Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học và ứng dụng những
thành tựu kỹ thuật mới vào y học đã giúp khống chế nhiều loại bệnh
nhưng bệnh nhiễm khuẩn vẫn có chiều hướng gia tăng. Hàng năm, tỷ
lệ mắc bệnh và tử vong do các căn nguyên vi khuẩn cịn cao, điển
hình là các trường hợp nhiễm khuẩn do các vi khuẩn Gram âm. Một
trong các căn ngun đó là Klebsiella pneumoniae. Lồi vi khuẩn này
gây ra các bệnh nghiêm trọng như nhiễm trùng huyết, viêm phổi,
nhiễm trùng đường tiết niệu, bệnh phổi mạn tính và nhiễm khuẩn
bệnh viện, ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch và gây tỷ lệ tử
vong tương đối cao.
Việc phát minh ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách
mạng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên, trong thực tế
do việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong những thập kỷ vừa qua đã
dẫn đến sự xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh và đa
kháng kháng sinh, gây nên một mối nguy cơ toàn cầu đe dọa nền y
học hiện đại. Trong số các loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc
kháng sinh thì Klebsiella pneumoniae đã được nhiều nghiên cứu đề
cập đến. Mức độ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae thay
đổi theo từng quốc gia và khu vực địa lý.
Ở Việt Nam, theo số liệu thống kê của chương trình giám sát
quốc gia về tính kháng thuốc kháng sinh ASTS (Antibiotic
Sensitivity Testing Study): tỷ lệ Klebsiella đề kháng các kháng sinh
thuộc phân nhóm cephalosporin là hơn 30% (năm 1999) và tăng lên
hơn 50% (năm 2004). Trên 99% các chủng vi khuẩn này còn nhạy
cảm với imipenem. Việc xác định căn nguyên gây nhiễm khuẩn nói
chung và Klebsiella pneumoniae nói riêng cũng như xác định độ
kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn là việc làm cần thiết để giúp
các thầy thuốc lâm sàng có phương hướng sử dụng kháng sinh hợp
lý, góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong, giảm chi phí điều trị.

Bên cạnh những nghiên cứu xác định tỷ lệ gây nhiễm khuẩn và
mức độ kháng thuốc kháng sinh của Klebsiella pneumoniae thì ngay
từ năm 1980, người ta đã nghiên cứu về một số yếu tố độc lực như độ
bám dính, đại thực bào chứa sắt, kháng nguyên O và vỏ capsule có
liên quan đến bệnh sinh của vi khuẩn này. Năm 2007, tác giả Fang
C.T., Kuo-Ming Y. và cộng sự đã nghiên cứu bệnh sinh của áp xe
gan và nhận thấy căn nguyên gây áp xe gan có liên quan đến vai trị


2
của Klebsiella pneumoniae thuộc serotype K1 và K2. Serotype K2
thường gặp ở những chủng vi khuẩn phân lập được từ bệnh nhân
viêm phổi, nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết.
Nghiên cứu của Wen-Liang Y. và cộng sự cũng cho biết, những
chủng Klebsiella pneumoniae có kháng nguyên vỏ, mang gen magA,
và rmpA thường gây áp xe gan vì gen magA mang đặc trưng kiểu
hình và độ nhày của vi khuẩn, làm tăng khả năng kháng thực bào và
khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Gen rmpA được biết đến với vai trò
trong việc tổng hợp polysaccharide ngoại bào liên quan đến chất
nhầy của Klebsiella pneumoniae.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu trong nước đa số mới chỉ tập trung
vào việc xác định kiểu hình và mức độ kháng thuốc kháng sinh của
Klebsiella pneumoniae mà chưa có nghiên cứu nào tìm hiểu về gen
và serotype của loài vi khuẩn này.
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương hàng năm tiếp nhận số
lượng lớn bệnh nhân vào viện với bệnh cảnh lâm sàng thường đa
dạng và nặng, trong đó có một số lượng tương đối nhiều bệnh nhân bị
nhiễm khuẩn do Klebsiella pneumoniae.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, với mong muốn góp phần
đáp ứng yêu cầu nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh do

Klebsiella pneumoniae gây nên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang
gen magA, rmpA ở các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập
được tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương (1/2007-12/2011),
với 2 mục tiêu:
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1.
2.

Xác định sự phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae ở các bệnh
phẩm và mức độ kháng kháng sinh của chúng.
Xác định tỷ lệ mang gen magA, rmpA; Serotype của một số
chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được theo bệnh phẩm.
CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Xác định được sự phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae ở các
bệnh phẩm.


3
2. Xác định mức độ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella
pneumoniae phân lập được trong các mẫu bệnh phẩm.
3. Xác định được tỷ lệ các chủng Klebsiella pneumoniae mang gen
magA, rmpA phân lập được tại Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương.
4. Xác định tỷ lệ các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập được
thuộc serotype K1, K2, K5, K20, K54, K57.
CẤU TRÚC LUẬN ÁN
Luận án gồm có 107 trang khơng kể phụ lục, gồm 4 chương, 19
bảng, 4 biểu đồ, 8 hình, 114 tài liệu tham khảo.

Bố cục luận án gồm:
Đặt vấn đề 03 trang;
Chương 1: Tổng quan tài liệu 27 trang;
Chương 2: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang;
Chương 3: Kết quả nghiên cứu 25 trang;
Chương 4: Bàn luận 24 trang;
Kết luận 02 trang; Kiến nghị 01 trang; Danh mục các cơng trình
nghiên cứu có liên quan 01 trang.
Tài liệu tham khảo (tổng số 114 tài liệu, 26 tài liệu tiếng Việt, 88
tài liệu tiếng Anh).
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ PHÂN LOẠI KLEBSIELLA
Klebsiella là một trong những chi quan trọng thuộc họ vi khuẩn
đường ruột, được đặt theo tên của nhà vi khuẩn học người Đức là
Edwin Klebs (1834 - 1913). Klebsiella có trong hệ vi khuẩn bình
thường ở ruột người trưởng thành, với số lượng nhỏ, có thể gặp ở
đường hô hấp trên. Klebsiella cũng là thành viên của hệ vi khuẩn
bình thường ở nhiều lồi động vật và phân bố rộng rãi ngồi mơi
trường. Trong số các loài thuộc giống Klebsiella, Klebsiella
pneumoniae (K. pneumoniae) là loài gây bệnh điển hình và quan
trọng nhất. Căn cứ vào kháng nguyên O, K. pneumoniae được chia
thành 9 nhóm, trong đó nhóm O1 là hay gặp nhất. Dựa vào cấu trúc
vỏ của K. pneumoniae, người ta chia thành 77 serotype.
1.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ KLEBSIELLA


