ĐÁNH GIÁ TÍNH GỐC CỦA TẾ BÀO UNG THƯ KHI BIỂU HIỆN VƯỢT MỨC CD47

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

ĐÁNH GIÁ TÍNH GỐC CỦA TẾ BÀO UNG
THƯ KHI BIỂU HIỆN VƯỢT MỨC CD47

Chuyên ngành : Sinh lý Động vật

Cán bộ hướng dẫn : TS. Phạm Văn Phúc


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
LUẬN VĂN THẠC SĨ
ĐÁNH GIÁ TÍNH GỐC CỦA TẾ BÀO UNG
THƯ KHI BIỂU HIỆN VƯỢT MỨC CD47

Chuyên ngành : Sinh lý động vật
Mã số : 60 42 30

Xác nhận của Cán bộ hướng dẫn

TS. Phạm Văn Phúc

Tp.HCM, Tháng 05 năm 2015

MỤC LỤC

!"#

1. Tính cấp thiết của đề bài ................................................................................ 1
2. Tổng quan ...................................................................................................... 2
3. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................... 9
4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 9
5. Các phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 10
6. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 10
7. Nơi thực hiện đề tài ...................................................................................... 19
8. Thời gian thực hiện ....................................................................................... 19
9. Tài liệu tham khảo ........................................................................................ 19
!


1. Tính cấp thiết của đề tài
Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới,
đặc biệt là những nước đang phát triển. Ung thư có thể tấn công bất cứ ai, không phân
biệt tuổi tác, giới tính, môi trường và hoàn cảnh xã hội. Hiện nay, căn bệnh này đã và
đang trở thành ám ảnh cho bệnh nhân và gánh nặng cho gia đình và xã hội. Theo
thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2012, 8.2 triệu người chết do ung
thư, 60% ca mắc thường niên thuộc khu vực Châu Phi, Châu Á, khu vực Trung và
Nam Mỹ. Ung thư bắt nguồn từ những tế bào tăng sinh và phân chia không kiểm soát,
gây ra bởi những đột biến trên DNA tác động đến những gien thúc đẩy quá trình phân
chia tế bào và ức chế những cơ chế chống ung thư tự nhiên. Các nghiên cứu cho thấy
không phải tất cả tế bào ung thư đều giống nhau. Trong một khối u ác tính hoặc giữa
những tế bào ung thư bạch cầu trong hệ tuần hoàn, có thể có rất nhiều loại tế bào. Từ

đó xuất hiện những giả thuyết về sự tồn tại những loại tế bào giống tế bào gốc trong
khối u, gọi tắt là những tế bào gốc ung thư.
Việc xâm lấn của những tế bào giống tế bào gốc có một vài tính chất đặc biệt,
ví dụ như khả năng lẩn trốn hệ miễn dịch của và tính kháng với liệu pháp hóa trị liệu.
Việc xác định những tế bào giống tế bào gốc trong ung thư và hiểu rõ về tính chất
của nó sẽ mang tính quyết định khi phát triển liệu pháp chống ung thư mới, khi những
quần thể tế bào ung thư khác nhau trong khối u có thể chuyển đổi qua lại giữa lại một
tế bào phân chia nhanh nhưng không xâm nhập và những tế bào giống tế bào gốc
phân chia chậm nhưng có khả năng di cư nhanh.
Việc xác định những con đường mà tế bào sử dụng để điều hòa sự tăng sinh,
biệt hóa và sống sót có vai trò rất quan trọng để hiểu rõ về cơ chế ung thư và cũng rất
cần thiết để thiết kế những trị liệu mới cho căn bệnh nguy hiểm này. Trong chiều
hướng này, đã có rất nhiều gien và đường truyền liên hệ đến tiến trình ung thư được
khám phá và ứng dụng. Tại PTN Tế bào gốc, chúng tôi nghiên cứu gien CD47 để tìm
hiểu cơ chế biệt hóa và tái biệt hóa tế bào gốc ung thư. Nghiên cứu này dựa trên một
số tính mới về con đường truyền tín hiệu liên quan đến CD47 giới hạn khả năng sống

1


sót và tái tạo tế bào sau stress, người ta thấy rằng CD47 tăng biểu hiện trên bề mặt
của tế bào ung thư làm tăng cường khả năng tăng sinh và sống sót.[1] Như thế, việc
nghiên cứu về gien CD47 và chức năng trong tế bào gốc ung thư có tiềm năng giúp
tìm ra những cơ chế và liệu pháp mới cho bệnh ung thư.
2. Tổng quan:
2.1.

Thuyết tế bào gốc ung thư
Từ lâu, nhiều nhà nghiên cứu đã đặt ra giả thiết về mối liên hệ giữa tế bào gốc

và tế bào ung thư. Cách đây hơn 150 năm, Durante (1874) đã đề xuất rằng ung thư
bắt nguồn từ một quần thể nhỏ tế bào bình thường mang tính chất của tế bào gốc. Sau
đó 1 năm, Cohnheim (1875) đưa ra một giả thiết là tế bào gốc có thể đi lạc trong quá
trình hình thành phôi và trở thành nguồn gốc của khối u có thể hình thành trong quá
trình sống. Trong một thời gian dài, nhiều nhà nghiên cứu đã xem xét giả thiết này để
khẳng định sự tồn tại của tế bào gốc ung thư. Sau nhiều năm, nhiều nhà nghiên cứu
đã dần khẳng định được sự tồn tại một quần thể tế bào giống tế bào gốc trong những
khối u ung thư (Bruce WR,1963); (Kleismith LJ, 1964); (Makino, 1956); (Park CH,
1971); (Hamburger AW, 1977).[2]
Năm 1994, John E.Dick và cộng sự lần đầu tiên đã chứng minh được hầu hết
những tế bào bạch cầu dòng tủy ác tính có khả năng tăng sinh giới hạn, từ đó đưa ra
đề xuất rằng những dòng tế bào bạch cầu có thể được duy trì bằng một quần thể tế
bào gốc rất nhỏ[3]. Tính đến nay, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được sự tồn tại
của một quần thể nhỏ các tế bào khởi nguồn ung thư, có khả năng tái tạo lại quần thể
tế bào ung thư khi được cấy ghép dị loài.[4, 5]
Thuyết tế bào gốc ung thư cho rằng trong tất các tế bào ung thư sẽ có một vài tế
bào hoạt động như tế bào gốc, tạo ra chính nó và duy trì ung thư, giống như những tế
bào gốc bình thường khác tự làm mới và duy trì những cơ quan và mô trong cơ thể
chúng ta. Theo thuyết này, những tế bào ung thư không phải tế bào gốc không thể
duy trì sự tấn công cơ thể chúng trong một thời gian dài. Từ đó, ý tưởng rằng tế bào
ung thư chủ yếu được thúc đẩy bởi một quần thể tế bào gốc nhỏ có ý nghĩa quan

