Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất vắc xin thương hàn vi polysaccharide ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*********

ĐÀO THỊ VI HÒA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN
THƢƠNG HÀN VI POLYSACCHARIDE Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ VI HÒA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN
THƢƠNG HÀN VI POLYSACCHARIDE Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số chuyên ngành: 62.42.40.01

Phản biện 1: TS. Lê Văn Bé
Phản biện 2: PGS.TS. Trần Đình Từ
Phản biện 3: TS. Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Nguyễn Đinh Nga
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Đăng Quân

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. ĐÀO XUÂN VINH
2. PGS. TS. PHẠM THỊ ÁNH HỒNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2014


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cám ơn Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Thành phố
Hồ Chí Minh và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học
tập cũng nhƣ hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến
PGS. TS. Đào Xuân Vinh, Giám đốc Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt.
PGS. TS. Phạm Thị Ánh Hồng, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên.
là những ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cám ơn
GS. TS. Trần Linh Thƣớc, Hiệu trƣởng
PGS. TS. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, Trƣởng phòng Đào tạo sau đại học
Chị Trần Thị Phƣợng Giang, Phòng Đào tạo sau đại học
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Thành phố Hồ Chí Minh
là những ngƣời thầy đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án và mọi
thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cám ơn
Cố GS. TSKH. Đặng Đức Trạch, nguyên Chủ nhiệm Chƣơng trình
Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia, Viện phó Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội.
Dr. John B. Robbins và Dr. Shousun C. Szu, Viện Y tế Quốc gia Mỹ.
TS. Lê Văn Bé, Viện trƣởng
GS. TS. Nguyễn Thị Kê, nguyên Viện trƣởng Viện Vắc xin và Sinh phẩm
y tế Nha Trang
là những ngƣời thầy đã hƣớng dẫn, tạo điều kiện cho tôi đƣợc tiếp cận và học

tập công nghệ sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi polysaccharide.
Tôi xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Đình Bồng và các anh chị
đồng nghiệp thuộc Phòng thƣơng hàn Vi, Phòng kiểm định - Viện Vắc xin cơ sở 2
Đà Lạt; các anh chị đồng nghiệp thuộc Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang
đã nhiệt tình giúp tôi hoàn thành các mục tiêu nghiên cứu.
Tôi biết ơn những ngƣời thân trong gia đình đã luôn động viên, hỗ trợ, quan
tâm và tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc yên tâm học tập và nghiên cứu.


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học do chính tôi thực
hiện. Các số liệu và kết quả trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố
trong công trình nghiên cứu khác.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày

tháng

Tác giả

Đào Thị Vi Hòa

i

năm


MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan

i

Mục lục

ii

Danh mục các chữ viết tắt

vii

Danh mục các bảng

x

Danh mục các hình

xii

MỞ ĐẦU

1

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1

Tình hình dịch tễ bệnh Thƣơng hàn trên thế giới và ở Việt Nam

5

1.2

Bệnh Thƣơng hàn

8

1.3

Vi khuẩn Thƣơng hàn

9

1.3.1

Hình thái vi khuẩn

10

1.3.2

Tính chất nuôi cấy

10

1.3.3

Đặc tính sinh hóa

11

1.3.4

Kháng nguyên

11

1.3.4.1 Kháng nguyên O (Ohne)

12

1.3.4.2 Kháng nguyên H [Hauch]

13

1.3.4.3 Kháng nguyên Vi (Virulence)

13

1.4

Kháng nguyên vỏ Vi polysaccharide

15

1.4.1

Cấu tạo kháng nguyên Vi polysaccharide của S. Typhi

15

1.4.2

Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS của S. Typhi

18

1.4.2.1 Các gen mã hóa độc lực ở S. Typhi (đảo gây bệnh 7 (SPI-7), locus
viaA và locus viaB)

18

1.4.2.2 Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS

19

ii


Đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên Vi PS

21

1.4.3.1 Bản chất khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên Vi PS

21

1.4.3.2 Cơ chế đáp ứng miễn dịch gây ra bởi kháng nguyên PS

22

1.4.3

1.5

Vắc xin Thƣơng hàn

24

1.5.1

Lịch sử vắc xin Thƣơng hàn

24

1.5.2

Các loại vắc xin Thƣơng hàn

25

1.5.2.1 Vắc xin Thƣơng hàn chết toàn tế bào

25

1.5.2.2 Vắc xin Thƣơng hàn sống giảm độc lực

25

1.5.2.3 Vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

27

1.6

Sản xuất vắc xin Thƣơng hàn

29

1.6.1

Tình hình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS trên thế giới

29

1.6.1.1 Phƣơng pháp điều chế kháng nguyên Thƣơng hàn Vi PS trong
điều kiện làm biến tính

29

1.6.1.2 Phƣơng pháp điều chế kháng nguyên Thƣơng hàn Vi PS trong
điều kiện không biến tính

31

1.6.2

Sản xuất vắc xin Thƣơng hàn tại Việt Nam

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

34
35

2.1

Vật liệu

36

2.1.1

Chủng giống

36

2.1.2

Kháng huyết thanh

36

2.1.3

Hóa chất

36

2.1.4

Thiết bị

37

2.1.5

Môi trƣờng và dung dịch

37

2.2

Phƣơng pháp nghiên cứu

42

2.2.1

Sơ đồ nghiên cứu

43

2.2.2

Kiểm tra chủng giống Thƣơng hàn S. Typhi Ty2

44

2.2.3

Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít và 75 lít

44

2.2.3.1

Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít

44

iii


2.2.3.2

Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 75 lít

45

2.2.4

Đánh giá vắc xin Thƣơng hàn Vi PS trên thực địa

45

2.2.5

Phƣơng pháp xây dựng quy trình sản xuất ở quy mô nồi lên men
300 lít

47

2.2.5.1

Khảo sát các thông số nuôi cấy vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi Ty2
ở nồi lên men 300 lít

47

2.2.5.2

Khảo sát các thông số bất hoạt vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi Ty2

51

2.2.5.3

Phƣơng pháp thu và tinh sạch kháng nguyên Vi PS

52

2.3

Pha vắc xin

58

2.4

Phƣơng pháp kiểm định

58

2.5

Hình thành quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở
quy mô nồi lên men 300 lít

59

2.6

Sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS theo thông số đã chọn và
khảo sát tính ổn định của quy trình sản xuất

59

2.7

Khảo sát tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

59

2.8

Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS và tiêu chuẩn vắc xin
Thƣơng hàn Vi PS

60

2.8.1

Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS

60

2.8.2

Tiêu chuẩn vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

61

2.9

Hiệu quả kinh tế xã hội của đề tài luận án

61

2.10

Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở
quy mô nồi lên men 300 lít

62

2.11

Xử lý số liệu

62

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

64

3.1

Kết quả kiểm tra chủng giống Thƣơng hàn S. Typhi Ty2

65

3.1.1

Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn và tính chất nuôi cấy

65

3.1.2

Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa

67

3.1.3

Kết quả kiểm tra khả năng ngƣng kết với huyết thanh

68

3.2

Kết quả sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít và 75 lít

70

iv


3.2.1

Kết quả sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 7 lít

70

3.2.2

Kết quả sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men 75 lít

70

3.3

Kết quả đánh giá vắc xin trên thực địa

73

3.3.1

Phản ứng phụ sau tiêm

73

3.3.2

Đáp ứng miễn dịch

74

3.4

Kết quả khảo sát các thông số nuôi cấy vi khuẩn Thƣơng hàn
S. Typhi Ty2 ở nồi lên men 300 lít

76

3.4.1

Kết quả khảo sát tỷ lệ giống

76

3.4.2

Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

77

3.4.3

Kết quả khảo sát oxy hòa tan

79

3.4.4

Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy

81

3.4.5

Kết quả khảo sát các thông số bất hoạt

85

3.4.6

88

3.5.1

Hình thành quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nồi lên
men 300 lít

Kết quả sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nồi lên men
300 lít theo thông số đã xác lập
Kết quả thu nhận kháng nguyên Vi PS

