ứng dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bt( bacillus thuringiensis var )

Báo Cáo Tiểu Luận
BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

ĐỀ TÀI:

ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG
SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Bt
(Bacillus thuringiensis)
GVHD: Phạm Minh Tuấn
NHÓM 3

TP.HCM, THÁNG 6 NĂM 2012
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 1


Báo Cáo Tiểu Luận

MỞ ĐẦU
Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao
với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học và
hàng lọat các biện pháp như trồng lúa 3 vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với
mục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng. Chính vì vậy, với sự canh tác trên
đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh
thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày
càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại

không dự báo trước.
Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng
chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng của Việt
Nam nói riêng và thế giới nói chung. Hiện các chế phẩm đang được sử dụng nhiều tại các
vùng trồng rau sạch ở Đà Lạt, Vĩnh Phúc, Thanh Trì, Hải Dương, Hà Tây, Đông
Anh...của Việt Nam.
Nhiều thập kỉ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) đã phát huy được tác dụng
tích cực trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ cây trồng, tuy nhiên nó cũng gây ra những
tác dụng không mong muốn như ảnh hưởng xấu đến môi trường sống, ô nhiễm lương
thực, thực phẩm, gây ngộ độc chết người... Do vậy, việc sử dụng các tác nhân sinh học
như virut, vi khuẩn, vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh để
phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu vi
sinh đã và đang được lựa chọn. Trong đó thuốc trừ sâu BT thuộc nhóm thuốc trừ sâu vi
sinh nó có nhiều ưu điểm đối với cây trồng và an toàn đối với môi trường được nhiều
người lựa chọn.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 2


Báo Cáo Tiểu Luận

MỤC LỤC
I. TỔNG QUAN.............................................................................................................4
1.1. Giới thiệu chung về thuốc trừ sâu.......................................................................4
1.2. Thuốc trừ sâu sinh học..........................................................................................5
1.2.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học...................................................................5
1.2.2. Phân loại thuốc trừ sâu sinh học.........................................................................6
1.3. Thuốc trừ sâu sinh học Bt....................................................................................6

1.3.1. Lịch sử..................................................................................................................6
1.3.2. Phân loại............................................................................................................... 8
1.3.3. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt)..................................................8
1.3.4.

Đặc điểm tinh thể độc và cơ chế tác động của vi khuẩn Bacillus

thuringenisis.................................................................................................................10
1.3.5. Tính an toàn của thuốc sinh học Bt..................................................................15
II. QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU BT.......................18
2.1 Tuyển chọn chủng..................................................................................................18
2.2. Lên men................................................................................................................ 18
2.3. Thu hồi sản phẩm và tạo chế phẩm kỹ thuật......................................................20
2.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm.............................................................................21
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành tinh thể Cry.......................................22
III. ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BT..............23
3.1. Ưu điểm ................................................................................................................23
3.2 Hạn chế và cách khắc phục...................................................................................23
IV. KẾT LUẬN............................................................................................................25

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 3


Báo Cáo Tiểu Luận

I. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về thuốc trừ sâu
Đa số những thuốc trừ sâu dùng trong sản xuất nông nghiệp đều là những chất hữu cơ

tổng hợp. Thuốc trừ sâu lân hữu cơ, thuốc trừ sâu Pyrethroid (Cúc trừ sâu tổng hợp),
thuốc điều hoà sinh trưởng côn trùng, (như Atabron, Nomolt…), thuốc trừ sâu Cacbamat,
và các hợp chất hữu cơ khác (Padan, Trebon, Confidor, Regent,…). Một số loại thuốc trừ
sâu không phải là những hợp chất hoá học do con người tổng hợp ra, chúng là những chế
phẩm chứa những vi sinh vật hoặc những độc tố do vi sinh vật tạo ra có tác dụng trừ sâu:
Bacterine, Xentari, NPV, Beauverine,… Ngoài ra có một số thuốc trừ sâu có nguồn gốc
thực vật: Fortenone (Rotenone) chế từ rễ cây ruốc cá, thuốc trừ sâu Nimbecidine chế từ
hạt cây Neem (Xoan Ấn Độ). Thuốc trừ sâu thường tác động đến sâu hại ở giai đoạn sâu
non (ấu trùng). Sâu non ở tuổi càng nhỏ càng dễ mẫn cảm với thuốc, dễ bị thuốc gây độc.
Trưởng thành của nhiều loại sâu hại cũng dễ bị thuốc gây độc (rầy nâu, bọ xít, bọ cánh
cứng, …).
Thuốc trừ sâu thường ít có hiệu quả đối với giai đoạn nhộng. Đa số các thuốc trừ sâu tổng
hợp hữu cơ tác động đến hệ thần kinh côn trùng, có tác động tiếp xúc, vị độc, và cả xông
hơi, diệt côn trùng tương đối nhanh: Thuốc trừ sâu lân hữu cơ, Cacbamat, cúc trừ sâu, …
Một số thuốc trừ sâu có tác động chủ ngăn cản sự lột da của sâu non và ấu trùng và hiệu
lực trừ sâu thể hiện chậm hơn: Atabron, Nomolt, Applaud…
Có loại thuốc trừ sâu lại tác động chủ yếu đến hệ tiêu hoá, phá huỷ vách ruột côn trùng:
Thuốc trừ sâu BT.
Thuộc về nhóm thuốc trừ sâu còn có những hợp chất tuy không gây độc trực tiếp cho sâu
hại nhưng lại góp phần hạn chế đáng kể tác hại của chúng đến mùa màng, chất dẫn rụ
Methyl Eugenol không gây độc trực tiếp cho côn trùng nhưng có tác dụng thu hút nhiều
loại ruồi đục trái cây từ xa di chuyển đến nơi có phun thuốc khiến cho số lượng côn trùng
bị nhiễm độc tăng cao (bẫy ruồi đục quả Vizubon D), từ đó mà làm tăng hiệu quả của
thuốc trừ sâu. Hoặc việc sử dụng những bẫy Pheromone trên đồng ruộng vào thời điểm
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 4


