BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẶNG THỊ TÙNG LOAN

BÁO CÁO TIỂU LUẬN TỔNG QUAN
VÀ ĐỀ CƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Sinh lí học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62420104
Khóa học năm: 2013
Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Trương Đình Kiệt

Tp. HCM, năm 2015
1


2


Phần 1: Tiểu luận tổng quan
Đái tháo đường là bệnh do sự tổn thương hay suy giảm chức năng của tế bào
tụy đảo và sản phẩm của nó (insulin), biểu hiện bởi nồng độ đường trong máu cao.
Bệnh có lượng bệnh nhân gia tăng rất nhanh trong thời gian gần đây, cả ở Việt Nam
và trên thế giới. Hơn nữa, đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm như
suy thận, xuất huyết võng mạc, đục thủy tinh thể, mù lòa, bệnh cơ tim, bệnh thần
kinh, bệnh động mạch vành, bệnh mạch ngoại vi, … (Harris et al., 2009). Theo Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) và Liên đoàn đái tháo đường thế giới (IDF), Việt Nam là
một trong những nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới
(khoảng 8 - 10%/năm); vì vậy, đái tháo đường được đánh giá ngang với bệnh dịch.
Năm 2012, theo công bố của Bệnh viện nội tiết Trung ương, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo

đường là 5,7% và số bệnh nhân có khả năng sẽ tăng gấp đôi vào năm 2020 (Hội Nội
tiết và Đái tháo đường Việt Nam).
Trên thế giới, các nghiên cứu về đái tháo đường đã được thực hiện từ những
năm cuối thế kỉ 19 và nghiên cứu điều trị đã có từ những năm đầu thế kỉ 20. Tuy
nhiên, cho đến nay, các nhà khoa học vẫn tiếp tục công cuộc nghiên cứu nhằm
hướng đến một phương pháp điều trị hiệu quả lâu dài. Các phương pháp điều trị
hiện nay đều có những hạn chế như: (1) tiêm insulin : phụ thuộc lâu dài, tốn kém,
khó điều chỉnh lượng insulin ngoại sinh phù hợp với từng thể trạng, tình trạng
kháng insulin khi sử dụng trong thời gian dài; (2) ghép tụy, ghép đảo tụy, ghép tế
bào đảo tụy: nguồn mô, tế bào hiến tặng không sẵn có và khan hiếm, sự thải ghép;
khả năng duy trì và phát triển của mô ghép không cao. Vì vậy, phương pháp điều trị
đái tháo đường không phụ thuộc insulin và nguồn mô hiến tặng có ý nghĩa rất lớn,
cả về khoa học và ứng dụng thực tiễn.
Hiện nay, liệu pháp tế bào gốc đóng vai trò chủ lực cho y học tái tạo và phục
hồi. Liệu pháp này sử dụng các tế bào gốc và tế bào tiền thân như một công cụ hiệu
quả trong việc ngăn ngừa, điều trị bệnh hay sửa chữa, thay thế các cơ quan bị hư
hại. Kết quả của các nghiên cứu trên thế giới cho thấy triển vọng của việc ứng dụng
liệu pháp tế bào gốc trong điều trị thành công đái tháo đường từ cận lâm sàng cho
đến lâm sàng (Voltarelli et al., 2007; Xiao et al., 2008; Dong et al., 2008; Zhu et al.,
2009; Ito et al., 2010; Chandra et al., 2011; Iskovich et al., 2012; Karaoz et al.,
2013); theo đó, liệu pháp tế bào gốc thể hiện sự khả dụng đặc biệt đối với bệnh đái
3


tháo đường type 1. Tuy nhiên, việc điều trị bằng liệu pháp này vẫn còn tồn tại nhiều
vấn đề chưa được làm rõ nên việc tiếp tục đầu tư nghiên cứu cải thiện những hạn
chế, phát huy những thành tựu của những nghiên cứu trước là rất cần thiết, hướng
đến việc tối ưu hóa phương pháp điều trị, từ đó có thể ứng dụng trên người.
Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, luận án tập trung vào nghiên cứu điều
trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế bào gốc, sử dụng tế

bào gốc từ mô mỡ và phương pháp ghép thay thế tế bào.
Tình hình nghiên cứu trong nước
Các nước Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, có tốc độ mắc hàng năm tăng
cao (9.2%) cùng với các biến chứng nguy hiểm, bệnh đái tháo đường thu hút sự
quan tâm của cộng đồng xã hội và giới y – khoa học. Các y, bác sĩ và nhà nghiên
cứu Việt Nam đã có những nỗ lực nhằm điều trị hiệu quả, an toàn. Tuy nhiên, cho
đến nay, các nghiên cứu về điều trị đái tháo đường ở nước ta chủ yếu là các nghiên
cứu điều trị hoặc hỗ trợ điều trị đái tháo đường bằng dược chất tự nhiên hoặc tổng
hợp như: thực phẩm chức năng, tác dụng của nụ vối (Trương Tuyết Mai et al., 2010,
2013), metformin (Nguyễn Thiện Hải, 2012), polyphenol từ trà xanh (Nguyễn Thị
Hà et al., 2005), mướp đắng (Đoàn Thị Nhu et al., 2004), nấm dược liệu (Nguyễn
Thị Chính et al., 2011) …(Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia). Các
nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc khảo sát đường huyết và một số chỉ tiêu
sinh hóa máu như chuyển hóa lipid, chống oxi hóa. Ngoài ra, một số nghiên cứu về
sản xuất insulin tái tổng hợp đã được tiến hành ở Việt Nam nhằm hướng đến có thể
tự sản xuất và cung cấp insulin cho người dân Việt Nam với giá thành phù hợp với
điều kiện kinh tế của phần đông người dân. Tiêu biểu là nghiên cứu của tiến sĩ Lê
Văn Phủng và cộng sự (2010); hay nghiên cứu của phó giáo sư Phạm Thành Hổ và
các đồng nghiệp ở trường Đại học Khoa học Tự nhiên (2010). Tuy nhiên, các
phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị này chỉ mang tính chất điều trị triệu chứng
(đường huyết cao) và không mang lại hiệu quả tốt và lâu dài như ghép tạng. Vì
nguồn tạng rất ít nên một hướng tiếp cận mới được các nhà nghiên cứu cập nhật
trong điều trị đái tháo đường là liệu pháp thay thế tế bào, đặc biệt là tế bào gốc.
Ở Việt Nam, hiện nay, các nghiên cứu về tế bào gốc đã có nhiều bước tiến
quan trọng. Cụ thể, trong 5 năm gần đây, nghiên cứu về tế bào gốc gặt hái được
nhiều thành tựu ở nhiều đơn vị như Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế
4