3.5.2

Kết quả bất hoạt theo thông số đã chọn

91

3.5.3

Kết quả đánh giá chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

91

3.5.4

Kết quả số lƣợng kháng nguyên Vi PS và sản lƣợng vắc xin

94

3.5.5

Khảo sát tính ổn định của quy trình sản xuất

94

3.6

Quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

99

3.7

Kết quả kiểm tra tính ổn định vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

101

3.7.1

Kết quả kiểm tra tính ổn định vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nhiệt độ 101
37oC

3.7.2

Kết quả kiểm tra tính ổn định vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nhiệt độ 101
17 – 25oC

3.7.3

Kết quả kiểm tra tính ổn định vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nhiệt độ 102
2 – 8oC

3.8

Hiệu quả kinh tế, xã hội của đề tài luận án

3.5

v

89
89

103


3.8.1

Cung cấp vắc xin Thƣơng hàn Vi PS cho Chƣơng trình TCMR 103
Quốc gia

3.8.2

Giá thành vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

104
106

1.

Kết luận

107

2.

Đề nghị

107

NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN

108

1.

Về khoa học

108

2.

Về thực tiễn ứng dụng

108

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC

109

TÀI LIỆU THAM KHẢO

110

PHỤ LỤC

vi


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

BCR

B cell receptor

Thụ thể tế bào B

CD

Cluster of differentiation

Cụm biệt hóa

CDC

Center for
Prevention

CMI

Cell-mediated immunity

Miễn dịch trung gian tế
bào

CPS

Capsule polysaccharide

Polysaccharide vỏ

Da

Dalton

DC

Dendritic cells

Tế bào có tua

DO

Dissolved oxygen

Oxy hòa tan

DOMI

Diseases of the Most Impoverished

Chƣơng trình phòng bệnh
cho những nƣớc nghèo
nhất

EPS

Exopolysaccharide

Polysaccharide ngoại bào

D/H

Diameter/High

Đƣờng kính/Chiều cao

IgG

Immunoglobulin

kD

Kilo Dalton

LPS

Lipopolysaccharide

MS
M cell

Monosaccharide
Microfold cells

MZ
MLNs

Marginal zone
Mesenteric lymph nodes

NAD+

-nicotinamide adenine dinucleotide

Disease

Control

vii

and Trung tâm Kiểm soát và
Phòng chống dịch bệnh

Tế bào biểu mô chuyên
biệt
Vùng rìa
Hạch bạch huyết mạc treo

ruột


NADP
NIH
NMR
OD
ORF
PS
RU
SAGE
SPI-7
TFF
TAB
TACI

tARN
WHO
TI
TD
TNFtviB
tviC
UDP
UDP-Gal
UDPGalNAc
UDPGalNAcA
UDP-Glc
UDPGlcNAc
UDPGlcNAcA
US FDA

-nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate
National Institute of Heath - USA
Nuclear magnetic resonance
Opacity Density
Open Reading Frame
Polysaccharide
Repeat Unit
Strategic Advisory Group of Experts

Viện y tế quốc gia Mỹ
Cộng hƣởng từ hạt nhân
Độ đục
Khung đọc mở

Đơn vị lặp lại
Nhóm chuyên gia tƣ vấn
chiến lƣợc
Salmonella pathogenicity island 7
Đảo gây bệnh 7
Tangential Flow Filtration
Hệ thống lọc dòng chảy
tiếp tuyến
Typhoid – paratyphoid A and B
Thƣơng hàn – phó thƣơng
hàn A và B
Transmembrane activator and calcium Phối tử cyclophilin điều
modulating cyclophilin ligand
chỉnh canxi

interactor
Transfer ARN
ARN vận chuyển
World Health Organizationn
Tổ chức y tế thế giới
(TCYTTG)
Thymus Independence
Không phụ thuộc T
Thymus Dependence
Phụ thuộc T
Tumour-necrosis factorYếu tố u bƣớu – hoại tử
cytokine tiền viêm
UDP-N-acetylglucosamine 6dehydrogenase
UDP-N-acetylglucosaminuronic acid Protein tổng hợp Vi PS
4-epimerase
Uridine 5‟-diphosphate
UDP-galactose
UDP-N-acetylgalactosamine
UDP-N-acetylgalactosaminuronic
acid
UDP-glucose
UDP-N-acetylglucosamine
UDP-N-acetylglucosaminuronic acid
United Sate Food and Drug
Administration

viii

Cục quản lý thuốc và
thực phẩm Mỹ

viaA
viaB
vvm
WHO

Volume/volume/minute
World Health Organization

ix

Gen điều hòa tổng hợp
kháng nguyên Vi PS
Gen sinh tổng hợp kháng
nguyên Vi PS
Thể tích/thể tích/phút
Tổ chức y tế thế giới
(TCYTTG)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn ở lứa tuổi 5 – 14 (1999-2003)

