Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền Bắc Việt Nam potx

ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn mẫu dịch não tuỷ
cho phân lập virut do muỗi truyền từ bệnh nhân
có hội chứng não cấp ở miền bắc việt nam
Phan Thị Ngà, Mary B. Crabtree*
Viện Vệ sinh dịch tễ trung -ơng (VSDTTƯ), Hà Nội
*Trung tâm kiểm soát bệnh tật, Fort Collins, Colorado
virut, kỹ thuật này nhạy nh-ng chỉ có thể ứng
I. Đặt vấn đề
dụng để định loại sự hiện diện vật liệu di
Trong những năm gần đây, có rất nhiều
truyền của những virut đã biết [8, 9, 10].
căn nguyên virut gây HCNC mới đ-ợc phát
Trong thực tế vật liệu di truyền của nhiều virut
hiện, hoặc mới thấy xuất hiện ở những vùng
nh- là một túi cóp nhặt (grap-bags), nó có
tr-ớc đây ch-a có sự l-u hành của những
đ-ợc một số gen từ vật chủ của nó cũng nh-
virut này ví dụ nh- virut Hendra, virut viêm
có đ-ợc một số gen từ những virut khác. Do
não Nhật bản (VNNB) ở Australia, virut Nipah
vậy vật liệu di truyền của nhiều virut trong các
ở Malaysia, virut West Nile ở Mỹ [6, 8]. ở Việt
họ khác nhau trong phần lớn các tr-ờng hợp
Nam theo số liệu thống kê, hàng năm có
rất khác nhau, nh-ng trong một số tr-ờng
khoảng 2000 - 3000 tr-ờng hợp bị HCNC,
hợp lại t-ơng tự nh- nhau về trình tự của vật
nh-ng cho đến nay mới xác định đ-ợc virut
liệu di truyền [3, 5]. Nên có giả thiết rằng: kết
VNNB, virut đ-ờng ruột là căn nguyên, số
quả xác định d-ơng tính từ mẫu bệnh phẩm

còn lại có thể do nhiễm virut khác [2, 4].
chỉ đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di
Để phát hiện một tác nhân virut mới gây
truyền của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân
bệnh, phân lập virut có ý nghĩa quan trọng
lập virut từ những mẫu bệnh phẩm này, hiệu
cho việc xác định tác nhân, tuy nhiên phân
quả phân lập đ-ợc virut rất cao.
lập virut th-ờng ít đạt kết quả do bị ảnh h-ởng
Do vậy trong nghiên cứu này cặp mồi của
của nhiều yếu tố nh- thời gian lấy mẫu, bảo
3 nhóm virut là những nhóm virut đã đ-ợc xác
quản và vận chuyển mẫu làm giảm hiệu giá
định hoặc giả định có thể là tác nhân gây
virut trong mẫu, mặt khác thời gian có kết quả
HCNC [4, 9, 10] đ-ợc sử dụng sàng lọc mẫu
chậm. Ng-ợc lại kỹ thuật PCR cho phép
DNT để phân lập virut gây HCNC do muỗi
khuếch đại nhiều lần theo cấp số nhân những
truyền ở miền bắc Việt Nam trong năm 2003.
đoạn ADN phiên mã từ vật liệu di truyền của
Bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng mồi đột biến của 3 nhóm virut để chọn mẫu dịch não tuỷ (DNT) phân
lập virut gây hội chứng não cấp (HCNC) do muỗi truyền. Xét nghiệm 53 mẫu DNT của bệnh nhân HCNC
bằng kỹ thuật RT-PCR, xác định có 16 tr-ờng hợp d-ơng tính với tỉ lệ nh- sau: 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng
tính với mồi của nhóm virut do muỗi truyền, 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut tiềm
tàng, 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá. Kết quả d-ơng
tính bằng kỹ thuật RT-PCR không thể thay thế kết quả phân lập, nh-ng nó định h-ớng cho việc chọn mẫu
thích hợp để phân lập virut. Sử dụng tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng C6/36 để phân lập virut do muỗi
truyền. Từ 7 mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi
truyền, phân lập đ-ợc 7 chủng virut, trong số này có 5 chủng là virut VNNB, 1 chủng là virut thuộc nhóm

virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở Việt nam 2002, còn 1 chủng ch-a định loại đ-ợc.
15
TCNCYH 30 (4) - 2004
Tế bào muỗi Aedes Albopictus dòng
II. Vật liệu và ph-ơng pháp
C6/36, môi tr-ờng nuôi tế bào Eagle Minimun
2.1. Vật liệu:
Essential Medium (EMEM) có 10 % huyết
Mẫu bệnh phẩm: 53 mẫu DNT của bệnh
thanh bê bào thai.
nhân HCNC đ-ợc lấy ở Viện Nhi trung -ơng
Máy PCR, các trang thiết bị, sinh phẩm
trong tháng 4 và tháng 5 năm 2003, các mẫu
hoá chất và vật liệu cần thiết khác.
DNT đ-ợc xác định không có kháng thể IgM
2.2. Ph-ơng pháp:
kháng VNNB.
Tách chiết ARN của virut từ DNT bằng bộ
Sử dụng mồi đột biến một số nucleotit
sinh phẩm QIAamp theo h-ớng dẫn của bộ
(denegenate primer) để tăng độ nhậy của kỹ
sinh phẩm.
thuật RT-PCR: Với nhóm virut do muỗi truyền
sử dụng cặp mồi của virut nhóm Alpha, Flavi,
Kỹ thuật RT-PCR thực hiện theo h-ớng
Bunya. Với nhóm virut tiềm tàng sử dụng cặp
dẫn của sinh phẩm.
mồi của nhóm virut Herpes. Với nhóm virut
Phát hiện vật liệu di truyền của virut trong
lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc, sử

mẫu DNT với mồi đột biến (denegenate
dụng cặp mồi của nhóm virut Entero, Adeno
primer).
và Nipah. Các mẫu chứng d-ơng cho kỹ
Phân lập virut bằng tế bào muỗi C6/36
thuật RT-PCR do Trung tâm kiểm soát bệnh
theo th-ờng quy phòng thí nghiệm Virut viêm
tật CDC, Mỹ và Viện Y học Nhiệt đới
não Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung -ơng.
Nagasaki cung cấp.
Định loại sơ bộ virut phân lập bằng kỹ
Cặp mồi đặc hiệu để định loại virut VNNB
thuật ELISA-Sandwich với kháng thể kháng
(841N, 2670 R), cặp mồi đặc hiệu để định
virut VNNB. Những mẫu d-ơng tính đ-ợc
loại virut Arbo mới phát hiện ở Việt Nam (85F,
khẳng định bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi
475 R).
đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu âm tính
Bộ sinh phẩm QIAamp để tách chiết ARN
đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của virut
của QIAGEN, Nhật Bản.
nhóm Alpha, nhóm Bunya, virut Arbo mới [1].
Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR trực tiếp
Sản phẩm PCR tổng hợp đ-ợc kiểm tra
của Roche (Titan one tube RT-PCR System),
trên thạch 1% trong Tris-Borat-EDTA có
Nhật Bản.
ethidium bromide chạy điện di 100 mA, 40
Sinh phẩm cho kỹ thuật RT-PCR của

phút, đọc kết quả bằng máy đọc Polaroid
Takara Bio Inc, Nhật Bản.
theo nguyên lý hoá phát quang
(Chemilluminescence).
Bảng 1. Kết quả xác định căn nguyên virut gây HCNC, 2003
bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi của 3 nhóm virut

Mồi của nhóm virut

Số mẫu

xét nghiệm
Số mẫu

d-ơng tính

%

Do muỗi truyền 53 8 15,09
Virut tiềm tàng 53 7 12,96
Lây qua đ-ờng tiêu hoá, tiếp xúc 53 1 1,88