bào gốc, Đại học Y – Dược TP HCM, Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện

108, Bệnh viện Bạch Mai. Một số nghiên cứu đã được đánh giá theo kịp trình độ
của thế giới (Phuc et al., 2011, Ngoc et al., 2011; Toai et al., 2010…). Bên cạnh đó,
từ năm 1997 đến nay, việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc cũng đã mang lại các kết
quả khả quan trong điều trị một số bệnh như: ghép tế bào gốc điều trị bệnh ung thư
máu (Bệnh viện Truyền máu - Huyết học, 2004), ghép thành công tế bào gốc tự
thân điều trị bệnh xương (Bệnh viện 108, 2010), ghép tế bào gốc điều trị bệnh động
mạch vành (Viện Tim mạch, 2011), ghép tế bào gốc điều trị bệnh nhồi máu cơ tim,
hỗ trợ điều trị ung thư và điều trị bệnh về thị giác (Đại học Y Hà Nội, 2007) …
Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc được thành lập vào năm
2007, là một trong những đơn vị nghiên cứu chuyên môn về tế bào gốc đầu tiên của
nước ta. Từ khi thành lập đến nay, đơn vị này đã đạt được những thành tựu như: tạo
vật liệu sinh học điều trị tổn thương mất da, trị bỏng (Trần Lê Bảo Hà et al., 2009);
ghép tế bào gốc chữa bệnh mắt (Phan Kim Ngoc et al., 2011); biệt hóa tế bào gốc
trung mô máu cuống rốn thành tế bào tiết insulin (Phạm Văn Phúc et al, 2011);
nâng cao hiệu quả điều trị đái tháo đường bằng ghép tế bào tiết insulin được cô lập
miễn dịch (Phan Kim Ngọc et al., 2011), điều trị tổn thương sụn khớp bằng ghép
SVF (stromal vascular fraction) từ mô mỡ (Phạm Văn Phúc et al., 2013), … Các
thành tựu này là tiền đề cho một nghiên cứu về điều trị đái tháo đường bằng liệu
pháp tế bào gốc ở Việt Nam.
Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Liệu pháp thay thế tế bào gốc trong điều trị đái tháo đường hướng đến việc
tạo mới, bổ sung những tế bào beta hay tế bào tiết insulin cho cơ thể. Ghép tế bào
gốc khắc phục được những hạn chế của phương pháp ghép mô/tế bào tiểu đảo trước
đây như: (i) không phụ thuộc nguồn mô/tế bào hiến tặng, (ii) có thể có số lượng lớn
đủ để ghép hiệu quả, điều này thật sự quan trọng trong trường hợp đái tháo đường
type 1, khi mà lượng tế bào ghép phải nhiều và sự phát triển của tế bào beta phải
nhanh hơn sự phá hủy của hệ thống miễn dịch (Moorefield, 2012).
Nhiều loại tế bào gốc có thể được sử dụng để biệt hóa thành tế bào tiết
insulin (Insulin producing cell_IPC) và có thể sử dụng cho liệu pháp thay thế tế bào.
Cấy ghép tế bào gốc/ IPCs để điều trị tiểu đường đã được kiểm tra trong những năm

5


gần đây sử dụng mô hình chuột và người. Nhiều loại tế bào gốc khác nhau đã được
kiểm tra với nhiều phương pháp khác nhau.
a. Tế bào gốc trung mô
Việc cấy ghép tế bào gốc từ tủy xương hoặc máu cuống rốn giúp cải thiện
đáng cải tình trạng của các con chuột đái tháo đường (Dong et al., 2008; Li et al.,
2010; Jurewicz et al., 2010; Ho et al., 2012; Iskovich et al., 2012). Trong khi một
phần nhỏ (1-3%) các tế bào ghép có khả năng tiết insulin, thì vấn đề quan trọng hơn
được các nhà khoa học quan tâm trên các con chuột được cấy tế bào gốc đó là khả
năng kích thích các sự tăng sinh tế bào β của cơ thể chủ. Điều này được cho là lí do
chính giúp phục hồi nhanh chóng số lượng tế bào β và cải thiện tình trạng bệnh
(Hess et al. 2003).
Các tế bào tiền thân từ mô mỡ được nghiên cứu từ những năm đầu 1990
(Kirkland, 1993) nhưng cho đến đầu 2000, các tế bào gốc từ mô mỡ mới được phân
lập và định danh (Gimble, 2003). Gần 10 năm sau đó, nguồn tế bào gốc này được
sử dụng nhiều và phổ biến do chúng có khả năng điều biến miễn dịch
(immunomodulatory) cao hơn cả tế bào gốc tủy xương (Melief et al., 2013). Việc
điều trị đái tháo đường bằng tế bào gốc trung mô từ mô mỡ được thực hiện ở nhiều
nghiên cứu và cho kết quả khả quan khi nhu cầu insulin giảm, đường huyết giảm và
ổn định trong nhiều tháng (Trivedi et al., 2008; Cramer et al., 2010; Yang et al.,
2010; Bassi, 2012; Li et al. 2012; Dave et al., 2013). Nghiên cứu gần đây còn chỉ ra
rằng các tế bào gốc mô mỡ có khả năng cận tiết để bảo vệ chống lại sự tăng đường
huyết do Streptozotocin (Kono et al., 2014).
b. Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem cell_ESC)
Tế bào gốc phôi là tế bào gốc toàn năng. Chúng có thể biệt hóa thành tất cả
các tế bào có chức năng từ 3 lớp mầm, các lớp này cũng tạo nên các tế bào beta
hoặc tế bào tiết insulin. Nhiều nghiên cứu đã biệt hóa ESC thành IPC bằng cách mô

