Nuôi cấy phôi dừa dứa ( Cocos nucifera L.)

MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC...................................................................................................................................
MỤC LỤC......................................................................................................................................
DANH SÁCH BẢNG....................................................................................................................
DANH SÁCH HÌNH......................................................................................................................
TỪ VIẾT TẮC...............................................................................................................................
GIỚI THIỆU...................................................................................................................................
CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc và sự phân bố.........................................................................................................
1.2 Đặc tính thực vật......................................................................................................................

1.2.1 Rễ...........................................................................................................................................
1.2.2 Thân.......................................................................................................................................
1.2.3 Lá...........................................................................................................................................
1.2.4 hoa..........................................................................................................................................
1.2.5 Trái.........................................................................................................................................
1.3 Giống dừa.................................................................................................................................
1.3.1 Nhóm giống dừa cao.............................................................................................................
1.3.2 Nhóm dừa lùn........................................................................................................................
1.3.3 Nhóm dừa lai.........................................................................................................................
1.4 Sinh thái....................................................................................................................................
1.5 Đặc tính của dừa Dứa...............................................................................................................
1.6 Nhân giống dừa........................................................................................................................
1.7 Nuôi cấy in vitro dừa và một số cây họ Ảecaceace.................................................................
1.7.1 Nuôi cấy phôi dừa.................................................................................................................
1.7.2 Tạo phôi vô tính ở dừa và một số cây họ Arecaceace..........................................................
1.8 Hiện tượng hoá nâu mẫu cấy....................................................................................................


1.8.1 Nguyên nhân của hiện tượng hoá nâu...................................................................................

1.8.2 Ngăn chặn sự hoá nâu...........................................................................................................
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................................................
2.1 Phương tiện...............................................................................................................................
2.1.1 Vật liệu..................................................................................................................................
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ................................................................................................................
2.1.3 Hoá chất.................................................................................................................................
2.1.4 Địa điểm và thời gian thí nghiệm..........................................................................................
2.1.5 Điều kiện thí nghiệm.............................................................................................................
2.2 Phương pháp.............................................................................................................................
2.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm..............................................................................................................
2.2.2 Bố trí thí nghiệm...................................................................................................................
Thí nghiệm 1: Hiệu quả môi trường và điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của phôi.................
Thí nghiệm 2: Hiệu quả của 2,4-D và BA lên sự tạo mô sẹo từ mầm chồi của phôi...................
2.2.3 Xử lý số liệu..........................................................................................................................
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của phôi....
3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của 2,4-D và BA lên sự tạo mô sẹo từ mầm chồi của phôi.............
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận.....................................................................................................................................
4.4 Đề nghị.....................................................................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG


DANH SÁCH BẢNG
STT
Tựa bảng
Trang
1 Bảng 2.1 Các nồng độ 2,4-D và BA trong từng nghiệm thức (NT)........................................
2

Bảng 3.1 Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ nảy mầm của phôi (%)
ở 30 ngày sau khi cấy
................................................................................................................................................

3

Bảng 3.2 Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ ra rễ của phôi (%) ở
30 và 60 ngày sau khi cấy
................................................................................................................................................
Bảng 3.3 Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên chiều cao chồi (cm) ở 30 và
60 ngày sau khi cấy
................................................................................................................................................
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên tỷ lệ mẫu hoá nâu của mẫu cấy (%) ở 30 ngày
sau khi cấy
................................................................................................................................................
Bảng 3.5 Hiệu quả của 2,4-D và BA lên tỷ lệ tạo mô sẹo từ mầm chồi (%) ở 60 ngày sau
khi cấy
................................................................................................................................................

4

5

6


DANH SÁCH HÌNH
STT

TỰA HÌNH

Trang

1 Hình 2.1 Cây dừa Dứa trồng ở Trại Nghiên cứu và Thực Nghiệm Nông nghiêp.....................
2 Hình 2.2 Vị trí của phôi trong trái dừa Dứa................................................................................
3 Hình 2.3 Vị trí mầm chồi được cắt ra để nuôi cấy......................................................................
4 Hình 3.1 Phôi được tách ra và nuôi cấy trên môi trường đặc (a) và môi trường lỏng (b).........
5 Hình 3.2 Phôi trên môi trường Y3 ở điều kiện ngoài sáng (a), điều kiện lỏng lắc (b), và
điều kiện tối (c) ở 15 ngày sau khi cấy..........................................................................................
7
8

9

Hình 3.3 Mẫu cấy mầm chồi bị chết do hoá nâu.....................................................................
Hình 3.4 Mầm chồi tạo mô sẹo trên môi trường Y3 bổ sung 2 mg/l 2,4-D và 0.5 mg/l
BA ở 60 ngày sau khi cấy
................................................................................................................................................
Hình 4.1 Quy trình nuôi cấy phôi dừa dứa..............................................................................


TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

BA

Benzyl adenine

MS

Murashige và Skoog (1962)

NSKC

Ngày sau khi cấy

NT

Nghiệm thức

Y3

Eeuwent (1976)


GIỚI THIỆU
Dừa (cosos nucifera L.) là một trong các cây lấy dầu quan trọng nhất thế giới với tổng diện
tích khoảng 11.5 triệu ha được trồng tại hơn 86 quốc gia, chủ yếu ở khu vực Châu Á và Thái
Bình Dương chiếm khoãng 86% (Perseley,1992). Cây dừa cung cấp nguồn thực phẩm (chủ
yếu là chất béo), nguyên liệu cho công nghiệp chế biến hàng tiêu dùng và xuất khẩu. Cây
dừa được xem là cây của cuộc sống (tree of lief). Sản phẩm từ dừa rất đa dạng và phong
phú. Từ khi các sản phẩm nước dừa, cơm dừa, dầu, sợi và gỗ được khai thác, dừa đóng vai
trò quan trọng trong lĩnh vực công nghiệp và thương mại
Trong đó dừa dứa là giống dừa quý hiếm mới được nhập nội từ Thái Lan trong thời gian gần
đây. Dừa dứa có mùi thơm như nếp Bắc pha với mùi dứa, là loại thức uống được nhiều du
khách nước ngoài ưa thích, bên cạnh đó cơm dừa tương đối dày, có hàm lượng dầu tương
đối cao rất có giá trị trong ngành công nghệ chế biến thực phẩm. Hiện nay, giống dừa Dứa

đã được nhân giống trồng phổ biến ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt là
Bến Tre và Trà Vinh, không chỉ mang lại giá trị cao trong ngành công nghiệp thực phẩm mà
còn có giá trị trong lĩnh vực du lịch
Tuy nhiên, các giống cây trồng hiện nay là do nhập nội nên giá thành còn cao mà nguồn gốc
chắc chắn có phải là Dừa Dứa hay không thì vẫn còn khó khăn khi xác định, bên cạnh đó
phương pháp nhân giống thông thường từ trái mất rất nhiều thời gian và gặp trở ngại lớn do
tỉ lệ nảy mầm của dừa Dứa trong tự nhiên rất thấp. Sự cứu phôi hây nuôi cấy phôi là kỹ
thuật nhằm giúp cho sự nảy mầm của phôi đã được áp dụng đối với dừa Makapuno là giống
dừa đột biến rất có giá trị kinh tế với cơm dừa dày, đặc sệt như sáp nhưng phôi của giống
dừa này không thể nảy mầm trong điều kiện tự nhiên. Kỹ thuật này ngày nay đã được ứng
dụng rất phổ biến ở philippine (Batugal và Engelmann, 1998; Rillo, 1999). Bên cạnh đó,
phương pháp nuôi cấy tạo phôi vô tính nhằm tạo ra số lượng lớn cây giống đồng nhất có đặc
tính giống với cây mẹ cũng đang được nghiên cứu
Chính vì vậy đề tài “Nuôi cấy phôi dừa dứa (Coscos nucifera L.)” được thực hiện nhằm mục
tiêu xác định môi trường thích hợp cho sự nhân giống cây dừa Dứa thông qua kỹ thuật nuôi
cấy phôi


