Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI
------*****------

ĐẶNG MINH HẰNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT – PCR
SÀNG LỌC GIỐNG SẠCH BỆNH VÀ NHÂN NHANH IN
VITRO MỘT SỐ GIỐNG KHOAI LANG SẠCH BỆNH
VIRUT ĐỐM LÔNG CHIM (SPFMV)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI - 2014


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Viết,
người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong
suốt quá trình học tập và hoàn thiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng nuôi cấy mô Viện
Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào
trung tâm thực hành thí nghiệm trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện và tận
tình giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi về kiến thức, kỹ thuật và kinh nghiệm trong suốt
thời gian tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè luôn bên cạnh
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 12 tháng 10 năm 2014
Học viên

Đặng Minh Hằng

2


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU SỬ DỤNG
Chữ viết tắt

Viết đầy đủ

ADN

Axit Deoxiribo Nucleic

ARN

Axit Ribo Nucleic

BAP

6- benzylaminopurin

CT

Công thức

dNTP

Deoxyribo Nucleotide Triphotphat

ĐC

Đối chứng

IAA

Indol Acetic Acid

Kb

Kilo base

MS

Muraghige – Skoog

NAA

α – naphytyl Acetic Acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

TAE

Tris – acetic acid – EDTA

Taq

Thermus aquaticus

UV

Ultra Violet

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

3


4


DANH MỤC BẢNG

5


MỤC LỤC

6


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Cây khoai lang được coi là một trong 7 loài cây lương thực quan trọng trên thế
giới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển. Nó được trồng trên
hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối với
con người, gia súc cũng như là vật liệu thô cho các ngành công nghiệp chế biến.

Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trên
cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào. Trong một
nghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái cây và rau quả khác trong việc làm
ngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng.
Ngoài ra khoai lang còn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng.
Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp
khác nhau, nó có thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những
vùng đất bị khô hạn. Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác
nhau với tổng diện tích là 11.200 hecta với năng suất là 30 tấn/ha. Trong vòng vài
ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất
được 6.000 tấn sang châu Âu. Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm cho
khoai lang ở Ai Cập không đạt được năng suất tối đa. Trong đó bệnh virus được coi
là nguyên nhân chính làm giảm năng suất. Do đó, Viện Nghiên Cứu Kỹ thuật Gen
Nông nghiệp Ai Cập (AGERI) đã áp dụng nhiều kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai
lang và đã rất thành công.
Ở Việt Nam khoai lang là một trong bốn loại lương thực chính sau lúa, ngô, sắn,
là cây lương thực quan trọng của một số vùng nước ta, tạo sinh khối lớn trong thời gian
ngắn. Khoai lang thuộc giống cây có củ, là đối tượng kinh tế mà người trồng sử dụng
và giao lưu kinh tế trên thị trường để có thu nhập và đảm bảo cuộc sống hằng ngày.
Một số giống khoai lang cho năng suất cao, phẩm chất tốt được trồng nhiều hiện nay
như giống khoai Hoàng Long, KTB1, KTB2, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím
thường…
Việt Nam được xếp thứ năm về sản lượng khoai lang xuất khẩu trên toàn thế
7


giới. Tuy nhiên, năng suất còn thấp và bấp bênh, không ổn định, củ nhỏ do sử dụng
giống bị thoái hóa, ít quan tâm đến biện pháp canh tác và sâu bệnh. Mặt khác, hầu
hết nông dân vẫn chưa tiếp cận và nhận được nguồn giống đảm bảo sạch bệnh.
Virut đốm lông chim khoai lang (Sweetpotato feathery mottle virus –

