Kỹ thuật cấy nuôi cấy tế bào động vật

LOGO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
********&********
KỸ THUẬT CƠ BẢN
TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
GVHD : TS. Nguyễn Hữu Đức
Nhóm III

STT MSSV Họ và tên
1 533314 Lê Văn Vẻ
2 533272 Vũ Thị Huế
3 533253 Sa Thu Giang
4 533317 Lê Thị Xuân
5 533278 Vũ Thị Hường
6 533289 Hoàng Văn Phúc
7 533292 Phạm Thị Sang
8 533296 Đoàn Hữu Thanh
Hà Nội - 3/2011
1
NỘI DUNG
2
I
I
MỞ ĐẦU
II
NỘI DUNG
1.
2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO

5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO
6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN
KẾT LUẬN
III
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN
I - MỞ ĐẦU

Những năm gần đây, công nghệ tế bào động vật đã đạt được
những bước tiến mạnh mẽ. Nuôi cấy tế bào động vật là một
lĩnh vực quan trọng trong công nghệ tế bào động vật.

Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật: mô hình thử nghiệm
và chuẩn đoán bệnh, sản xuất các hợp chất sinh học, làm vật
liệu cấy ghép, tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy…

Trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro, chìa khóa để thành
công là cần phải nắm vững một số các kỹ thuật cơ bản như:
cấy chuyển, đông lạnh, giải đông, đếm số lượng tế bào…
3
II - NỘI DUNG
1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN
2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO
5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO
6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN
4
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

Cấy chuyển tế bào lớp đơn là kỹ

thuật chọn lọc và tách các tế bào
dạng lớp đơn từ kết quả nuôi cấy
sơ cấp, chuyển sang nuôi cấy các
loại tế bào khác nhau.

Trong dụng cụ nuôi cấy có môi
trường dinh dưỡng thích hợp

5
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

Chu kỳ sinh trưởng của tế bào
động vật gồm 4 pha:

Pha tiềm sinh (lag phase)

Pha số mũ ( Log phase)

Pha tuyến tính (Stationary phase)

Pha suy thoái (Death phase)
6
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

Giai đoạn cấy chuyển vào gần cuối pha log
7
Vật liệu

Các bình nuôi cấy tế bào sơ cấp


HBSS không có Ca
2+
và Mg
2+
, 37 ° C

Dung dịch Trypsin/EDTA, 37° C

Môi trường được bổ sung huyết thanh
Vd: DMEM với 10% - 15% (V/ V)

FBS (Đầy đủ DMEM-10 hay-15), 37° C

Pipet, đầu côn vô trùng

Khay ấm 37°C hoặc máy ủ

Bình nuôi cấy 25cm
2
hoặc đĩa petri
8
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN
Các bước thực hiện

Hút bỏ môi trường cũ

Rửa và tách các tế bào

Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang môi trường mới

9
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

Hút bỏ môi trường cũ
- Loại bỏ tất cả các môi trường
từ nuôi cấy sơ cấp với một ống
pipet vô trùng.
- Nếu các tế bào bám chặt có thể
đổ bỏ môi trường.
- Nếu nhiều tế bào nổi hay bám
yếu, nên lắc nhẹ và rửa.
10
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

Rửa và tách các tế bào
- Rửa lớp đơn tế bào bám dính một hoặc hai lần với một
lượng nhỏ HBSS ở 37°C không có Ca2+ và Mg2+
- Tách các tế bào: Sử dụng trypsin / EDTA ở 37°C


11
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN
Trypsin là một serine protease
tìm thấy trong hệ tiêu hóa của
nhiều động vật có xương sống,
có vai trò thủy phân các protein.
Môi trường hoạt động
pH: 6-9 (tối ưu ở pH 8-9)
12
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN


Rửa và tách các tế bào
- Đặt đĩa trên một khay ấm 37°C từ 1-2 phút.
- Gõ nhẹ đáy đĩa trên mặt bàn để tách các tế bào.
- Kiểm tra quá trình nuôi cấy bằng kính hiển vi hồng ngoại.
- Thêm huyết thanh hoặc môi trường có chứa huyết thanh để ức
chế trypsin.
13

Chọn các tế bào thích hợp chuyển sang
môi trường mới
- Thêm một lượng bằng nhau dung dịch huyền phù tế bào cho
các đĩa hoặc bình nuôi cấy đã được dán nhãn thích hợp.
- Thêm 4 ml môi trường mới vào, bảo quản trong tủ nuôi cấy
điều kiện 37
0
C, CO
2
5%.
- Cung cấp dinh dưỡng cho các mảng nhỏ nuôi cấy
(subconfluent cultures) sau 3 hoặc 4 ngày bằng cách loại bỏ
môi trường cũ và thay môi trường mới, 37
0
C.
- Chuyển qua lần nuôi cấy tiếp theo khi môi trường nghèo chất
dinh dưỡng
14
CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN
NỘI DUNG
1. CẤY CHUYỂN TẾ BÀO LỚP ĐƠN

2. CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
3. ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
4. GIẢI ĐÔNG TẾ BÀO
5. XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG TẾ BÀO
6. CHUẨN BỊ TẾ BÀO CHO VẬN CHUYỂN
15
CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY HUYỀN
PHÙ TẾ BÀO

Nuôi cấy huyền phù tế bào là
phương thức nuôi cấy các tế
bào trong môi trường lỏng
trong bình nuôi có dung tích
phù hợp và lắc nhẹ nhàng.

Cấy chuyển các dung dịch
huyền phù ít phức tap hơn cấy
chuyển nuôi cấy lớp đơn do
không cần thiết phải tách
chúng bằng enzyme trước khi
khi cấy chuyển.
16
CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY
HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
VẬT LIỆU

Các bình nuôi cấy chứa dung dịch
huyền phù tế bào

Bình Shaker mà không có vách ngăn

hoặc bình spinner

Môi trường sinh trưởng hoàn
chỉnh,được làm ấm tới 37
0
C

Tủ ủ 37
0
C với nồng độ CO
2
5%

Máy khuấy từ, giá đựng bình

Hóa chất và trang thiết bị để xác định
kết quả và đếm tổng số tế bào.
17
CẤY CHUYỂN TRONG NUÔI CẤY
HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
CÁC BƯỚC THỰC HIỆN

Cung cấp dinh dưỡng cho tế bào 2-3 ngày cho đến khi các tế
bào nuôi cấy kết tụ.

Lấy nhẹ nhàng dung dịch huyền phù từ buồng ủ, tránh làm
phân tán các tế bào đã ổn định ở đáy bình.

Loại bỏ khoảng 1/3 môi trường từ bình và thay thế bằng
môi trường đã được làm ấm 37

0
C với cùng một lượng thể
tích. Nếu các tế bào sinh trưởng nhanh chóng, thêm vào bình
10% môi trường để duy trì mật độ 1 × 10
6
tế bào /ml. Nhẹ
nhàng lắc bình để làm phân tán các tế bào.

Đặt bình vào buồng ủ:
Vmt <15ml: đặt bình nằm ngang
Vmt ≥15ml: đặt bình đứng.
18