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

Cây dừa có tên khoa học là Coscos nucifera L., giống Coscos chỉ có loài, thuộc họ
Arecaeae, họ phụ Cocoideae. Dừa có nguồn gốc từ vùng Indo—Malaysia (Chan và
Elevitch, 2006)
Dừa được trồng nhiều ở Ấn Độ, Philippine, Sri Laka, Mã Lai, Indonesia, Trung Mỹ, quần
đảo Cuba, Puerto Rico, quần đảo Nam Thái Bình Dương… Thảm thực vật trên các đảo và
bờ biển vùng Nam Thái Bình Dương chủ yếu là dừa (Apacible, 1986)
Được phân bố rộng rãi trong vùng nhiệt đới, có khoãng 90% dừa được tìm thấy trong giới
hạn vĩ độ 20o Bắc và 20o Nam. Sự phân bố rộng rãi và phán tán từ vùng này sang vùng

khác là do 2 tác nhân: con người và biển. Trái dừa được nước mưa đưa ra biển rồi trôi nỗi đi
xa hàng nghìn dặm, đến khi chúng bị giữ lại bởi những bờ cát rồi định cư ở đó (Ohler,1999;
Woodroof. 1979). Dưới ánh nắng mặt trời vùng nhiệt đới, dừa mọc mầm và bắt đầu cuộc
sống mới, chính vì vậy mà dừa tìm thấy ở khắp bờ biển vùng này. Thêm vào đó, trong quá
trình giao lưu buôn bán trao đổi hàng hoá, con người đã vận chuyển dừa và canh tác trên
nhiều vùng khác nhau của thế giới
1.2 Đặt tính thực vật

Dừa có số lượng nhiễm sắc thể 2n= 32, được phân loài là cây đơn từ diệp, hiển hoa bí tử,
thân gỗ. Dừa chỉ có một đỉnh sinh trưởng trên cây, không may đỉnh sinh trưởng này bị hại
sẽ làm chết toàn cây. Dừa sống rất lâu từ 50- 120 năm, trung bình 70 năm (Ohler, 1999)
1.2.1

Rễ

Dừa có rễ bất định sinh ra liên tục ở phần đáy gốc thân, không có rễ cọc, chúng mọc dài
ngang ra 5-7 m và sâu 0.3- 1.2 m (Perley, 1992; Reynold, 1988), lúc mới mọc có màu trắng
sau chuyển dần sang màu đỏ nâu. Cá biệt rễ có thể mọc dài trên 30 m và mọc sâu đến 5.5 m
cũng được tìm thấy (Ohler, 1984). Rễ bất định không lớn theo bề ngang được vì thiếu
thượng tầng
Rễ không có lông hút mà chỉ có những rễ nhỏ là rễ dinh dưỡng. Những rễ nhỏ hình thành
trên rễ chính và cũng hoạt động như rễ hô hấp, những rễ này trao đổi khí giúp cho dừa chụi
được sự gập nước
1.2.2

Thân


Trong giai đoạn đầu mới trồng chiều dài lóng trên thân dừa ngắn và chậm phát triển, đến khi
chiều ngang của thân phát triển đầy đủ thì thân mới bắt đầu cao lên, tiến trình này có thể kéo

dài 4 năm tuỳ thuộc vào giống (Ohler, 1984)
Dừa có thể mọc cao đến 35m, không nhánh, thân cột to, chắc, khẻo mang nhiều sẹo lá quấn
quanh trọn thân
Thân dừa không có thượng tầng (tầng phát sinh gỗ), một khi bị cắt hay tổn thương thì không
phục hồi hoặc lành vết thương bằng mô mới, đường kính thân cũng không lớn ra thêm theo
thời gian
1.2.3

Lá

Lá dừa (tàu lá) rất to gồm một bẹ lá ôm trọn thân, mọc theo hình xoắn ốc. Bẹ lá này cách bẹ
lá kia 1400, diệp tự 2/5 nghĩa là 2 vòng xoắn ốc thì 2 lá ở cùng vị trí, như lá thứ nhất và lá
thứ 6 chẳng hạn (Tôn Thất Trình, 19974). Bẹ gồm một phần cứng và yếm dừa xơ đan chéo
nhau. Tàu lá dừa có một sóng chính mang hai hàng lá phụ hai bên, dạng hình lông chim dài
từ 4.5- 6 m, rộng từ 0.5- 0.8 m, nặng 10- 15 kg. Lá phụ nhỏ hẹp, dài khoảng 1 mét, có k
khoảng 200 lá, mọc không đối xứng hai bên sóng chính và thường chênh nhau 4-5 lá. Lá
phụ có một gân chính và nhiều gân phụ song hành, mặt trên có màu xanh láng hơn mặt
dưới. Cây dừa lúc nhỏ chỉ có tàu nguyên , sau đó tàu lá mới có lá phụ tách ra, đến khoảng 45 năm cây mới hoàn toàn có tàu lá lông chim (Nguyễn Bảo Vệ et al., 2005)
1.2.4

Hoa

Dừa có phát hoa sau khi trồng từ 3- 8 năm (nhóm dừa cao từ 5-8 năm còn nhóm dừa lùn từ
3-4 năm). Phát hoa rất to, trổ quanh năm ở nách lá, mỗi nách lá có một phát hoa, lúc đầu
phát hoa ở trong một lá bắc dày gọi mo dừa (thật ra có 2 mo, mo nhỏ ở ngoài, mo lớn ở
trong). Phát hoa có nhiều nhánh, dài từ 0.6 -1.2 m, mang hoa
Hoa dừa thuộc đơn tính đồng chu, nghĩa là hoa đực và hoa cái ở riêng trên cùng một nhánh
của phát hoa, hoa đực ở ngoài chóp nhánh còn hoa cái ở trong gần đáy nhánh, thường mỗi
nhánh hoa có một hoa cái. Mỗi phát hoa có khoảng 8.000 hoa đực, chiếm gần hết phát hoa,
với 1- 30 hoa cái (Ohler, 1984; Ohler, 1999; Woodroof, 1979)

Sự thụ phấn chéo xảy ra ở dừa cao, còn ở dừa lùn thì hoa cái nhận phấn trước khi hoa đực
chấm dứt, như vậy hoa cái thụ phấn của cùng một phát hoa. Thụ phấn chéo đã tạo ra nhiều
cây lai, trong đó lai giữa giống dừa lùn và dừa cao tạo ra cây ưu thế lai. Sức sống của hạt
phấn rất mạnh ở dừa cao và dừa lai, kém hơn ở giống dừa lùn và bán lùn (Ohler, 1999)
1.2.5