Báo Cáo Tiểu Luận

côn trùng trưởng thành ra rộ sẽ ngăn cản sự ghép cặp để giao phối của chúng, khiến cho
chúng không sinh sôi phát triển được. Sự hiểu biết về cơ chế tác động của thuốc trừ sâu
đến sâu hại là cơ sở xây dựng kế hoạch dùng luân phiên thuốc trừ sâu trên các ruộng
vườn chuyên canh nhằm ngăn ngừa hoặc khắc phục hiện tượng kháng thuốc của sâu hại.
Tính độc của thuốc trừ sâu đối với người và động vật có ích thay đổi nhiều tuỳ theo nhóm
thuốc, loại thuốc, dạng thành phần. Có những thuốc rất ít độc với người và động vật máu
nóng: BT, Applaud, Nomolt, … chúng được khuyến khích sử dụng trừ sâu trên rau xanh,
trái cây, … có những thuốc có độ độc cấp tính tương đối cao đối với người và động vật
máu nóng: Methomyl, … lại có những thuốc có tính độc cao với ong hoặc đối với cá
hoặc đối với thiên địch của sâu hại: Thiodan, …
1.2. Thuốc trừ sâu sinh học
1.2.1. Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học là những chế phẩm sinh học được sản xuất ra từ các loại thảo
dược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhau
theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo
ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ được các loại sâu, bọ gây
hại cây trồng nông, lâm nghiệp.
Thật ra các loại thuốc trừ sâu sinh học đã được bà con nông dân sử dụng từ lâu đời như
một kinh nghiệm sống. Ví dụ như: lá sầu đâu (xoan đào), cây thuốc cá, mủ đu đủ, mủ
xương rồng, mủ vú sữa... đã được bà con sử dụng từ bao đời nay để diệt sâu bọ, cua, ốc
cắn phá cây trồng. Tuy nhiên, việc sử dụng các loại cây, lá trên để diệt trừ sâu bọ gây hại
đòi hỏi rất nhiều công sức và thời gian. Để khắc phục khó khăn đó, các nhà khoa học trên
thế giới đã đầu tư nghiên cứu để chiết xuất ra các hoạt chất, tạo thành một dòng các sản
phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, chủ yếu là trừ sâu, trừ nấm bệnh và
kích thích sinh trưởng như khuẩn Bacillus thuringiensis (BT), nấm Trichoderma, hoạt
chất Azadirachtin, bột neem (chiết xuất từ cây neem - xoan đào), Karanjin - chiết xuất từ
cây hoa đào Ấn Độ, Matrine - chiết xuất từ cây khổ sâm, Saponin - bã trà, abamectin,
emamectin benzoate... và hoạt chất được sản xuất để diệt trừ sâu, bọ mới đây nhất là hoạt
chất Methylamine avermectin.
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 5