phỏng con đường tín hiệu của sự phát triển tụy ở giai đoạn phôi (D’Amour et al.,
2006, Jiang et al., 2007). Quá trình biệt hóa nhiều giai đoạn có bổ sung các yếu tố
tăng trưởng và các phân tử nhỏ tái hiện lại các giai đoạn biệt hóa tế bào beta như sự
hình thành nội mô, biệt hóa thành tụy và phát triển chức năng nội tiết, cuối cùng là
sự trưởng thành của tế bào beta. Mặc dù cơ chế biến dưỡng glucose có thể kiểm
soát, nhưng hiệu quả biệt hóa thành công ESC thành tế bào β khá thấp (khoảng
6


10%) và khả năng hình thành khối của ESC khá cao. Bên cạnh đó, việc sử dụng
ESC gặp rất nhiều khó khăn vì tính nhạy cảm xã hội có liên quan đến y đức và đạo
lí sinh học; do vậy các nhà nghiên cứu còn quan ngại khi đưa ESC vào ứng dụng
lâm sàng.
c. Tế bào gốc đa tiềm năng do cảm ứng (Induced pluripotent stem cell_IPSC)
Bước tiến quan trọng trong lĩnh vực tế bào gốc là sự phát triển của dòng tế
bào đa tiềm năng được tạo ra từ nguyên bào sợi da. IPSC có đặc điểm giống ESC và
vì vậy, IPSCs có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác nhau như tế bào thần
kinh (Dimos et al., 2008; Chambers et al., 2008), tế bào cơ tim (Zhang et al., 2009)
và tế bào tiết insulin (Tateishi et al., 2008; Zhang et al., 2009). Đồng thời, tương tự
ESC, IPSC cũng có khả năng sinh ung thư. Vì vậy, việc ứng dụng IPSC vẫn còn
phải được nghiên cứu kĩ càng.
d. Cấy ghép IPC biệt hóa từ tế bào gốc trung mô từ tủy xương và mô mỡ
Tế bào gốc trung mô đã biệt hoá thành công in vitro thành tế bào tiết insulin
và có thể làm giảm đường huyết ở động vật và người sau khi cấy ghép (Chandra et
al., 2011). Tương tự như việc cấy ghép tế bào gốc, các IPC được nghiên cứu với
nhiều phương pháp ghép vào mô hình chuột ví dụ: tĩnh mạch cửa, trong màng bụng,
gan, tĩnh mạch đuôi và vỏ thận.
Các IPC biệt hóa từ MSC thu nhận từ tủy xương đã được dị ghép cùng loài
vào tĩnh mạch cửa của chuột cống để điều trị cho các con chuột rat bị đái tháo
đường. Sau khi ghép, các IPC có thể di cư vào gan, biểu hiện các hormone của tiểu

đảo và hàm lượng glucose thấp trong các con chuột rat bị đái tháo đường vào các
ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 (Wu et al., 2007). Gần đây, tế bào gốc trung mô tủy
xương được thu nhận từ bệnh nhân đái tháo đường type 2 và được biệt hóa thành
IPCs, sau đó các IPCs được ghép vào vỏ thận của chuột nude mắc đái tháo đường.
Kết quả bệnh được kiểm soát trong 3 tháng và kiểm tra huyết thanh của chuột phát
hiện có insulin và C-peptide người và lượng nhỏ insulin chuột (Gabr et al., 2012).
Nghiên cứu của Tsai và cộng sự (2013) cũng cho kết quả tương tự.
IPCs còn được biệt hóa từ MSCs thu nhận từ mô mỡ. Các tế bào sau biệt hóa
biểu hiện các đặc điểm của lớp nội mô (Hnf3β, TCF2 và Sox17) và đặc điểm của tế
bào tụy (PDX1, Ngn3, NeuroD, Pax4) và có thể tiết insulin. Các tế bào sau biệt hóa
được ghép vào chuột đái tháo đường cho kết quả đường huyết được giữ ở mức gần
7


bình thường trong 3-4 tuần. Đồng thời, trong máu chuột phát hiện có insulin có
nguồn gốc từ tế bào người được ghép vào (Chandra et al., 2011). Nghiên cứu của
Zhang và cộng sự (2011) cho rằng việc ghép tế bào IPC có nguồn gốc từ MSC mô
mỡ và kết hợp với việc blocking con đường truyền tín hiện Fas và TNF sẽ giúp duy
trì sự tồn tại của tế bào ghép trong thời gian dài.
Hiệu quả điều trị đái tháo đường được ghi nhận tốt hơn khi đồng ghép tế bào
gốc trung mô với tiểu đảo hay các cụm tế bào giống tiểu đảo được biệt hóa từ tế bào
gốc trung mô (Figliuzzi et al., 2009; Ito et al., 2010; Rackham et al., 2011; Okcu et
al., 2013).