Trái

Trái dừa được phân loại như là quả hạch sợi, nó phát triển từ noãn có 3 tâm bì có “mắt”,
mỗi tấm bì chứa một tiểu noãn. Thông thường có 2 tiểu noãn không phát triển khi thụ phấn,
chính vì vậy trong 3 “mắt’ chỉ có một mắt chứa mầm của tiểu noãn phát triển (Ohler, 1984).
Mắt dừa có chứa mầm thì mềm, 2 mắt còn lại không có mầm bị cứng do hoá gỗ. Mầm nhỏ


nằm trong cơm dừa có tử diệp (mộng dừa) sẽ phù to khi mọc để tiêu hoá phôi phôi nhũ
(Phạm Hoàng Hộ, 1968). Phôi nhũ khá đặc biệt, gồm một phần lỏng ở bên trong và một
phần đặc (cơm dừa) bao bọc ngoài
Trái dừa lớn có thể chứa 0.6 lít nước, 30 g đường (Fuctose và sucrose) và 2 g kali
(Ohler,1999). Mỗi quầy dừa trung bình có từ 1-20 trái, thông thường 6-7 trái đối với dừa
cao và trên 10 trái đối với dừa lùn, mỗi trái có trọng lượng vài kilogram. Một cây dừa có thể
cho 100 trái mỗi năm
Trái thường già trong vòng 12 tháng sau thu phấn và có dạng tròn hay oval có 3 mảnh là
dấu tích của 3 tâm bì. Ngoại quả bì chuyển từ màu xanh sang nâu khi trái trưởng thành. Mô
của trung quả bì ở thể sợi. Nội quả bì là gáo dừa cứng có 3 mảnh, ở phần tiếp giáp với
cuống trái thấy rõ có 3 “mắt”. Vỏ khô cùng lúc với mất nước trong ruột trái
1.3 Giống dừa

Theo Nguyễn Bảo Vệ et at. (2005), giống dừa trồng thường được xác nhận dựa trên màu
sắc, hình dạng, kích thước trái và dặc tính lùn của cây. Bởi vì trong tự nhiên dừa có dặc tính
lai tap rất cao, tạo ra nhiều loại khác nhau về màu sắc, kích thước và chất lượng trái ở mỗi

vùng cũng rất khác nhau
Hầu hết giống dừa được biết đến với tên địa phương nơi mà nó được canh tác. Nhiều khi
cùng một giống mà tên gọi mỗi địa phương cũng khác nhau. Tuy nhiên, có thể phân biệt
theo nhóm dừa, chúng được xác định rất khác biệt nhau và ghi nhận dừa trên hình thái là
dừa cao (C. Nucifera typica) và dừa lùn (C. nucifera nana). Ngoài ra còn dừa lai giữa dừa
cao và dừa lùn
1.3.1

Nhóm dừa cao

Gọi là dừa cao vì nó có thân to cao, có thể cao trên 20 m. Giống dừa cao chiếm hầu hết quần
thể dừa của thế giới và được trồng với mục đích hàng hoá vì nó cho copra thuộc loại tối ưu,
khô dầu là cơm dừa phơi khô dùng để ép lấy dầu. Dừa cao cho nhiều lá hơn dừa lùn
(khoãng 40 lá/cây), kích thước trái từ trung bình đến lớn. Cây có gốc phình to, dễ nhiễm
bệnh chết vàng và bệnh Cadang cadang
Đặc tính của giống dừa cao là:
Tốc độ sinh trưởng chậm và ra trái muộn (6-10 năm sau khi trồng)
Thụ phấn chéo với tỷ lệ cao nên dễ bị lai
Chống chụi tốt điều kiện khắc nghiệt của môi trường (chụi mặn và chụi hạn giỏi)
Sống lâu lên đến 80-120 năm
Copra, dầu, sợi có chất lượng cao
Trái già sau 12 tháng kể từ thụ phấn


1.3.2

Nhóm dừa lùn

Gọi là dừa lùn vì cây thấp. Dừa lùn có thể là biến dị từ dừa cao, nó cũng được canh tác rộng
rãi nhưng cho khô dầu có chất lượng kém hơn dừa cao, chính vì vậy thường không được

trồng với quy mô lớn. Dừa lùn có chiều cao từ 7.5- 9m và trổ hoa khi cây chỉ cao khoảng
1m. Dừa có gốc không phình to, có ưu điểm là cho nhiều trái và kháng bệnh chết vàng
Đặc tính của nhóm dừa lùn là
Tốc độ sinh trưởng nhanh và cho trái sớm (4-5 năm sau khi trồng). Giống lai có trái sau 3
năm trồng
Phần lớn tự thụ phấn
Chống chụi kém điều kiện môi trường và đòi hỏi đất tốt và khí hậu thích hợp mới đạt năng
suất cao
Có đời sống ngắn, chỉ khoảng 30 năm

Thường trồng để uống nước dừa tươi
Màu sắc của trái thay đổi: vàng, đỏ, xanh, vàng cam…
1.3.3

Nhóm dừa lai

Trên thế giới đã có nhiều chương trình lai tạo hay chọn lọn dừa lai tự nhiên để có những
giống dừa chô trái sớm, năng suất cao, phẩm chất khô dầu tốt và kháng bệnh chết vàng.
Tóm lại, dừa lai có nhiều ưu điểm hơn dừa cao hay dừa lùn, nhưng nó phải thâm canh tốt
mới phát huy được tiềm năng của nó
1.4 Sinh thái

Theo Purseglove (1972), do đặc điểm cấu trức sinh lý, dừa phát triển tốt ở những bờ biển và
vùng đất duyên hải bằng phẳng. Cấu trúc của bộ rễ giúp cây có thể chui đựng được mặn.
Dừa yêu cầu khí hậu ôn hoà với độ ẩm cao và điều này thường gần với bờ biển. Cây cần sự
thoát nước tốt, đất thoáng khí đầy đủ
Nhiệt độ trung bình thích hợp nhất từ 27 – 32OC. Lượng mưa phân bố 1.270 – 2550 mm
mỗi năm. Ẩm độ cao, ánh sáng nhẹ, không chụi bóng râm. Dừa có thể trồng ở nhiều vùng
đất: đất cát duyên hải, đất phù sa, đất vùng núi lửa, đất laterit, than bùn, đất, sét… với sự
cung cấp đầy đủ tháo nước và thoáng khí. Chụi được khoảng pH rộng tư 5- 8. Yêu cầu cung

cấp đầy đủ muối kali
1.5 Đặc tính của dừa Dứa

Theo viện nghiên cứu dầu và cây có dầu (2008), dừa Dứa thuộc nhóm dừa lùn. Đặc điểm
nổi bật của giống dừa Dứa là không chỉ nước dừa mà các thành phần khác của cây dừa như