2


trọng. Ví dụ, nhiều liệu pháp chống ung thư được đánh giá dựa trên khả năng làm teo
khối u, những nếu liệu pháp không giết những tế bào gốc ung thư, khối u sẽ sớm mọc
trở lại (thường kháng lại với những liệu pháp được sử dụng như hóa và xạ trị). Có thể
so sánh với việc cắt cỏ, được đánh giá dựa trên việc có thể cắt cỏ thấp tới mức nào,
những không quan trọng là cỏ được cắt bao nhiêu, nếu bộ rễ không được nhỏ đi thì

cỏ vẫn có thể mọc lại.
Ý nghĩa của tế bào gốc ung thư trong trị liệu ung thư[6]
Nếu những tế bào gốc ung thư là nguồn cơ bản dẫn đến sự tăng trưởng và di cư
của ung thư, do đó tác động nhằm điều trị ung thư phải nhắm đến tế bào gốc ung thư.
Việc teo nhỏ khối u ung thư hoặc giảm tác động của những tế bào ung thư máu trong
dòng máu có thể đem lại sự suy giảm tạm thời, nhưng không thể tiếp tục chữa trị
trong một thời gian dài nếu những tế bào gốc ung thư không được loại bỏ. Hơn nữa,
nếu chỉ những tế bào gốc ung thư bị loại bỏ, những tế bào ung thư còn sót lại trong
cơ thể sẽ bị các tế bào của hệ miễn dịch tấn công hoặc chết tự nhiên khi những tế bào
ung thư không phải là tế bào gốc, được xác định là không có khả năng tự làm mới.

Hình 1: Liệu pháp teo nhỏ khối u dựa trên việc tấn công tế bào gốc ung thư (CSC)

3


Vì vậy, những liệu pháp hữu hiệu nhất để điều trị ung thư trong tương lai sẽ tập
trung vào mục tiêu là tế bào gốc ung thư. Việc tìm kiếm những liệu pháp sẽ cần những
hiểu biết nhất định của chúng ta về số lượng và biểu hiện của tế bào gốc ung thư.
Việc tìm hiểu về tế bào gốc ung thư cũng giúp chúng ta xác định liệu pháp hiệu
nay cho tác động tối đa, ví dụ, những nhà nghiên cứu tại trung tâm Y học và nghiên
cứu tế bào gốc ung thư Ludwig, khám phá ra lý do rằng tế bào gốc, bao gồm tế bào
gốc ung thư, kháng lại những bức xạ ion được sử dụng trong nhiều trị liệu ung thư.
Trong tương lai, việc hiểu biết về tính kháng này sẽ giúp những nhà nghiên cứu tìm
ra những phức hợp phá hoại quá trình này và làm cho những tế bào tế bào gốc ung
thư bị tổn thương bởi sự phá hủy này.
Những bằng chứng đầu tiên về việc xác định tế bào gốc từ những khối u rắn đã
được Al-Hajj và cộng sự công bố, khi phân lập những tế bào sinh u từ khối mô ung
thư vú bằng cách sử dụng kĩ thuật FACS để tinh sạch những quần thể có khả năng
hình thành khối u trong chuột bị suy giảm miễn dịch. Những tế bào ung thư biểu mô

vú được phân tách dựa vào biểu hiện CD44 và CD24 của nó, hai này cho biểu hiện
tương đối đồng nhất giữa những tế bào khối u. Những mẫu phân đoạn được ghép vào
tuyến vú của chuột NOD/SCID và chỉ phân đoạn CD44+/CD24- mang hoạt tính khởi
đầu khối u, trong khi với lượng tế bào gấp 100 từ những phân đoạn CD44 +/CD24+
hoặc CD44- không có khả năng hình thành khối u. [7]
2.2.

Tái thiết lập chương trình tế bào ung thư thành tế bào gốc ung thư.
Theo giả thiết trên thì tế bào gốc ung thư là những tế bào biểu trưng cho tình

trạng bệnh lý của tế bào gốc phôi hoặc tế bào gốc sinh dưỡng. Những tế bào gốc ung
thư này biểu hiện những marker chuyên biệt và những gen liên quan đến tính kháng
hóa xạ trị, tính gốc, quá trình chuyển dạng nội mô-trung mô, v.v.[8] Có nhiều liệu
pháp trị liệu đã được áp dụng nhưng vẫn chưa có liệu pháp nào có thể tiêu diệt hoàn
toàn ung thư. Trong trường hợp ung thú vú, có nhiều liệu pháp tập trung tác động
trúng đích vào tính gốc của tế bào gốc ung thư vú. Tất cả những liệu pháp đó đều
nhắm đến việc biệt hóa tế bào gốc ung thư vú thành những tế bào không phải tế bào