16
TCNCYH 30 (4) - 2004


VN105 VN89 VN82 VN81 VN79 Neg. Pos. 1 Kb
Trong số 53 mẫu DNT của bệnh nhân năm Có 8/53 (15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi
2003 đ-ợc xác định không có kháng thể IgM của nhóm virut do muỗi truyền (nhóm virut
kháng virut VNNB, ứng dụng kỹ thuật RT- Bunya), có 7/53 (12,96 %) mẫu d-ơng tính với

PCR để phát hiện nhanh vật liệu di truyền của mồi của nhóm virut tiềm tàng (nhóm virut
virut. Kết quả d-ơng tính đ-ợc xác định với Herpes), có 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính với
mồi của 3 nhóm virut với tỉ lệ xác định d-ơng mồi của nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu
tính với cặp mồi của từng nhóm virut nh- sau: hoá, tiếp xúc (nhóm virut Entero).
Bảng 2. Kết quả phân lập virut từ các mẫu DNT xác định d-ơng tính bằng
kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của nhóm virut do muỗi truyền
Ký hiệu
mẫu
DNT
Ký hiệu
chủng
virut
Kết quả (+) với
mồi của nhóm virut
do muỗi truyền
Kết quả
phân lập
virut
Kết quả
định loại
virut
03CSF13
// + (Weak band) Hết mẫu //
03CSF14 03VN76 + ( Strong band) D-ơng tính Arbo mới
03CSF17
03VN79
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB
03CSF23
03VN81
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB

03CSF25
03VN82
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB
03CSF62
03VN89
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB
03CSF78
03VN99
+ (Weak band) D-ơng tính Ch-a xác định
03CSF85
03VN105
+ (Weak band) D-ơng tính VNNB


Hình 1: Kết quả định loại virut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu với virut VNNB
17
TCNCYH 30 (4) - 2004
Thử nghiệm phân lập virut bằng tế bào muỗi với mồi đặc hiệu với virut VNNB, những mẫu
C6/36 từ các mẫu DNT đ-ợc xác định d-ơng âm tính đ-ợc kiểm tra với mồi đặc hiệu của
tính bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi của virut nhóm Alpha, virut nhóm Bunya và virut
nhóm virut do muỗi truyền, kết quả phân lập Arbo mới phát hiện ở Việt Nam 2002. Kết quả
đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT. Virut VNNB xác định có 5 chủng là virut VNNB, có 1
trong n-ớc nổi tế bào gây nhiễm đ-ợc phát chủng là thuộc nhóm genotyp của virut Arbo
hiện bằng kỹ thuật ELISA-Sandwich với mới phân lập ở Việt Nam năm 2002, còn 1
kháng thể đặc hiệu kháng virut VNNB, xác chủng virut ch-a định loại đ-ợc, không có
định 5 mẫu d-ơng tính, 2 mẫu âm tính bằng mẫu nào d-ơng tính với mồi của virut nhóm
kỹ thuật này. Những mẫu d-ơng tính đ-ợc Alpha và virut nhóm Bunya.
kiểm tra và xác dịnh bằng kỹ thuật RT-PCR