lá, hoa, phấn, cơm và vỏ dừa đều thơm mùi lá dứa rất được ưa chuộng nên luôn bán được
giá cao từ 2-3 lần so với các giống dừa uống nước địa phương khác. Dừa Dứa có nguồn gốc
Thái Lan được một số quốc gia du nhập như Philipine, Việt Nam. Cho trái sớm sau 36 tháng
trồng, năng suất từ 80- 140 trái/cây/năm, thể tích từ 250-350 ml/trái. Hương thơm của dừa
Dứa khác biệt tuỳ theo nhóm giống và do phấn dừa Dứa quyết định. Hương thơm của dừa
dứa tỷ lệ nghịch với kích thước trái của nhóm giống. Nhóm có trái càng nhỏ thì hương thơm
đậm đà hơn. Tỷ lệ nảy mầm của trái cũng khác biệt tuỳ theo nhóm giống và tỷ lệ nảy mầm
của trái tỷ lệ thuận với kích thước trái của từng nhóm giống. Nhóm giống có trái càng nhỏ
thì tỷ lệ nảy mầm càng thấp
Theo khảo sát, đánh giá dừa Dứa có 3 nhóm khác nhau:
Nhóm 1: Trái nhỏ, tròn, màu xanh, giống như trái dừa xiêm. Thơm nhiều nhất và có tỉ lệ
nảy mầm thấp nhất (khoảng 10%) trong số ba giống
Nhóm 2: Trái tròn, trung bình, màu xanh, đáy trái có 3 cạnh như dừa ta, hương thơm nhẹ
hơn nhóm 1 và có tỉ lệ nảy mầm của trái cao hơn nhóm 1(khoảng 40-60%)
Nhóm 3: Trái to tròn, màu xanh, đáy trái có 3 cạnh như dừa ta. Hương thơm nhẹ nhất trong
3 nhóm
Trong 3 nhóm và tỷ lệ nảy mầm cao nhất (khoảng 70-90%)
Theo viện nghiên cứu dầu và cây có dầu (2010). Qua điều tra khảo sát các cây dừa dứa đang
được trồng rãi rác ở Bến Tre và Tiền Giang từ trước khi có dự án phát triển sản xuất giống
dừa, phân tích thành phần dinh dưỡng trong cơm dừa của giống dừa dứa và một số giống
dừa khác cho thấy các chỉ tiêu về năng lượng, khoáng, đạm trong cơm dừa dứa rất cao so
với một số nước giải khác tổng hợp khác. Thành phần năng lượng trong cơm dừa từ 133234 Kcalo/100g, đạm từ 2.62- 2.87 g/100g, glucid từ 2.46- 6.38 g/ 100g. Thành phần dinh
dưỡng trong cơm dừa cuar giống dừa dứa cao hơn so với giống dừa cao (dừa ta)

1.6 Nhân giống dừa

Theo Nguyễn Bảo Vệ et al. (2005), dừa được nhân giống chủ yếu bằng cách ương trái. Kỹ
thuật cấy mô cũng đã được nghiên cứu như là một phương pháp nhân giống mới (Kovoor,
1981) nhưng chưa được sử dụng rộng rãi. Dừa rất dễ bị lai, nên khi nhân giống bằng hột,
việc chọn lựa cây con giữ đặc tính tốt như bản chất của giống là rất cân thiết
Khi trái dừa nảy mầm, phôi phát triển và thoát ra từ mắt mềm ở gáo thành cây con. Đồng
thời một mộng lớn là tử diệp phát triển ở bên trong gáo, hút chất dinh dưỡng của nước và
cơm (phôi nhũ) để nuôi cây con. Mộng dừa phát triển rất nhanh, khoảng 1.5 tháng đã chiếm
hết thể tích của gáo và lúc này rễ bắt đầu mọc. Sau 10 tháng thì mộng dừa tiêu thụ hết cơm
dừa. Nhờ nước dừa và cơm dừa nên cây con phát triển trong thời gian dài sau khi nảy mầm
không cần dinh dưỡng chất từ bên ngoài.


Trái khi ương được 4 tháng bắt đầu mọc mầm. Đây cũng là thời điểm chọn những trái đã
mọc mầm đem ra vườn ươm cây con. Thời gian cây con ở vườn ươm lâu mau tuỳ thuộc vào
sự phát triển của cây con. Nguyên tắc là khi con bắt đầu có lá hình lông chim là có thể bứng
đem trồng, thường thì khoảng 5-7 tháng cho nhóm dừa cao và 3-4 tháng cho nhóm dừa lùn,
không nên để cây con lâu ở vườn ươm
1.7 Nuôi cấy in vitro dừa và một số cây họ Arecaceace
1.7.1 Nuôi cấy phôi dừa

Sự cứu phôi hay nuôi cấy phôi là kỹ thuật đã được báo cáo lần đầu tiên bởi De Guzman và
Del Rosario (1964) giúp cho sự nảy mầm của phôi dừa Makapuno vì phôi không thể nảy
mầm do những biến đổi sinh hoá của nội nhũ trái. Kỹ thuật ngày nay đã được ứng dụng rất
phổ biến ở Philippine (Batugal và Engelmam, 1998; Rillo, 1999). Tuy nhiên, hiệu quả của
những quy trình này còn bị giới hạn, đặc biệt là tỷ lệ sống sót của cây con ở điều kiện ex
vitro
Theo báo cáo tình trạng nuôi cấy phôi dừa và kỹ thuật thuần dưỡng ở trường đại học
Philipne Los Banxos (Batugal và Engelmam,1998), trái được thu hoạch để tách phôi cấy

thường ở giai đoạn 9-11 tháng tuổi đối với dừa Makapuno. Phôi được nuôi cấy trên môi
trường Y3 cho tỉ lệ nảy mầm là 86% sau 4-6 tuần
Quy trình nuôi cấy phôi dừa của Philippine Coconut Authority (PCA) (Batugal và
Engelmann, 1998)
Thu thập phôi ở ngoài đồng: Dùng ống khoang lấy phôi nhũ chứa phôi, để vào keo lọ sạch.
Mẫu được khữ trùng sơ bộ bằng cách rữa dưới nước máy và rữa nhanh với ethanol 95% để
loại bỏ lớp dầu. Sau đó khử trùng với chất tẩy thương mại 100% (Zỗn ) trong 20 phút
Trong điều kiện vô trùng, phôi sau tách ra được khử trùng lại với chất tẩy 10% trong 1 phút
và rửa nước cất vô trùng 3-5 lần. Phôi được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng Eeuwens
(1976), ký hiệu là Y3. Phôi hình thành rễ và chồi sau 6- 8 tuần. Thời gian chuyển ra điều
kiện ex vitro sớm nhất là 4 tháng
Cây chuyển từ phòng thí nghiệm xuống nhà lưới một tuần để giúp cứng cây. Sau đó cây
được lấy ra, rữa sạch agar và khử trùng bằng thuốc diệt nấm. Trồng cây vào giá thể là cát
sông (river sand) đã được khử trùng. Cây con được trùm trong bao plastic 5-7 ngày để giữ
ẩm độ. Sau đó mở bao plastic một phần để cây quen dần với điều kiện nhà lưới, giữ trong
một tuần. Tuần thứ 3, cây con được mở bao plastic hoàn toàn. Tưới nước đều dặn và cung
cấp dinh dưỡng được pha loãng cho đến khi cây phát triển lá mới. Sau 3 tháng chuyển cây
sang chậu lớn hơn với giá thể đất. Sau 3-5 tháng, cây con có thể chuyển ra cánh đống sau
khi có 4-6 lá
Ở Bangladesh, phôi hợp tử của bốn giống dừa BARI Narikel 1, BARI Nairkel 2, Srilanka
Tall và Malaysian Dwarf được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng Y3. Tỷ lệ nẩy mầm của
phôi tương ứng là 93, 96, 89 và 40%. Hầu như phôi tạo rễ và chồi cùng một lúc và tỷ lệ
sống là 60% (Molla et at., 2004)