4
1.2.1. Đặc điểm sinh học của K. pneumoniae
1.2.1.1. Hình thể
K. pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, trên tiêu bản nhuộm

Gram, vi khuẩn thường đứng thành từng đơi. K. pneumoniae có kích
thước 0,3 - 1 x 0,6 - 6 µm.
1.2.1.2. Kháng nguyên
K. pneumoniae có kháng nguyên O và kháng nguyên K.
Kháng nguyên O bản chất là LPS (lipopolysaccharide)- kháng
nguyên thân của vi khuẩn, mang tính đặc hiệu nhóm. LPS là một
phức hợp protein, poliosid và lipid, trong đó protein làm cho phức
hợp có tính kháng ngun, poliosid quyết định tính đặc hiệu kháng
ngun cịn lipid quyết định tính độc. Dựa vào kháng nguyên O, K.
pneumoniae được chia thành 9 nhóm.
Kháng nguyên K (bản chất là polysaccharide) - là kháng nguyên
vỏ hoặc kháng nguyên bề mặt mang tính đặc hiệu type. Kháng nguyên
K có tác dụng giúp vi khuẩn tránh được tế bào thực bào. Dựa vào
kháng nguyên K người ta chia vi khuẩn thành 77 serotype.
1.2.1.3. Các yếu tố độc lực
K. pneumoniae có trong đường hơ hấp và đường tiêu hóa của
khoảng 5% người bình thường, lồi vi khuẩn này cũng là thành viên
của hệ vi khuẩn bình thường ở nhiều lồi động vật và phân bố rộng
ngồi mơi trường. K. pneumoniae với nhiều yếu tố độc lực tạo điều
kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập, lan truyền và gây bệnh, bao
gồm: yếu tố bám và xâm nhập, vỏ, nội độc tố, độc tố ruột, khả năng
cạnh tranh sử dụng sắt, bacteriocin
1.2.1.4. Cơ chế đề kháng kháng sinh của K. pneumoniae
Tạo ra các enzym
Tạo ra các enzym làm biến đổi hoặc phá huỷ cấu trúc của phân tử
kháng sinh làm kháng sinh mất tác dụng. Những enzym này có thể
nằm ở thành tế bào, bảo vệ sự vững chắc của tế bào.
Làm giảm tính thấm của màng nguyên tương
Vi khuẩn giảm mức độ thấm thuốc qua thành tế bào hoặc giảm
tính thấm của màng nguyên tương hoặc làm mất hệ thống vận chuyển

5
qua màng. K. pneumoniae có màng ngồi chống lại khả năng thấm
của những kháng sinh ưa nước.
Tạo ra các isoenzym
Trong số các cơ chế kháng kháng sinh của K. pneumoniae, cơ
chế vi khuẩn sinh enzym, nhất là vi khuẩn sinh -lactamase phổ
rộng cần được đặc biệt quan tâm, vì khi vi khuẩn sinh ESBLs thì sẽ
đề kháng tồn bộ nhóm -lactam, nhất là cephalosporins - các kháng
sinh được dùng phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, việc sản sinh các
enzym carbapenemases hoặc metallo-beta-lactamase bởi K.
pneumoniae có thể làm cho vi khuẩn đề kháng với tất cả các kháng
sinh thuộc nhóm beta-lactam, bao gồm cả carbapenem.
1.2.2. Phân loại serotype và gen độc lực của K. pneumoniae
Các yếu tố liên quan đến độc lực của K. pneumoniae như độ
bám dính có fimbriae bám và khơng có fimbriae bám, bacteriocin,
đại thực bào chứa sắt, kháng nguyên O và vỏ polysaccharide. Những
yếu tố độc lực chính của K. pneumoniae để gây các bệnh nhiễm trùng
như: serotype huyết thanh, kiểu hình hypermucoviscosity,
lipopolysaccharide, đại thực bào có chứa sắt và pili. Mức độ độc lực
của K. pneumoniae có thể gây nhiễm khuẩn khác nhau, như đối với
serotype của chủng vi khuẩn K. pneumoniae được chia thành 77
serotype và độc lực của serotype ở các vùng địa lý khác nhau thì rất
khác nhau. Trong số 77 serotype kháng nguyên vỏ của K.
pneumoniae theo phân loại thì serotype K1, K2, K4 và K5 đã được
chứng minh có độc lực cao khi gây nhiễm khuẩn thực nghiệm ở
chuột, đồng thời gây nhiễm trùng nặng ở người và động vật. Serotype
K1 thường gặp trong các trường hợp viêm phổi và áp xe gan, gây
biến chứng nặng nề làm nhiễm khuẩn hệ thống thần kinh trung ương

như viêm màng não. K. pneumoniae có serotype K1 có K2 thường có
kiểu hình hypermucoviscosity do vậy có khả năng sản sinh chất nhày
làm tăng độ nhớt và độ bám dính của vi khuẩn trên mơi trường ni
cấy, làm cho K. pneumoniae tính độc lực cao hơn so với các
serotype khác và dẫn đến gây tử vong.
Các nghiên cứu về gen của K. pneumoniae gồm có: cps (capsular
polysaccharide synthesis), rmpA, (regulator mucoid phenotype A),
magA (mucoviscosity associated gene A). Chức năng của các gen này
là hoàn toàn khác nhau, như gen cps thực hiện việc tổng hợp


6
polysaccharide. Gen rmpA chịu trách nhiệm điều hoà sự tổng hợp các
polysaccharide ngoại bào và sinh ra các kiểu hình
hypermucoviscosity. Gen magA mã hóa một protein màng ngồi 43
kD. Gen magA nằm trong operon có liên quan đến serotype K1 hay
các operon có chứa gen magA là có serotype K1 và gen magA chống
lại thực bào do vậy hay gây áp xe gan, viêm màng não. Gen magA
cịn đóng vai trò quan trọng trong nhiễm trùng do Klebsiella như
nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi và áp xe gan, đồng thời cũng mang
đặc trưng kiểu hình và độ nhày của lồi vi khuẩn này làm tăng khả
năng chống lại hiện tượng thực bào. Gen magA gần đây đã được xác
định trong các chủng K. pneumoniae gây áp xe gan ở bệnh nhân
không chỉ ở Đài Loan mà còn các nước khác trên thế giới. Chủng K.
pneumoniae mang gen magA thì độc lực tăng và có thể gây nên bệnh
cảnh lâm sàng nặng nề, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao đối với người bệnh.
Nghiên cứu về K. pneumoniae tại Đài Loan cho thấy, sự kết hợp của
gen magA với kiểu gen chất nhày có liên quan đến sinh bệnh học của
thể áp xe gan. Ngồi magA thì rmpA cũng đóng vai trị quan trọng
trong biểu hiện kiểu hình chất nhày.