8


Phần 2: Đề cương luận án
1. Tên đề tài luận án
“Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế

bào gốc”
2. Mục đích nghiên cứu
 Tối ưu hóa xây dựng mô hình chuột đái tháo đường type 1 ;
 Xây dựng thành công quy trình phân lập, biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô
mỡ thành tế bào tiết insulin ;
 Đánh giá được tính an toàn và khả năng di cư của tế bào ghép ;
 Xây dựng thành công quy trình điều trị bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu
pháp tế bào gốc từ mô mỡ trên mô hình động vật thực nghiệm ;
3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Chuột được sử dụng để xây dựng mô hình bệnh đái tháo đường type 1 và
các thí nghiệm liên quan. Chuột được cung cấp và đạt các tiêu chuẩn của Viện
Pasteur Tp. HCM dành cho động vật thí nghiệm. Các thao tác trên động vật thí
nghiệm phù hợp với các quy định, hướng dẫn của Phòng thí nghiệm Nghiên cứu
và Ứng dụng Tế bào gốc.
3.2 Phương pháp
3.2.1 Cách tiếp cận
 Kiến thức: thông qua việc đọc, tìm hiểu, tổng hợp các tài liệu có liên quan
trong và ngoài nước; thông qua việc học tập tại các khóa học, hội nghị; thông
qua việc học tập, tiếp xúc với các chuyên gia, nhà khoa học đầu ngành,…
 Kĩ thuật: thông qua quá trình nghiên cứu, tìm hiểu; thông qua các khóa huấn
luyện (training) kĩ thuật, …

9


3.2.2 Giản đồ thí nghiệm

MÔ MỠ

Tế bào gốc
trung mô

Tế bào tiết
insulin

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN
VÀ SỰ DI CƯ
Mô hình chuột
đái tháo đường TYPE 1
NGHIÊN CỨU
ĐIỀU TRỊ

3.2.3 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột
3.2.3.1 Phương pháp thu nhận, nuôi cấy tế bào gốc ứng viên từ mô mỡ chuột
 Chuột sau khi được gây mê bằng ketamin (5 mg/0,1 ml/con), việc thu nhận
mỡ được tiến hành bằng cách giải phẫu. Vị trí thu nhận mỡ cách lỗ sinh dục
1 cm hướng về phía bụng; mỡ được lấy ra từ vết cắt mở ngang khoảng 1 cm.
Sau đó, vết mổ được khâu và xử lí lại cẩn thận và mô mỡ thu nhận được bảo
quản trong PBS lạnh có bổ sung kháng sinh 5X.
 Mỡ chuột (dạng khối) được rửa sạch nhiều lần bằng PBS-kháng sinh và
vortex kĩ để loại bỏ hồng cầu và làm cho mô mỡ trở nên lỏng lẻo hơn. Sau
đó, mỡ được xử lí với với hỗn hợp super extract và li tâm hai giai đoạn: li
tâm ở tốc độ 500g trong 5 phút, lấy dịch nổi, sau đó li tâm dịch nổi 1000 g
trong 10 phút thu cặn. Cặn tế bào được huyền phù trong môi trường
DMEM/F12 10% FBS và tế bào được nuôi ở điều kiện 370C, 5% CO2. Môi

10

trường được thay mới mỗi 3 ngày đến khi tế bào phát triển 70% bề mặt flask
và việc cấy chuyền dùng trypsin 0,25%.
3.2.3.2 Định danh tế bào gốc ứng viên được phân lập từ mô mỡ chuột
Tế bào gốc ứng viên phân lập từ mô mỡ được định danh là tế bào gốc trung
mô phải đạt các tiêu chuẩn của ISCT (International Society for Cellular Therapy)
(Dominici et al., 2006) như sau:
i) Hình thái giống nguyên bào sợi;
ii) Có khả năng tự làm mới;
iii) Có khả năng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ;
iv) Biểu hiện một số marker đặc trưng của tế bào gốc trung mô như: CD13,
CD44, CD90, CD133, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào gốc
tạo máu như CD14, CD34, CD45. Việc phân tích được tiến hành bằng kĩ
thuật flow cytometry.
3.2.4 Biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin in vitro
bằng hóa chất
Tế bào gốc trung mô được biệt hóa thành tế bào tiết insulin (Insulin
producing cell_IPC) bằng phương pháp sử dụng các tác nhân cảm ứng, định hướng
biệt hóa.
Quá trình biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào IPC có thể được chia
thành 3 bước:
-

Bước 1: cảm ứng chuyển biệt hóa sang dạng tế bào thuộc lớp ngoại phôi bì
bằng tác nhân N2 trong môi trường DMEM/F12;

-

Bước 2: cảm ứng chuyển biệt hóa thành dạng tế bào nội phôi bì và dạng tế bào
tiểu đảo bằng N2, B27, b-FGF và nicotinamide;

-

Bước 3: biệt hóa thành tế bào tiết insulin bằng các tác nhân: N2, B27, b-FGF,
nicotinamide, sodium pyruvate.