Báo Cáo Tiểu Luận

1.2.2. Phân loại thuốc trừ sâu sinh học
Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Thành phần
giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các
chất do vi sinh vật tiết ra (thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (là
chất độc hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia
thành hai nhóm chính là:
- Nhóm thuốc vi sinh: Thuốc trừ sâu vi sinh bao gồm một vi sinh vật (ví dụ: vi khuẩn,
nấm, virút hoặc động vật nguyên sinh) như thành phần hoạt hóa. Thuốc trừ sâu vi sinh có
thể kiểm soát nhiều loài gây hại khác nhau mặc dù mỗi hoạt chất đặc hiệu cho mỗi loài
gây hại mục tiêu của nó. Ví dụ: có những loại nấm kiểm soát một số loại cỏ dại, và những
loại nấm khác tiêu diệt được một số loại côn trùng. Các loại thuốc trừ sâu vi sinh được sử
dụng nhiều nhất là những loài phụ và những chủng của Bacillus thuringiensis, hay Bt.
- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầu
thực vật.
1.3. Thuốc trừ sâu sinh học Bt
1.3.1. Lịch sử
Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát hiện một loài vi
khuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus bombycis. Sau đó vào năm 1911, nhà
côn trùng học người Đức là Berline đã phát hiện loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ở
Thuringia vùng Địa Trung Hải và đặt tên là Bacillus thuringiensis (viết tắt là Bt). Sau đó
đến khoảng giữa thế kỷ 20, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt ký sinh trên nhiều loài
sâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông. Từ đó vi khuẩn Bt đã được chế tạo
thành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệ
thuốc trừ sâu sinh học.

Bt lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1901 tại Nhật Bản bởi nhà sinh vật học Shigente
Ishiwarti, khi ông tìm ra nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột của một số sâu tơ. Shigente
Ishiwarti đầu tiên phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gọi đó là Bacillus Sotto. Năm
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 6


Báo Cáo Tiểu Luận
1911, Bernard - người Đức, tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vi
khuẩn ký sinh trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring.
1971, chế phẩm Bt đã được nghiên cứu.
Với những thành tựu của di truyền học và công nghệ sinh học, người ta đã phát hiện
nhiều chủng Bt có khả năng ký sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm có hàm lượng
độc tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ tác dụng trên nhiều
loài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau. Đã xác định có tới
trên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng Bt, trong đó bao gồm hầu như toàn bộ các loài
sâu hại có ở Việt Nam.
Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh
học trên thế giới cũng như ở nước ta. Ngoài việc dùng làm thuốc trừ sâu, hiện nay người
ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt ghép vào hệ thống gen của cây để tạo ra các giống
cây kháng sâu như giống bông kháng sâu xanh, giống lúa kháng sâu đục thân, sâu cuốn
lá, giống ngô kháng sâu…
Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis var.) đã được nghiên cứu từ năm 1971.
Hơn 20 chế phẩm Bt nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và
ngoài đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh bướm trắng, sâu
xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo.
Các lọai sản phẩm thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP,
16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc ...

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 7


Báo Cáo Tiểu Luận
Hình 1. Sản phẩm Bt trên thị trường
1.3.2. Phân loại
Thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi sinh vật (Bacillus thuringiensis var.) , phổ
diệt rộng và hữu hiệu với các lọai sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu
ăn tạp …
Có nhiều loại thuốc Bacillus thuringiensis trên thị trường thế giới như:
- Bacilus thuringiensis var aizawai kiểu serotype, hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể, chế
biến thành dung dịch đặc, dùng trừ ấu trùng mọt hại kho tàng.
- Bacillus thuringiensis var. israelensis (tên khác: Teknar) hoạt chất ở dạng tinh thể ôendotoxin tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var. israelensis, Serotype
(H-14). Thuốc được gia công ở nhiều dạng như dung dịch, bột thấm nước... dùng trừ
muỗi, ấu trùng ruồi.
- Bacillus thuringiensis var. kurstaki (tên khác Bakthane, Agritol, Bactospeine plus,
Biotrol...), hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể ô-endotoxin được tạo thành qua lên men
Bacillus thuringiensis Berliner, var. kurstaki, Serotype H-3a 3b. Thuốc được gia công
thành nhiều dạng như bột thấm nước, sữa huyền phù, dung dịch đặc... dùng trừ ấu trùng
bộ Lepidoptera như sâu khoang, sâu tơ, sâu xanh và nhiều loại sâu khác hại rau, màu và
cây ăn trái.
- Bacillus thuringiensis var. morrisoni, hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể ô-endotoxin
được tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var morrisoni, serotype 8a 8b.
Thuốc được gia công thành dạng bột khô tan trong nước và bột thấm nước, dùng trừ ấu
trùng bộ Lepidoptera hại rau, màu, cây ăn trái, cây cảnh, cây công nghiệp.
- Bacillus thuringiensis var. San Diego (tên khác: Myx 1850), dùng để trừ bọ cánh cứng
cho khoai tây, cà chua, cây xanh.
1.3.3. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt)

Bacillus thuringiensis, là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia,
Đức.
Ở Việt Nam trong số 185 mẫu đất, bùn thu thập ở Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thái
Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Ninh Bình đã phân lập được 920 chủng Bacillus với đặc
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 8