1.2.3. Khả năng gây bệnh của K. pneumoniae
1.2.3.1. Nhiễm khuẩn huyết
1.2.3.2. Viêm phổi
1.2.3.3. Áp xe gan
1.2.3.4. Viêm màng não
1.2.3.5. Một số bệnh khác
1.2.4. Các phương pháp chẩn đoán K. pneumoniae
1.2.4.1. Phương pháp hiển vi
1.2.4.2. Ni cấy phân lập
K. pneumoniae là lồi vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ngộ, phát
triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch
thường, thạch máu. Nhiệt độ thích hợp từ 35 - 37oC, pH 7- 7,2.
Kỹ thuật kháng sinh đồ:
Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch;
Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh ức chế tối thiểu – MIC;
Phương pháp phát hiện ESBLs.
1.2.4.3. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)


7
Đây là kỹ thuật cho phép nhân bản một đoạn ADN mong muốn từ hệ
gen ADN của sinh vật bằng một cặp mồi đặc hiệu.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ K. PNEUMONIAE
1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới về K. pneumoniae
1.3.1.1. Tình hình nhiễm khuẩn do K. pneumoniae
K. pneumoniae thường gây viêm phổi, gây NKH, viêm màng não, áp
xe gan, nhiễm khuẩn đường tiết niệu,
Wen-Chien K. cùng cộng sự (CS) đã thực hiện một nghiên cứu
rộng khắp trong thời gian 2 năm (1/1996 - 12/1997), với mạng lưới
liên kết của 12 bệnh viện ở nhiều nước khác nhau, trên 440 bệnh

nhân bị NKH do K. pneumoniae với 445 mẫu dương tính từ bệnh
phẩm máu cho thấy tỷ lệ NKH mắc phải tại cộng đồng có sự khác
biệt giữa các quốc gia: 68% ở Đài Loan, 43% ở Mỹ, 39% ở Úc, 34%
ở Nam phi, 22% ở Châu Âu và 17% ở Ác-hen-ti-na.
1.3.1.2. Tình hình kháng kháng sinh của K. pneumoniae
Theo NNISS (National Nosocomial Infections Surveillance
System): kết quả so sánh năm 2003 với giai đoạn 1998 - 2002 cho
thấy tỷ lệ kháng các cepholosporin thế hệ 3 của K. pneumoniae ở Mỹ
tăng lên 47%. Ở Pháp tỷ lệ K. pneumoniae kháng ceftazidime là
40%. Tính chung trên tồn khu vực châu Âu, các chủng K.
pneumoniae phân lập được tại các khoa Điều trị tích cực kháng
ceftazidime với tỷ lệ là 42%. Năm 2011, các nhà khoa học ở Trung
Quốc báo cáo tỷ lệ nhiễm K. pneumoniae trên trẻ sơ sinh ở châu Phi
và đã xác định tỷ lệ kháng kháng sinh của K. pneumoniae với
ampicillin và chloramphenicol đều chiếm 83,3%; tỷ lệ kháng
cephalexin và cefotaxim đều chiếm 50%; kháng ceftriaxon,
ceftazidim và cefoperazon với tỷ lệ bằng nhau (16,7%).
1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu về serotype và gen của K. pneumoniae
Serotype K1, K2 kết hợp các kiểu hình chất nhầy chính là yếu tố
độc lực của K. pneumoniae và đặc biệt serotype K1, K2 có thể bảo vệ
vi khuẩn tránh được hiện tượng thực bào của bạch cầu đa nhân trung
tính và tránh được sự tác động của kháng sinh.
Nghiên cứu của Kuo-Ming Y. và CS tại Singapore và Đài Loan
trong thời gian 2002 - 2004 với đối tượng bệnh nhân áp xe gan nhiễm


8
K. pneumoniae được cấy từ bệnh phẩm mủ và máu, cho thấy serotype
K1 chiếm là 46,6% và K2 chiếm tỷ lệ là 20,5%. Trong đó 100% số
chủng đều mang gen magA và rmpA. Ở hai trung tâm Y tế Đài Loan

năm 2008 tác giả Yu W. L. đã nghiên cứu 50 chủng K. pneumoniae
phân lập được từ bệnh nhân áp xe gan nguyên phát. Trong đó K1
(n=26; 52%), K2 (n=10; 20%) và rmpA chiếm 90%.
1.3.2. Nghiên cứu trong nước về K. pneumoniae
Phạm Thị Hằng và cộng sự nghiên cứu tại Bệnh Viện Nhi Trung
ương (2005) cho biết: các kiểu đa kháng kháng sinh của 132 chủng
K. pneumoniae gây nhiễm khuẩn huyết ở bệnh nhi (trên một tháng
tuổi), trong đó kiểu kháng từ 6 kháng sinh trở lên chiếm 80%. Tại
Bệnh viện Nhi Đồng 2 (2007), K. pneumoniae kháng
trimethoprim/sulfamethoxazol
(74%),
cefuroxime
(71,2%),
cefotaxime (65,3%), gentamycine (63,6%), ceftazidime (53,1%),
netilmycine (43,52%), amikacin (42,9%). Theo Phạm Hùng Vân và
nhóm nghiên cứu MIDAS trong nghiên cứu đa trung tâm về tình hình
kháng imipenem và meropenem của trực khuẩn Gram âm ở 16 bệnh
viện tại Việt Nam (5/2008 - 11/2009), thì tỷ lệ K. pneumoniae kháng
imipenem là 3,2% và kháng meropenem là 1,2%.
Tóm lại, đa số kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều
cho thấy K. pneumoniae thực sự là một tác nhân gây bệnh quan
trọng. Loài vi khuẩn này ngày càng gia tăng tỷ lệ đề kháng với các
kháng sinh thường dùng trên lâm sàng. Các tác giả cũng đã nghiên
cứu về gen và phân bố serotype của các chủng K. pneumoniae, tuy
nhiên đa số nghiên cứu về khía cạnh này mới chỉ dừng lại trong phạm
vi một vài quốc gia với số mẫu nghiên cứu chưa lớn. Đây chính là lý
do mà Đơn vị nghiên cứu Lâm sàng - Đại học Oxford đã hợp tác
cùng khoa Xét nghiệm - Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
nghiên cứu về sự phân bố, mức độ kháng kháng sinh, tỷ lệ mang gen
magA, rmpA ở các chủng K. pneumoniae phân lập được theo các mẫu