* Đánh giá tế bào sau biệt hóa: tế bào sau biệt hóa được phân tích sự thành công của
quá trình biệt hóa theo các chỉ tiêu sau:
i) Sự hình thành tiểu đảo: các tế bào trong môi trường biệt hóa sẽ kết cụm lại,
hình thành các cụm tế bào giống tiểu đảo (islet-like cluster). Sau khi nhuộm
với Dithizone, các cụm tế bào có sản xuất Zn như tiểu đảo sẽ bắt màu với
thuốc nhuộm.
11


ii) Phân tích sự biểu hiện gene ở mức phiên mã các gene của tế bào beta tiểu
đảo tụy: các tế bào sau biệt hóa được phân tích sự biểu hiện của các gen như
Pdx-1, Ngn3, Nkx6, Pax4, Insulin ở mức phiên mã bằng kĩ thuật Realtime
Reverse Transcriptase PCR (Realtime RT-PCR).
iii) Tế bào sau biệt hóa được kiểm tra khả năng tiết insulin và c-peptide bằng:
thứ nhất, bằng kĩ thuật Elisa để kiểm tra sự hiện diện của insulin, c-peptide
trong

môi

trường

nuôi

cấy;

nhuộm

hóa

miễn

dịch

tế

bào

(Immunocytochemstry) để kiểm tra sự tồn tại của insulin, c-peptide trong tế
bào.
3.2.5 Phương pháp xây dựng và chuẩn hóa quy trình tạo mô hình chuột đái
tháo đường type 1
a. Xây dựng mô hình chuột đái tháo đường type 1 bằng Streptozotocin
-

Chuột cùng giới tính, cùng độ tuổi, thể trọng tương đương nhau (20-25
gram) nuôi ổn định 1 tuần, kiểm tra đường huyết trước khi sử lí STZ;

-

Cho chuột nhịn đói 8 tiếng trước khi xử lí với STZ;

-

Tiêm xoang bụng chuột bằng dung dịch STZ với các liều khảo sát: 100, 120
140, 160, 180, 200 mg/kg (n=10/lô);

-

Cho chuột uống nước chứa 10% sucrose qua đêm để tránh sốc cao đường
huyết sau khi tiêm;

-

Kiểm tra tình trạng sinh lí chuột hàng ngày, vệ sinh chuồng 3 lần/tuần, chế
độ ánh sáng 12 giờ/ngày, nuôi nhốt 3-4 con/chuồng.

b. Đánh giá hiệu quả của quy trình
i) Trọng lượng
Cân nặng của chuột được ghi nhận hàng tuần trong suốt 6 tuần khảo sát.
ii) Đường huyết
 Kiểm tra đường huyết chuột 2 ngày/lần trong suốt 6 tuần sau khi xử lí
với STZ.
 Đo đường huyết bằng máy đo đường huyết One Touch Ultra của
hãng Lifescan – Johnson & Johnson (USA).
 Tiêu chuẩn đạt đái tháo đường: những con chuột có nồng độ đường
huyết tăng cao trên 200 mg/dl và duy trì đến tuần thứ 6 sau khi xử lí STZ,

12


80% tế bào beta tụy bị hủy hoại, insulin huyết thanh thấp hơn chuột bình
thường tối thiểu 5 lần.
iii) Test dung nạp glucose (Ayala et al., 2010)
 Chuột bị bỏ đói khoảng 6 giờ trước khi tiến hành test;
 Đo đường huyết chuột trước khi tiến hành test;

 Tiêm vô trùng dung dịch D-glucose 20% với lượng 2 gram/kg thể
trọng vào khoang bụng chuột;
 Đo đường huyết chuột vào các thời điểm 15, 30, 60, 120 phút.
 Đường huyết bình thường vào khoảng dưới 7.8 mmol/L (140 mg/dL)
ở thời điểm 120 phút; khoảng từ 140 – 200 mg/dL được cho là rối
loạn dung nạp đường; trên 200 mg/dL được cho là đái tháo đường
(theo WHO)
iv) Phương pháp kiểm tra mức độ chịu đựng insulin
 Chuột nhịn đói 6 giờ.
 Pha insulin liều 0,75 mg/kg trong PBS.
 Kiểm tra nồng độ glucose máu vào thời điểm 30 phút trước khi tiêm.
 Tiêm dung dịch insulin chuẩn bị ở trên.
 Kiểm tra nồng độ glucose máu vào các thời điểm 30, 60, 120 phút sau
tiêm.
v) Định lượng insulin, HbA1C trong máu
HbA1C hay A1C là phức hợp của Hemoglobin và glucose trong máu. Test
nồng độ HbA1C có ý nghĩa quan trọng hơn đường huyết do tính ổn định trong thời
gian tương đối dài (8 -12 tuần, thời gian tồn tại trung bình của hồng cầu trong máu).
Nồng độ insulin, HbA1C trong máu được phân tích bằng kĩ thuật Elisa.
vi) Đánh giá cấu trúc mô tụy bằng nhuộm hóa mô Hematoxyline và Eosin
 Giết chuột, thu nhận mẫu mô tụy chuyển vào dung dịch 4%
paraformaldehyde qua đêm
 Đúc mẫu trong paraffin, sau đó được cắt thành tiêu bản có độ dày 4m và
nhuộm với Hematoxylin và Eosin.