4


bào gốc ung thư vú. Thật vậy, khi chúng mất đi tính gốc, chúng sẽ mất tiềm năng
kháng với liệu pháp xạ trị hoặc hóa trị, cũng như giảm khả năng xâm lấn, di cư sang
những mô xung quanh. Một khái niệm mới nổi trong liệu pháp biệt hóa được đề xuất
bởi một công bố đáng chú ý, bằng cách knockdown CD44 trong những tế bào gốc
ung thư có kiểu hình CD44+/CD24- sẽ làm cho những tế bào biểu hiện những đặc
điểm không phải của tế bào gốc như tiềm năng sinh ung thấp, thay đổi chu trình tế
bào, biểu hiện gen,... [9] Mặt khác, từ khi xuất hiện tế bào iPSC (Yamanaka và cs,
2006), có thể chuyển biệt hóa trực tiếp từ tế bào chức năng trong cơ thể thành tế bào
có tính gốc giống tế bào gốc phôi, thông qua việc chuyển những nhân tái thiết lập

chương trình trực tiếp (OCT4, SOX2, Klf4 và c-Myc) với triển vọng có thể đem lại
hiệu quả lớn lao cho những liệu pháp y học tái tạo. Từ đó một giả thiết mới về việc
tái thiết lập chương trình tế bào gốc ung thư thành tế bào ung thư được đưa ra. Thật
vậy, những liệu pháp ung thư truyền thống chỉ có thể tấn công và giết những tế bào
ung thư của khối u nhưng không thể tiêu diệt tế bào gốc ung thư, vì thế khối u có thể
teo nhỏ nhưng có thể tăng sinh trở lại. Do đó, liệu pháp nhắm trúng đích tế bào gốc
ung thư ra đời với hy vọng có thể tấn công tất cả những tế bào gốc ung thư làm cho
khối u bị tiêu biến. Những nhà nghiên cứu đã thử áp dụng việc tái thiết lập chương
trình những tế bào ung thư bằng những gen tái thiết lập (Yamanaka, 2006) và đã thu
nhận những tế bào có biểu hiện marker bề mặt (CD44/CD24) giống với thuộc tính
của tế bào gốc ung thư.[10] Gần đây, trong một nghiên cứu của Kaur và cs (2013)
cho thấy mối liên quan giữa việc biểu hiện cao protein CD47 và những gen liên quan
đến tính gốc của tế bào ung thư. Cụ thể, trong nghiên cứu này cho thấy khi giảm biểu
hiện CD47 sẽ giúp tăng cường biểu hiện của những gen tính gốc như c-Myc, Klf,
Oct4 và Sox2.[11] Qua đó, mở ra một hướng nghiên cứu tiềm năng, liên quan đến
việc chuyển biệt hóa tế bào thông qua con đường CD47.

5


Hình 2: Tín hiệu của CD47 làm giới hạn khả năng tự làm mới của tế bào gốc.[1]
2.3.

Mối tương quan giữa những marker xác định tế bào gốc
Tế bào gốc ung thư có thể được định nghĩa là một quần thể tế bào hiện diện

trong khối u, có khả năng tự làm mới và biệt hóa. Giống như tế bào gốc thông thường,
tế bào gốc ung thư cũng có thể tạo ra tất cả những tế bào ung thư trong khối u và do
đó nó được gọi là tế bào gốc ung thư. Có rất nhiều bằng chứng hỗ trợ cho vai trò thiết
yếu của tập hợp tế bào này trong việc khơi mào và duy trì khối u, cộng với khả năng

điều khiển sự xâm lấn, di căn, tính hỗn tạp và kháng với liệu pháp điều trị.
Việc xác định và phân lập tế bào gốc ung thư bằng cách sử dụng những marker
bề mặt giữ một vai trò chính yếu trong nghiên cứu ung thư. Trong nhiều nghiên cứu
đã cho thấy rằng quần thể tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24- biểu hiện những gen
tiền xâm lấn cao và thấy biểu hiện xâm lấn cao hơn[12]. Theo nghiên cứu của AlHaji và cộng sự, 2003, một quần thể rất nhỏ (khoảng 200 tế bào) có biểu hiện marker
bề mặt CD44+/CD24-/low có thể hình thành khối u trong chuột NOD/SCID, trong khi
một quần thể lớn hơn (khoảng 1000 tế bào) được phân lập từ khối u lại không thể
hình thành khối u mới trong chuột NOD/SCID. Do đó, kiểu hình tế bào CD44+/CD24được sử dụng để xác định và phân lập những tế bào ung thư với tiềm năng sinh ung
cao[2].

6


Hình 3: Kiểu hình marker bề mặt tế bào của tế bào gốc ung thư trong một số
bệnh ung thư.[13]
Trong một nghiên cứu của Ginestier C, 2007 đã chứng minh một quần thể biểu
hiện ALDH+, dẫn đến sự oxi hóa retinol thành axit, một sự kiện xảy ra ở đầu giai
đoạn biệt hóa của tế bào gốc. Việc kết hợp kiểu hình CD44+/CD24- và ALDH+ để
chọn lọc tế bào gốc ung thư cho thấy rằng những tế bào có kiểu hình này có tiềm năng
sinh ung cao hơn những tế bào có kiểu hình CD44+/CD24- hoặc ALDH+.[14] Gần
đây, CD47 được lưu tâm cho nghiên cứu tế bào gốc ung thư cho sự biểu hiện của
CD24/CD44/CD47 giúp phân biệt những quần thể tế bào khác nhau giữa mô thường
và mô bệnh.[15]

7


2.4.