SPFMV) thường làm giảm năng suất đáng kể ở các vụ mùa khoai lang trên toàn thế
giới. Trên các cánh đồng, sản lượng các cây khoai lang bị nhiễm virus thường giảm
từ 20% đến 100% so với nhiều cây trồng không bị nhiễm bệnh. Những cây trồng
mẫn cảm hơn với vi rút thường bị thiệt hại đáng kể năng suất so với những cây
trồng có khả năng chịu đựng tốt.
Các triệu chứng của SPFMV trên tán lá thường nhẹ hoặc không có. Mức độ
hiển thị triệu chứng trên phụ thuộc tính mẫn cảm của giống cây trồng, giai đoạn
phát triển và mức độc tố của virut. Các triệu chứng trên củ phụ thuộc chủng
SPFMV và giống khoai lang. Virus cũng có thể tiềm ẩn trong dây,tồn tại trong hom
giống và được lưu truyền do nhiều loài rệp. SPFMV được tìm thấy bất cứ nơi nào
khoai lang được trồng.
Ngày nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và phương pháp nhân
giống invitro đã tạo nhiều giống sạch bệnh, năng suất cao, phẩm chất tốt. Đặc biệt
ứng dụng trên nhiều giống quý cho hiệu quả cao. Mặc dù trên thế giới các phương
pháp này đã được ứng dụng khá nhiều tuy nhiên ở Việt Nam còn khá hạn chế.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in
vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)
2. Mục đích nghiên cứu của đề tài
- Sử dụng kỹ thuật RT-PCR chọn giống sạch virut đốm lông chim (Sweetpotato
-

feathery mottle virus) làm vật liệu nhân nhanh in vitro.
Xác định ảnh hưởng của kiểu gen đối với một số thành phần Cytokinin và Auxin
trong môi trường nuôi cấy in vitro qua đó xác định được môi trường nhân nhanh
thích hợp một số giống khoai lang quý, năng suất cao, phẩm chất tốt phục vụ cho

sản xuất.
3. Nhiệm vụ cụ thể của đề tài
- Nghiên cứu sàng lọc ban đầu và đánh giá hiệu quả sàng lọc của mẫu mô nuôi cấy

8


-

tạo vật liệu nhân giống khoai lang.
Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen giống đối với hiệu quả nhân nhanh 6 giống

-

khoai lang.
Đánh giá bước đầu triển vọng áp dụng kỹ thuật RT-PCR kết hợp nuôi cấy in vitro tạo

nguồn giống khoai lang sạch bệnh virut cho sản xuất.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Sử dụng kỹ thuật RT-PCR sàng lọc được các giống khoai lang đảm bảo sạch bệnh
-

virut đốm lông chim, cung cấp nguồn giống cho sản xuất ở địa phương.
Xác định môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp sẽ góp phần phát triển nhanh các
giống khoai lang chất lượng cao phục vụ nông dân những vùng khó khăn và đẩy

5.
•
•
•
-

mạnh sản xuất khoai lang hàng hóa trên quy mô lớn.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu.
Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ
Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm thực hành, thí nghiệm - Trường Đại học Vinh
Vườn thực nghiệm – Khoa sinh học – Trường đại học Vinh.
Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2014 – 10/ 2014

9


PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Giới thiệu chung về cây khoai lang
1.1.
1.1.1.
-

Phân loại, nguồn gốc, phân bố và đặc điểm tế bào học
Phân loại
Giới (kingdom) : Thực vật (Plantae)
Ngành (division): Thực vật hạt kín (Mangrolyophyta)
Lớp (class): Một lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ (order): Solanales
Họ (family): Họ bìm bìm (Convolvulaceae)
Chi (genus): Ipomoea
Loài : Ipomoea Batatas L.

Hình 1.1 Cây khoai lang
1.1.2.
1.1.2.1.

Nguồn gốc và phân bố
Nguồn gốc
Khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên.
Dấu tích củ khô tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của Chilca Canyon thuộc
Peru (Engel, 1970). Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của khoai lang đầu tiên tại
vùng Mayan của Trung Mỹ. Astin (1977) đã giả thuyết có hai trung tâm phát sinh
nguồn gốc khoai lang tại Guatamala và nam Peru. Trong một số công trình khác
cũng chỉ ra sự đa dạng loài khoai lang cao nhất ở Colombia, Equador và nam Peru.