bệnh phẩm.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG


9
Đối tượng nghiên cứu gồm 537 chủng vi khuẩn K. pneumoniae
phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bị nhiễm khuẩn do K.
pneumoniae nằm điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương,
trong đó:
- 166 chủng vi khuẩn K. pneumoniae hồi cứu từ (1/2007 đến
12/2008) được lưu giữ tủ lạnh âm 200C.
- 371 chủng vi khuẩn K. pneumoniae tiến cứu từ (1/2009-12/2011)
phân lập từ các mẫu bệnh phẩm.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng
- Chủng vi khuẩn K. pneumoniae phân lập và định danh từ các
mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân.
- Chủng vi khuẩn K. pneumoniae được lưu giữ tại khoa xét
nghiệm.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
Không phân lập được vi khuẩn K. pneumoniae từ các mẫu bệnh
phẩm của bệnh nhân nằm điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
Trung ương từ 1/2009 đến 12/2011.
Các chủng phân lập lần 2 từ cùng một bệnh nhân.
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Địa điểm
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 1 năm 2007 đến tháng 12 năm 2011

2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.3.1. Môi trường, sinh phẩm và thiết bị sử dụng để nuôi cấy,
định danh K. pneumoniae và làm kháng sinh đồ
2.3.1.1. Môi trường - sinh phẩm
* Môi trường cấy máu: chai cấy máu của Becton Dickinson - Mỹ.
* Môi trường phân lập xác định K. pneumoniae
+ Thạch máu (Blood agar) của hãng Oxoid – Anh;
+ Thạch Sô-cô-la của hãng Oxoid – Anh;
+ Thạch Uri-Select 4 của hãng Oxoid – Anh;
+ Thạch Mueller - Hinton của Bio-Merieux;
+ Thạch mềm của hãng Oxoid – Anh.
* Kít định danh K. pneumonia: API 20E hoặc card Gram (-) của
Bio-Merieux – Pháp.


10
* Khoanh giấy kháng sinh để làm kháng sinh đồ của hãng Oxoid –
Anh hoặc Card kháng sinh đồ Gram (-) mã số 411924 của BioMerieux - Pháp.
2.3.1.2. Các chủng chuẩn quốc tế để kiểm tra chất lượng
* Escherichia coli
ATCC 25922
* Klebsiella pneumoniae
ATCC 700603
* Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
2.3.1.3. Trang thiết bị chính
+ Máy cấy máu tự động BACTEC 9050- 9120 của Becton
Dickinson - Mỹ;
+ Máy định danh vi khuẩn tự động VITEK 2 - Compact của BioMerieux - Pháp;
+ Tủ ấm Memmert (INB 500-E5050872) và tủ ấm CO2

Advatage - Lab (05-91845) - Đức;
+ Tủ an toàn sinh học Telstar Bio-II-A - Mỹ;
2.3.2. Sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ và thiết bị dùng trong PCR
2.3.2.1. Sinh phẩm, hóa chất
+ dNTP’s của hãng Roche - Mỹ;
+ MgCl2 của hãng Qiagen - Đức;
+ Nước khử ion của hãng Sigma - Mỹ;
+ Hostar taq ADN polymerase của hãng Qiagen - Đức;
+ K1, K2, K5, K20, K54, K57, magA, rmpA, của Sigma- Mỹ
Gen Chiều dài
Mồi
Trình tự
magA
1282
magA-F GGTGCTCTTTACATCATTGC
magA-R GCAATGGCCATTTGCGTTAG
535
rmpA-F ACTGGGCTACCTCTGCTTCA
rmpA
rmpA-R CTTGCATGAGCCATCTTTCA
K1
1045
K1- F
GTAGGTATTGCAAGCCATGC
K1- R GCCCAGGTTAATGAATCCGT
K2
1120
K2 – F GGAGCCATTTGAATTCGGTG
K2 – R TCCCTAGCACTGGCTTAAGT
K5

280
K5 – F TGGTAGTGATGCTCGCGA
K5 – R CCTGAACCCACCCCAATC
K20
741
K20-F CGGTGCTACAGTGCATCATT


11
K20-R GTTATACGATGCTCAGTCGC
K54
880
K54-F CATTAGCTCAGTGGTTGGCT
K54-R GCTTGACAAACACCATAGCAG
K57
1181
K57-F CGACAAATCTCTCCTGACGA
K57-R CGCGACAAACATAACACTCG
+ Thạch Agarose dùng trong điện di gel của hãng invitrogen - Mỹ;
+ Ethidium bromide dùng để nhuộm gel của hãng Sigma- Mỹ;
+ ADN ladder- Sm 1283 của hãng Fermentas - Mỹ;
+ TBE 10X của hãng BD - Mỹ;
+ TAE (Tris Acetate EDTA) hãng Sigma - Mỹ;
+ PBS (Phosphate buffer Saline) hãng Sigma - Mỹ.
2.3.2.2. Thiết bị - Dụng cụ
+ Máy ly tâm của hãng Eppendorf, Đức;
+ Máy PCR Eppendorf - MasterCycler grandient, Đức;
+ Máy điện di mini của hãng Bio-Rad, Pháp;
+ Máy đọc gel Geldoc hãng Bio-Rad, Pháp;
+ Máy chụp ảnh gel hãng Bio-Rad, Pháp.

+ Dụng cụ, bao gồm:
- Pipet eppendorf của Đức hoặc Gilson, Nhật Bản loại 10 µl, 20
µl, 200 µl và 1000 µl;
- Týp vơ trùng eppendorf loại 1,5ml;
- Týp phản ứng huỳnh quang loại 0,2ml;
- Týp trắng khơng có huỳnh quang loại 0,2ml;
2.4. PHƯƠNG PHÁP, KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mơ tả cắt ngang có phân tích, phương pháp nghiên
cứu phịng thí nghiệm.
2.4.2. Kỹ thuật ni cấy K. pneumoniae
2.4.2.1. Kỹ thuật cấy máu
2.4.2.2. Kỹ thuật cấy dịch não tủy
2.4.2.3. Kỹ thuật cấy đờm
2.4.2.4. Kỹ thuật cấy dịch rửa phế quản