Protein CD47 :

CD47 (tên gốc là protein liên kết với integrin (IAP)) là một protein bề mặt tế

bào của siêu họ globulin miễn dịch (Ig), được glycosyl hóa nặng và biểu hiện hầu như
trên mọi tế bào trong cơ thể người và biểu hiện vượt mức trong nhiều loại tế bào ung
thư bao gồm ung thư vú, buồng trứng, ruột kết, tuyến tiền liệt và các loại ung thư
khác.[10] Đầu tiên CD47 được nhận diện như một protein có kích thước 50 kDa được
liên kết và tinh sạch cùng với α-v-ß-3 integrin trong nhau thai và các bạch cầu hạt
trung tính và sau đó cho thấy có khả năng điều hòa chức năng của integrin và sự đáp
ứng của các bạch cầu với các phức hợp protein ngoài màng chứa RDG. CD47 cũng
được xác định với kháng nguyên OA3/OVTL3 biểu hiện cao trong hầu hết các ung
thư biểu mô buồng trứng. CD47 cũng được xem là yếu tố điều hòa tính gốc của tế
bào [11].
CD47 bao gồm một vùng ngoại bào IgV, một vùng trải xuyên màng rộng 5 lần,
và một đuôi nội bào ngắn được ghép nối thay thế. Ở cả người và chuột, đuôi nội bào
có thể được tìm thấy ở 4 dạng cấu hình ghép nối từ 4 đến 36 amino acids, cho thấy
các khuôn mẫu biểu hiện trên mô khác nhau.
Các tương tác của CD47:


Thrombospondin-1 (TSP-1) : một glycoprotein tiết giữ vai trò trong sự phát
triển và hình thành mạch máu. Việc gắn TSP-1 với CD47 ảnh hưởng đến vài
chức năng cơ bản của tế bào gồm sự di cư và bám dính của tế bào, tăng sinh
hoặc apoptosis của tế bào, và giữ một vai trò trong sự điều hòa hình thành
mạch máu và phản ứng viêm.



Protein điều hòa tín hiệu α (SIRPα) – một thụ thể ức chế xuyên màng hiện diện
trong các tế bào dòng tủy. Tương tác CD47/SIRPα dẫn đến các tiến hiệu hai
chiều, gây ra các đáp ứng tế bào với tế bào khác nhau bao gồm sự ức chế thực

bào, kích hoạt sự dung hợp tế bào và hoạt hóa tế bào T.

8




Integrins – vài integrin màng, phổ biến nhất là integrin avb3. Những tương
tác đó dẫn đến hình thành phức hợp CD47/integrin tác động một loại các chức
năng tế bào gồm sự bám dinh, lan rộng và di cư.
Những tương tác đó với nhiều protein và nhiều loại tế bào tạo ra vài chức năng

quan trọng, bao gồm : sự tăng sinh của tế bào, sự chết theo chu trình tế bào, sự di cư,
sự hình thành mạch và các đáp ứng viêm. Liên kết của CD47 gây ra các loại đáp ứng
khác nhau, phụ thuộc vào loại tế bào và phối tử của liên kết đó.
Kiểu hình M2 của những đại thực bào liên kết với khối u (TAM) hiện diện trong
nhiều khối u và thường liên kết với quá trình tiến triển của vài loại ung thư. Mô ung
thư đại tràng người được chứng minh là biểu hiện vượt trội những tế bào CD68+
(marker của đại thực bào) và những tế bào CD206+ (dấu hiệu đại thực bào M2) và
tăng biểu hiện của CD47[16]
Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra con đường tín hiệu CD47-SIRPα trong nội
cân bằng miễn dịch và trong điều hòa mạng lưới tế bào thần kinh. Những tiến bộ
trong việc phân tích cấu trúc và chức năng của con đường tín hiệu CD47- SIRPα cung
cấp các gợi ý thú vị cho các lợi ích của liệu pháp thao tác trên hệ thống tín hiệu này
trong các bệnh tự miễn, ung thư và rối loạn thần kinh [17].
Khía cạnh trị liệu và lâm sàng của CD47 trong bệnh ung thư ở người.
CD47 biểu hiện vượt mức trong nhiều loại tế bào của các bệnh ung thư ở người
và chức năng của chúng được biết như là một tín hiệu “đừng ăn tôi”, cho thấy tiềm
năng để nhắm trúng đích con đường CD47-SIRPα như một liệu pháp chung cho các
khối u ác tính ở người[18, 19]. Sự tăng điều hòa biểu hiện CD47 ở các bệnh ung thư

người cũng ảnh hưởng tới sự tăng trưởng và lan rộng khối u. Đầu tiên, việc tăng biểu
hiện của CD47 trong vài khối u máu ác tính được tìm thấy có liên quan với một tiên
lượng lâm sàng tồi tệ hơn và trong ALL để tiên lượng sự dai dẳng với các liệu pháp
hóa trị tiêu chuẩn[19-22]. Thứ hai, CD47 được chứng minh để điều hòa sự di căn và
lan rộng của khối u trong cả HM và NHL[19].

9


CD47 biểu hiện rộng khắp trên bề mặt tế bào là thụ thể cho thrombospondin-1
và SIRPα. Liệu pháp kháng thể trúng đích CD47 tác động đến tế bào gốc ung thư vú
thông qua việc giảm biểu hiện thụ thể EGFR trên bề mặt tế bào. Đây là một cơ chế
mới đưa kháng thể khóa CD47 trở thành một liệu pháp ứng viên tiềm năng cho điều
trị bệnh ung thư vú triple-negative (triple negative breast cancer-TNBC).[23]
Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để phát triển các liệu pháp ức chế con đường
CD47-SIRPα, chủ yếu qua việc ngăn chặn các kháng thể đơn dòng trực tiếp kháng
CD47, nhưng cũng có thể với một loại protein SIRPα tái tổ hợp cũng có thể gắn và
ngăn chặn CD47.
Trong khi các liệu pháp đơn nhắm đến CD47 có hiệu quả trong vài mô hình
khối u tiền lâm sàng, các chiến lược kết hợp liên quan đến sự ức chế con đường CD47SIRPα thường đem lại tiềm năng liệu pháp lớn hơn. Đặc biệt là, các kháng thể nhắm
đến CD47-SIRPα có thể bao gồm trong các liệu pháp với các kháng thể liệu pháp
khác, các tác nhân tăng cường đại thực bào, liệu pháp hóa trị hoặc như một liệu pháp
tá dược để ức chế sự di căn[19].
Hơn thế nữa, sự tăng điều hòa qua gián tiếp liệu pháp hóa – xạ trị của các
calreticulin trên bề mặt tế bào có thể làm tăng tiềm năng hoạt động của kháng thể
kháng CD47. Tuy nhiên, hướng tiếp cận cũng có thể dẫn đến sự tăng tính độc như
calreculin bề mặt tế bào được biểu hiện trên các tế bào không phải ung thư trải qua
quá trình apoptosis, một tác động chủ yếu của liệu pháp hóa – xạ trị[24].