10


Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểm
tìm ra châu Mỹ năm 1492. Ông đã đưa nó vào Tây Ban Nha được gọi là khoai tây
Tây Ban Nha hay khoai tây ngọt, mãi sau này mới gọi là khoai lang.
Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con đường từ Tây Ban Nha
vào châu Âu sau đó truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ và Tây Ấn. Con đường khác do
người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines (Yen, 1982)
vào khoảng năm 1521 (Obrien, 1972), sau đó tiếp tục đưa đến châu Phi (Cinklin,
1963). Khoai lang được đưa về Trung Quốc từ Philippines và xuất hiện ở Phúc Kiến
(Fukien) năm 1594. Con đường khác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha,
đưa vào vùng Combatfami năm 1674. Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615.
Khoai lang được tiếp tục đưa vào Malaysia và các nước Nam Á, Đông Nam Á.
Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại như “Thực vật bản thảo”, “Lĩnh nam
tạp kỷ” và “Quảng Đông tân ngữ“ của Lê Quí Đôn thì khoai lang được du nhập vào
nước ta từ Philipines vào khoảng cuối đời Minh cai trị nước ta. Cây được trồng
trong phạm vi rộng giữa vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam và lên tới độ cao 2.300
m so với mặt nước biển (Đinh Thế Lộc, 1996).
1.1.2.2.

Phân bố
Ø Trên thế giới
Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vực nhiệt đới và
ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó.
Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì sản lượng toàn thế giới là 127
triệu tấn. Trong đó phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn và
diện tích trồng là 49.000 km². Khoảng một nửa sản lượng của Trung Quốc được
dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm .
Sản lượng tính trên đầu người đạt cao nhất tại các quốc gia mà khoai lang là
mặt hàng lương thực chính trong khẩu phần ăn, đứng đầu là quần đảo Solomon với
160 kg/người/năm và Burundi với 130 kg.
Bắc Carolina, bang đứng đầu Hoa Kỳ về sản xuất khoai lang, hiện nay cung
cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm của quốc gia này.
Ø Trong nước
11


Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp sau
lúa và ngô. Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven
biển. Đây là một trong những loại cây có củ quan trọng, có khả năng thích ứng
mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ,
đất thịt, đất cát. Khoai lang lại có thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho
năng suất cao, tương đối ổn định. Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền
Trung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long,...
Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây có củ quốc gia đã nhập
nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đó có Trường Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh tham gia. Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trung
tâm Cây có củ thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên
cứu Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nông nghiệp miền Nam gồm nhiều

mẫu giống và dòng lai.
Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứu
Nông nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tuyển
chọn được 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giới
thiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL518. Năm 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp và
PTNT công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn
Hộ và Enrique Chujoy, 1995).
1.2.
1.2.1.

Đặc tính thực vật học
Đặc điểm hình thái loài khoai lang
ØRễ
Khoai lang sau khi trồng 3 - 4 ngày sẽ mọc rễ mới, trong điều kiện khô hạn
hoặc nhiệt độ và ẩm độ thấp thì khoai mọc rễ non chậm. Rễ mọc đầu tiên ở các đốt
thân dưới đất. Mỗi đốt có khả năng ra 15 - 20 rễ, nhưng thường chỉ có 5 - 10 rễ
được phân hoá thành rễ dầy mới có cơ hội hình thành củ.
Rễ khoai lang chia làm ba loại: rễ con, rễ đực và rễ củ.
ØThân

12


Thân khoai lang có dạng bò hay nửa đứng. Thân phổ biến màu xanh, tím và
xanh tím. Thân có nhiều đốt với chiều dài lóng khác nhau. Ở mắt đốt mọc ra rễ phụ.
Độ dài đốt phụ thuộc vào giống. Căn cứ vào độ dài thân chính người ta chia làm hai
loại: Loại thân dài khoảng 2- 5 m , loại thân ngắn: 0,5 -1 m. Thân phát triển dài ngắn
ngoài yếu tố chính là giống còn phụ thuộc nhiều vào chế độ mưa, loại đất và phân bón.
ØLá
Lá khoai lang là lá đơn, mọc cách, mỗi mắt một lá gồm cuống lá và phiến lá.