13


3.2.6 Đánh giá tính an toàn của các tế bào/ cụm tế bào được sử dụng để ghép
vào chuột

3.2.6.1 Đánh giá sự toàn vẹn nhiễm sắc thể
Sự toàn vẹn số lượng nhiễm sắc thể của tế bào được kiểm tra bằng kĩ thuật
Nhiễm sắc thể đồ (Karyotype).
3.2.6.2 Khả năng gây ung thư
a. Kiểm tra mức biểu hiện của các gen sinh u (oncogenes) và các gen ức chế khối
u (tumor suppressor genes) ở mức phiên mã
Các gen sinh u được kiểm tra: Oct4, nanog, sox2, SSEA.
Các gen ức chế khối u được kiểm tra: p15, p16, p53.
Sự biểu hiện của các gen này ở mức phiên mã sẽ được kiểm tra thông qua kĩ
thuật RT-PCR với các cặp mồi đặc trưng cho gen.
b. Đánh giá tính sinh u in vivo – Khả năng tạo u trên mô hình chuột
Để đánh giá nguy cơ tạo u của tế bào ghép, các tế bào gốc trung mô từ mô
mỡ và tế bào IPC được ghép vào dưới da chuột với mật độ 2-5x106 tế bào gốc từ mô
mỡ và 500 – 1000 cụm tế bào IPC. Sau đó, chuột được theo dõi sự hình thành khối
u trong khoảng thời gian 10 – 12 tuần. Sau thời gian trên, vùng da được ghép tế bào
sẽ được cắt ra và kiểm tra hình thái mô học bằng kĩ thuật nhuộm hóa mô H&E.
3.2.6.3 Khả năng gây chết
Tế bào mục tiêu được ghép vào chuột và tình trạng sinh lí của chuột sau ghép
được theo dõi trong 3 tuần.
3.2.7 Kiểm tra sự di cư của tế bào ghép
Tế bào gốc trung mô biểu hiện protein phát huỳnh quang (Green florescent
protein_GFP) mạnh và ổn định (thương mại) được sử dụng cho thí nghiệm này.
Trước khi ghép, mật độ tế bào sống được xác định và điều chỉnh về liều ghép 5x106
tế bào/ 0,1 ml bằng PBS.
Chuột được gây mê bằng ketamine (5 mg/0,1 ml/con) tiêm vào dưới da. Sau
đó, tiến hành ghép tế bào vào chuột ở các vị trí tĩnh mạch đuôi.
Sau 7, 14, 28 ngày, vị trí của các tế bào phát huỳnh quang sẽ được phát hiện
thông qua scan hình ảnh chuột bằng hệ thống UVP Imaging.

14

3.2.8 Phương pháp điều trị đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế bào gốc
trên mô hình chuột
Trong nghiên cứu này, việc điều trị đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp tế
bào gốc dựa vào chiến lược chính là thay thế tế bào bằng cách ghép tế bào gốc trung
mô hoặc tế bào IPC hoặc phối hợp cả hai loại.
Tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ
Tiêm tĩnh mạch 107 tế bào/con

Tế bào tiết
insulin

Kết hợp

đuôi
Tiêm vỏ thận

1000 cụm tế bào/ 106 tế bào MSC + 500
con

cụm tế bào /con

Chuột sau ghép được nuôi nhốt trong điều kiện sạch và theo dõi trong 12
tuần. Hiệu quả điều trị được đánh giá thông qua các chỉ tiêu:
-

Tình trạng sinh lí chuột: ổn định hoặc cải thiện;

-

Đường huyết, nồng độ HbA1C trong máu giảm bằng hoặc về gần mức bình
thường;

-

Khả năng dung nạp glucose và chịu đựng insulin về mức bằng hoặc gần mức
bình thường;

-

Cấu trúc mô tụy

4. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu
Nội dung 1: Thiết lập quy trình tạo mô hình chuột đái tháo đường type 1 bằng hóa
chất;
Nội dung 2 : Thiết lập quy trình phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột;
Nội dung 3: Thiết lập quy trình biệt hóa tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào
tiết insulin in vitro;
Nội dung 4 : Đánh giá tính an toàn của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ và tế bào tiết
insulin;
Nội dung 5 : Đánh giá sự di cư của tế bào ghép trên chuột
Nội dung 6 : Nghiên cứu điều trị bệnh đái tháo đường type 1 bằng liệu pháp thay
thế tế bào.

15


5. Dự kiến kết quả đạt được (kết quả nghiên cứu, bài báo khoa học)

5.1. Kết quả nghiên cứu
 Xây dựng được mô hình chuột đái tháo đường type 1 tối ưu hóa : quy trình
tối ưu khi đạt được trên 80% chuột có đái tháo đường (theo các chỉ tiêu
theo dõi) và duy trì đến 6 tuần.
 Biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin
in vitro
 Đánh giá được tính an toàn tế bào gốc từ mô mỡ và tế bào tiết insulin
 Tế bào ghép không biểu hiện hoặc biểu hiện thấp các gen ung thư và
biểu hiện cao các gen đặc trưng (gen đặc trưng cho tế bào beta đối với tế
bào tiết insulin) ;
 Tế bào ghép có khả năng di cư, tồn tại trong cơ thể chuột ít nhất 3
tuần sau ghép.
 Xây dựng thành công quy trình điều trị bệnh đái tháo đường type 1 bằng
liệu pháp tế bào gốc từ mô mỡ trên mô hình động vật thực nghiệm: Hiệu
quả điều trị đạt 50-70% chuột có biểu hiện giảm hay ổn định đường huyết;
kéo dài tuổi thọ của chuột khoảng 50-70% số chuột nghiên cứu ít nhất 3
tháng so với không điều trị.
5.2 Bài báo khoa học
1 – 2 bài báo quốc tế
1 – 2 bài báo trong nước
1 – 2 bài tham gia Hội nghị
6. Nơi thực hiện đề tài
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào
gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí
Minh.