10

Hình 4: Cơ chế nhắm trúng đích con đường CD47/SIRPα trong ung thư[19].
Liệu pháp nhắm trúng đích của con đường CD47/SIRPα có thể gây ra việc loại
bỏ các tế bào ung thư qua nhiều cơ chế khác nhau. Đầu tiên sự ức chế tương tác
CD47-SIRPα với một kháng thể ngăn chặn kháng CD47, một kháng thể ngăn chặn
kháng SIRPα hoặc một protein SIRPα tái tổ hợp (ở đây mô tả như một protein dung
hợp kép với Fc) dẫn đến sự thực bào “ăn” các tế bào khối u của các đại thực bào.
Thứ hai, một kháng thể kháng CD47 có thể loại bỏ các tế bào khối u qua các cơ chế
truyền thống phụ thuộc Fc kháng thể bao gồm ADCC và CDC gián tiếp qua tế bào
NK. Thứ ba, kháng thể kháng CD47 trực tiếp kích hoạt quá trình apoptosis của các tế
bào khối u qua một cơ chế không phụ thuộc caspase. Thứ tư, kháng thể kháng CD47
cũng có khả năng thực bào các tế bào khối u bằng các tế bào tua (DC) và tiếp tục trình
diện kháng nguyên với các tế bào T CD4 và CD8, theo đó kích hoạt một đáp ứng
miễn dịch thích ứng kháng khối u.
Một số nghiên cứu đã chứng minh bằng cách nào mà tế bào ung thư có thể duy
trì mức độ biểu hiện CD47 cao để lẩn trốn sự tấn công của hệ miễn dịch, trong khi

11


vẫn duy trì đồng thời những tế bào gốc ung thư/tế bào khởi phát khối u giúp duy trì
sự phát triển của khối u.[1]
3. Mục đích nghiên cứu
Con đường biệt hóa tế bào gốc ung thư thành tế bào ung thư không phải là con
đường một chiều. Đã có những nghiên cứu cho thấy một số tế bào trong quần thể khối
u có khả năng tái biệt hóa thành tế bào gốc ung thư, dẫn đến khả năng duy trì ung thư
lâu dài. Như vậy về chiến lược, nếu có thể dùng một phương pháp nào đó để tái thiết
lập chương trình tế bào ung thư thành tế bào gốc ung thư, sẽ mở ra một hướng đi mới
trong trị liệu ung thư thông qua tiêu diệt hoàn toàn tế bào gốc ung thư. Gần đây, nhiều

nghiên cứu đã cho thấy rằng có một mối liên quan mật thiết giữa việc biểu hiện CD47
và tính gốc của tế bào gốc. Mục đích của nghiên cứu nhằm bước đầu đánh giá ảnh
hưởng của CD47 lên tính gốc của tế bào ung thư khi biểu hiện vượt mức CD47. Mặt
khác, bước đầu đánh giá việc sử dụng CD47 như một marker mới trong việc nhận
diện tế bào gốc ung thư.

knockdown CD44

Cancer
stem
cell

Cancer
cell
Overexpression CD47

4. Đối tượng nghiên cứu
 Vector pcDNA3.4 mang gen CD47 được thiết lập tại Phòng Thí nghiệm
Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc bằng cách phân lập mRNA mã hóa cho protein
CD47 từ tế bào gốc ung thư, gắn vào plasmid pcDNA3.4 có gắn sẵn enzyme
Topoisomerase, giúp cho việc gắn gen dễ dàng hơn.
 Tế bào ung thư vú MCF-7 (Michigan Cancer Foundation 7) là một dòng tế bào
ung thư vú ác tính người, được phân lập từ mô vú của một người phụ nữ gốc Âu năm

12


1970. Dòng tế bào này đã được sử dụng trong nghiên cứu khởi đầu của thụ thể
estrogen và hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu.
5. Các phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát:
Tế bào gốc ung thư

Vector mang gene
CD47

RNA tổng số

Gắn vào
plasmid

RT-PCR
Gen CD47

Chuyển gen
Tế bào ung thư
MCF-7

Đánh giá biểu hiện
gen CD47

Real
time RTPCR

trước và sau khi chuyển gen
Đánh giá tính gốc (trước và
sau khi chuyển gen)

Flow
Cytometr

y

Đánh giá biểu
hiện gen
CD44+/CD24/CD47

Khả
năng
tạo
sphere

Tính kháng
thuốc
(Tamoxifen,
Verapamil,
Doxorubicine)

Khả
năng
sinh ung
trong in
vivo

5.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
 Thu toàn bộ huyền phù tế bào cho vào một eppendorf 1.5ml sạch.
 Ly tâm 13000 vòng, 40C trong 5 phút để loại môi trường nuôi cấy.
 Rửa tế bào với PBS (-) và ly tâm thu tế bào tại 13.000 rpm, 40C trong 5 phút.
 Đổ bỏ PBS (-) và huyền phù đều tế bào trong 1 ml easyBlue đến khi không
còn thấy cặn tế bào.
 Bổ sung 200 μl chloroform, đảo eppendorf vài lần, lắc kĩ đến khi hỗn hợp trộn

lẫn thành một pha.