1.7.2

Tạo phôi vô tính ở dừa và một số cây họ Arecaceae

Việc kích thích tạo mô sẹo từ nhiều nguồn mẫu cấy khác nhau như rễ (Fulford et all, 1981),

lá (Pannetier và Buffard- Morel, 1982b), phát hoa(Eeuwens, 1976, Blake và Eeuwens,
1981)… cũng đã được nghiên cứu
Những nghiên cứu về tạo phôi vô tính trong nuôi cấy dừa đạt từ nhiều mẫu cấy khác nhau
như lá non, rễ, phôi, và phát hoa non với nhiều mức độ thành công khác nhau. Những năm
đầu thập niên 90, mô sẹo thu được từ tất cả các mô nhưng phôi vô tính và sự tái sinh phôi
chỉ đạt được từ mẫu lá non (Karunaratne và periyapperuma, 1989) và phát hoa non (Branton
và Blake, 1986). Những nghiên cứu mới đây cho thấy sự tạo phôi vô tính và sự tái sinh có
thể đạt được từ mẫu cấy mầm chồi (plumule) cho kết quả cao hơn các mẫu cấy khác
(Hornung, 1995; Chan et al., 1998)
Theo Duval et al. (1993), có sự phát sinh cơ quan (callogenesis) trên hai loại mẫu cấy khác
nhau là lá và phát hoa non của cây dừa trưởng thành (20- 25 năm tuổi) thuộc giống dừa
yellow Dwarf và giống lai Malayan Yellow Dwarf x West African Tall. Mẫu được nuôi cấy
trên môi trường đa vi lượng theo Eeuwens (1976), vitamin theo Morel và Wetmore, sucrose
40g/l, than hoạt tính 2-3 g/l, agar 7.5 g/l, bổ sung 2,4-D (30-80 mg/l) trong điều kiện tối ở
270C. Cảm ứng sự tạo phôi bằng cách tăng nồng độ 2,4- D. Sự trưởng thành của phôi vô
tính có được khi giảm dần nồng độ 2,4-D. Chồi phát trong điều kiện sáng, trên môi trường
có than hoạt tính và không có chất điều hoà sinh trưởng. Sự tạo rễ yêu cầu môi trường có
NAA
Phôi hữu tính trưởng thành của cây cọ dầu Elaeis guineensis Jacq var tenera tách ra cấy trên
môi trường Eeuwens (1976) chứa 2 mg/l 2,4 –D. Những mẫu phôi này tạo mô sẹo trong 8
tuần. Mộ sẹo được cấy trên môi trường Murashige và Skoog (1962, MS) bổ sung 0.5 mg/l
2,4-D để tạo phôi. Hai môi trường nuôi cấy thành công để biệt hoá phôi và tái sinh cây con
là MS-CAP bổ sung 0.05% than hoạt tính, không có chứa 2,4-D và môi trường MS-CAP bổ
sung 0.1 mg/l 2,4-D và 2.5 mg/l BA (Kanchanapoon và Domyoas, 1999)
1.8 Hiện tượng hoá nâu mẫu cấy
1.8.1 Nguyên nhân của hiện tượng hoá nâu

Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hoá nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi
cấy. Khi bị hoá nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và nếu để lâu ngày thì mẫu sẽ chết
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)

Sự hoá nâu là do hoạt động của enzyme oxy hoá có chứa đồng (catechol oxidase), thường
được gọi là những polypphenol oxidase, phenolase và tyrosinase (monophenol) oxidase )
được phóng thích, tổng hợp, hay hiện diện với điều kiện oxy hoá và chất nền thích hợp khi
mô bị tổn thương hay lão hoá (George, 1996)
1.8.2

Ngăn chặn sự hoá nâu


Theo George (1996), có nhiều biện pháp có thể ngăn cản sự hoá nâu như làm giảm sự tổn
thương mẫu cấy, loại bỏ những hợp chất phenol sản sinh phenol không tối ưu, giảm quá
trình oxy hoá khử của mô, giảm hoạt động phenolase và chất nền sẵn có hay thay đổi thành
phần môi trường và chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng
Hoạt động của enzyme liên quan đến cả sự tổng hợp và sự oxy hoá phenol được tăng cường
bởi ánh sáng (Creasy, 1968). Theo Durand-Cresswell et all., 1985), dịch trích lá của cây
Eucalytus cho thấy hàm lượng các hợp chất phenol cao hơn, đặc biệt là flavonoid khi trích
ở điều kiện sáng so với điều kiện trong tối. Vì vậy biện pháp khắc phục là giữ mẫu mới cấy
trong điều kiện tối vài tuần. Bên cạnh đó, mẫu cấy của những cây có khả năng bị hoá nâu có
thể được rửa trong dung dịch chất chống oxy hoá hay ngâm trong dung dịch chất chống oxy
hoá sau kh cắt ra. Những chất được sử dụng như là accorbic acid (0.1%), hỗn hợp ascorbic
acid và citric acid

Sự hoá đen xuất hiện ở mẫu cấy của những cây họ dừa là vấn đề phổ biến nhưng có thể khắc
phục bằng cách thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy hay chuyển mẫu thường xuyên
trong giai đoạn nuôi cấy đầu tiên. Những phương pháp ngăn cản sự hoá nâu khác dường
như không có hiệu quả (Tisserat, 1979). Một vài ví dụ về ngăn cản sự hoá nâu ở họ Palmae
bằng cách thêm than hoạt tính nồng độ từ 0.45- 3g/l đã được báo cáo như ở cây trà là
(Tisserat, 1979; Reynolds và Murashige, 1979), cây dừa (Fisher và Tsai, 1978)…
Theo George (!996), sự hoá nâu thường có liên quan đến việc sử dụng 2,4 –D, đặt biệt là khi
được thêm môi trường với nồng độ cao. Theo Giri et al.(1993), mô sẹo của cây Aconitum

heterophyllum tiết phenol trên môi trường có bổ sung 5 mg/l NAA và 1 mg/l BAP thì sự
hoá nâu không là vấn đề đáng ngại. Sự hoá nâu xảy ra ở mẫu cấy phát hoa dừa khi sử dụng
2,4-D nồng độ từ 100- 500 µM (Ebert và Taylor, 1990)


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương tiện
2.1.1 Vật liệu
Trái dừa dứa ở giai đoạn 9-10 tháng tuổi thu từ cây trồng trong trại nghiên cứu và thực
nghiệm nông nghiệp, khoa nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường đại học Cần Thơ
(Hình 2.1)