7

1.2

Các chủng vi khuẩn có kháng nguyên Vi PS

14

1.3

Hiệu quả bảo vệ của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

28

2.1

Thành phần môi trƣờng sản xuất

39

2.2

Số lƣợng ngƣời lớn và trẻ em đƣợc tiêm vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

45

2.3

Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

49

2.4

Khảo sát oxy hòa tan

50

2.5

Khảo sát tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

60

2.6

Tiêu chuẩn kháng nguyên Vi PS

60

2.7

Tiêu chuẩn vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

61

3.1

Kết quả kiểm tra hình thái vi khuẩn và tính chất nuôi cấy

65

3.2

Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa

67

3.3

Kết quả xác định khả năng ngƣng kết với kháng huyết thanh

69

3.4

Chất lƣợng kháng nguyên Vi PS sản xuất thử nghiệm ở nồi lên men
7 lít

70

3.5

Kết quả nuôi cấy thử nghiệm S. Typhi Ty2 ở nồi lên men 75 lít

70

3.6

Chất lƣợng kháng nguyên Vi PS thu đƣợc từ nuôi cấy ở nồi lên men
75 lít

71

3.7

So sánh kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên Vi PS bởi DAVAC, NIH
và FDA

71

3.8

Kết quả kiểm tra chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS sản xuất từ
nồi lên men 75 lít

72

3.9

Phản ứng phụ sau khi tiêm vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

73

3.10

Biến đổi nồng độ kháng thể và tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm
vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở ngƣời lớn

74

x


Biến đổi nồng độ kháng thể và tỷ lệ đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm
vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở trẻ em

75

3.12

Kết quả khảo sát tỷ lệ giống

76

3.13

Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

78

3.14

Kết quả khảo sát mức độ oxy hòa tan khác nhau

80

3.15

Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy

82

3.16

Giá trị OD trung bình theo thời gian nuôi cấy

84

3.17

Kết quả khảo sát bất hoạt vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi Ty2

84

3.18

Thông số nuôi cấy ở nồi lên men 300 lít đã chọn

87

3.19

Thông số bất hoạt vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi Ty2 đã chọn

88

3.20

Kết quả thu nhận kháng nguyên Vi PS

89

3.21

Kết quả kiểm tra chất lƣợng kháng nguyên Vi PS

90

3.22

Kết quả bất hoạt vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi Ty2

91

3.23

Kết quả kiểm tra chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

92

3.24

So sánh chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS của DAVAC và Sanofi
Aventis

93

3.25

Số lƣợng kháng nguyên Vi PS và sản lƣợng liều vắc xin

94

3.26

Kết quả kiểm tra tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nhiệt
độ 37oC

101

3.27

Kết quả kiểm tra tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nhiệt
độ 17 – 25oC

102

3.28

Kết quả kiểm tra tính ổn định của vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nhiệt
độ 2 – 8oC

102

3.29

So sánh giá thành vắc xin Thƣơng hàn Vi PS trong nƣớc và nhập

ngoại

105

3.11

xi


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Tỷ lệ mắc Thƣơng hàn hàng năm trên thế giới và ở Việt Nam từ
1999 – 2003 (WHO)

5

1.2

Sự phân bố mắc bệnh Thƣơng hàn theo lứa tuổi

6

1.3

Việt Nam trong phân bố toàn cầu về đề kháng kháng sinh của
Salmonella enterica Serotype Typhi từ 1990 đến 2004

8

1.4

Quá trình nhiễm vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi ở ngƣời

9

1.5

Vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi

10

1.6

Các kháng nguyên của vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi

12

1.7

Cấu trúc kháng nguyên O của vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi

12

1.8

Kháng nguyên Vi PS

14

1.9

Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram âm

15

1.10

Liên kết glycoside

16

1.11

Cấu trúc kháng nguyên Vi polysaccharide của vi khuẩn Thƣơng hàn
S . Typhi

17

1.12

Các gen mã hóa độc lực ở S. Typhi (đảo gây bệnh 7 của Salmonella
(SPI-7) và locus viaB ở S. Typhi)

19

1.13

Sinh tổng hợp kháng nguyên Vi PS ở vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi

21

1.14

Kháng nguyên PS không phụ thuộc tế bào T typ 2 (TI-2)

22

1.15

Đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên polysaccharide

23

2.1

Hệ thống nồi lên men 300 lít (Chemap – Thụy Sĩ)

49

2.2

Sơ đồ tách lọc canh khuẩn và cô đặc kháng nguyên Vi PS thô bằng

TFF

52

2.3

Sơ đồ phản ứng tủa giữa Cetavlon và kháng nguyên Vi PS thô

53

2.4

Hệ thống lọc tiếp tuyến TFF – Sartorius (Đức)

54

2.5

Sơ đồ phản ứng tách kháng nguyên Vi PS khỏi tủa Vi PS thô-Cetavlon
bằng NaCl

55

xii


3.1

Vi khuẩn thƣơng hàn S. Typhi Ty2

66

3.2

Khuẩn lạc của vi khuẩn S. Typhi Ty2 trên môi trƣờng thạch TSB

66

3.3

Thử nghiệm đặc tính sinh hóa của chủng S. Typhi Ty2

68

3.4

Halo bao quanh khuẩn lạc của vi khuẩn S. Typhi Ty2 trên thạch TSB –
kháng huyết thanh Vi

69

3.5

Nuôi cấy S. Typhi Ty2 với các tỷ lệ giống khác nhau

77

3.6

Kết quả nuôi cấy S. Typhi Ty2 ở 3 mức oxy hòa tan khác nhau

80

3.7

Mối liên quan giữa pH, đậm độ vi khuẩn và hàm lƣợng Vi PS

83

3.8

Đồ thị biểu diễn tƣơng quan giá trị OD theo thời gian nuôi cấy

85

3.9

So sánh chất lƣợng kháng nguyên Vi PS của DAVAC và Sanofi
Aventis

90

3.10

So sánh hàm lƣợng Vi PS của vắc xin Thƣơng hàn TYViVAC và
TYPHIM Vi

93

3.11

So sánh hàm lƣợng O-acetyl của vắc xin Thƣơng hàn TYViVAC và
TYPHIM Vi

94

3.12

Kết quả tính ổn định của tỷ lệ giống

95

3.13

Kết quả tính ổn định của OD lúc gặt

95

3.14

Kết quả tính ổn định của pH lúc gặt

95

3.15

Kết quả tính ổn định của hàm lƣợng Vi PS thô

96

3.16

Kết quả tính ổn định của hàm lƣợng Vi PS

96

3.17

Kết quả tính ổn định của hàm lƣợng O-acetyl

97

3.18

Kết quả tính ổn định của kích thƣớc Vi PS

97

3.19

Tính ổn định của sản lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS

98

3.20

Vắc xin Thƣơng hàn Vi PS (TYViVAC)

98

3.21

Số lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS đƣợc cung cấp cho Chƣơng trình
Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia

104

xiii


MỞ ĐẦU

1


Thƣơng hàn là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi khuẩn Salmonella enterica
serotype Typhi gây ra. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh Thƣơng hàn ảnh hƣởng
tới sức khỏe cộng đồng với tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết đáng kể ở nhiều quốc gia
đang phát triển, đặc biệt ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, theo số liệu
thống kê, bệnh Thƣơng hàn xảy ra ở một số tỉnh miền núi phía Bắc và phần lớn ở
các tỉnh phía Nam. Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn Thƣơng hàn đề kháng ngay cả
kháng sinh thuộc thế hệ thứ ba nhƣ fluoroquinolones và cephalosporins dẫn đến
việc điều trị và kiểm soát bệnh Thƣơng hàn ngày càng trở nên khó khăn
[32,41,44,64].
Từ những năm 1980, cùng với những tiến bộ trong nghiên cứu cấu trúc
polysaccharide bề mặt của vi khuẩn có vỏ và đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho
B và T đã tạo cơ sở cho việc nghiên cứu polysaccharide làm vắc xin, chống lại các
tác nhân gây bệnh có thành phần polysaccharide vỏ [56,103. Vắc xin Thƣơng hàn
Vi polysaccharide (PS) với một mũi tiêm duy nhất chứa 25 g kháng nguyên Vi PS,
là loại vắc xin chỉ sử dụng kháng nguyên vỏ - polysaccharide của vi khuẩn để tạo

