, Phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học Phân tử (PTN.CNSHPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Trường ĐH
KHTN) thuộc Đại học Quốc gia TP.HCM (ĐHQG - HCM) quan tâm đến hướng
nghiên cứu phát triển vắc-xin phòng virus cúm A dựa trên epitope bảo tồn nêu trên.
Trong các năm 2008 – 2010, PTN.CNSPT đã được Bộ Khoa học và Công nghệ giao
chủ trì triển khai một đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước là “Nghiên cứu ứng
dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vắc-xin và thuốc”, mã số KC.04.18/06-10. Một
trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope được nhận diện bởi tế
bào B, tế bào T từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A bằng các chương trình
dự đoán epitope khác nhau và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope dự đoán.

Trong đề tài KC.04.18/06-10, 08 epitope tế bào B và T được dự đoán từ HA và NA
được tuyển chọn để tổng hợp và kiểm chứng tính sinh miễn dịch. Các kết quả bước đầu
đánh giá tính sinh miễn dịch của các epitope dự đoán in silico từ đề tài KC.04.18 đã
cho thấy một số epitope tế bào T có tính sinh miễn dịch mạnh. Các epitope tế bào B
được tổng hợp hóa học cho thấy đáp ứng miễn dịch rất yếu. Việc tổng hợp di truyền
các epitope được dự đoán nhằm làm tăng tính sinh miễn dịch chưa được thực hiện bởi
đề tài KC.04.18 do giới hạn về thời gian. Do vậy, các epitope này cần được tổng hợp
theo chiến lược tăng cường tính sinh miễn dịch của kháng nguyên. Là một thành viên
của đề tài trực tiếp tham gia việc tổng hợp và kiểm chứng thực nghiệm tính sinh miễn
dịch các epitope đã được dự đoán, trong luận án này, nghiên cứu sinh kế thừa các kết
quả nghiên cứu của đề tài KC.04.18 và tiếp tục tổng hợp các epitope dự đoán từ kháng
nguyên HA, hiện diện trên bề mặt của virus và có vai trò quyết định độc tính của virus.
Mục tiêu của luận án này nhằm tổng hợp di truyền một số epitope đã được dự đoán từ
kháng nguyên HA virus cúm A/H5N1, kiểm chứng thực nghiệm tính sinh miễn dịch và
triển vọng áp dụng các epitope này trong phát triển vắc-xin phòng virus cúm A/H5N1.
Nội dung thực nghiệm của luận án bao gồm:
2


Lời mở đầu

-

Tổng hợp hóa học các epitope tế bào B và T đã được dự đoán từ kháng nguyên
HA và tổng hợp di truyền các epitope này dưới dạng các peptide tái tổ hợp;

-

Đánh giá tính sinh miễn dịch của các epitope tế bào B, epitope tế bào T đã được
tổng hợp hóa học và tổng hợp di truyền;

-

Đánh giá khả năng trung hòa kháng nguyên HA và trung hòa độc lực virus của
kháng huyết thanh kháng epitope và kháng peptide tái tổ hợp;

-

Đề xuất các kháng nguyên có triển vọng ứng dụng để phát triển vắc-xin và bước
đầu đánh giá hiệu quả trung hòa kháng nguyên HA và trung hòa độc lực virus
của hỗn hợp các kháng nguyên tiềm năng.

3


Tổng quan

1.1.

DỊCH BỆNH DO VIRUS CÚM A/H5N1 Ở GIA CẦM VÀ Ở NGƢỜI

1.1.1. Bệnh cúm do virus cúm A/H5N1
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A,
thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng truyền nhiễm từ động vật sang người.
Tuy quần thể chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời) và gia cầm (vịt, gà tây, gà,
ngan, ngỗng) là các vật chủ tự nhiên của virus cúm A, nhưng nhóm virus này có khả
năng dễ dàng biến đổi các kháng nguyên bề mặt dẫn đến việc nó có thể xâm nhiễm và
gây bệnh cho người. Ca nhiễm cúm gia cầm ở người do virus cúm A/H5N1 gây ra
được báo cáo lần đầu tiên là tại Hồng Kông năm 1997. Năm 2006, các nghiên cứu trên
một chùm ca nhiễm virus cúm A/H5N1 ở Thái Lan cho thấy sự lan truyền từ người