1 Kp Pos. VN 76 VN 99 Neg. 100 bp

phòng bệnh [9, 10]. Tuy nhiên kết quả âm
IV. Bàn luận
tính với mồi của những virut khác chỉ có nghĩa
Việc phát hiện nhanh vật liệu di truyền của
rằng trình tự phần khuếch đại của mẫu không
virut bằng kỹ thuật RT-PCR, kết quả có thể
đ-ợc phát hiện [10]. Ví dụ nh- trong nghiên
nhận đ-ợc ngay trong ngày nhận mẫu có ý
cứu này không có mẫu nào đ-ợc phát hiện
nghĩa quan trọng để định h-ớng cho việc
Hình 2: Kết quả định loại vi rut phân lập đ-ợc với cặp mồi đặc hiệu của vi rut Arbo mới
18
TCNCYH 30 (4) - 2004
d-ơng tính với mồi của virut nhóm Flavi, d-ơng tính với mồi của nhóm virut tiềm tàng,
mặc dù virut VNNB là một virut thuộc nhóm có 1/53 (1,88 %) mẫu d-ơng tính vi mồi của
Flavi gây HCNC ở Việt Nam [4]. Kết quả này nhóm virut lây truyền qua đ-ờng tiêu hoá.
cũng phù hợp với nghiên cứu đã công bố
Sử dụng tế bào muỗi Aedes Albopictus
tr-ớc đây việc phát hiện genôm của virut
dòng C6/36 để phân lập virut từ 7 mẫu DNT
VNNB trong dịch não tuỷ th-ờng ít đạt kết
đ-ợc xác định d-ơng tính bằng mồi của nhóm
quả, ng-ợc lại đối với virut West Nile, một
virut do muỗi truyền, kết quả phân lập đ-ợc 7/
virut thuộc nhóm Flavi, việc phát hiện genôm
7 chủng virut, trong số này 5 chủng đ-ợc xác
của virut này trong dịch não tuỷ có hiệu suất
định là virut VNNB, 1 chủng đ-ợc xác định
cao hơn [7].
thuộc nhóm virut Arbo mới đ-ợc phát hiện ở

Mặt khác kỹ thuật PCR cũng có những Việt Nam năm 2002, 1 chủng ch-a định loại
giới hạn nhất định vì nó không định loại đ-ợc đ-ợc.
toàn bộ thành phần virut, nên kết quả xác
Lời cảm ơn:
định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR
không thể thay thế đ-ợc kết quả phân lập
Đề tài thực hiện tại CDC Fort Collins,
virut.
Colorado và Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung
Ương.
Với giả thiết kết quả xác định d-ơng tính
bằng kỹ thuật PCR từ mẫu bệnh phẩm là
Tập thể tác giả xin trân trọng cảm ơn:
đồng nghĩa với nhận định có vật liệu di truyền
- Sự hỗ trợ của nhóm Pathogen Discovery
của virut trong mẫu; nh-ng nếu phân lập virut
Group, CDC Atlanta về việc trợ giúp kỹ thuật
từ những mẫu bệnh phẩm này, khả năng
và sinh phẩm để phát hiện vật liệu di truyền
phân lập đ-ợc virut rất cao. Kết quả phân lập
của virut nhóm Herpes, Adeno và Entero.
đ-ợc 7 chủng virut từ 7 mẫu DNT đ-ợc xác
- GS. Kouichi Morita về việc cung cấp sinh
định d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR trong
phẩm cho kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vật
nghiên cứu này là một minh chứng cho nhận
liệu di truyền của virut Nipah, virut VNNB,
định trên. Mặc dù 7 mẫu DNT đ-ợc xác định
virut Arbo mới.
d-ơng tính bằng kỹ thuật RT-PCR với mồi

của virut nhóm Bunya, nh-ng 7 chủng virut
TàI liệu tham khảo
đ-ợc phân lập từ các mẫu dịch não tuỷ này
không có mẫu nào d-ơng tính với mồi của
1. Phan Thị Ngà, Kouichi Morita. 2004.
virut nhóm Bunya, kết quả này cho thấy việc
Phát hiện virut viêm não mới từ dịch não tuỷ
sử dụng mồi đột biến để phát hiện vật liệu di
của bệnh nhân có hội chứng não cấp ở miền
truyền từ mẫu DNT làm tăng độ nhạy của kỹ
Bắc Việt Nam. Tạp chí nghiên cứu Y học, tập
thuật RT-PCR, nh-ng có thể có d-ơng tính
29, số 3:
giả [3].
2. Nguyễn Thị Hiền Thanh. 2003. B-ớc
đầu tìm hiểu căn nguyên gây viêm màng não
V. kết luận
ở trẻ em do một số virut đ-ờng ruột. Tạp chí Y
ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xét nghiệm
học dự phòng, tập XIII, số 4 (61): 5 12.
53 mẫu DNT của bệnh nhân có HCNC với
3. Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M.
cặp mồi của 3 nhóm virut, xác định: Có 8/53
th
et al. 1996. Virology 3 Edition: 15 57.
(15,09 %) mẫu d-ơng tính với mồi của nhóm
virut do muỗi truyền, có 7/53 (12,96 %) mẫu
4. Ha D. Q., Calisher C. H., Tien P. H.,
19
TCNCYH 30 (4) - 2004