Cuống lá dài 6 - 20 cm, có lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên khoảng
không gian và có thể điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng để lá sử
dụng ánh sáng được tối đa, khắc phục nhược điểm thân nằm bò dưới mặt đất.
Những giống nhiều nhánh và cuống lá to, dài sẽ có năng suất chất xanh cao. Màu
sắc cuống lá do giống qui định. Đa số các giống khoai lang có cuống lá màu xanh,
một số khác có cuống màu tím nhạt, tím.
ØHoa
Hoa khoai lang mọc ở nách lá hoặc ngọn thân, hoa hình chuông có cuống
dài. Hoa mọc thành chùm hay riêng rẽ. Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớt
hồng, bên trong nó có nhiều lông tơ và tuyến mật hấp dẫn côn trùng. Một hoa gồm
5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái.
ØQuả và hạt
Quả khoai lang thuộc loại quả sóc hình tròn màu nâu đen, sau thụ phấn một
đến hai tháng thì quả chín và còn tùy thuộc giống và mùa vụ. Một quả có từ 1 đến 4
hạt, hạt có vỏ cứng, hạt dễ bị rụng khi quả chín.
1.2.2.

Sinh trưởng và phát triển
Khoai lang có bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm và ra rễ; Phân
cành và tạo củ; Tăng trưởng thân lá; Phát triển của củ .
ØThời kỳ ra rễ và chồi xanh
Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống và
điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau.
ØThời kỳ phân cành và hình thành củ
13


Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày. Các
nhánh trên thân bắt đầu phát triển và bò trải dần trên mặt luống. Củ hình thành
khoảng 1,0 - 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc giống và điều kiện môi trường. Đây

là thời kỳ quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu có sự hoạt động của các bó
mạch gỗ, hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ
ØThời kỳ phát triển thân lá
Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75 85 ngày. Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bò lan phủ kín mặt
và rãnh luống. Sự hình thành thêm rễ củ mới là không đáng kể. Nhưng những củ đã
được hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chóng. Một số củ hình thành sớm
bắt đầu quá trình tích lũy chất khô.
ØThời kỳ phát triển củ
Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoan này khoảng 90 - 105 ngày đối với
các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam. Điều kiện thuận lợi cho quá trình
phình to của củ là có sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng ấm, ban
đêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai đoạn cuối
thì năng suất củ khoai lang càng cao. Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn nhanh trong
khi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và rụng dần.
1.2.3.

Điều kiện sinh thái
Cây khoai lang là cây màu dễ trồng, đòi hỏi thâm canh và đầu tư không cao,
dễ sử dụng và có phổ thích nghi rộng nên được gọi là cây lương thực của người
nghèo. Khoai lang có yêu cầu điều kiện sinh thái như sau:
Ø Nhiệt độ:
Nhiệt độ thích hợp trong quá trình sinh trưởng từ 15 - 30 0C. Nhiệt độ dưới
100C cây khoai lang ngừng sinh trưởng, dưới 60C có thể chết héo.
Khi trồng, gặp nhiệt độ 18 - 20 0C khoai lang bén rễ nhanh. Trong suốt quá
trình sinh trưởng, nhiệt độ ban ngày 20 - 35 0C khoai đồng hoá tốt. Thời kỳ phát
triển củ, ban ngày trời nắng ráo, ban đêm trời mát lạnh củ phát triển nhiều, to và
nhiều tinh bột.
14

Ø Nước:
Suốt quá trình sinh trưởng, khoai lang cần độ ẩm thích hợp từ 60 - 70%, bị hạn
hoặc bị ngập đều ảnh hưởng không tốt đến việc hình thành, phát triển và làm củ.
Ø Ánh sáng:
Nói chung khoai lang cần nhiều ánh sáng. Nhưng trong thời kỳ đầu thích hợp
với ánh sáng dài ngày. Từ khi bắt đầu làm củ ánh sáng ngắn ngày thích hợp hơn.
Ø Đất trồng:
Khoai lang không kén đất, thích hợp nhất với đất cát pha, tơi nhẹ dễ thoát
nước. Đất sét nhẹ cũng trồng được khoai lang nhưng ít củ mặc dầu thân, lá phát
triển mạnh. Khoai lang có khả năng chịu đất chua, pH = 4,5 - 8 khoai lang đều sinh
trưởng bình thường. Về dinh dưỡng, khoai lang cần nhiều nhất kali rồi mới đến đạm
và lân. Kali cần nhiều từ khi bắt đầu làm củ. Đạm cần nhiều trong thời kỳ phát triển
thân, lá. Lân thúc đẩy hình thành tinh bột của củ.
1.2.4.