Hình 2.1: Cây dừa Dứa trồng ở Trại Nghiên Cứu và Thực nghiệm Nông Nghiệp
2.1.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng (autoclave), microwave, bếp điện, máy đo pH, cân phân
tích, máy khuấy từ, tủ sấy cao độ…
Micropipette, beaker, ống đông, đũa thuỷ tinh, chai lọ, kẹp cấy, ống khoan, dao mổ, găng
tay, giấy cấy, bông gòn, dao lam,…
2.1.3 Hoá chất
Khoáng đa vi lượng và các vitamin
Chất điều hoà sinh trưởng: 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Benzyl adenine (BA)
Đường sucrose, agar, than hoạt tính, nước dừa
Hoá chất khử trùng: cồn 70O, clorox
Hoá chất khác: HCl 0.1 N, NaOH 0.1 N…
2.4.1 Địa điểm và thời gian thí nghiệm


Địa điểm: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và nhà lưới, Bộ môn sinh lý hoá, khoa Nông
Nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: từ tháng 06 năm 2008 đến tháng 4 năm 2010
2.1.5 Điều kiện thí nghiệm
Phòng cấy mô có trang bị:
Máy điều hoà nhiệt độ (26 ± 20C)
Cường độ ánh sáng: 1.500 lux
Quang kỳ 16 giờ/ngày
2.2 Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường
Môi trường sau khi pha chế xong được điều chỉnh ở pH 5.8, sau đó nấu cho tan agar và rót
vào ống nghiệm (20 ml/ống) và keo có đường kính 6 cm và cao 12 cm (30 ml/keo). Môi
trường được khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 121Oc, áp suất 1 atm trong 20 phút
Thành phần môi trường
Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường đa vi lượng và vitamin theo Eeuwens (1976), kí
hiệu Y3. Bổ sung các thành phần: đường (45g/l), agar (8g/l). Tuỳ theo các thí nghiệm có bổ
sung chất điều hoà sinh trưởng thực vật, nước dừa, than hoạt tính (2.5g/l)
Khử trùng mẫu cấy
Trái dừa dứa được tách bỏ lớp vỏ sợi
Rửa bề mặt trái dưới vòi nước máy
Lau cồn bề mặt trái trong điều kiện vô trùng và tách làm đôi
Dùng ống khoan vô trùng khoan lấy khối phôi nhũ chứa phôi và cho nước cất vô trùng (hình
2.2)
Ngâm mẫu trong dung dịch Clorox: Nước tỷ lệ 1:2 trong 15 phút
Tách lấy phôi và đặt vào môi trường nuôi cấy chứa ống nghiệm


Hình 2.2: Vị trí của phôi trong trái dừa Dứa
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của phôi
Mục tiêu: Xác định môi trường cũng như điều kiện thích hợp cho sự nảy mầm và phát triển

của phôi dừa dứa
Phương pháp: Phôi dừa ở giai đoạn 9-10 tháng tuổi sau khi phân lập trong điều kiện vô
trùng theo các bước mô tả trên sẽ được cấy vào các loại môi trường khác nhau để đánh giá
sức sống và sự sinh trưởng của phôi. Môi trường nuôi cấy cơ bản Y3 (Eeuwens, 1976) và
môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung agar (8g/l) và than hoạt tính
(2.5g/l). Tuỳ theo các nghiệm thức có bổ sung thêm nước dừa (100 ml/l), môi trường lỏng
không có bổ sung than hoạt tính
Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố, có 5 nghiệm thức với 4
lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại là một ống nghiệm chưa phôi
Các nghiệm thức:
1/ Y3+ agar + than hoạt tính
2/ Y3 + agar + than (đặt trong tối)
3/ Y3 + agar + than + nước dừa 100 ml/l
4/ MS + agar + than + nước dừa 100 ml/l
5/ Y3 lỏng lắc
Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian phôi nảy mầm
Tỷ lệ % phôi nảy mầm
Tỷ lệ % phôi tạo rễ
Chiều cao chồi (cm): chiều cao chồi được đo từ gốc lá đến vị trí cao nhất


Thời gian ghi nhận chỉ tiêu: 15, 30 và 60 ngày sau khi cấy
Thí nghiệm 2: Hiệu quả của 2,4-D và BA lên sự tạo mô sẹo từ mầm chồi phôi
Mục tiêu: Xác định môi trường thích hợp cho sự phát sinh mô sẹo từ mầm chồi
Phương pháp: Phôi nảy mầm trên môi trường Y3 đặc, trong điều kiện tối ở 60 NSKC được
cắt thành lát mỏng ngang khoảng 0.2-0.3 cm. Vị trí cắt là từ phần thân lên đến đỉnh chồi
(Hình 2.4). Mẫu được cấy vào môi trường Y3 có các nồng độ 2,4-D và BA khác nhau để
kích thích sự biến đổi sẹo

Hình 2.3: Vị trí mầm chồi được cắt ra để nuôi cấy
Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên thừa số hai nhân tố, có 8 nghiệm thức
với 7 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại là một keo chứa 2 mẫu
Bảng 2.1: Các nồng độ 2,4-D và BA trong từng nghiệm thức (NT)
Nồng độ NAA (mg/l)
1
2
4
8

Nồng độ BA (mg/l)
0.55
NT 1
NT 2
NT 3
NT 4

1
NT 5
NT 6
NT 7
NT 8

Chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ % mẫu hoá nâu
Thời gian mẫu tạo mô sẹo
Tỷ lệ % mẫu tạo mô sẹo
2.2.3 Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Excel và phần mềm thống kê MSTATC,
kiểm định LSD ở mức ý nghĩa 5%

Các số liệu là tỷ lệ phần trăm nếu biến động từ 0- 100% được chuyển sang dạng Arcsine √x
theo công thức trong bảng tính Excel: Giá trị chuyển đổi bằng arsin(sqrt(x)/10)*180/3,1416;
giá trị là 0% được chuyển đổi bởi công thức 1/4n, 100% được chuyển đổi bởi công thức
100-1/4n; với x là giá trị phần trăm cần chuyển đổi (%); n là mẫu dựa trên để tính trăm
(Gomez và Gomez, 1984)


CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của phôi
Sự phát triển của mẫu cấy phụ thuộc rất lớn vào quá trình xử lý mẫu và cả thao tác khử
trùng mẫu. Có được mẫu vô trùng hoàn toàn là bước đầu thành công trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật. Hiệu quả của việc khử trùng bề mặt phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn
mẫu, loại và lượng hoá chất khử trùng cũng như thời gian khử trùng bề mặt mẫu. Phôi dừa ở
giai đoạn này bao quanh bởi cơm dừa và phôi chưa lộ ra ngoài không khí nên phương pháp
khử trùng bề mặt đơn giản chỉ với dung dịch Clorox đã đạt hiệu quả mẫu vô trùng cao. Kết
quả mẫu vô trùng theo phương pháp nêu trên đạt tỷ lệ phôi sống và sạch 100% (Hình 3.1)

a

b

Hình 3.1: Phôi được tách ra và nuôi cấy trên môi trường đặt (a) và môi trường lỏng (b)
Tỷ lệ nảy mầm của phôi
Sau 15 ngày nuôi cấy, phôi chuyển sang màu xanh, bắt đầu phát triển và có sự gia tăng kích
thước ở tất cả các nghiệm thức đặt ngoài sáng. Phôi trong điều kiện tối cũng có sự phát triển
nhưng không có sự tổng hợp diệp lục tố nên có màu trắng (Hình 3.2)

a

b

c

Hình 3.2: Phôi trên môi trường Y3 ở điều kiện ngoài sáng (a), điều kiện lỏng lắc (b), và điều
kiện tối (c) ở 15 ngày nuôi cấy