Báo Cáo Tiểu Luận
điểm Gram +, hình que, bào tử không phình. Chỉ có 295 chủng trong số đó có tinh thể
hình tròn, tháp đôi, hình kim. Các chủng Bacillus có tinh thể được phân loại thành loài
Bacillus thuringiensis (Bt).
Bt có trong các mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước, ao hồ… Hình dạng tinh thể (một
trong những đặc điểm quan trọng để phân loại Bt thành loài phụ) rất đa dạng. Phần lớn
các chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình tháp đôi , một số hình cầu và một số chủng
có tinh thể với các hình dạng khác nhau.
Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, gram dương (không mất màu
nhuộm khi tẩy bằng iôt và cồn, kích thước 3-6 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào
đứng riêng rẽ và xếp thành từng chuỗi, chứa tinh thể độc có khả năng diệt sâu.
Bt phát triển trong điều kiện nhiệt độ 15-45 0C nhưng thích hợp nhất 29-30 0C. Bào tử
dạng hình oval, hình trứng dài 1,2 – 1,6 µm.

Hình 2. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 9

Báo Cáo Tiểu Luận

Hình 3. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis
Trưởng thành mỗi tế bào vi khuẩn có một bào tử hình trứng và một tinh thể độc hình quả
trám.

Hình 4. Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) và bào tử (spore)
1.3.4. Đặc điểm tinh thể độc và cơ chế tác động của vi khuẩn Bacillus thuringenisis
a. Đặc điểm tinh thể độc
Dựa vào cơ chế tác động diệt côn trùng người ta xác định có 4 loại độc tố:
- Nội độc tố endotoxin, còn gọi là tinh thể độc crystal: cry I, cry II, cry III, cry IV.
Hầu hết là các chủng Bt có một hoặc nhiều gen tiền độc tố. Cơ sở gây bệnh cho côn trùng
chính là các gen Cry khác nhau. Gen Cry được chia thành 4 lớp chính: Cry I, II, III, IV.
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 10


Báo Cáo Tiểu Luận
+ Gen Cry I: Thường tổng hợp các Protein hình thoi gây bệnh cho côn trùng bộ cánh vẩy.
+ Gen Cry II: Tạo tinh thể dạng hình tháp gây bệnh cho côn trùng bộ cánh vẩy và côn
trùng bộ 2 cánh. Ví dụ như gen Cry IIA gây bệnh cho loài Lymantria dispa, Cry IIB
Helicoverpa armigera.
+ Gen Cry III: Tổng hợp tinh thể dạng hình thoi, gây bệnh cho côn trùng bộ cánh cứng
Coleoptera .
+ Gen Cry IV: Tổng hợp cả tinh thể dạng hình thoi và hình tháp, chỉ gây bệnh cho côn
trùng bộ 2 cánh Diptera.

Hình 4: Pansy peacock

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Hình 5: Diaethria

Page 11


Báo Cáo Tiểu Luận

Hình 6: Helicoverpa armigera

Hình 7: Lymantria dispa

Hình 8. Bộ cánh cứng Coleoptera

Hình 9. Bộ 2 cánh Diptera

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 12


Báo Cáo Tiểu Luận
Năm 1955, C.L. Hannay và P.C Fitz James xác định được bản chất protein có liên quan
đến độc tính của vi khuẩn. Tinh thể độc của Bt có dạng hình thoi, hình quả trám, hình
tháp mang bản chất Protein và có độc tính cao với rất nhiều loại côn trùng, chiếm 30%
trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màu
dưới kính hiển vi đối pha tinh thể độc. Tinh thể độc rất bền vững ở nhiệt độ cao, có trọng
lượng phân tử là 5000 đơn vị và không phải bào tử nào cũng có tinh thể độc. Trong quá
trình bảo quản nếu để lâu Bt sẽ mất hoạt tính do tinh thể độc bị biến dạng hoặc phân huỷ.

Chất focmandehit 20% và tia tử ngoại có thể làm mất hoạt tính của tinh thể độc.

Hình 10. Bào tử Bt và tinh thể độc
Bản chất hóa học của tinh thể: trong tinh thể độc có nhiều loại acid amin, trong đó có hai
loại có tỉ lệ cao nhất là acid glutamic và acid asparaginic. Trong tinh thể có chứa lượng
khá lớn 5 nguyên tố C, N, H, O, S. Ngoài ra còn chứa 19 nguyên tố khác nhưng không có
P. Các phân tử có khối lương lớn thì có độc tính còn loại có phân tử lượng nhỏ thì không
có độc tính.
Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố ở dạng hòa tan, chẳng hạn tinh thể B.
thuringensis sotto ở 65oc sau 1 giờ vẫn còn hoạt tính trong khi các dạng khác sẽ mất hoàn
toàn độc tính.
- Ngoại độc tố (anpha) exotoxin, còn được gọi là phospholipaza. Thực chất đây là một
loại men liên quan đến sự phân hủy phospholipit dẫn đến côn trùng chết.
- Ngoại độc tố (beta) exotoxin, còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt. Chúng có khối lượng
phân tử thấp (707-850). Sau 15 phút ở 120oc vẫn còn hoạt tính. Chúng tác động lên côn
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 13