Kỹ thuật trồng và chăm sóc khoai lang
Phần lớn các giống khoai lang nổi tiếng, có chất lượng hiện nay là các giống
khoai lang cổ truyền ở các vùng, miền. Giống khoai này là thời gian sinh trưởng dài
(khoảng 4,5 - 5 tháng), năng suất không cao như khoai Nghệ. . . Dựa theo thời gian
sinh trưởng, các giống khoai lang được phân ra như sau:
Ø Giống ngắn ngày:
Thời gian sinh trưởng 75 - 80 ngày như: Khoai Hồng Quảng, Bất Luận
Xuân. . . năng suất cao nhưng hàm lượng nước nhiều, tỷ lệ tinh bột thấp, phẩm chất
kém.
Ø Giống trung ngày:
Thời gian sinh trưởng 100 - 110 ngày có các giống khoai 3 tháng ở Đồng
bằng sông Cửu Long, khoai Chiêm Dâu ở các tỉnh miền Trung, khoai Yên Thuỷ Hoàng Long (nhập nội từ Hồ Nam - Trung Quốc), và một số giống khoai mới như:
K51, VT1, H-1-2, KL5, KB-1, VĐ1, KB4.
Ø Giống dài ngày:
Thời gian sinh trưởng trên 120 ngày như: Khoai Lim, Khoai Thuyền, Khoai

Nghệ, Khoai ruột tím. . .
15


Ở một số nơi đã đưa vào sử dụng một số giống mới như: VĐ1 (Đồng bằng
sông Hồng), KTB1 (Bắc Trung Bộ), H-1-2, TV1, TB1, KTB2, K15, K51, P1, DT2,
VA5, VA6, J1, DJF, Elina. Kuma… (Quảng Trị, thừa Thiên Huế)
Ø Thời vụ trồng khoai lang
Khoai lang có thể trồng được quanh năm, trừ các tỉnh từ Bắc Trung Bộ trở ra
phải tránh trồng trong các tháng mùa đông lạnh.
Vùng
- Đông Bắc, Tây bắc
- Đồng bằng sông Hồng
- Bắc Trung Bộ
- Nam Trung Bộ, Tây Nguyên
- Đông Nam Bộ, ĐBSCL

Vụ Đông-Xuân,
Vụ Xuân
Tháng 2 - 3
Tháng 1 - 2
Tháng1 1 - 12
Tháng 1 - 3

Vụ Hè-Thu
Tháng 4 – 5
Tháng 4 – 5
Tháng 4 – 5
Tháng 4 - 5
-

Vụ Thu-Đông
Tháng 9 - 10
Tháng 9 - 10
Tháng 7 - 08
-

Ø Làm đất

- Cày bừa đất kỹ, sạch cỏ dại và trang cho mặt ruộng bằng phẳng.
- Lên luống rộng 0,9 - 1,1m, cao 35 - 40cm, rãnh luống rộng 30cm.
- Rạch hàng dọc luống sâu 10 - 15cm để bỏ phân lót chuẩn bị cho đặt dây.
Ø Phân bón
Tuỳ theo giống, thời vụ, đất đai và điều kiện thâm canh có thể bón theo các mức:
- Mức thâm canh trung bình: 10 tấn phân chuồng + 250kg super lân + 130kg
urê + 120kg clorua kali/ ha
- Mức thâm canh cao: 15 tấn phân chuồng + 400kg super lân + 250kg urê +
200kg clorua kali/ha
- Bón lót theo rạch trên luống: toàn bộ phân chuồng + toàn bộ phân lân + 1/3
lượng phân đạm + 1/3 lượng phân kali.
- Bón thúc sau khi trồng 30 - 40 ngày, dùng cày hoặc cuốc xả luống bón 2/3
lượng phân đạm + 2/3 lượng phân kali kết hợp bón tro bếp, sau đó vun lại vồng khoai.
Ø Đặt dây
- Dây giống dùng đoạn 1 và đoạn 2 (dây bánh tẻ). Mỗi dây dài khoảng 25cm.
Số lượng dây cho 1 ha khoảng 33. 000 - 42. 000 dây.