đáp ứng miễn dịch, không chứa toàn bộ tế bào của vi khuẩn và do vậy không tái
sinh sản trong cơ thể nhận. Vắc xin dễ dung nạp, tính an toàn cao và không có phản
ứng phụ nghiêm trọng, cho hiệu quả bảo vệ 64% đến 72% [32,48].
Tại Việt Nam, vắc xin thế hệ cũ nhƣ vắc xin Thƣơng hàn bất hoạt toàn tế bào
cho bảo vệ 51 – 67% nhƣng có tỷ lệ phản ứng phụ cao từ 9 – 34% ở ngƣời nhận và
phải dùng nhiều liều. Vắc xin Thƣơng hàn sống, giảm độc lực Ty21a có hiệu quả
bảo vệ 65% nhƣng khó áp dụng rộng rãi do phải dùng nhiều liều, thiếu kháng
nguyên Vi PS và vi khuẩn có khả năng hồi biến gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng vắc
xin [9,10,48,109].
Việc phát triển vắc xin Thƣơng hàn Vi PS - một vắc xin phòng bệnh Thƣơng
hàn thế hệ mới phù hợp với điều kiện của Việt Nam là cần thiết. Hơn nữa, sử dụng
vắc xin sẽ mang lại lợi ích trong việc bảo vệ sức khỏe cho ngƣời dân đối với bệnh
Thƣơng hàn, làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cũng nhƣ gánh nặng về kinh tế

2


do bệnh Thƣơng hàn gây ra ở những vùng dịch lƣu hành [44,50]. Từ năm 1997, Bộ
Y tế phải nhập vắc xin Thƣơng hàn Vi PS (TYPHIM Vi) của Pháp để cung cấp cho
Chƣơng trình Tiêm chủng Mở rộng Quốc gia. Để đáp ứng nhu cầu sử dụng và giảm
giá thành vắc xin Thƣơng hàn, Công ty Vắc xin Pasteur Đà Lạt – DAVAC (trƣớc
đây là Viện vắc xin cơ sở 2 Đà Lạt thuộc Viện vắc xin và sinh phẩm y tế Nha Trang
– IVAC) tiếp nhận chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS từ
Viện Y tế Quốc gia Mỹ. Từ đó, chúng tôi nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật mới để sản
xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS tại Việt Nam.
Xuất phát từ ý nghĩa và yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất vắc xin Thương hàn Vi
polysaccharide ở Việt Nam”.
Mục tiêu của đề tài:
- Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi polysaccharide bằng phƣơng

pháp lên men đạt tiêu chuẩn chất lƣợng của Dƣợc điển châu Âu và quy định của
TCYTTG.
Nội dung nghiên cứu:
- Sản xuất thử nghiệm vắc xin Thƣơng hàn Vi PS ở nồi lên men 7 lít và 75 lít.
- Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin Thƣơng hàn Vi PS:
+ Xác định các thông số kỹ thuật thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn Thƣơng
hàn Salmonella Typhi Ty2 ở nồi lên men 300 lít: Tốc độ khuấy, tốc độ sục khí,
nhiệt độ, tỷ lệ giống, OD, pH, oxy hòa tan, thời gian gặt.
+ Xác định các thông số bất hoạt thích hợp cho vi khuẩn Thƣơng hàn khi
nuôi cấy ở nồi lên men 300 lít.
+ Đánh giá chất lƣợng vắc xin Thƣơng hàn Vi PS đƣợc sản xuất theo quy
trình sản xuất đã xây dựng.