Kết quả bảng 3.1 cho thấy, đến 30 ngày sau khi cấy, phôi phát triển chồi và ra rễ ở các
nghiệm thức môi trường đặc (có agar), trong khi nghiệm thức môi trường Y3 lỏng, phôi
tăng kích thước nhưng không phát triển chồi.Tỷ lệ nảy mầm của phôi khác biệt có ý nghĩa
1% giữa các nghiệm thức. Tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt 100% trên môi trường cơ bản Y3 đặt
ở điều kiện ngoài sáng và trong tối. Môi trường Y3 hay môi trường MS có bổ sung nước
dừa 100 ml/l cho tỷ lệ nảy mầm của phôi thấp hơn (tương ứng là 50% và 25%). Môi trường
Y3 trong điều kiện lỏng lắc phôi chỉ tăng kích thước nhưng không nảy mầm. Theo dõi đến
60 ngày sau khi cấy, không có sự gia tăng tỷ lệ nảy mầm ở các nghiệm thức
Bảng 3.1: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ nảy mầm của phôi (%) ở
30 ngày sau khi cấy
Tỷ lệ nảy mầm

Nghiệm thức
Y3 + agar + than
Y3 + agar + than (đặt trong tối)
Y3 + agar + nước dừa 100ml/l
MS + agar + than + nước dừa 100ml/l
Y3 lỏng lắc
F
CV (%)

100 a
100 a
50 ab
25 b
0b
**
61.82

Ghi chú: Trong cùng 1 cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi
dùng phép kiểm định LSD ở mức ý nghĩa 5%, (**): Khác biệt ở mức ý nghĩa 1%

Tỷ lệ ra rễ
Kết quả bảng 3.2 cho thấy, ở 30 NSKC, phôi có sự hình thành rễ cao nhất trên môi trường
Y3 đặt ở điều kiện tối và ngoài sáng tương tự nhau với tỷ lệ 50%. Môi trường Y3 và môi
trường MS có bổ sung 100ml/l nước dừa ở thời điểm này vẫn chưa thấy có sự phát triển của
rễ
Bảng 3.2: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên tỷ lệ ra rễ của phôi (%) ở 30
và 60 ngày sau khi cấy
Nghiệm thức
Y3 + agar + than
Y3 + agar + than (trong tối)
Y3 + agar + than + nước dừa
(100 ml/l)
MS + agar + than + nước
dừa (100 ml/l)
Y3 lỏng lắc

Tỷ lệ ra rễ (%)
30 NSKC

50
50
0

60 NSKC
100
100
50

0

0

-

-

Đến thời điểm 60 NSKC, có sự gia tăng tỷ lệ tạo rễ giữa các nghiệm thức. Chồi trên môi
trường Y3 đặt ở điều kiện tối và ngoài sáng cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất, đạt 100%. Môi trường


Y3 bổ sung 100 ml/l nước dừa cho tỷ lệ tạo rễ của chồi thấp, chỉ đạt 50%. Chồi trên môi
trường MS có bổ sung 100 ml/l nước dừa ở thời điểm này vẫn không có sự hình thành rễ
Bảng 3.3: Hiệu quả của môi trường và điều kiện nuôi cấy lên chiều cao chồi (cm) ở 30 và
60 ngày sau khi cấy
Chiều cao chồi (cm)
Nghiệm thức
30 NSKC
Y3 + agar + than
Y3 + agar + than (đặt trong tối)

Y3 + agar + than + nước dừa 100 ml/l
MS + agar + than + nước dừa 100 ml/l
Y3 lỏng lắc

0.53
0.95
0.25
0.2
-

60 NSKC
1.45
2.03
0.4
0.3
-

Đến 60 ngày sau khi cấy, có sự gia tăng cao chồi ở các nghiệm thức. Chiều cao chồi cao
nhất đạt được trên môi trường Y3 đặt ở điều kiện tối, trung bình khoảng 2 cm. Chồi phát
triển trong điều kiện này có màu trắng. Môi trường Y3 ở ngoài sáng cũng cho kết quả chiều
cao chồi khá cao với khoảng 1.45 cm cao hơn các nghiệm thức có bổ sung nước dừa cũng
trên môi trường cơ bản Y3 và môi trường MS
Qua các kết quả đạt được cho thấy môi trường Y3 không có bổ sung nước dừa, đặt ở điều
kiện trong tối và ngoài sáng đều cho tỷ lệ nảy mầm của dừa Dứa tối ưu với 100% phôi
ddeeuff nảy mầm. Chiều cao của chồi đạt kết quả cao nhất và tỷ lệ tạo rễ là 100% ở 60
NSKC. Môi trường Y3 có bổ sung 100 ml/l nước dừa cho thấy hiệu quả lên sự nảy mầm và
sinh trưởng của chồi cũng như sự phát triển của rễ thấp hơn môi trường Y3 đối trứng. Môi
trường MS có bổ sung 100 ml/l nước dừa cho thấy tỉ lệ nảy mầm của phôi rất thấp, chỉ
khoảng 25% và không có sự hình thành rễ. Theo viện nghiên cứu dầu và cây có dầu (2008)
thì tỷ lệ nảy mầm của trái dừa Dứa cũng khác biệt tuỳ theo nhóm giống và tỷ lệ nảy mầm

của trái tỷ lệ thuận với kích thước trái của từng nhóm giống. Nhóm giống có trái càng nhỏ
thì tỷ lệ nảy mầm càng thấp. Bên cạnh đó, bên trong trái dừa khi phôi bắt đầu nảy mầm, tử
diệp sẽ phát triển và hút chất dinh dưỡng từ nước và cơm (phôi nhũ) để nuôi cây con. Nhờ
nước dừa và cơm dừa nên cây con phát triển trong thời gian dài sau khi nảy mầm không cần
dưỡng chất từ môi trường bên ngoài. Vì vậy sự nảy mầm của phôi cũng có thể ảnh hưởng
bởi các thành phần các chất có trong nước dừa của trái. Trong thí nghiệm, nước dừa sử dụng
là nước dừa tươi của giống dừa Ta không phải là nước dừa Dứa. Kết quả việc bổ sung nước
dừa này vào môi trường nuôi cấy cho thấy không hiệu quả cho sự nảy mầm của phôi dừa
Dứa, thậm chí gây cản trở cho sự phát triển của phôi và sự hình thành rễ so với môi trường
đối chứng không bổ sung nước dừa. Môi trường Y3 trong điều kiện lỏng lắc cũng cho thấy
không hiệu quả cho sự nảy mầm của phôi dừa Dứa. Khi được cấy vào môi trường này, phôi
được ngâm hoàn toàn trong môi trường, mặc dù được đặc trong điều kiện lắc để tăng cường