16


Đặt dây nông, nuối đuôi nhau dọc theo rạch hàng giữa luống hoặc có nơi đặt

dây kiểu áp tường hoặc đặt dây cong. Dùng tay lấp đất và ấn nhẹ (đất cát, đất thịt
nhẹ lấp sâu 5 - 7cm. Đất thịt nặng lấp sâu 4 - 5cm).
Ø Chăm sóc
- Sau khi trồng 30 - 40 ngày, xới xáo, cày (hoặc cuốc) xả hông luống .
- Bón thúc sớm kết hợp cày xả hông luống. Sau đó lấp kỹ và vun vồng cao
tạo điều kiện để củ phát triển.
- Nhấc dây, vén dây: Thân lá phát triển thường có nhiều rễ phụ (nông dân gọi
là rễ đực) bám trên mặt luống làm tiêu hao dinh dưỡng. Do vậy, sau trồng, 45 - 50
ngày phải nhấc dây để đứt dễ phụ và vén dây gọn trên mặt luống nhằm tập trung
dinh dưỡng cho khoai phình củ.
- Trong điều kiện gặp hạn, đặc biệt là vụ Thu - Đông, Đông Xuân cần có
biện pháp tưới ẩm thích hợp để kích thích quá trình phình to củ. Tưới ngập 2/3
luống khoai, khi đã ngấm vào giữa luống cần phải tháo nước ngay, không để đất
quá sũng nước.
Ø Thu hoạch, bảo quản
- Nếu các vụ khoai cần phải cắt dây để chăn nuôi thì nên cắt sau khi thân lá
đã phủ luống. Chỉ cắt tỉa những nhánh dây ra trước và mặt sát mặt đất, không tỉa
dây chính. Mỗi gốc khoai lang chỉ tỉa 1 - 2 dây nhánh.
- Sau khi trồng 75 - 80 ngày đã có thể thu hoạch sớm (vụ Thu Đông khoảng
85 - 90 ngày). Nếu để quá thời gian thu hoạch thì củ sẽ bị già, dễ nẩy mầm trên củ.
- Dùng cát hoặc tro bếp rải đều, sau đó xếp củ (chú ý đừng để thành đống
cao). Sau đó phủ lá xoan lên bên trên lớp củ để phòng bọ hà và bệnh thối đen phá
hại củ trong thời gian bảo quản.

1.3.
1.3.1.

Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng của khoai lang
Thành phần dinh dưỡng của khoai lang

17


Trong củ khoai lang bao gồm một lượng lớn tinh bột, các acid amin, beta
carotene, vitamin C, B1 và hơn 10 loại nguyên tố vi lượng cần thiết cho sức khỏe
con người như canxi, phospho, kẽm, sắt,magie, natri, kali,… Vì vậy, các chuyên gia
dinh dưỡng đã gọi khoai lang là loại “thực phẩm cân bằng dinh dưỡng nhất”.
Về dinh dưỡng, khoai lang được xem là loại thực phẩm rất tốt cho việc đa dạng
chất bột đường trong khẩu phần ăn hàng ngày. Khi so sánh, người ta cũng thấy khoai
lang cung cấp một lượng năng lượng tương đương với cơm hay khoai tây. Việc ăn bổ
sung khoai lang cũng là một cách bổ sung thêm bột đường và năng lượng.
Ngoài ra, củ và rau khoai lang có còn những giá trị chữa bệnh nên từ lâu trong
dân gian có nơi còn gọi khoai lang là " Sâm nam". Khoai lang có khả năng kích thích
tiêu hóa, trị táo bón, chống viêm nhiễm, phòng chống cảm cúm, giải cảm sốt, cân bằng
lượng đường trong máu, phòng ngừa bệnh viêm khớp, chữa viêm tuyến vú...
1.3.2.