12
2.4.2.5. Kỹ thuật cấy dịch màng phổi, dịch màng bụng
2.4.2.6. Kỹ thuật cấy dịch mủ
2.4.2.7. Kỹ thuật cấy nước tiểu
2.4.2.8. Kỹ thuật cấy dịch họng
2.4.3. Kỹ thuật phân lập K. pneumoniae
2.4.3.1. Theo dõi các chai cấy máu
2.4.3.2. Phân lập, định danh K. pneumoniae
+ Lấy chai máu dương tính ra, dùng kim tiêm vô trùng hút hỗn
dịch tương đương 0,5 ml, cấy phân vùng vào môi trường thạch máu,
thạch Sô-cô-la. Để đĩa thạch máu để tủ ấm ở 370C qua đêm.
+ Các loại bệnh phẩm đã nuôi cấy trên các môi trường khác nhau
được lấy ra khỏi tủ ấm. Quan sát hình dạng, màu sắc, số lượng khuẩn

lạc, tiến hành nhuộm Gram. Nếu là trực khuẩn Gram âm thì tiếp tục
tiến hành các thử nghiệm sau:
- Oxydase: âm tính;
- Cấy chuyển khuẩn lạc vào ống thạch mềm để tủ ấm 37 0C qua
đêm;
- Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học bằng thanh định danh API
20E, để tủ ấm 370C qua đêm. Sau đó đọc kết quả với phần mềm được
cài sẵn trong máy vi tính;
- Hoặc sử dụng card định danh vi khuẩn Gram âm và máy định
danh tự động Vitek 2
2.4.4. Kỹ thuật xác định mức độ kháng thuốc của K. pneumoniae
2.4.4.1. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trong
thạch (kỹ thuật Kirby-Bauer)
* Nguyên lý: các chủng vi khuẩn khác nhau có mức độ nhậy cảm
với các loại kháng sinh khác nhau, biểu hiện của sự khác nhau bằng
đường kính vùng ức chế xung quanh khoanh giấy kháng sinh khi có
sự tiếp xúc giữa vi khuẩn với kháng sinh.
2.4.4.2. Phương pháp xác định nồng độ (MIC) của kháng sinh với
K. pneumoniae.
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC của vi khuẩn với kháng
sinh bằng máy tự động VITEK 2 - Compact dựa trên nguyên lý: hệ
thống quang học sử dụng ánh sáng nhìn thấy để theo dõi trực tiếp sự


13
phát triển của vi sinh vật thông qua việc đo cường độ ánh sáng bị chặn
lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng.
2.4.4.3. Phương pháp phát hiện ESBLs
* Nguyên lý: Quan sát hiện tượng kháng hay giảm nhạy cảm của
các trực khuẩn đường ruột đối với các cephalosporin (thử nghiệm

sàng lọc) - Thử nghiệm cộng lực giữa các cephalosporin thế hệ 3,4
và clavulanat, nếu có cộng lực dương thì ESBL dương tính.
Khi thấy hiện tượng giảm mức độ nhạy cảm với các kháng sinh
theo tiêu chuẩn dưới đây:
Cefotaxim (CTX) < 27 mm Ceftriaxon (CRO) < 25 mm
Ceftazidim (CAZ) < 22 mm

Cefpodoxim (CEF) < 17 mm

Aztreonam (ATM) < 27 mm
Nếu vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh kháng sinh mở rộng về
phía khoanh AMC (vịng vơ khuẩn méo mó hình elip hoặc xuất hiện
một vùng vô khuẩn giữa khoanh kháng sinh và khoanh AMC) là vi
khuẩn sinh ESBLs.
2.4.5. Kỹ thuật PCR
2.4.5.1. Nguyên lý của kỹ thuật PCR
2.4.5.2. Tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn K. pneumoniae.
2.4.5.3. Chuẩn bị cho phản ứng PCR
2.4.5.4. Tiến hành phản ứng PCR
+ Quy trình chạy PCR với các cặp mồi magA, rmpA và serotype
K1, K2, K5, K20, K54, K57 được dựa trên nghiên cứu của Kuo-Ming
Y. và Sylvain B. đồng thời chúng tơi cũng tiến hành tối ưu hóa các
quy trình này đế có được nồng độ của các chất thích hợp cho phản
ứng PCR.
Quy trình tối ưu hóa phản ứng PCR bao gồm như sau:


14
- Tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi: Sử dụng Gradient nhiệt độ để xác
định nhiệt độ tối ưu thích hợp của phản ứng

- Tối ưu hóa nồng độ các thành phần của phản ứng PCR để không
xuất hiện dimer thừa.
- Tối ưu nồng độ của ion Mg2+ xúc tác cho enzyme Taq
polymease nhằm có được sản phẩm PCR lớn nhất.


15
2.4.6. Sơ đồ nghiên cứu

Chủng vi khuẩn phân
lập từ mẫu bệnh phẩm
được
lưu giữ tại khoa

Mẫu bệnh phẩm

Bệnh phẩm máu

Các loại dịch, đờm, nước tiểu, mủ

Cấy vào chai CM Plus Aerobic/F

Âm tính

Để tủ ấm ủ
ở 37 độ C

Cấy vào TM, Sơ cô la,
uri-Select 4

Đặt vào máy BACTEC 9050

Máy báo Âm

Cấy TM

Để tủ ấm ủ
ở 37 độ C

Có mọc VK

Máy báo dương
Có mọc
VK

Nhuộm Gram

Khơng mọc VK

Cấy vào TM
Âm tính
Để tủ ấm ủ
ở 37 độ C

Trực khuẩn Gram (-)

Nhuộm Gram
Oxydaza (-)
Trực khuẩn Gram (-)
Phân lập và định danh lại

bằng SVHH, API 20E
hoặc card Gram (-)

Oxydaza (-)

Phân lập và định danh lại bằng SVHH, API
20E hoặc card Gram (-)

Klebsiella pneumoniae

Làm KSĐ

Chạy PCR phát hiện magA,
rmpA, K1, K2...


16
2.5. Xử lý số liệu
* Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Stata 12.0, SAS 9.2 và
SPSS 19, so sánh và phân tích kết quả.
* Test X2 được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa hai tỷ lệ.
Giá trị p <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. PHÂN BỐ TỶ LỆ K. PNEUMONIAE Ở CÁC LOẠI BỆNH
PHẨM VÀ MỨC ĐỘ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CHÚNG
3.1.1. Phân bố tỷ lệ K. pneumoniae ở các loại bệnh phẩm
3.1.1.1. Phân bố tỷ lệ K. pneumoniae ở các loại bệnh phẩm
Bảng 3.1. Phân bố tỉ lệ K. pneumoniae ở các loại bệnh phẩm khác nhau
STT

Loại bệnh phẩm

Số lượng

Tỷ lệ %

1

Đờm

321

59,7

2
3

Máu
Mủ

134
38

25,0
7,1

4

Dịch họng

18

3,4

5

Nước tiểu

18

3,4

6

Dịch não tủy

6

1,1

7

Dịch màng bụng

2

0,4

537

100%

Tổng cộng

Nhận xét: phân bố tỷ lệ vi khuẩn K. pneumoniae ở bệnh phẩm
đờm là cao nhất (59,7%), tiếp đến là bệnh phẩm máu (25,0%) và mủ
là 7,1%. Phân bố tỷ lệ K. pneumoniae ở các loại bệnh phẩm khác
dao động từ 0,4% đến 3,4%.