3


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


1.1. Tình hình dịch tễ bệnh Thƣơng hàn trên thế giới và ở Việt Nam
Theo thống kê của TCYTTG, hàng năm có 21,6 triệu ngƣời mắc và 216.500
ngƣời chết do bệnh Thƣơng hàn ở tất cả lứa tuổi trên toàn cầu, chủ yếu ở các nƣớc
đang phát triển thuộc châu Á, Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ. Trong đó, 75%
số ngƣời mắc Thƣơng hàn ở các nƣớc thuộc châu Á và có 90% trƣờng hợp tử vong,
chủ yếu ở vùng Nam và Đông Nam Á (Hình 1.1) [43,44,110]. Hầu hết tỷ lệ mắc
Thƣơng hàn cao nhất ở lứa tuổi trƣớc khi đến trƣờng và thanh thiếu niên, phổ biến
từ 5 – 19 tuổi [40,86].

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc Thƣơng hàn hàng năm trên thế giới và ở Việt Nam
từ 1999 – 2003 (WHO) [43,44]
Ở các nƣớc châu Á, theo số liệu của chƣơng trình DOMI dƣới sự tài trợ của
“Quỹ Bill & Melinda Gates” tại 5 nƣớc Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Inđonesia,

5


Pakistan tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn từ 180 trƣờng hợp/100.000 dân đến 494 trƣờng
hợp/100.000 dân ở lứa tuổi 5 – 15 [44,71]. Ở lứa tuổi 1 đến 5 và ngƣời trung niên
có tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn nhất định và trẻ dƣới 1 tuổi thì thƣờng có triệu chứng
lâm sàng nghiêm trọng hơn (Hình 1.2) [64,81].

Hình 1.2. Sự phân bố mắc bệnh Thƣơng hàn theo lứa tuổi [41]
Ở Việt Nam, bệnh Thƣơng hàn thƣờng gặp ở các tỉnh phía Nam đặc biệt là ở
khu vực đồng bằng sông Cửu Long nhƣ Sóc Trăng, Đồng Tháp, An Giang, Kiên
Giang và ở một số tỉnh ở miền núi phía Bắc nhƣ Sơn La, Lai Châu, Điện Biên. Việt
Nam thuộc khu vực có tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn 100/100.000 dân (Hình 1.1 và
Bảng 1.1). Từ những năm 90, bệnh dịch có chiều hƣớng gia tăng thành ổ dịch lan
rộng toàn quốc, đặc biệt ở các tỉnh phía Nam tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn năm 1990
là 4.859 trƣờng hợp và đến năm 1995 là 30.901 trƣờng hợp (tăng 6 lần), với lứa tuổi
mắc bệnh Thƣơng hàn chủ yếu từ 5 đến 9 tuổi [38,64]. Theo số liệu thống kê từ
1999 – 2003, tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn ở lứa tuổi từ 5 – 14 ở 7 tỉnh với tỷ lệ mắc
cao  100 trƣờng hợp/100.000 dân và 23 tỉnh có tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn trung
bình là 10 – 100 trƣờng hợp/100.000 dân (Hình 1.2 và Bảng 1.1) [43,73].

6


Bảng 1.1. Tỷ lệ mắc bệnh Thƣơng hàn ở lứa tuổi 5 – 14 (1999-2003) [33]

Các tỉnh có tỷ lệ mắc trung bình hàng năm 100 trƣờng hợp Số lƣợng mắc
(trƣờng hợp)
/100000 dân ở lứa tuổi 5 – 14 (1999-2003)
Lai Châu