Báo Cáo Tiểu Luận
trùng làm cản trở việc tổng hợp ARN thông tin. Chúng còn có tác động cộng hưởng với
nội độc tố, sau khi nội độc tố phá vở biểu bì ruột giữa, chúng nhanh chóng xâm nhiễm
vào huyết tương và máu đi đến các cơ quan làm thay đổi quá trình trao đổi chất và làm
cho côn trùng mau chết.
- Ngoại độc tố (gamma) exotoxin, còn gọi là độc tố tan trong nước. chúng có khối lượng
phân tử thấp 200-2000, có một số acid amin tự do, tan trong nước, mẫn cảm với ánh sáng
và đặc biệt mất hoạt lực trong 15 phút ở 600 trở lên.
b. Cơ chế tác động

Hình 11. Cơ chế tác động của tinh thể độc đối với sâu
Khi được phun lên lá cây, protein độc tố dưới dạng tinh thể sẽ diệt những loại sâu hại
nhất định.
Tác động của tinh thể lên côn trùng là rất phức tạp. Tác động điển hình là làm liệt đường
ruột và xoang miệng.
Cụ thể là sau khi sâu hại ăn phải các tinh thể tiền độc tố, dưới tác dụng của một loại men
tiêu hoá trong dịch ruột của sâu, tiền độc tố bị hoà tan thành những phân tử nhỏ có hoạt
tính độc.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 14


Báo Cáo Tiểu Luận
Các độc tố này bám vào màng vi mao trong ruột, tạo ra các lỗ rò để cho nước chảy vào,
làm sâu mọng nước, ngừng ăn và chết.
Sau khi ăn tinh thể 1-7 giờ tằm dâu bị liệt toàn thân các tế bào thượng bì. Sau khi ăn 1
phút, tinh thể đã xuất hiện tại thượng bì ruột giữa sâu xanh bướm cải. Một số tế bào bị
tách rời, biến đổi, các chất bên trong chảy ra ngoài màng (như trên sâu độc thân) làm tăng
tính thấm thẩu Kali và đã chứng minh tăng K+ trong máu và bạch huyết là nguyên nhân
gây tê liệt đường ruột và toàn thân tằm dâu.
Sự thay đổi tác động của tinh thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chẳng hạn bình thường,
khi vào ruột trước và ruột giữa, nếu pH cao (>7.0) và cơ thể không có cơ chế giải độc,
tinh thể sẽ vỡ ra làm nhiễm độc máu. Hiện tượng thấy phổ biến trên tằm, sâu róm, bướm
cải…Tuy vậy trong nhiều trường hợp khi tinh thể độc vỡ ra, một số loài sâu có cơ chế tự
giải độc, ngừng ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau một thời gian nhất định đường tiêu
hóa được phục hồi.
Các động vật có vú không bị ngộ độc khi ăn phải tinh thể là do chất pepsin trong ruột
động vật (hoạt động thích hợp khi pH =2) đã làm mất tính độc của tinh thể vi khuẩn.

Hình 12. Sâu chết do trúng độc từ thuốc trừ sâu Bt
1.3.5. Tính an toàn của thuốc sinh học Bt
Các sản phẩm Bt được sử dụng rộng rãi trên thế giới, chiếm 1 đến 2% tổng sản lượng thị
trường thuốc trừ sâu trên thị trường thế giới vào những năm 1990. Protein Cry có tính đặc
hiệu cao tới các loài côn trùng có chủ đích. Các protein Cry ít hoặc không ảnh hưởng tới
các loài sinh vật khác. Trong gần 40 năm được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới, chúng

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 15


Báo Cáo Tiểu Luận
ta chưa tìm thấy ảnh hưởng xấu của chúng tới sức khỏe con người hay môi trường (EPA,
1998a; Mc Clontock et. A;..1995).
Kể từ năm 1961 đến năm 1998 tại Hoa Kỳ hiện có ít nhất 180 sản phẩm vi sinh Bt đã
được đăng ký kiểm định. Tại châu Âu có hơn 120 sản phẩm. Theo cuộc khảo sát gần đây
của WHO về tính an toàn của sản phẩm vi sinh Bt và đã khẳng định rằng: Không tồn tại
mối nguy hiểm nào của sản phẩm Bt tới con người, động vật có xương sống khác hoặc
tới các sinh vật không chủ đích khác” (IPCS, 2000).
- Sức khỏe con người:
Các nghiên cứu về tính an toàn của thuốc trừ sâu vi sinh Bt trong hơn 40 năm đã chứng
minh rằng không tìm thấy dấu hiệu ảnh hưởng nào tới việc tăng cân, khám nghiệm lâm
sàng hay trên tử thi.” (McClintock et al., 1995).
Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Prôtectin Agency US-EPA) đã triển
khai những đánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn.
Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc trừ sâu ở
một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi
ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trong các ngày khác nhau… không