17
1.1.1.2. Phân bố tỷ lệ K. pneumoniae theo nhóm tuổi và giới tính
Bảng 3.2. Phân bố tỷ lệ K. pneumoniae theo nhóm tuổi và giới (n=537)
Nam (n=385)
Nữ (n=152)
pNhóm tuổi
Số
Tỷ lệ
Số
Tỷ lệ
values
lượng
(%)
lượng
(%)
≤ 19 tuổi

24

6,2

8

5,3

0,669

51

13,2

27

17,8

0,181

58

15,1

20

13,2

0,473

92

23,9

22

14,5

0,0024

85

22,1

25

16,5

0,0542

≥ 60 tuổi

75

19,5

50

32,9

0,0001

Tổng

385

71,7

152

28,3

20 –
tuổi

29

30 –
tuổi

39

40 –
tuổi

49

50 –
tuôi

59

Bảng 3.2 cho thấy: phân bố tỷ lệ phân lập được K. pneumoniae ở
các nhóm tuổi lớn từ 40 trở lên là cao hơn so với các nhóm tuổi dưới
40 tuổi, điều này quan sát thấy ở cả 2 giới. Ở nữ giới, tỷ lệ nhiễm K.
pneumoniae ở nhóm tuổi trên 60 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với
nam giới với p<0,01. Ngược lại ở các nhóm tuổi nhỏ hơn, tỷ lệ nhiễm
ở nam lại cao hơn nữ giới.
Biểu đồ 3.2. Phân bố tỷ lệ phân lập K. pneumoniae theo nhóm tuổi


18
Kết quả ở biểu đồ 3.2 cho thấy, phân bố tỷ lệ phân lập K.
pneumoniae ở cả nam và nữ có xu hướng tăng theo nhóm tuổi.
Phương trình tuyến tính cho thấy tuổi càng tăng thì tỷ lệ có thể phân
lập được K. pneumoniae cũng càng tăng.
3.1.2. Kết quả về mức độ kháng kháng sinh của các chủng K.
pneumoniae phân lập được
3.1.2.9. Mức độ kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae
phân lập được từ năm 2007 đến 2011
Bảng 3.11. Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae
phân lập được từ năm 2007 đến 2011
Kháng
sinh
TCC
CAZ
CRO
FEP
ATM
IPM
AMK
GEN

TOB
CIP
SXT
CHL
TCY

2007
2008
(n=72)
(n=94)
TL
SL
SL TL (%)
(%)
26 37,7 40
48,8
22 31,4 37
42,0
23 32,4 35
39,8
16 25,8 24
33,3
7 10,4 0
0,0
3
4,3
1
1,2
13 20,0 20
25,3

17 25,8 29
34,5
19 28,4 27
32,1
17 25,8 25
31,3
11 23,4 18
34,0
22 31,9 40
47,6
9 23,1 7
23,1

2009
(n=119)
TL
SL
(%)
61 58,7
53 46,9
56 50,0
35 34,0
17 26,2
12 10,8
23 22,5
32 37,6
35 34,7
37 35,9
57 55,9
56 51,4

36 63,2

2010
(n=134)
TL
SL
(%)
70 78,7
59 45,4
63 48,8
51 39,5
33 26,4
5
3,9
37 29,4
46 49,5
35 34,0
43 33,1
68 54,4
66 51,6
75 60,0

2011
(n=118)
TL
SL
(%)
54 60,0
26 22,4
29 24,6

27 23,7
24 20,9
3
2,6
16 13,7
22 19,3
26 22,6
18 15,4
38 32,5
29 25,2
31 28,7

Nhận xét: bảng 3.11 cho thấy, sự đề kháng theo xu hướng tăng từ
năm 2007 đến 2009 và 2010: Ví dụ: đối với ticarcillin-clavulanic acid
từ 37,7% tăng lên 78,7%, với tetracycline tăng từ 23,1% (năm 2007)
lên 63,2% vào (năm 2009), trimethoprim-sulfamethoxazole từ 23,4%
(năm 2007) đến 55,9% (năm 2009). Năm 2011 tỷ lệ đề kháng kháng
sinh lại có xu hướng giảm đối với một số loại kháng sinh như:
amikacin, gentamicin, tobramycin, ciprofloxacin và các kháng sinh
thuộc phân nhóm cephalosporin. Ceftazidime và ceftriaxone từ
31,4% và 32,4% tăng lên 46,9% và 50,0% vào năm 2009, sau đó lại
giảm dần vào năm 2010 và đến năm 2011, tỷ này lần lượt giảm
xuống còn 22,4% và 24,6%. Kháng sinh có mức độ kháng thuốc thay


19
đổi ít là: tobramycin từ 22,6% đến 34,7%, amikacin từ 13,7% đến
29,4%. Riêng với imipenem, năm 2009 đã có 10,8% số chủng K.
pneumoniae kháng imipenem. Tuy nhiên tỷ lệ này lại giảm dần vào
các năm 2010 và 2011 (tỷ lệ tương ứng là 3,9% và 2,6%).

3.1.2.10. Tỷ lệ sinh ESBL của các chủng K. pneumoniae phân lập
được
Trong số 537 chủng K. pneumoniae thì chúng tơi xác định được
ESBL của 531 chủng K. pneumoniae là được phát hiện ESBL (còn 6
chủng do chúng tôi hết sinh phẩm xác định ESBL).
Bảng 3.12. Tỷ lệ sinh ESBL của các chủng K. pneumoniae
phân lập được (n=531)
Năm
Số chủng thử ESBL Dương tính Tỷ lệ %
2007
72
24
33,3
2008