16


7. Phân bố thời gian thực hiện đề tài

Năm thứ nhất
TT

Tên công việc

1

Viết đề cương và bảo vệ
đề cương nghiên cứu

X

2

Nội dung 1

X

3

Nội dung 2

3

Nội dung 3

4

Nội dung 4

5

Nội dung 5

6

Nội dung 6

7

Viết bài báo

8

Tổng hợp, viết báo cáo

9

Bảo vệ luận án

Q
1

Q
2

Q
3

Q

4

X

X

X

X

X

X
X

Năm thứ hai
Q
1

Q
2

X

X
X

X
X

X

Q
3

Q
4

Q
1

X

X

Q
2

X

X

X

X

X

X

X

X

X

Q
3

Q
4

X

X

X

X

X

X
X

Năm thứ ba

X
X

X

X

17


8. Tiến độ thực hiện
Kết quả
STT
Nội dung
Kết quả đã đạt
Khó khăn gặp
được
phải
Nội dung 1: Thiết - Nồng độ STZ Chưa thực hiện
1
lập quy trình tạo mô 140

–

Hướng khắc
phục

160 các kiểm tra về

hình chuột đái tháo mg/kg cho hiệu dung nạp insulin,
đường type 1 bằng quả tốt nhất
hóa chất

nhuộm hóa mô

- Ở liều STZ HE,
này,
100%

nồng

(10/10) insulin,

độ

HbA1C

chuột huyết tương.

nhắt trắng bị cao
đường

huyết

(>250 mg/dL)
2

Nội dung 2: Thiết Tóm tắt quy trình
lập quy trình phân

- Trữ mô mỡ bằng PBS+ (có kháng sinh);

lập tế bào gốc trung

- Rửa mô mỡ nhiều lần với dung dịch Washing buffer

mô từ mô mỡ

(WB) 1 (thương mại);
- Bổ sung vào mô mỡ dung dịch WB2;
- Xử lí mô mỡ với hỗn hợp enzyme thương mại Super
Extract cho đến khi quan sát thấy các đốm/sợi màu
trắng đục (collagen);
- Thu cặn tế bào, loại mỡ nổi bằng cách li tâm 3000
vòng/phút trong 5 phút;
- Rửa cặn tế bào bằng li tâm (3000 vòng/phút trong 5
phút) trong dung dịch WB3;
- Huyền phù tế bào vào dung dịch nuôi MSC Cult Kit
(thương mại).
- Điều kiện nuôi cấy 37oC, 5% CO2.

3

Nội dung 3: Biệt - Quy trình biệt hóa gồm 3 bước;
hóa tế bào gốc mô - Có sự hình thành các khối cầu tế bào giống tiểu đảo
mỡ thành tế bào tiết (islet-like sphere_ILS);
insulin

- Các ILS này bắt màu cam đỏ với thuốc nhuộm
18


Dithizone; có biểu hiện insulin/proinsulin nội bào; có

đáp ứng với các nồng độ đường khác nhau và có biểu
hiện gen ở mức phiên mã các gen liên quan đến sự biệt
hóa tế bào beta.
4

Nội dung 4 : Đánh Đã đánh giá được sự biểu hiện các oncogene và tumor
giá tính an toàn của suppressor gene ở mức phiên mã và phân tích sự ổn định
tế bào gốc trung mô bộ nhiễm sắc thể của tế bào gốc mô mỡ người.
từ mô mỡ và tế bào
tiết insulin;

5

Nội dung 5 : Đánh Đang tiền hành bằng theo dõi sự di cư của tế bào được
giá sự di cư của tế chuyển gen phát huỳnh quang (gfp)
bào ghép trên chuột

6

Nội

dung

6 : Đang tiền hành thử nghiệm

Nghiên cứu điều trị
bệnh đái tháo đường
type 1 bằng liệu
pháp thay thế tế
bào.

9. Tài liệu tham khảo
[1] Ayala JE, Samuel VT, Morton GJ, Obici S, Croniger CM, Shulman GI,
Wasserman DH, McGuinness OP (2010). Standard operating procedures for
describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis
Model Mech 3(9-10): 525–534.
[2] Chandra V et al. (2011). "Islet-like cell aggregates generated from human
adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice."
PLoS One 6(6): e20615.
[3] Cramer, C., et al. (2010). "Persistent high glucose concentrations alter the
regenerative potential of mesenchymal stem cells." Stem Cells Dev 19(12):
1875-1884.
[4] D'Amour KA, Bang AG, Eliazer S, Kelly OG, Agulnick AD, Smart NG,
Moorman MA, Kroon E, Carpenter MK, Baetge EE (2006). Production of
19


pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem
cells. Nat Biotechnol 24:1392–1401
[5] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause
D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E (2006). Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for
Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4):315-7.
[6] Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK (2008). Induced pluripotent stem cells
generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons,
Science 321: 1218—1221.
[7] Dong QY, Chen L, Gao GQ, Wang L, Song J, Chen B, Xu YX, Sun L
(2008). Allogeneic diabetic mesenchymal stem cells transplantation in
streptozotocin-induced diabetic rat. Clin Invest Med 31(6):E328-37.
[8] Figliuzzi M, Cornolti R, Perico N, Rota C, Morigi M, Remuzzi G, Remuzzi

A, Benigni A (2009). Bone marrow-derived mesenchymal stem cells improve
islet graft function in diabetic rats. Transplant Proc 41(5): 1797-800.
[9] Gabr MM, Zakaria MM, Refaie AF, Ismail AM, Abou-El-Mahasen MA,
Ashamallah SA, Khater SM, El-Halawani SM, Ibrahim RY, Uin GS, Kloc M,
Calne RY, Ghoneim MA (2012). Insulin-producing cells from adult human bone
marrow mesenchymal stem cells control streptozotocin-induced diabetes in nude
mice. Cell Transplant 22(1): 133-45.
[10] Harris DT, Badowski M, Harman SM (2009). Treatment of Type I
Diabetes in the NOD Mouse with Syngeneic Cord Blood Stem Cells. The Open
Stem Cell Journal 1:62-68.
[11] Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA,
Bhatia M (2003). Bone marrow–derived stem cells initiate pancreatic
regeneration. Nature Biotechnology 21: 763 – 770.
[12] Ho JH et al. (2012). Multiple intravenous transplantations of mesenchymal
stem cells effectively restore long-term blood glucose homeostasis by hepatic
engraftment and beta-cell differentiation in streptozocin-induced diabetic mice.
Cell Transplant 21(5): 997-1009.