gây ra chứng bệnh gì. Những người ăn 1 gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hòan toàn
không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”. Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị
phân hủy bởi dịch vị dạ dày (trong điều kiện phòng thí nghiệm) (Extoxnet, 1996).
- Ảnh hưởng đến môi trường:
Nước ngầm và hệ sinh thái đất: Protein Bt tồn tại tương đối bền trong đất và được phân
loại vào dạng bất động vì nó không có khả năng di chuyển hoặc thấm qua nước ngầm.
Protein này không bền vững trong điều kiện đất axit, và bị phân hủy nhanh chóng khi
phơi dưới ánh sáng mặt trời, dưới tác động của tia UV.
Các chuyên gia đã tiến hành những nghiên cứu độc lập nhằm điều tra các ảnh hưởng của
cây trồng Bt đối với sinh vật đất và các loài côn trùng khác được xem là có ích trong
nông nghiệp. Kết quả cho thấy, chúng không gây ra ảnh hưởng bất lợi đối với các sinh
vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay cả khi cá sinh vật này được
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 16


Báo Cáo Tiểu Luận
xử lý Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thể xảy ra trong điều kiện trồng
trọt tự cho thấy không có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh
đồng có nguyên liệu thực vật Bt và cánh đồng có nguyên liệu thực vật truyền thống
(Donegan và cộng sự, 1995), cũng như không quan sát thấy sự khác biệt giữa các cánh
đồng trồng cây Bt và cây không chuyển gen Bt (Donegan và cộng sự, 1996 ).

- Động vật và côn trùng:

Các thử nghiệm tiến hành trên chó, chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim cho
thấy protein Bt không gây ra những ảnh hưởng có hại. Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố
cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có ích hoặc động vật ăn thịt
như ong mật và bọ cánh cứng (Extoxnet, 1996).

Năm 1999, có một báo cáo về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô Bt đến ấu trùng
của loài bướm Monarch. Báo cáo này đã gây ra mối quan tâm và lo ngại về những rủi ro
mà thực vật Bt có thể gây ra đối với sinh vật không cần diệt. Tuy nhiên, những nghiên
cứu gần đây cho thấy ngô Bt gây ảnh hưởng không đáng kể đối với quần thể bướm
Monarch trên cánh đồng. Nỗ lực nghiên cứu hợp tác giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và
Canada đã cung cấp những thông tin để xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về
ảnh hưởng của ngô Bt đối với quần thể bướm Monarch. Họ đi đến kết luận rằng, hầu hết
các giống lai thương mại, protein bt được biểu hiện với nồng độ thấp trong hạt phấn và
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như trên cánh đồng cho thấy mọi mật độ hạt
phấn đều không gây ảnh hưởng có hại trên đồng ruộng.
- Tính an toàn của cây trồng được bảo vệ bởi Bt được chứng minh nhờ các đặc tính
sau:
+ Cây trồng được bảo vệ bởi Bt không có độc tố tới con người và không tìm thấy dấu
hiệu của sự dị ứng.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 17


Báo Cáo Tiểu Luận
+ Dựa trên hai tiêu chí (về lương thực và thực phẩm) thì cây trồng Bt là an toàn cho tiêu
thụ.
+ Các protein Cry gần như không có độc tố tới các sinh vật không chủ đích, ngoại trừ các
loài côn trùng có quan hệ gần gũi với vật chủ đích,
+ Protein Cry,các marker và cây trồng Bt không tìm thấy rủi ro tới môi trường.

II. QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU BT
2.1 Tuyển chọn chủng
- Chọn chủng tự nhiên có độc lực cao: Phân lập từ đất và côn trùng.

Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 10 chủng Bacillus thurigensis được phân lập để sản xuất
thuốc trừ sâu sinh học.
Mỗi chủng VSV chỉ chứa 1 hoặc 1 vài gene tổng hợp protein gây độc với 1 lọai sâu nhất
định.
- Tạo giống bằng gây đột biến và công nghệ gen:
Để sản xuất được chế phẩm diệt được nhiều lọai sâu, người ta tiến hành xác định ( có
chọn lọc ) những đọan gene đó rồi dùng kĩ thuật chuyển gene để đưa vào 1 chủng Bt.
Chủng giống Bt này sau đó được cấy vào bình lên men, trong điều kiện nhiệt độ thích
hợp (28-30 độ C). Sau khoảng 52-54 giờ là có thể thu hoạch được dịch thể chứa các tinh
thể protein độc tố đối với sâu hại.
2.2. Lên men
- Nhân giống cho nuôi cấy vi khuẩn:
Mục đích: Tạo lượng giống đã hoạt hoá nhằm giúp giai đoạn pha lag phát triển nhanh.
Nếu lag kéo dài: tốn thời gian, môi trường.
Thời gian pha lag phụ thuộc: lượng giống, trạng thái sinh lý của giống:
+ Tỷ lệ giống được chọn: 3 – 10%.
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 18