91

33

36,3

2009
2010

116
134

55
62

47,4
46,3

2011
Tổng

118
531

24
198

20,3
37,3

Nhận xét: bảng 3.12 cho thấy, năm 2009 có số chủng K.
pneumoniae sinh ESBL cao nhất với 47,4%, tiếp đến là năm 2010 với
46,3%, năm 2008 là 36,3%, năm 2007 là 33,3% và thấp nhất là năm
2011, tỷ lệ K. pneumoniae sinh ESBL là 20,3%.
3.2. TỶ LỆ MANG GEN magA, rmpA; SEROTYPE CỦA MỘT
SỐ CHỦNG K. pneumoniae PHÂN LẬP ĐƯỢC THEO BỆNH
PHẨM
3.2.1. Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng K. pneumoniae
phân lập được theo bệnh phẩm
3.2.1.1. Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng K.
pneumoniae phân lập được
Từ các chủng K. pneumoniae phân lập được, chúng tôi sử dụng kỹ
thuật PCR để xác định gen magA, rmpA. Vì kinh phí đề tài có giới
hạn nên chúng tơi lấy chính là bệnh phẩm nhiễm khuẩn từ tổ chức kín
như máu, dịch não tủy, dịch màng bụng, mủ áp xe đồng thời chúng

tôi cũng lấy một số chủng K. pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh
phẩm nước tiểu, đờm và dịch họng. Do vậy chúng tôi lấy 213 chủng


20
K. pneumoniae xác định gen magA và rmpA. Kết quả thể hiện trong
bảng sau:
Bảng 3.14. Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng
K. pneumoniae phân lập được
Kiểu gen

Số chủng K. pneumoniae mang
gen

Tỷ lệ (%)

magA (n=213)
rmpA (n=213)

40
118

18,7
55,4

magA
và
36
rmpA
Nhận xét: kết quả của bảng 3.14 cho thấy, trong 213 chủng được

xác định gen magA có 18,7% số chủng dương tính và gen rmpA có
55,4% dương tính với số chủng K. pneumoniae. Trong đó có 36
chủng K. pneumoniae vừa mang đồng thời 2 gen magA và rmpA.
M

700 bp
535 bp
500 bp

Hình 3.1. Kết quả điện di của gen rmpA
Chú thích:
* M: maker 100 bp - Fermentas
* PC: Chứng dương; NTC: Chứng âm
* Các giếng 03, 06, 10, 18, 23, 39, 46: là các chủng có sản phẩm PCR nhân
bản gen rmpA thể hiện băng có kích thước 535bp .
* Các giếng 04, 16, 26, 54, 59, 60 : là những chủng không mang gen rmpA;


21
3.2.1.2. Tỷ lệ mang gen magA, rmpA của các chủng K.
pneumoniae phân lập được theo loại bệnh phẩm
Bảng 3.15. Tỷ lệ mang gen magA của các chủng K. pneumoniae
phân lập được theo loại bệnh phẩm

Bệnh phẩm
Đờm (n=321)
M.u (n=134)
Mủ (n=38)
Dịch họng (n=18)
Nước tiểu (n=18)

Dịch não tủy (n=6)
Dịch màng bụng (n=2)
Tổng cộng (n=537)

Số chủng K.
pneumoniae
được xác định
magA
66
77
35
16
13
4
2
213

Tỷ lệ (%)
magA
magA dương
dương tính
tính
11
17
9
2
0
1
0
40

16,7
22,1
25,7
12,5
0,0
0,0
18,7

Nhận xét: qua bảng 3.15 cho thấy, các chủng K. pneumoniae các
chủng K. pneumoniae có nguồn gốc từ mẫu bệnh phẩm mủ mang gen
magA có tỷ lệ là 9/35 (25,7%); tiếp đến là các chủng K. pneumoniae
mang gen magA trong mẫu bệnh phẩm máu 17/77 (22,1%); đờm là
11/66 (16,7%) và dịch họng có 2/16 (12,5%). Trong khi đó 18 chủng
K. pneumoniae phân lập được từ 2 loại bệnh phẩm là nước tiểu (13
chủng) và dịch màng bụng (2 chủng) đều khơng có chủng nào mang
gen magA.
Bảng 3.16. Tỷ lệ mang gen rmpA của các chủng K. pneumoniae
phân lập được trong các mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm

Đờm (n=321)
Máu (n=134)
Mủ (n=38)
Dịch họng (n=18)
Nước tiểu (n=18)
Dịch não tủy (n=6)
Dịch màng bụng
(n=2)

Số chủng K.
pneumoniae được
xác định rmpA

rmpA
dương
tính

Tỷ lệ (%)
rmpA
dương tính

66
78
34
16
13
4
2

34
47
22
9
2
3
1

51,5
60,3

64,7
56,3
15,4


22
Tổng cộng (n=537)
213
118
55,4
Nhận xét: bảng 3.16 cho thấy, trong số 4 chủng K. pneumoniae
phân lập từ dịch não tủy thì có 3 chủng mang gen rmpA; tiếp đến là
các chủng từ bệnh phẩm mủ có 22/34 (64,7%); các chủng từ bệnh
phẩm máu 47/78 (60,3%); chủng từ bệnh phẩm dịch họng 9/16
(56,3%) và bệnh phẩm đờm 34/66 (51,5%). Trong số 13 chủng K.
pneumonia phân lập từ nước tiểu, chúng tôi chỉ xác định được 2
chủng mang gen rmpA (15,4%) và trong số 2 chủng K. pneumonia
phân lập từ dịch màng bụng thì có 1 chủng mang gen rmpA.
3.2.2. Kết quả xác định serotype của các chủng K. pneumoniae
phân lập được theo loại bệnh phẩm
Chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để xác định serotype của các
chủng K. pneumoniae. Mặc dù K. pneumoniae có tới 77 serotype
theo phân loại nhưng trong khn khổ của đề tài, chúng tơi chỉ có
điều kiện sử dụng 6 cặp mồi để xác định 6 loại serotype của K.
pneumonia đó là các cặp mồi K1, K2, K57, K20, K54 và K5.
3.2.2.1. Kết quả xác định serotype của các chủng K. pneumoniae
Bảng 3.17. Tỷ lệ xác định serotype của các chủng K. pneumoniae (n=214)
Serotype
Số dương tính
Tỷ lệ (%)

K1
40
18,7
K2
27
12,6
K57
4
1,9
K20
1
K54
1
K5
1
Nhận xét: bảng 3.17 cho thấy, trong tổng số 214 chủng K.
pneumoniae được xác định serotype, tỷ lệ serotype K1 chiếm 18,7%,
serotype K2 chiếm 12,6%. Serotype K5, K20, K54 đều mới gặp 1
chủng K. pneumoniae thuộc các serotype này.
~ 1045 bp
1000 bp
700 bp
500 bp
300 bp
200 bp
100 bp


