Bài giảng các kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật

Các kỹ thuật chuyển gen vào
tế bào động vật

1


Nội dung bài học








Mở đầu
Các phương pháp chuyển gen không sử
dụng virus
Các phương pháp chuyển gen sử dụng
virus
Ứng dụng
Kết luận

2


Mở đầu


Dự án giải mã bộ gen Người (Human
Genome Project, 1990 – 2003)




Hiểu biết rõ ràng hơn về bộ gen Người
Cải tiến về các phương pháp chuẩn đoán,
điều trị trên từng cá thể

 Liệu

pháp gen

3


Mở đầu




Liệu pháp gen là việc áp dụng các
nguyên lí di truyền trong điều trị bệnh lí
trên người
Liệu pháp gen = chuyển vật liệu di
truyền vào tế bào với các mục tiêu





Thay thế cho các gen mất chức năng

Ức chế sự biểu hiện của gen bệnh
Tiêu diệt tế bào bệnh bằng gen tự sát
…

4


Mở đầu

Mô hình liệu pháp gen
5


Mở đầu


Chiến lược chuyển gen



In vivo
Ex vivo

6


Mở đầu


Các phương pháp chuyển gen




Phương pháp chuyển gen sử dụng virus
Phương pháp chuyển gen không sử dụng virus



Phương pháp hóa học
Phương pháp vật lí

7


Phương pháp


Chuyển gen bằng virus





Khả năng xâm nhiễm đa dạng và chuyên biệt
Gắn chèn gen mục tiêu vào bộ gen của tế bào
chủ  biểu hiện ổn định protein mục tiêu
Retrovirus, Herpesvirus, Adenovirus, Lentivirus,
…

8

Phương pháp


Quá trình sao chép của virus

9


Chuyển gen sử dụng virus


Chiến lược sử dụng vector virus


Giai đoạn 1: tạo vector virus
Tín hiệu đóng gói Gen mục tiêu
Vector DNA
Helper DNA

Virus hoang dại

Gen cần thiết của virus
Protein virus

Tế bào đóng gói
Protein virus

Vector retrovirus

10


Chuyển gen sử dụng virus


Giai đoạn 2: quá trình xâm nhiễm
Vector trần

vector
Vector tồn
tại trong
nhân
Tế bào mục tiêu

Vector gắn
chèn vào
NST
mRNA và
Protein trị liệu
11


Chuyển gen sử dụng virus



Retrovirus
Cấu tạo


Vỏ




Thụ thể Glycoprotein

Lõi




Protein lõi
Vật liệu di truyền
Các enzym

12


Chuyển gen sử dụng virus


Retrovirus

13


Chuyển gen sử dụng virus


Retrovirus


Ưu điểm







Gắn chèn gen mục tiêu vào NST của tế bào quan tâm
 biểu hiện gen mục tiêu ổn định
Ít nhạy cảm với hệ miễn dịch
Sử dụng đối với các dòng tế bào phân chia mạnh

Khuyết điểm





Gắn chèn gen mục tiêu một cách ngẫu nhiên
Không có khả năng chuyển nhiễm lên các dòng tế bào
không phân chia
Sự biểu hiện bắt đầu giảm đi sau một thời gian biểu
hiện ổn định
14

Chuyển gen sử dụng virus

15


Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp hóa học






Calcium Phosphate
DEAE dextran
Liposome

Phương pháp vật lí



Điện biến nạp
Súng bắn gen

16

Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp hóa học









Sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965 (DEAEdextran)
Giúp cho DNA dễ dàng bám và di chuyển
qua màng tế bào, màng nhân.
Hiệu quả thấp hơn so với các phương pháp
chuyển gen sử dụng virus
Yêu cầu nghiêm ngặt về hóa chất sử dụng
Không liên quan đến các vấn đề về an toàn
sinh học

17


Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp Calcium Phosphate








Tạo tủa từ phức hợp DNA/CaCl2 và đệm HBS
2X (Hepes buffer saline)
Tủa có chứa DNA sẽ được gắn lên bề mặt tế
bào quan tâm
DNA sẽ di chuyển vào bên trong tế bào
thông qua cơ chế thực bào (endocytosis)
Tủa CaPO4: ngăn chặn sự ảnh hưởng của
nuclease

18


Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp Calcium Phosphate

19


Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp DEAE-dextran








Phức hợp DNA/DEAE-dextran được tạo ra
dưới tác dụng của lực tĩnh điện
DEAE-dextran có điện tích +, gắn kết DNA
(-) và màng tế bào (-)
Hiệu quả cao hơn Calcium phosphate, nhưng
DEAE-dextran độc với tế bào, dễ làm chết tế
bào sau biến nạp
Thực hiện biến nạp không sử dụng huyết
thanh

20


Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp DEAE-dextran

21

Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp Cationic lipid (Liposome)




Một trong những phương pháp không sử
dụng virus khá hiệu quả
Khi cho Cationic lipid vào DNA








Tập hợp DNA (điện tích)
Hình thành phức hợp 2 lớp nhiều tầng DNA/cationic
lipid

Dễ dàng thấm qua màng tế bào hoặc di
chuyển thông qua quá trình thực bào
Một số loại cationic lipid độc với tế bào
Một số sản phẩm thương mại: Lipofectamine
(Invitrogen), Fugene (Roche, Promega)
22

Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp Cationic lipid (Liposome)

23


Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp vật lý






Thường sử dụng khi các phương pháp chuyển
gen bằng hóa học kém hiệu quả
Không phụ thuộc vào loại tế bào
Không có giới hạn về kích cỡ DNA chuyển
Yêu cầu có các dụng cụ chuyên biệt (Súng
bắn gen, Máy điện biến nạp, Hệ thống vi
thao tác, …)

24

Chuyển gen không sử dụng virus


Phương pháp điện biến nạp








Sử dụng dòng điện  tạo một điện trường
tác động lên màng tế bào trong thời gian cực
ngắn (us – ms)
Xuất hiện các lổ (pore) trên màng tế bào 
vector dễ dàng di chuyển xuyên qua màng tế
bào
Thông số điện biến nạp giữa các dòng tế bào
rất khác nhau
Thường gây chết tế bào !!!

25