13


 Ly tâm 13.000 rpm, 40C trong 10 phút. Sau khi ly tâm, hỗn hợp sẽ được phân
tách thành 3 lớp (1) DNA sẽ hòa tan trong pha phenol (pha easyBlue có màu xanh),
(2) màng tế bào và các protein bị biến tính khác (cặn màu trắng phân tách giữa hai
lớp), (3) RNA hòa trong pha nước ở phía trên cùng.
 Cẩn thận thu nhận khoảng 400 μl pha nước vào một eppendorf sạch.
 Tủa RNA bằng cách bổ sung 400 μl isopropanol lạnh với tỉ lệ 1:1 vào
eppendorf. Để hỗn hợp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
 Ly tâm 13.000 rpm, 40C trong 10 phút để thu cặn.
 Rửa tủa RNA thu nhận được bằng cách bổ sung 1ml Ethanol 70 lạnh. Đảo
eppendorf vài lần.
 Ly tâm 10.000 rpm, 40C trong 10 phút để thu RNA. Đổ bỏ dung dịch đợi tủa
RNA khô.
 Huyền phù tủa RNA thu nhận được trong 50 μl nước đã xử lý DEPC.
5.1.

Phương pháp RT-PCR cho gien CD47

Nguyên tắc: sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase để tổng hợp
gen dựa trên mạch nền là mRNA.
Quy trình thực hiện:
Thành phần

Thể tích

ONE-STEP RT-PCR Premix

4 𝜇𝑙

RNA template

1 𝜇𝑙

Mồi xuôi (10 mM)

0.5 𝜇𝑙

Mồi ngược (10 mM)

0.5

Nước Mili-Q

4 𝜇𝑙

 Tổng hợp toàn bộ trình tự nucleotide của protein CD47 bằng mồi chuyên biệt
cho gen CD47.
 Sử dụng kit ONE-STEP RT-PCR Premix kit của Intron
 Thành phần phản ứng

14


 Chu trình luân nhiệt
Bước

Thời gian

Nhiệt độ (0C)

Phiên mã ngược

30 phút

45

Bất hoạt enzyme

5 phút

95

Biến tính

30 giây

95

Bắt cặp

30 giây

55

Kéo dài

1 phút

72

Kéo dài cuối cùng

10 phút

72

Các cặp mồi được sử dụng :
Gien

Trình tự mồi

Kích thước

GAPDH

5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3'

238 bp

5' - TTGATTTTGGAGGGATCTCG - 3'
CD47

5' - GAGATGTGGCCCCTGGTA - 3'

Full length

5' - TCCATCACTTCACTTCAGTTATTC - 3'

CD47

5' - GGCAATGACGAAGGAGGTTA - 3'

~ 900 bp
217 bp

5' - ATCCGGTGGTATGGATGAGA - 3'
5.2. Phương pháp Realtime RT-PCR:
Nghiên cứu này sử dụng kit Brilliant III Ultra-Fast SYBR green QRT-PCR của
hang Thermo Scientific. RNA tổng số sau khi được thu nhận định lượng được sử
dụng để thực hiện phản ứng realtime RT-PCR. RNA tổng số sẽ được reverse bởi hoạt
động của dung dịch DTT.
Các thành phần trong phản ứng Realtime RT-PCR
Thành phần

Thể tích

SYBR Green QRT-PCR master mix

10 𝜇𝑙

15


DTT

0.2 𝜇𝑙

RT/RNase block

1 𝜇𝑙

RNA template

1 𝜇𝑙

Mồi xuôi

0.2 𝜇𝑙

Mồi ngược

0.2 𝜇𝑙

Nước Mili-Q

7.4 𝜇𝑙

Phản ứng phiên mã RNA thành DNA
Bước

Thời gian (phút)

Nhiệt độ (0C)

Phiên mã ngược

60

45

Bất hoạt enzyme

5

94

Chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt xác định nhiệt độ nóng chảy
Bước

Thời gian

Nhiệt độ (0C)

Biến tính

15 giây

95

Bắt cặp

15 giây

60

Biến tính từ từ

20 phút

95

Các cặp mồi được sử dụng cho phân tích biểu hiện gien
Gien

Kích thước

Trình tự mồi

GAPDH 5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3'

238 bp

5' - TTGATTTTGGAGGGATCTCG - 3'
CD47

5' - GGCAATGACGAAGGAGGTTA - 3'
5' - ATCCGGTGGTATGGATGAGA - 3'

16

217 bp


5.3. Tạo dòng protein CD47 tái tổ hợp:
Sử dụng hệ thống plasmid biểu hiện pcDNA 3.4 trên dòng tế bào HEK 293.

Hình 3: Sơ đồ plasmid pcDNA3.4
Nguyên tắc hoạt động của hệ thống TOPO:
pcDNA 3.4-TOPO được cung cấp ở dạng mạch thẳng với một đầu 3’ thymidine
(T) nhô ra giúp cho tạo dòng TA, enzyme topoisomerase liên kết cộng hóa trị với
vector (dạng vector “được hoạt hóa)
Enzyme Taq polymerase có hoạt tính transferase ở đầu cuối không phụ thuộc
mạch nền giúp gắn một deoxyadenosine (A) vào cuối đầu 3’ của sản phẩm PCR. Mặt
khác trên vector có một gốc deoxythymidine (T) nhô ra, cho phép sản phẩm PCR
chèn hữu hiệu vào vector.