23

Hình 3.2. Kết quả điện di của serotype K1
Chú thích:
* Mk: maker 100 bp – Fermentas; NTC: chứng âm; Mock:chứng âm;
* PC: chứng dương
* Giếng 515: là chủng có sản phẩm PCR nhân bản gen thuộc serotype K1 thể
hiện băng có kích thước 1045bp
* Các giếng 272, 388, 481, 371, 283, 514: là các chủng không thuộc serotype K1;

~1120 bp
1000 bp
700 bp
500 bp
300 bp
200 bp
100 bp

Chú thích:
* Mk: maker 100 bp –
Fermentas; NTC: chứng
âm; Mock:chứng âm;
* PC: chứng dương
* Giếng 388 và 410: là
các chủng có sản phẩm
PCR nhân bản gen thuộc
serotype K2 thể hiện
băng có kích thước
1120bp
* Giếng 272: là chủng
khơng thuộc serotype
K2;

Hình 3.3. Kết quả điện di của serotype K2
3.2.2.2. Kết quả xác định serotype K1, K2 của các chủng K.
pneumoniae phân lập được trong các mẫu bệnh phẩm
Bảng 3.18. Tỷ lệ xác định serotype K1 trong các mẫu bệnh phẩm
Số mẫu
K1
Tỷ lệ (%) K1
Bệnh phẩm
Xác định K1 Dương tính dương tính
Đờm (n=321)
66
11
16,7
Máu (n=134)
78
17
21,8
Mủ (n=38)
35
9
25,7
Dịch họng (n=18)
16
2
12,5
Nước tiểu (n=18)
13
0
0,0

Dịch não tủy (n=6)
4
1


24
Dịch màng bụng
2
0
0,0
(n=2)
Tổng
214
40
18,7
Nhận xét: kết quả bảng 3.18 cho thấy, các chủng K. pneumoniae phân
lập được từ bệnh phẩm mủ thuộc serotype K1 chiếm tỷ lệ là 25,7%, tiếp
đến là bệnh phẩm máu (21,8%) và bệnh phẩm đờm (16,7%). Có 2/16
(12,5%) chủng K. pneumoniae phân lập từ dịch họng và 1/4 chủng K.
pneumoniae phân lập từ dịch não tủy thuộc serotype K1. Khơng có
chủng K. pneumoniae nào phân lập từ nước tiểu và dịch màng bụng
thuộc serotype K1. Trong số 214 chủng K. pneumoniae có 40 chủng
(18,7%) thuộc serotype K1.
Bảng 3.19. Tỷ lệ xác định serotype K2 theo các mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm
Đờm (n=321)
Máu (n=134)
Mủ (n=38)
Dịch họng (n=18)
Nước tiểu (n=18)

Dịch não tủy (n=6)
Dịch màng bụng
(n=2)
Tổng

Số mẫu
xác định
K2
66
78
35
16
13
4

K2
dương
tính
7
12
5
2
0
1

Tỷ lệ (%)
K2 dương
tính
10,6
15,4

14,3
12,5
0,0

2

0

0,0

214

27

12,6

Nhận xét: kết quả bảng 3.19 cho thấy, các chủng K. pneumoniae phân
lập được từ bệnh phẩm máu thuộc serotype K2 chiếm tỷ lệ cao nhất
(15,4%), tiếp theo là bệnh phẩm mủ (14,3%) và đờm (10,6%). Có 2/16
(12,5%) chủng K. pneumoniae phân lập từ dịch họng và 1/4 chủng K.
pneumoniae phân lập từ dịch não tủy thuộc serotype K2. Chúng tôi cũng
chưa thấy chủng K. pneumoniae nào phân lập từ nước tiểu và dịch màng
bụng thuộc serotype K2. Trong số 214 chủng K. pneumoniae được xác
định serotype thì có 27 (12,6%) thuộc serotype K2.
KẾT LUẬN


25
Qua nghiên cứu 537 chủng K. pneumoniae từ các mẫu bệnh phẩm
của 537 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn do K. pneumoniae nằm điều trị tại

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 01/2007 đến tháng
12/2011, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
1. Phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae ở các bệnh phẩm và mức độ
kháng kháng sinh của chúng
1.1. Phân bố tỷ lệ Klebsiella pneumoniae theo các loại bệnh phẩm
Phân bố tỷ lệ K. pneumoniae ở bệnh phẩm đờm là cao nhất (59,6%),
tiếp đến là bệnh phẩm máu (25,0%) và mủ là 7,1%. Với bệnh phẩm khác
tỷ lệ này dao động từ 0,4% đến 3,4%.
1.2. Mức độ kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn K. pneumoniae
phân lập được
- Mức độ kháng kháng sinh của K. pneumoniae phân lập được từ năm
2007 - 2011 có sự thay đổi nhiều: ticarcillin-clavulanic acid (từ 37,7%
đến 78,7%), tetracycline (từ 23,1% đến 63,2%). Kháng sinh có mức độ
kháng thuốc thay đổi ít là tobramycin và amikacin. Imipenem bị kháng
10,8% (năm 2009) nhưng tỷ lệ này lại giảm vào các năm 2010 và 2011
(3,9% và 2,6%).
- Mức độ kháng kháng sinh của K. pneumoniae phân lập được từ
đờm, máu có xu hướng tăng từ năm 2007 đến năm 2010, nhưng năm
2011 thì đa số tỷ lệ này lại giảm.
2. Tỷ lệ mang gen magA, rmpA; Serotype của một số chủng K.
pneumoniae phân lập được theo các bệnh phẩm
- Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae mang gen rmpA là 55,4%, cao hơn so
với tỷ lệ mang gen magA (18,7%), với p<0,000001.
- Các chủng K. pneumoniae mang gen magA trong bệnh phẩm mủ chiếm
tỷ lệ cao nhất là 25,7%; máu (22,1%), đờm (16,4%), dịch họng (12,5%),
trong số 4 chủng K. pneumoniae phân lập từ dịch não tủy có 1 chủng mang
gen magA.
- Các chủng K. pneumoniae mang gen rmpA chiếm tỷ lệ cao nhất ở mẫu
bệnh phẩm dịch não tủy là 75%; tiếp đến là các chủng phân lập từ bệnh
phẩm mủ (64,7%), máu (60,3%), dịch họng (56,3%) và đờm (51,5%).

- Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae thuộc serotype K1 là 18,7%, serotype
K2 là 12,6%, K57 là 1,9%; các serotype K5, K20 và K57 thì mỗi serotype
có 1 chủng.
- Các chủng K. pneumoniae phân lập được từ bệnh phẩm mủ thuộc
serotype K1 chiếm tỷ lệ cao nhất (25,7%), bệnh phẩm máu (21,8%), bệnh
phẩm đờm (16,7%).