Isolation of a newly recognized Alphavirus Waqar M. A. 1994. Detection of West Nile
from mosquitoes in Vietnam and evidence for and Japanese Encephalitis viral genome
human infection and disease. Am. J. Trop. sequences in cerebrospinal fluid from acute
Med. Hyg. 53(1): 100 -104. encphalitis cases in Karachi, Pakistan.
Microbiol Immmunol, Vol. 38: 827 -830.
5. Hazelton P. R., Gelderblom H. R. 2003.
Electron Microscopy for rapid diagnosis of 8. Parida M., Posadas G., Inoue S.,
infection agents in Emergent situation. Hasebe F. and Morita K. 2004. Real-Time
Emerging Infectious Diseases. Vol. 9, No. 3: Reverse Transcription Loop-Mediated
294 303. Isothermal Amplification for Rapid Detection
of West Nile virus. Journal of clinical
6. Mackenzie J.S., Johansen C.A.,
Microbiology, Vol. 42 No. 1: 257 263.
Ritchie S.A., Van den Hurk A.F & Hall R.A.
2002. Japanese encephalitis as an emerging 9. Read S. J., Jeffery K. J. M. anh
virus: The emergence and spread of Bangham C. R. M. 1997. Aseptic Meningitis
Japanese encephalitis virus in Australia. In and Encephalitis: The Role of PCR in the
Current topics in microbiology and
diagnostic laboratory. Journal of Clinical
Immunology: Japanese encephalitis and
Microbiology : 691 696.
West Nile virus infections, Vol. 267: 49-73.
10. Weidmann M., Rudaz V., Nunes M. R.
Edited by J.S. mackenzie, A.D. Barret & V.
T., Vasconcelos P. F. C. and Hufert F. T.
Deubel. Berlin: Springer-Verlag.
2003. Rapid detection of human pathogenic
7. Igarashi A., Tanaka M., Morita K.,
Orthobunyaviruses. Journal of Clinical
Ahmed Akhtar, Ahmed Arsalam, Akram D. S.,

Microbiology: 3299 3305.
Summary
Application RT-PCR for the selection of CSF samples for
the isolation of virus transmiss by mosquitoes from acute
encephalitis syndrome patients in the North Vietnam, 2003
RT-PCR technique with denegenate primers of three viral groups were used to selection samples for
the isolation of mosquito borne viruses which cause acute encephalitis (AES) syndrome. The results
showed that 16 out of 53 positive cases were confirmed by RT-PCR with proportion as following: 8/53
(15.09 %) were confirmed positive by primers of mosquito borne viruses, 7/53 (12.96 %) by primers of
latent viruses and 1/53 (1.88 %) by viral group of hand-food-mouth diseases. The confirmed positive
results by RT-PCR can not replace results of the isolation of virus, but it orients for the selection of
relevant CSF samples for the isolation of virus . The Aedes Albopictus clone C6/36 cells were used to
isolate virus which is transmitted by mosquitoes. From 7 CSF samples which were confirmed positive by
RT-PCR, the isolation of virus were carried out yielding 7 virus strains. Among them, 5 strains were
confirmed Japanese encephalitis virus, 1 strain belongs to group of new type Arbovirus and 1 strain was
unknown.
20
TCNCYH 30 (4) - 2004