17


Enzyme Topoisomerase I từ virus Vaccinia gắn với DNA mạch đôi tại các vị trí
chuyên biệt khung phosphodiester sau vị trí 5’-CCCTT trong một mạch (Shuman,
1991). Năng lượng từ việc phá vỡ khung sườn phosphodiester được chuyển đổi bằng
sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa đầu 3’ phosphate của mạch bị cắt và gốc
tyrosyl (Tyr-274) của enzyme Topoisomerase I. Sau đó, liên kết phosphor-tyrosyl
giữa DNA và enzyme có thể bị tấn công bởi đầu 5’OH của mạch gốc bị cắt, đảo chiều
phản ứng và giải phóng enzyme topoisomerase (Shuman, 1994). Phản ứng tạo dòng
TOPO lợi dụng phản ứng này để tạo dòng sản phẩm PCR hữu hiệu.
Khi sản phẩm PCR được clone vào vector pcDNA3.4-TOPO và các thể biến
nạp được phân tích đúng chiều vector và khung đọc mở, plasmid biểu hiện có thể
được chuyển vào dòng tế bào mong muốn.
5.4. Phương pháp chuyển gen bằng lipofectamine :
Sử dụng chuyển plasmid DNA vào tế bào động vật trên đĩa 24 giếng.
 Trước khi chuyển gen, phân tách và đếm tế bào. Bổ sung khoảng 0.5 -1.25x105
tế bào trên một giếng trong 0.5ml môi trường tăng trưởng hoàn chỉnh. Mật độ tế bào
trải nên vào khoảng 50-80% bề mặt đĩa nuôi vào ngày chuyển gen.

 (Tùy chọn) Vào ngày chuyển gen, loại bỏ môi trường cũ và thay thế với 0.5ml
môi trường tăng trưởng hoàn chỉnh.
 Trên mỗi giếng tế bào cần chuyển, pha loãng 0.5 μg DNA in 100 μl môi trường
không có huyết thanh.
 Với mỗi giếng, bổ sung 0.75-1.75 μl Lipofectamine đặt phía trên dung dịch
môi trường:DNA, trộn đều và ủ khoảng 30 phút tại nhiệt độ phòng.
 Sau 30 phút ủ, bổ sung 100 μl hỗn hợp DNA-Lipofectamine trực tiếp vào mỗi
giếng chứa tế bào và trộn đều bằng cách gõ đáy và thành đĩa.
 Không được loại bỏ phức hợp sau khi chuyển. Ủ tế bào tại 37oC trong tủ ấm
CO2 trong khoảng 18-24h sau khi chuyển, trước khi biểu hiện gen chuyển.

18


5.5. Phương pháp nuôi cấy tạo khối tế bào (sphere formation assay)
 Tế bào được nuôi ở mật độ 1000 tế bào/ml trong môi trường DMEM/F12
không huyết thanh, được bổ sung nhân tố tăng trưởng bFGF 10 ng/ml, EGF 20 ng/ml,
5 ng/ml insulin và 0.4% BSA.
 Tế bào được nuôi cấy trong điều kiện đó sẽ hình thành những cụm tế bào khối
cầu không bám dính, gọi là “sphere” hay “mammosphere”).
 Số lượng sphere trong mỗi giếng nuôi cấy được đánh giá sau 7 ngày.
5.6. Phương pháp Flow Cytometry
Trong sinh vật đa bào, DNA của tất cả các tế bào đều giống nhau nhưng protein
thì khác nhau rất nhiều, dựa vào đó có thể phân tách các loại tế bào khác nhau trong
một quần thể tế bào. Kỹ thuật Flow Cytometry được thực hiện bằng một thiết bị đặc
biệt Fluorescene Activated Cell Sorting (FACS) cho phép :
 Phân tách các tế bào có kiểu hình khác nhau.
 Xác định số lượng tế bào biểu hiện protein quan tâm.
 Định lượng biểu hiện của protein trong quần thể tế bào.
Ban đầu quần thể tế bào được đặt vào một bình chứa và mỗi lần chỉ cho một tế

bào đi qua ống phân tích, tạo thành một dòng chảy nhỏ giọt. Khi một tế bào đi xuống
theo dòng chảy chất lỏng sẽ bị quét bằng tia laser. Một số ánh sáng laser sẽ bị tế bào
tán xạ và được một đầu dò cảm biến thu nhận và truyền dữ liệu đến máy tính. Tại
đây, dữ liệu thu được sẽ được phân tích và biểu diễn dưới dạng đồ thị.
Nếu muốn tách riêng một quần thể tế bào, ta có thể dùng một loại kháng thể có
gắn huỳnh quang gắn chuyên biệt với một loại protein duy nhất có trên bề mặt tế bào
mục tiêu. Ánh sáng laser sẽ kích thích các thuốc nhuộm phát ra một ánh sáng sẽ được
máy cảm biến thu nhận và truyền đến máy tính xử lý. Bằng cách thu thập thông tin
ánh sáng, máy tính có thể xác định các loại tế bào được phân tách và thu nhận chúng.
Kết quả được biểu diễn qua đồ thị dot plot với trục X biểu diễn trị số FSC (kích
thước tế bào), và trục Y biểu diễn trị số SSC (độ đậm đặc của tế bào chất).