496

Sóc Trăng

288

Đồng Tháp

179

An Giang

163

Sơn La

136

Ninh Thuận

122

Kiên Giang

116

Trong khi đó, các chủng Thƣơng hàn đề kháng đa kháng sinh ngay cả kháng
sinh thuộc thế hệ thứ ba nhƣ các fluoroquinolone và cephalosporin, điều này đã làm
giảm sự nhạy cảm khi dùng kháng sinh trong điều trị bệnh Thƣơng hàn [32,41,101].
Ở Việt Nam, khoảng 89% đến 93% chủng Thƣơng hàn đề kháng với kháng
sinh thế hệ thứ nhất nhƣ chloramphenicol, trimethoprim, ampicillin và tetracycline,
4% chủng đề kháng với acid nalidixic (1 quinolone). Hơn 80% chủng Thƣơng hàn
phân lập từ các vụ dịch ở đồng bằng sông Cửu Long đề kháng với ampicillin,
chloramphenicol, nalidixic hoặc ciprofloxacin. Năm 1995, hơn 90% chủng phân lập
từ máu đề kháng kháng sinh và những chủng này ngày càng trở nên độc hơn (Hình
1.3) [32,51,73].
Bên cạnh đó, trẻ em chiếm gần một nửa tổng số các trƣờng hợp bị đa kháng
thuốc, dễ bị sốt Thƣơng hàn và đa số bị các biến chứng. Do sự đề kháng với kháng
sinh phổ biến nên việc tiêm chủng là lựa chọn duy nhất và khả thi để phòng bệnh và
kiểm soát bệnh Thƣơng hàn [32].

7


Hình 1.3. Việt Nam trong phân bố toàn cầu về đề kháng kháng sinh của
Salmonella enterica Serotype Typhi từ 1990 đến 2004 [32,73]
1.2. Bệnh thƣơng hàn
Thƣơng hàn là bệnh nhiễm trùng máu và sốt cấp tính do vi khuẩn Salmonella
enterica typ huyết thanh Typhi (S. Typhi) gây nên. Bệnh lây truyền qua đƣờng phân
– miệng khi nƣớc bị ô nhiễm hoặc thực phẩm bị nhiễm chất thải của con ngƣời cùng
với vệ sinh kém. Con ngƣời là ổ chứa và vật chủ của vi khuẩn Thƣơng hàn. Tính
độc của nó liên quan đến kháng nguyên vỏ Vi PS – một yếu tố quan trọng trong
suốt quá trình nhiễm bệnh Thƣơng hàn [22,47,50].
Vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi xâm nhập vào cơ thể theo đƣờng tiêu hóa qua
thức ăn và nƣớc uống bị nhiễm. Trong vòng 1 hoặc 2 tuần đầu tiên chƣa có triệu

chứng. Giai đoạn đầu, phần lớn vi khuẩn bị tiêu diệt bởi môi trƣờng axit của dịch vị
dạ dày ( 1,5). Những vi khuẩn sống sót xuống ruột non, xâm nhập tế bào M (tế
bào biểu mô chuyên biệt), tế bào ruột qua mảng Peyer, tế bào có tua tại bề mặt niêm

8


mạc ruột, hạch bạch huyết mạc treo ruột (MLNs) và máu đến tế bào lƣới nội mô của
gan, lách, tủy xƣơng và túi mật. Vi khuẩn tồn tại và nhân lên ở đây rồi lan tỏa, gây
nhiễm trùng toàn thân (số lƣợng vi khuẩn đủ để gây bệnh là từ 105 đến 107)
[4,5,26,34,69].

Hình 1.4. Quá trình nhiễm vi khuẩn Thƣơng hàn S. Typhi ở ngƣời [69]
Sau khi gây nhiễm, vi khuẩn định vị ở những bạch cầu bị viêm và mạc treo
ruột. Vi khuẩn theo đƣờng gan, mật tiếp tục xâm nhập ruột non, nhân lên ở các
mảng Peyer. Từ máu, vi khuẩn tới lách và các cơ quan khác để sinh trƣởng và phát
tán vào những tế bào không nhiễm, tạo thƣơng tổn mới. Tại ruột, vi khuẩn chết và
giải phóng nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây hoại tử,
thủng ruột, tổn thƣơng mảng Peyer và theo máu kích thích trung tâm thần kinh thực
vật ở não thất ba gây phát bệnh toàn thân. Bệnh Thƣơng hàn gây nhiễm trùng máu
cùng với sốt và nhiều biến chứng dẫn đến tử vong với tỷ lệ 7 – 14% (Hình 1.4)
[4,5,26,34,69].
1.3. Vi khuẩn Thƣơng hàn
Vi khuẩn Thƣơng hàn thuộc họ đƣờng ruột Enterobacteriaceae,

9