Báo Cáo Tiểu Luận
+ Giống vi khuẩn được tiếp vào khi vi khuẩn đang ở giai đoạn phát triển log, tế bào
chuyển hoá mạnh.
Cuối pha log bắt đầu xảy ra tạo bào tử, kéo dài pha lag.
- Thành phần môi trường:
Thành phần
Bột đậu tương
Bột khô lạc
Bột ngô

Nước chiết ngô
Tinh bột
Bột cá
Pepton
Glucose
Rỉ đường
Cao nấm men
K2PO4
K2HPO
FeSO4.7H2O
MgSO4.7H2O
MnSO4.7H2O
ZnSO4.7H2O
CaCO4
(NH4)2SO4

22
10
10
1
1
0.02
1
-

22.5
20
15
1.5
-

30
30
2
45
2
0.02
0.3
0.02
0.02
-

Hàm lượng (g/l)
40
14
20
16.7
7.5
30
18.6
0.75
1
-

18

25
-

5

36

40
-

20

3
-

3
2.16
1.1
-

-

5

10
1

20

-

-

2
1

1
-

0.7
2
-

1
2

Bảng 1: Thành phần môi trường nuôi cấy Bt
Có hai phương pháp sản xuất chế phẩm Bt là lên men bán rắn và lên men chìm
- Phương pháp lên mem chìm
Phương pháp hiện nay được coi là tốt nhất để sản xuất các chế phẩm Bt thương mại
Chuẩn bị môi trường lên men: Hoà trộn các thành phần môi trường trong nước; thanh
trùng; làm nguội và bơm vào các thiết bị lên men.
Quá trình lên men:
Nhiệt độ: 28 – 34oC.
pH: pHBĐ = 6,8 – 7,2; pHQT

5,5 – 5,6 Hoặc giữ không đổi bằng cách sử dụng

NaOH; NH4OH hoặc H2SO4.
GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 19


Báo Cáo Tiểu Luận

Bổ sung dầu phá bọt polypropylen, glycol, silicon hoặc dầu thực vật tinh chế nếu môi
trường giàu protein.
Điều khiển lượng oxy hoà tan thích hợp.
Dừng lên men khi đạt tỷ lệ tách bào tử tự do lớn nhất: 36– 96 giờ.
- Phương pháp nuôi cấy bán rắn
Chuẩn bị môi trường lên men: Cám, nước và các dung dịch dinh dưỡng, muối khoáng
được trộn lẫn và được thanh trùng bằng hơi.
Giống được nuôi cấy theo phương pháp lên men chìm trong máy lắc.
Quá trình lên men:
Nhiệt độ: 30oC.
Độ ẩm môi trường: 50 – 70%.
Độ ẩm không khí nuôi cấy: 80 – 100%.
Kết thúc lên men thường sau 48 giờ; không khí ẩm sẽ được thay bằng không khí khô để
giảm độ ẩm sản phẩm xuống 4%.
2.3. Thu hồi sản phẩm và tạo chế phẩm kỹ thuật
Sau khoảng 52-54 giờ là có thể thu hoạch được dịch thể chứa các tinh thể protein độc tố
đối với sâu hại.
- Điều chỉnh pH dịch lên men về 4,1 bằng H2SO4 5M
- Ly tâm liên tục dịch lên men ở ≥ 8000g và < 35ºC, vẫn khuấy trộn liên tục trong thùng
lên men
- Lấy mẫu
- Bổ sung từ từ chất phân tán với tỷ lệ 2% và 1% gum arabic hoặc 5% lactoza trong khi
vẫn đảo trộn trong 5 phút để đảm bảo không vón cục
- Sấy phun đến hàm lượng nước 6-7%
- Sàng qua lỗ < 50µm, nghiền các cục kích thước lớn ở < 35ºC
- Thử hoạt tính của sản phẩm.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 20

Báo Cáo Tiểu Luận
Thành phần

Phần trăm (w/w)

Vai trò

Dịch lên men ly tâm

97

Tác nhân sinh học

Dung dịch Bevaloid 211

2

Chất phân tán

40%
Gum arabic

1

Chất bảo vệ khi sấy

Bảng 2: thành phần chế phẩm kỹ thuật
2.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm

- Hiệu lực diệt sâu, kích thước hạt, độ ẩm, pH, độ thấm ướt, độ phân tán, độ tạo huyền
phù, độ nhớt…
- Hiệu lực sinh học
Số lượng tế bào và bào tử tự do: Số lượng tê bào và bào tử: đếm trên kính hiển vi quang
học
số lượng bào tử tự do: đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch
Hiệu lực diệt sâu: Liều lượng gây chết ấu trùng côn trùng: LC50 và LC95
Liều thử 25-50 ấu trùng, Thời gian 24 giờ, số lần lặp lại 4-6 lần
Trọng lượng phân tử protein tinh thể: Xác định bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamid (PAGE

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 21


Báo Cáo Tiểu Luận
2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành tinh thể Cry

Hình 13. Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc
- Nhiệt độ thích hợp: 25 – 35oC; Topt = 30oC
- pH thích hợp: 7,0; pH quá cao hoặc quá thấp làm biến tính tinh thể.
- Lượng oxy đưa vào môi trường phải tuỳ theo từng giai đoạn:
Giai đoạn sinh trưởng thiếu oxy: tích luỹ sinh khối giảm mạnh.
Giai đoạn tạo bào tử và hình thành tinh thể độc: thừa oxy lượng bào tử không thay đổi
nhưng lượng tinh thể tạo thành giảm mạnh.
- Tác động của axit amin:
Lơxin và izolơxin ức chế sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Bt. Nếu có mặt thêm
valin thì tác dụng ức chế bị mất đi.
Có mặt treonin hoặc serin ức chế sinh trưởng và sự hình thành bào tử của Bt. Nếu có mặt

của cả hai axit amin cùng một lúc thì tác dụng ức chế bị mất đi. Tác dụng ức chế của
serin mất đi khi có mặt của metionin.
Chất kháng sinh erythromycin ở nồng độ thấp chưa đủ ức chế sinh trưởng của Bt, nhưng
cản trở sự hình thành bào tử.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 22


Báo Cáo Tiểu Luận
III. ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BT
3.1. Ưu điểm
Kết quả thử nghiệm cho thấy các chế phẩm Bt diệt được gần 90% sâu hại, so với gần
80% của thuốc hoá học.
- Không gây ô nhiễm môi trường.
- Bt có hiệu lực cao đối với sâu đã kháng các loại thuốc gốc lân, carbamat,…
- Tinh thể độc do Bt tạo ra không thể hoà tan trong dịch dạ dày của người nên thuốc trừ
sâu sinh học Bt hoàn toàn vô hại đối với người, cũng như các sinh vật khác.
- Không độc với cá, ong mật và các loài thiên địch.
- Thời gian cách ly ngắn.
3.2 Hạn chế và cách khắc phục
- Chỉ diệt được sâu non khi chúng ăn lá, không diệt được trứng, nhộng và bướm.
- Dễ bị phân huỷ bởi tia cực tím có trong ánh mặt trời.
- Có tác động vi độc, không tiếp xúc.
- Hạn chế lớn nhất là phát tác chậm, 48 tiếng sau khi ăn độc tố thì sâu mới chết. Tác động
của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi sinh thường có
quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ bệnh phải mất 1-3
ngày.
Thuốc vi sinh có công nghệ sản xuất phức tạp thủ công nên giá thành cao ở Việt Nam .

Cách khắc phục:
- Nên chú ý phun sớm từ khi sâu non từ 1-3 ngày tuổi.
- Nên phun vào lúc chiều mát.
- Cần phun ướt đều hai mặt lá.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 23


Báo Cáo Tiểu Luận

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 24


Báo Cáo Tiểu Luận
IV. KẾT LUẬN
Mặc dù có những nhược điểm ko thể tránh khỏi nhưng hiệu quả của thuốc trừ sâu sinh
học từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis là không thể phủ nhận.Với những đặc tính không
gây hại cho môi trường và sinh vật có lợi thì chế phẩm sinh học thuốc trừ sâu Bt nên
được sử dụng rộng rãi để thay thế các sản phẩm hóa học.
Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinh
học trên thế giới cũng như ở nước ta diệt được nhiều loại côn trùng gây hại cho cây trồng.
Thuốc trừ sâu Bt là công cụ diệt sâu bệnh thực vật mới. Vấn đề khai thác mọi khả năng
giảm thiệt hại mùa màng và tăng sản lượng lương thực trở nên cấp bách khi dân số toàn
cầu tăng lên nhanh chóng và diện tích đất canh tác lại giảm đáng kể. Cùng với kỹ thuật
canh tác nông nghiệp thích hợp, công nghệ kháng côn trùng Bt có thể đem lại rất nhiều
lợi ích cho loài người.

GVHD: PHẠM MINH TUẤN

Page 25