sang người, tạo ra quan ngại về khả năng virus đạt được sự thích nghi và truyền nhiễm
từ người sang người và gây ra đại dịch [15] [21] [27].
1.1.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới
Virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại
Scotland vào năm 1959. Năm 1996, virus cúm A/H5N1 được phát hiện trở lại tại
Quảng Đông và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia
cầm mà còn thích ứng và gây chết trên người. Từ năm 2003 đến nay, virus cúm
A/H5N1 đã gây ra nhiều trận dịch cúm trên gia cầm và tiếp tục lây lan hơn 70 quốc gia
trên thế giới, cướp đi sinh mạng của gần 400 người và buộc các nhà chức trách phải
tiêu hủy hơn 400 triệu gia cầm, gây thiệt hại khoảng 20 tỷ USD. Tổ chức Lương Nông
(FAO) cảnh báo, hiện nay nhiều ổ virus cúm A/H5N1 vẫn tồn tại ở châu Á và Trung
Đông (Hình 1.1) [45] [52].
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) từ năm 2003 đến đầu năm 2015 có 694 ca
nhiễm cúm A/H5N1 trên người và 58% trường hợp tử vong. Việt Nam, Indonesia và
Ai Cập là 3 quốc gia có số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất trên
thế giới. WHO xác định Việt Nam là “điểm nóng”, có khả năng cho phép cúm A/H5N1
4


Tổng quan
có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của người
[27] [95].

Vùng có gia cầm và các loài chim bị giết bởi A/H5N1
Vùng có người, gia cầm và các loài chim bị giết bởi A/H5N1

Hình 1.1. Sự phân bố dịch cúm do virus cúm A/H5N1 [89] .
1.1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Việt Nam một trong những nước chịu thiệt hại nặng nề về người và kinh tế do
virus cúm A/H5N1. Dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam

vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các
tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia
cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt
hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân. Từ năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn
thường xuyên tái phát hàng năm tại nước ta và kéo theo nhiều trường hợp mắc bệnh và
tử vong. Trong những tháng đầu năm 2014, Việt Nam đã có thêm 2 ca nhiễm mới ở
người đã tử vong, nâng tổng số ca nhiễm cúm A/H5N1 trên người ở Việt Nam từ năm
2003 đến ngày 05/05/2014 lên 127 ca với 64 ca tử vong (WHO, 2014) [27] [95].
1.2.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A/H5N1
5


Tổng quan
1.2.1. Phân loại và danh pháp
a. Phân loại
Virus cúm A/H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae, chi Influenzavirus. Họ
Orthomyxoviridae gồm 5 týp A, B, C, D và Isavirus, được phân biệt dựa vào số lượng
sợi RNA trong bộ gen, thành phần nucleoprotein (NP), protein M và ký chủ của virus.
Virus cúm A có bộ gen gồm 8 sợi RNA, có độc lực mạnh, là nguyên nhân gây đại dịch
trên thế giới, lây nhiễm trên chim, heo, ngựa, người. Virus cúm B cũng có bộ gen gồm
8 sợi RNA, chỉ nhiễm trên người. Virus cúm C có bộ gen gồm 7 sợi RNA, độc lực
thấp, nhiễm ở người và heo. Virus cúm D là Thogotovirus được phân lập từ ve (rận) kí
sinh trên chuột lang. Isavirus là virus cúm được phát hiện ở cá vẫn chưa được nghiên
cứu kỹ [15] [52].
Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng nguyên bề mặt của protein
Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), virus cúm A được chia thành các thứ týp
(subtype) dựa vào sự tái tổ hợp giữa các thứ týp HA (H1 - H16) và NA (N1 - N9) khác
nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Virus cúm B và C không được chia thành các

thứ týp. Trong tất cả các thứ týp virus cúm A được tìm thấy ở chim, chỉ có 3 thứ týp
HA (H1, H2 và H3) và hai thứ týp NA (N1 và N2) có thể truyền nhiễm sang người
[52].
Ngoài ra, dựa trên cơ sở phân tử và khả năng gây bệnh, nhóm virus cúm A còn
được phân thành hai loại là virus cúm gia cầm thể độc lực thấp (Low Pathogenic Avian
Influenza - LPAI) và virus cúm gia cầm thể độc lực cao (High Pathogenic Avian
Influenza - HPAI). Theo Tổ chức Thú Y thế giới (OIE), virus được xếp vào loại có độc
lực cao khi có chỉ số gây bệnh IVPI (Intravenous Pathogenicity Index) dao động từ 1,2
– 3,0. Chủng virus cúm A/H5N1 được phân lập từ năm 2003 đến nay được xếp vào
loại virus có độc lực cao (HPAI) [27] [61].
b. Danh pháp

6


Tổng quan
Tên gọi đầy đủ của một chủng virus cúm được phân lập được quy định bao gồm
các thành phần là: týp virus (A hoặc B), loài ký chủ, vị trí địa lý, số thứ tự, năm phân
lập, kiểu huyết thanh H và N. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất
danh pháp cho virus cúm theo thứ tự kí hiệu: Týp - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa
lý phân lập - Số hiệu đăng kí chủng virus - Thời gian phân lập - Thứ týp HA (H) và
NA (N), ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1). Đối với các virus được phân
lập

trên

người,

không

cần

ghi

loài

nhiễm

trong

danh

pháp,

ví

dụ:

A/Vietnam/1194/2004(H5N1).
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc, di truyền và tiến hóa
a. Đặc điểm cấu trúc và di truyền
Virus cúm A có dạng hình cầu, thuộc họ virus có màng bao lipid, bên trong
chứa bộ gen RNA sợi đơn âm, liên kết chặt chẽ với các nucleoprotein (NP) gồm có tám
phân đoạn của phức hợp ribonucleoprotein (RNP) mã hoá 11 protein. Trung bình trong
một hạt virus có khoảng 500 phân tử glycoprotein HA (dạng hình que) và NA (dạng
hình nấm), 1000-3000 phân tử protein (M1 và NP) và 20-40 phân tử các polypeptid thứ
yếu. Protein M1 tạo thành một lớp protein nền trong hạt virus, nằm ngay dưới lớp
màng lipid, đóng vai trò là một nhân tố trung gian giữa vỏ lipid và RNP của virus
(Hình 1.2).

A
B
Hình 1.2. Cấu trúc virus cúm A (A) và ảnh chụp bằng kính hiển vi điện tử (B)
(nguồn: )
7


Tổng quan
Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm ((-) ssRNA),
bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt đặt tên từ 1 - 8 theo thứ tự giảm dần của kích
thước phân tử, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M1, M2, NP,
NS1, NS2, PA, PB1, PB1-F2 và PB2. Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N có các
đặc điểm và chức năng riêng biệt được miêu tả trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Vai trò, chức năng các phân đoạn gen virus cúm A/H5N1
Sợi
RNA

Protein

Kích thước
(kDa)

1

PB2

85,7

Khởi đầu phiên mã.

2

PB1

86,5

Gắn mũ RNA.

3

PA

84,2

Kéo dài phiên mã.

Vai trò, chức năng

4

HA

76

Gắn với các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ. Dung
hợp màng virus với màng tế bào chủ để đưa
nucleocapsid vào.
Dễ bị biến đổi hình thành nên chủng mới.

5

NP

56,1

Protein cấu trúc bao quanh các phân đoạn RNA.

6

NA

32

Loại bỏ sialic acid ra khỏi glycoprotein, giúp virus
vượt qua lớp nhầy của ống hô hấp, tham gia vào
việc lây truyền của virus.

7

M1 và
M2

M1: 27,8
M2: 11

M1: thành phần cấu trúc chính, tham gia quá trình
lắp ráp và nảy chồi.
M2: là các kênh ion.

8

NS1 và
NS2

NS1: 26,8
NS2: 14,2

NS1: ức chế vận chuyển mRNA.
NS2: đưa ribonucleoprotein ra ngoài nhân.

b. Đặc điểm tiến hóa
Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [4], [61].

8


Tổng quan
-

Sự lệch kháng nguyên (antigenic drift): là sự biến đổi tiến hóa do sự tích lũy

các đột biến điểm xảy ra trong các phân đoạn gen của virus. Tần suất xảy ra đột biến
điểm rất cao, cứ mỗi 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của
virus cúm A) thì có 1 nucleotide bị biến đổi. Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được
sinh ra đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó. Sự tích lũy các đột biến
này qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một thứ týp virus mới có đặc tính kháng
nguyên mới. Đột biến lệch kháng nguyên thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng
nguyên HA và NA.
-

Sự thay thế kháng nguyên (antigenic shift): là cơ chế biến đổi tiến hóa chỉ có

ở virus cúm, và ở một số virus RNA gây bệnh gia cầm khác. Khi hai chủng virus cúm A
khác nhau nhiễm đồng thời vào một tế bào chủ, sau khi các phân đoạn RNA của hai
chủng virus được sao mã, trong quá trình đóng gói vào vỏ capside (packaging) có khả
năng xuất hiện các hạt virus tái tổ hợp chứa các phân đoạn RNA từ hai chủng virus. Kết
quả là tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen tổ hợp, và đôi khi giúp cho chúng có
khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh.
-

Sự glycosyl hóa (glycosylation): là sự gắn của một chuỗi oligosaccharide với

Asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong phân tử HA hay NA, hay một số
polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị
trí N-X-S/T (N = Asparagine; X = acid amin bất kì, trừ Proline; S/T = Serine hoặc
Threonine) là những vị trí gắn với các kháng thể do đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự
glycosyl hóa làm kháng thể mất khả năng bất hoạt hoạt tính của HA, NA. Cơ chế lệch
kháng nguyên tạo ra đột biến điểm hình thành bộ mã của Asparagine, tạo tiền đề cho
hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA, làm thay
đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác động
miễn dịch bảo vệ của cơ thể vật chủ [62].
Cơ chế lệch kháng nguyên và glycosyl hóa xảy ra liên tục theo thời gian, còn cơ
chế thay thế kháng nguyên có thể xảy ra với tất cả các chủng của virus cúm A, khi đồng
9