20


[13] Iskovich S et al. (2012). Elutriated stem cells derived from the adult bone
marrow differentiate into insulin-producing cells in vivo and reverse chemical
diabetes. Stem Cells Dev 21(1): 86-96.
[14] Ito T, Itakura S, Todorov I, Rawson J, Asari S, Shintaku J, Nair I, Ferreri
K, Kandeel F, Mullen Y (2010). Mesenchymal stem cell and islet cotransplantation promotes graft revascularization and function. Transplantation
89(12): 1438-45.
[15] Jiang J, Au M, Lu K, Eshpeter A, Korbutt G, Fisk G, Majumdar AS (2007).
Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem
cells. Stem Cells 25: 1940–1953.

[16] Jurewicz, M.; Yang, S.; Augello, A.; Godwin, J.G.; Moore, R.F.; Azzi, J.;
Fiorina, P.; Atkinson, M.; Sayegh, M.H. & Abdi, R. (2010). Congenic
mesenchymal stem cell therapy reverses hyperglycemia in experimental type 1
diabetes. Diabetes 59(12): 3139-47.
[17] Karaoz, E., et al. (2013). Adipose tissue-derived mesenchymal stromal
cells efficiently differentiate into insulin-producing cells in pancreatic islet
microenvironment both in vitro and in vivo. Cytotherapy 15(5): 557-570.
[18] Li M, Abraham NG, Vanella L, Zhang Y, Inaba M, Hosaka N, Hoshino S,
Shi M, Ambrosini YM, Gershwin ME, Ikehara S (2010). Successful modulation
of type 2 diabetes in db/db mice with intra-bone marrow--bone marrow
transplantation plus concurrent thymic transplantation. J Autoimmun 35(4): 41423.
[19] Moorefield EC (2012). Doctor thesis: Stem cell based regenerative
pharmacology for the treatment of diabetes mellitus. Wake forest University
graduate school of art and sciences.
[20] Ngoc PK, Phuc PV, Nhung TH, Thuy DT, Nguyet NT (2011). Improving
the efficacy of type 1 diabetes therapy by transplantation of immunoisolated
insulin-producing cells. Hum Cell 24(2): 86-95.
[21] Phuc PV, Nhung TH, Loan DT, Chung DC, Ngoc PK (2010).
Differentiating of cryopreserved human umbilical cord blood derived
mesenchymal stem cells into insulin secreting cells. In vitro cellular and
developmental biology – animal 47(1): 54-63.
21


[22] Phuc PV, Ngoc VB, Lam DH, Tam NT, Viet PQ, Ngoc PK (2011).
Isolation of three important types of stem cells from the same samples of banked
umbilical cord blood. Cell Tissue Bank 13(2): 341-51.
[23] Rackham CL, Chagastelles PC, Nardi NB, Hauge-Evans AC, Jones PM, et
al. (2011) Co-transplantation of mesenchymal stem cells maintains islet
organisation and morphology in mice. Diabetologia 54, pp. 1127–1135.

[24] Tateishi, K He, J, Taranova, O, Liang, G., D'Alessio, AC, Zhang, Y (2008).
Generation of insulin-secreting islet-like clusters from human skin fibroblasts. J
Biol Chem. 14;283(46), pp. 31601-7.
[25] Toai TC, Thao HD, Thao NP, Gargiulo C, Ngoc PK, Van PH, Strong DM
(2010). In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical
cord blood. Cell Tissue Bank 11(3): 269-80.
[26] Tran CT, Gargiulo C, Thao HD, Tuan HM, Filgueira L, Michael Strong
D(2011). Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from
human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank 12(4): 247-61.
[27] Tsai, P. J,Wang, H. S., Lin, C. H., Weng, Z. C., Chen, T. H., Shyu, J. F.
(2013). Intraportal injection of insulin-producing cells generated from human
bone marrow mesenchymal stem cells decreases blood glucose level in diabetic
rats. Endocr Res.
[28] Voltarelli,

JC, Couri,

CE, Stracieri,

AB, Oliveira,

MC, Moraes,

DA, Pieroni, F, Coutinho, M, Malmegrim, KC, Foss-Freitas, MC, Simões,
BP,Foss, MC, Squiers, E, Burt, RK (2007). Autologous nonmyeloablative
hematopoietic stem cell transplantation in newly diagnosed type 1 diabetes
mellitus. JAMA. 11;297(14):1568-76.
[29] Zhang D, Jiang W, Liu M, Sui X, Yin X, Chen S, Shi Y, Deng H (2009).
Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature
pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19(4):429-38.

[30] Zhang S, Dai H, Wan N, Moore Y, Dai Z (2011). Promoting Long-Term
Survival of Insulin-Producing Cell Grafts That Differentiate from Adipose
Tissue-Derived Stem Cells to Cure Type 1 Diabetes. Plos one.

22