sự trao đổi khí nhưng có thể vẫn không cung cấp đủ oxy cho sự hô hấp nên đã gây ức chế sự
nảy mầm của phôi dừa Dứa
Môi trường dinh dưỡng Y3 là môi trường có hiệu quả được chuyên biệt sử dụng trong nuôi
cấy dừa được phát hiện bởi Eeuwens vào năm 1976 (Oropeza et al., 1999). Phôi dừa Dứa
nuôi cấy trên môi trường này cũng cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất đạt đến 100%, khi được đặt
ở điều kiện trong tối và cả ở ngoài sáng. Cây con nảy mầm trên môi trường Y3 ở điều kiện
ngoài sáng phát triển xanh tốt, thích hợp cho việc chuẩn bị thuần dưỡng ở điều nhà lưới.
Theo Molla et al (2004), tỷ lệ nảy mầm của phôi hợp tử của bốn giống dừa BARI Nairkel 1,
BARI Narkel 2, Srilanka Tall và Malaysian Dwart ở Bangladesh cũng đạt khá cao tuỳ theo
giống khi được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng Y3. Tỷ lệ nảy mầm của phôi tương
ứng là 93, 96, 89, và 40%. Hầu như phôi tạo rễ và chồi cùng một lúc
Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường dinh dưỡng Y3 cả trong điều kiện tối và ngoài sáng
đều cho tỷ lệ nảy mầm của phôi dừa Dứa tối ưu với 100% phôi nảy mầm. Chồi ra rễ và phát
triển tốt sau 60 ngày nuôi cấy (Hình 3.2)
2.2 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của 2,4 – D và BA lên sự tạo mô sẹo từ mầm chồi của phôi
Mầm chồi non của phôi dừa nảy mầm trong điều kiện tối được cắt thành lát có kích thước

khoảng 0.2- 0.3 cm và được nuôi cấy trên môi trường Y3 bổ sung các nồng độ 2,4- D và BA
khác nhau để kích thích sự hình thành mô sẹo
Trong thí nghiệm này, hiện tượng hoá nâu mẫu cấy (browing) là trở ngại lớn nhất cho kết
quả thí nghiệm . Mầm chồi sau khi được cắt ra và nuôi cấy dần trở nên đen và chết với tỷ lệ
rất cao (Hình 3.2). Tuy nhiên thí nghiệm cũng thu được kết quả khả quan là mẫu cấy mầm
chồi của phôi dừa Dứa có sự hình thành mô sẹo, mặc dù tỷ lệ này chưa cao

Hình 3.3: Mẫu cấy mầm chồi bị chết do hoá nâu
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy, hiện tượng hoá nâu xuất hiện ở tất cả các nghiệm
thức và với tỷ lệ rất cao . Mẫu bị hoá nâu cao nhất ở tất cả các nghiệm thức có bổ sung 2,4D ở các nồng độ từ 1-8 mg/l kết hợp với 1 mg/l BA, 100% mẫu cấy đều bị nâu và chết, khác
biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức kết hợp với BA ở nồng độ thấp hơn 0.5 mg/l.
Trên môi trường này, tỷ lệ mẫu hoá nâu trung bình là 87.5%. Ở các nghiệm thức bổ sung
2,4-D, nồng độ 2,4-D cao 8 mg/l cho thấy tỉ lệ hoá nâu ở mẫu cấy cao nhất với 100%. Tuy
nhiên kết quả khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức nồng độ từ 2,4-D


1-8 mg/l. Tương tác giữa các nghiệm thức 2,4-D và BA cũng khác biệt không có ý nghĩa
thống kê
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên tỷ lệ hoá nâu của mẫu cấy (%) ở 30 ngày sau khi
cấy
Nồng độ 2,4-D (mg/l)
1
2
4
8
Trung bình

Nồng độ BA (mg/l)
0.5
1.0

85.71
100.000
85.71
100.000
78.75
100.000
100.00
100.000
87.50 b

Trung bình
92.86
92.86
89.29
100.00

100.000 a

FNAA
FBA
FNAA x FBA

Ns
*
Ns

CV (%)

20.77

Ghi chú:Trong cùng 1 cột, những số có chữ theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi dùng phép
kiểm định LSD ở mức ý nghĩa 5%, (ns): Khác biệt không có ý nghĩa thống kê, (*): Khác biệt ở mức ý nghĩa 5%

Theo Tisserat (1979) sự hoá đen xuất hiện ở mẫu cấy của những cây họ dừa là vấn đề phổ
biến nhưng có thể khắc phục bằng cách thêm than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy. Bên
cạnh đó chúng tôi cũng đã tiến hành kết hợp đặt mẫu mới cấy trong điều kiện tối. Tuy
nhiên, vẫn chưa hạn chế được tình trạng hoá nâu mẫu cấy. Theo George (1996), chất điều
hoà sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng có thể ảnh hưởng lên sự hoá nâu của
mẫu cấy, đặc biệt là 2,4-D nếu thêm vào môi trường với nồng độ cao. Trong thí nghiệm này,
nồng độ 2,4-D sử dụng cũng tương đối cao từ 1-8 mg/l kết hợp với BA nồng độ 0.5 và 1
mg/l nên có thể có là nguyên nhân gây mẫu cấy với tỷ lệ khá cao
Kết quả trình bày ở bảng 3.5 cho thấy, ở thời điểm 60 NSKC, mẫu cấy mầm chồi trên môi
trường Y3 bổ sung 2 mg/l 2,4-D kết hợp với 0.5 mg/l BA có sự hình thành mô sẹo tuy nhiên
với tỷ rất thấp, chỉ khoảng 7.14%. Mô sẹo có màu trắng , có dạng rời và có nguồn gốc từ
mẫu lá của mầm chồi (Hình 3.4). Các nghiệm thức khác mẫu hoàn toàn không có sự tạo mô
sẹo
Bảng 3.5: Hiệu quả của 2,4-D và BA lên tỷ lệ tạo mô sẹo từ mầm chồi (%) ở 60 ngày sau
khi cấy
Nồng độ BA (mg/l)

Nồng độ 2,4-D (mg/l)
1
2
4
8

0.5
0
7.14
0

0

1
0
0
0
0


Hình 3.4: Mầm chồi tạo sẹo trên môi trường Y3 bổ sung 2 mg/l 2,4-D và 0.5 mg/l BA ở 60
ngày sau khi cấy
2.4-D có hiệu quả trong sự tạo mô sẹo từ nhiều loại mẫu cấy khác nhau của một số loài
thuộc họ dừa khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như theo báo cáo của Eshraghi et
al. (2005), Kanchanapoon và Domyoas (1999), Duvat et al. (1993). Tuy kết quả cảm ứng
tạo mô sẹo đạt được trong thí nghiệm này còn thấp nhưng bước đầu cũng đã mỡ ra hướng
mới và có triển vọng trong việc nhân giống cây dừa Dứa thông qua con đường tạo phôi vô
tính. Từ mô sẹo hình thành sẽ biến đổi tạo phôi vô tính và tái sinh chồi. Theo Hornung
(1995), Chan et al. (1998), những nghiên cứu mới đây cho thấy sự tạo phôi vô tính và sự tái
sinh có thể đạt được từ mẫu cấy mầm chồi (plumule) cho kết quả cao hơn các mẫu cấy khác
Qua kết quả thí nghiệm cho thấy có thể tạo mô sẹo từ mầm chồi của phôi dừa Dứa trên môi
trường này là 7.14% ở 60 NSKC