Sử dụng củ khoai lang
Củ khoai lang được luộc, nướng, chiên, phơi làm khoai deo… rất được ưa
thích. Khoai lang được sử dụng rất phổ biến trong đời sống hằng ngày và được sử
dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất bột dinh dưỡng cho
trẻ em, bột nấu súp, khoai chiên, đồ ăn chay… Các phế phẩm của khoai lang sau khi
thu hoạch được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi.

2.

PCR và ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu di truyền học.
2.1. PCR
2.1.1. Định nghĩa
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại

nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này
được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp
PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể
thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều
lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới

18


tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên
cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử...
2.1.2.

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp
DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số
lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN này.
Primer là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của
đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của ADN polymerase đoạn primer này được kéo dài
để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của ADN
polymerase, đoạn ADN nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản
sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận
đoạn ADN này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để
khuếch đại một trình tự ADN xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự
của ADN, đặc biệt là trình tự nucleotit ở hai đầu đoạn ADN đủ để tạo các primer bổ
sung chuyên biệt (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước như sau :

-

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi ADN, denaturation)
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của
phân tử (94 – 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử ADN mạch kép
tách thành 2 mạch đơn. Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự
tổng hợp 2 mạch bổ sung mới.

-

Bước 2: (bắt cặp, annealing)
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của
các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt
độ này dao động trong khoảng 55 – 650C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời
gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.

19


-

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)
Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho ADN polymerase hoạt động tốt nhất.
Dưới tác động của ADN polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo
nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ
dài của trình tự ADN khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự
khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa.
n: Là số chu kỳ.

2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Ø ADN mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên ADN thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với ADN thu nhận được trực tiếp từ dịch
chiết tế bào. Lượng ADN mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn
100ng) với việc sử dụng các ADN polymerase có hiệu quả cao. (trích dẫn bởi Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 2003)
Ø Enzyme
Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước
nóng Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính. Ngày
nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năng
chuyên biệt và hoàn thiện hơn.
Ø Primer và nhiệt độ lai
Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí
nghiệm PCR. Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang
lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh ADN đơn. Việc lựa chọn primer cần
tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
- Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu. Các đoạn mồi không nên chứa
hơn 3 Nu giống nhau xếp liên tiếp.
20


- Tỷ lệ GC lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp của
đoạn mồi là không quá thấp.
- Hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau.
- Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa là lúc đã cho enzyme tổng hợp ADN
vào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp cặp của đoạn mồi.
- Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa, vì nếu sự
chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn
primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với ADN.

- Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tưởng là
nhỏ hơn 1kb.
- Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng
“mismatch” – bắt cặp không đặc hiệu. Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà Các
kỹ thuật PCR và ứng dụng 6 thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G –
C mạnh hơn A – T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu.
Ø Các thành phần khác
+ Nồng độ dNTP (deoxynucleotide triphotphat)
Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20 – 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ
dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các
dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân bằng trong thành phần các
dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của ADN polymerase.
+ Nồng độ MgCl2
Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR.
Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase,
làm tăng Tm của DNA mạch kép. Mg 2+ là Co – factor của Taq polymerase nên nếu
lượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong
giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999), hạn chế quá trình kéo
dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi ADN và ngăn ngừa sự
biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi ) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho
sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định
21


hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ
chuyên biệt thấp.
+ Dung dịch đệm
Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệu
quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với
các đệm đang có mặt trên thị trường

- 16,6 mM ammoniumsulfate
- 67,7 mM TRIS – HCl, pH 8,89
- 10 mM beta – mercaptoethanol
- 170 microgams/ml BSA - 1,5 – 3 mM MgCl2
+ Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vượt quá 40. Sở
dĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn :
- Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượng
mẫu ban đầu.
- Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủy và cạn kiệt
các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, hoặc
các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc số lượng mẫu DNA ban đầu.
Nếu số lượng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ. Nếu số lượng mẫu ban
đầu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40 chu kỳ.
Ø Ứng dụng của PCR
Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với
nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây
bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y...
Trong nghiên cứu genome học
Nhân bản vô tính với PCR.
Phát hiện các khiếm khuyết gene
Định type các mô
Phát hiện các vi sinh vật gây bệnh
Recombinant PCR.
Kỹ thuật footprinting DnaseI. HLA ADN (các kháng nguyên bạch cầu người)
2.2. Phương pháp RT-PCR
22