19


5.7. Phương pháp đo đường cong tăng trưởng tế bào thực thời (Hệ thống
xCelligence)
Phương pháp này sử dụng hệ thống xCelligence được phát triển bởi Roche và
ACE Biosciences để ghi nhận sự tăng sinh tế bào thực thời. Về nguyên tắc thí nghiệm
trên hệ thống này cũng dựa trên các thí nghiệm đo đường cong tăng trưởng của tế
bào. Tuy nhiên, thay vì sử dụng đĩa 96 giếng thông thường thì các tế bào được cấy
lên một đĩa 96 giếng đặc biệt (E-plate) với các vi điện cực bằng vàng được bao phủ
dưới lớp đáy. Càng nhiều tế bào bám dính vào đáy giếng thì trở kháng của điện cực
sẽ càng tăng. Tuy nhiên, ngoài số lượng tế bào, các yếu tố khác như sự tương tác di
dộng của tế bào, hình thái tế bào cũng ảnh hưởng đến trở kháng. Do đó, trở kháng
điện cực sẽ thể hiện chỉ số tế bào (Cell Index – CI) phản ánh tình trạng sinh học của
tế bào bao gồm hình thái tế bào, số lượng tế bào sống, số lượng tế bào bám dính. Như
vậy, chỉ số tế bào (CI) là một thứ nguyên tham số, biến động tùy thuộc vào tình trạng
tế bào, theo các quy tắc sau:
 Khi không có tế bào, hoặc tế bào không bám dính vào điện cực ở đáy, chỉ số

CI bằng 0. Trong cùng điều kiện sinh lý, càng nhiều tế bào bám thì chỉ số CI càng
lớn. Hơn nữa, sự thay đổi trạng thái tế bào như hình thái, sự bám trải, sức sống sẽ dẫn
đến sự thay đổi CI.
 Đặc điểm ưu việt của hệ thống này chính là khả năng ghi nhận số liệu thực
thời chính xác đến từng phút, cho phép theo dõi sự tăng sinh tế bào, sự ảnh hưởng
của các tác nhân lên tế bào mà không cần phải can thiệp trực tiếp vào tế bào như các
phương pháp khác như MTT, XTT, BrdU.
Các thuốc kháng u
Thí nghiệm thực hiện với những mẫu tế bào chỉ xử lý từng loại thuốc:
Doxorubicine, Verapamil, Tamoxifen.
 Nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú
 Ly tâm thu nhận tế bào và bổ sung môi trường nuôi cấy mới, huyền phù
đều

20


 Đếm chính xác lượng tế bào bằng máy đếm tế bào hoặc trypan blue
 Pha loãng dịch huyền phù tế bào để mỗi 50 𝜇𝑙 dịch thì có 1000 tế bào vào
mỗi giếng.
 Sau 6h, khi tế bào đã bám xuống bề mặt đĩa, cho vào mỗi giếng môi trường
với những nồng độ Doxorubicin khác nhau 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 và 1 𝜇𝑔/ml.
6. Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu, giải quyết và phát
triển về kết quả đạt được
 Nội dung 1: Tạo thành công vector pcDNA3.4 mang gen CD47.
 Nội dung 2: Đánh giá tế bào MCF-7 là tế bào ung thư vú, không biểu hiện
những đặc điểm của tế bào gốc trước khi chuyển gen.
 Nội dung 3: Đánh giá biểu hiện tính gốc của MCF-7 sau khi chuyển gen.
7. Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn
Phòng Thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Cơ sở Linh Trung
Tòa nhà B23 – Khu phố 6, Phường Linh Trung, Quận Thủ Đức, Tp.HCM.
8. Thời gian thực hiện: 05/2015 – 30/09/2016
9. Các tài liệu tham khảo được sử dụng khi viết đề cương

1.

2.
3.

4.

Soto-Pantoja, D.R., S. Kaur, and D.D. Roberts, CD47 signaling
pathways controlling cellular differentiation and responses to stress.
Crit Rev Biochem Mol Biol, 2015: p. 1-19.
Pham, P.V., Breast cancer treatment by targeting breast cancer stem
cells - Gene therapy and Immunotherapy Strategies. 2012.
Lapidot, T., et al., A cell initiating human acute myeloid leukaemia
after transplantation into SCID mice. Nature, 1994. 367(6464): p.
645-8.
Trosko, J.E. and M.H. Tai, Adult stem cell theory of the multi-stage,
multi-mechanism theory of carcinogenesis: role of inflammation on
the promotion of initiated stem cells. Contrib Microbiol, 2006. 13: p.
45-65.
21


5.

6.

7.
8.
9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

O'Brien, C.A., et al., A human colon cancer cell capable of initiating
tumour growth in immunodeficient mice. Nature, 2007. 445(7123): p.
106-10.
Reya, T., et al., Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature,
2001. 414: p. 105 - 111.
Al-Hajj, M., et al., Prospective identification of tumorigenic breast
cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(7): p. 3983-8.
Antoniou, A., et al., Cancer stem cells, a fuzzy evolving concept: a cell
population or a cell property? Cell Cycle, 2013. 12(24): p. 3743-8.
Pham, P.V., et al., Differentiation of breast cancer stem cells by
knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med,
2011. 9: p. 209.

Nishi, M., et al., Induction of cells with cancer stem cell properties
from nontumorigenic human mammary epithelial cells by defined
reprogramming factors. Oncogene, 2014. 33(5): p. 643-652.
Kaur, S., et al., Thrombospondin-1 signaling through CD47 inhibits
self-renewal by regulating c-Myc and other stem cell transcription
factors. Sci Rep, 2013. 3: p. 1673.
Sheridan, C., et al., CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit
enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.
Breast Cancer Research, 2006. 8(5): p. R59.
Morrison, R., et al., Targeting the Mechanisms of Resistance to
Chemotherapy and Radiotherapy with the Cancer Stem Cell
Hypothesis. Journal of Oncology, 2011. 2011.
Ginestier, C., et al., ALDH1 is a marker of normal and malignant
human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.
Cell Stem Cell, 2007. 1(5): p. 555-67.
Hofner, T., et al., Expression and prognostic significance of cancer
stem cell markers CD24 and CD44 in urothelial bladder cancer
xenografts and patients undergoing radical cystectomy. Urol Oncol,
2014. 32(5): p. 678-86.
Zhang, Y., et al., Crosstalk between colon cancer cells and
macrophages via inflammatory mediators and CD47 promotes tumour
cell migration. Eur J Cancer, 2013. 49(15): p. 3320-34.

22