2.2.1. Khái niệm
RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) là một phương
pháp dùng để khuyếch đại cADN được tạo ra từ ARN dựa vào đặc tính phiên mã
ngược. RT-PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cADN (complementary
ADN) lớn từ một lượng rất nhỏ mARN, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến
và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc định
lượng mức độ phân tử của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan
trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus ARN.
2.2.2. Nguyên tắc
Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi
oligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) và ADN
polymerase. Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cADN từ
ARN và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi ADN từ cDNA. Do enzyme reverse Các
kỹ thuật PCR và ứng dụng 10 transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã
ngược để tạo ra cADN phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42450C). Điều này gây ra những trở ngại:
- Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không
đặc hiệu của các primers.
- Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành ARN cấu trúc bậc hai.
2.2.3. Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước khác nhau:

2.3.

- Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô
- Tạo ADN bằng phản ứng sao chép ngược
- Gây phản ứng bằng PCR với các cặp mồi
- Kiểm tra sản phẩm
- Tách dòng và giải trình trình tự sản phẩm.
RT- PCR cho độ chính xác cao
Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong các nghiên cứu tinh sạch virut
trên cây khoai lang

Năm 1975, Alconero và ctv đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng và xử lý nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng có kích
thước từ 0,4 -0,8 mm được cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và auxin

23


(NAA, IAA). Sau thời gian 20 - 50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mô sẹo.
Trong số cây con được test virus thì có 47% không nhiễm bệnh.
Mervat và ctv (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sóng khoai lang
(SPFMV). Các mẫu ngoài đồng ruộng được kiểm tra hiện diện virus bằng phương
pháp dot- ELISA. Những cây khoai lang bị nhiễm virus được xử lý nhiệt ở nhiệt độ
420C/ ngày (16giờ chiếu sáng) và 390C/ đêm (8giờ bóng tối) trong thời gian 3 tuần
trước khi tách đỉnh sinh trưởng. Những cây hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
tiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA. Kết quả nghiên cứu cho thấy không có cây
nào bị nhiễm.
Hiện nay, trên lĩnh công nghệ sinh học, cây khoai lang chưa được nghiên cứu
nhiều ở nước ta.
Năm 2013, Phạm Văn Linh, Nguyễn Đức Anh, Trần Thị Quỳnh Nga và cs
(Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ) nghiên cứu kết quả nhân nhanh
giống khoai lang bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Trong đó, có giai đoạn kiểm tra
virut đốm lông chim bằng công nghệ RT-PCR. Kết quả cho thấy sau khi sử dụng công
nghệ RT-PCR chọn giống sạch bệnh để vào mẫu, những cây con in vitro tiếp tục được
kiểm tra bằng RT-PCR. Kết quả cho thấy không có cây nào bị nhiễm bệnh.
3.

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trông nhân giống cây
trồng
3.1. Khái niệm nuôi cấy mô thực vật

3.1.1. Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật
ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ
quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối
khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện
vô trùng (Bùi Văn Thế Vinh, 2009)
Khi có môi trường dinh dưỡng thích hợp, mô tế bào thực vật có thể sống, qua
nhiều lần phân bào liên tiếp, biệt hóa thành mô, cơ quan, mô tế bào, có thể phát
triển thành cây hoàn chỉnh.
24


Nuôi cây mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống
nghiệm) để phân biệt với quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm, gọi là nuôi cấy in vitro
3.1.2. Khả năng nuôi cấy mô thực vật vào công tác giống cây trồng

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng đối với
nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho
thực tiễn sản xuất và đời sống.
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số
lĩnh vực như:
ü Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp
( nuôi cấy tế bào trần ).
ü Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng ( nuôi cấy huyền phù tế
bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glucoside, các
steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghệp thực phẩm, những chất
kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp.
ü Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây

con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).
üSản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).
ü Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại.
ü Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.
ü Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.
ü Nuôi cấy quang tự dưỡng.
3.2.
Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
3.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật

Haberlandt (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng, mỗi tế bào bất kỳ của một cơ
thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tang để có thể phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Bất cứ
25