Khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
–&—

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE
CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH BÀO TỬ

GVHD: ThS. Nguyễn Kim Minh Tâm
SVTH: Hồ Thị Mỹ Linh
MSSV: 60701279

Tp. HCM, tháng 01 năm 2012


LỜI CẢM ƠN
Luận văn đề tài “Khảo sát khả năng sinh amylase ngoại bào của một số
chủng vi khuẩn sinh bào tử” được thực hiện từ tháng 9/2011 đến tháng 1/2012.
Trong suốt quá trình làm luận văn tôi đã được rất nhiều sự giúp đỡ của:
Thạc sĩ Nguyễn Kim Minh Tâm – Bộ môn Công nghệ Sinh học trường đại
học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, cung cấp
tài liệu và luôn động viên tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.
Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô giáo trong
khoa Kỹ thuật Hóa học Đại học Bách Khoa TpHCM đã tận tình giảng dạy,
truyền đạt những kiến thức cơ bản để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.
Cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 Bộ môn công nghệ Sinh học,
trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử
dụng trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.

Cán bộ phòng thí nghiệm Hữu cơ – Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Đại học
Bách khoa TpHCM đã cho mượn một số dụng cụ thí nghiệm.
Cha, mẹ, anh và em tôi đã động viên tinh thần, giúp đỡ về mặt kinh tế để tôi
có thể an tâm thực hiện luận văn.
Các bạn thân và các bạn sinh viên lớp HC07BHS – Đại học Bách Khoa
TpHCM – đã cùng tôi học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá
trình làm việc.
Xin gửi đến những người trên lời cảm ơn chân thành!

i


TÓ M TẮ T
Enzyme amylase giúp phân hủy tinh bột hay glycogen, nó rất hữu ích trong
nhiều lĩnh vực công nghiệp như thực phẩm, dệt, giấy và y học… Amylase được thu
nhận từ nhiều nguồn: động vật, thực vật và vi sinh vật, trong đó amylase từ vi sinh
vật được sử dụng nhiều nhất. Trong đất, có rất nhiều loài vi sinh vật có ích có khả
năng sinh amylase. Do đó, việc phân lập được chúng là bước đầu quan trọng hỗ trợ
cho các nghiên cứu về sau. Bằng quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã phân lập được
một chủng vi khuẩn sinh bào tử có khả năng sinh amylase từ trong đất và khảo sát
hoạt tính enzyme amylase của chúng. Kết quả thu được cho thấy chủng vi khuẩn
này có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở 370C và môi trường pH7. Thời gian nuôi
cấy để lượng enzyme sinh ra cao nhất là 24 giờ, trong môi trường có 2% tinh bột,
nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme trong khoảng 50-700C.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. I

TÓM TẮT .................................................................................................................. II
MỤC LỤC ................................................................................................................ III
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ VI
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................VII
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................ VIII
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN............................................................................................................. 3
1. ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME ................................................................................ 3
1.1. Enzyme ngoại bào ........................................................................................... 3
1.2. Enzyme nội bào ............................................................................................... 3
2. ENZYME AMYLASE ........................................................................................... 3
2.1. Định nghĩa ....................................................................................................... 4
2.2. Phân loại .......................................................................................................... 4
2.3. Một số enzyme amylase phổ biến ................................................................... 5
3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ..................................................... 11
4. ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI SỐNG VÀ SẢN XUẤT
.............................................................................................................................. 12
4.1. Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm ..................................... 12
4.2. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác ............................................... 14
5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP AMYLASE
Ở VI SINH VẬT ................................................................................................... 15
5.1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 15
5.2. pH môi trường ............................................................................................... 16
5.3. Độ thông khí .................................................................................................. 16
iii


5.4. Thành phần môi trường ................................................................................. 16
6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE CỦA VI SINH
VẬT ...................................................................................................................... 17

6.1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 17
6.2. pH .................................................................................................................. 18
7. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE ........... 18
7.1. Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp Wolhgemuth ...................... 19
7.2. Phương pháp Heinkel .................................................................................... 19
7.3. Phương pháp xác định đường khử tạo thành (phương pháp Nelson) ........... 19
8. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH BÀO TỬ CÓ KHẢ NĂNG SINH AMYLASE .. 20
8.1. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 20
8.2. Đặc điểm của chi vi khuẩn cần phân lập ....................................................... 20
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 24
1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................... 23
1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 23
1.2. Môi trường thí nghiệm .................................................................................. 23
1.3. Vật liệu thử hoạt tính sinh học ...................................................................... 24
1.4. Dụng cụ thí nghiệm ....................................................................................... 25
2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ......................................................................................... 26
2.1. Giai đoạn 1 .................................................................................................... 27
2.2. Giai đoạn 2 .................................................................................................... 27
2.3. Giai đoạn 3 .................................................................................................... 27
2.4. Giai đoạn 4 .................................................................................................... 28
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 28
3.1. Phương pháp phân lập ................................................................................... 28
3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng sinh amylase của vi khuẩn ........................ 30
3.3. Phương pháp khảo sát khả năng thích nghi của vi khuẩn ............................. 31
iv


3.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để thu amylase ........................................... 31
3.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của vi khuẩn .. 31
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 23

1. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH AMYLASE ........................................................ 35
2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH AMYLASE
CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ......................................................................... 39
3. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA AMYLASE ................... 45
4. BÀN LUẬN .......................................................................................................... 47
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 35
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ........................................................................................... 54
TÀI LIỆU TIẾNG ANH ........................................................................................... 55

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase .. 32
Bảng 2. Các bước pha mẫu để xác định hoạt độ amylase ........................................ 33
Bảng 3. Khả năng sinh amylase ngoại bào và khả năng thích nghi với môi trường
của một số chủng vi sinh vật phân lập được ............................................................. 35
Bảng 4. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 19 theo
thời gian .................................................................................................................... 39
Bảng 5. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 theo
thời gian .................................................................................................................... 40
Bảng 6. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 21 theo
thời gian .................................................................................................................... 41
Bảng 7. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 24 theo
thời gian .................................................................................................................... 42
Bảng 8. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 25 theo
thời gian .................................................................................................................... 43
Bảng 9. So sánh hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn ........................ 44

Bảng 10. Kết quả khảo sát hoạt tính của amylase từ chủng 20 trên tinh bột ở những
nhiệt độ khác nhau .................................................................................................... 46

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Sơ đồ cấu trúc không gian của α–amylase ................................................... 5
Hình 2. Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase ................................................. 8
Hình 3. Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase. .................................. 10
Hình 4. Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng sinh amylase ngoại bào của một số chủng
vi khuẩn .................................................................................................................... 37
Hình 5. Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn trên môi trường có pH khác
nhau........................................................................................................................... 37
Hình 6. Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ khác nhau ......... 38
Hình 7. Kết quả so sánh khả năng sinh amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn ...
.................................................................................................................................. 38

vii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1. Đường chuẩn định lượng tinh bột bằng phương pháp Heinkel .............. 33
Biểu đồ 2. Hoạt tính amylase của chủng 19 theo thời gian ...................................... 40
Biểu đồ 3. Hoạt tính amylase của chủng 20 theo thời gian ...................................... 41
Biểu đồ 4. Hoạt tính amylase của chủng 21 theo thời gian ...................................... 42
Biểu đồ 5. Hoạt tính amylase của chủng 24 theo thời gian ...................................... 43
Biểu đồ 6. Hoạt tính amylase của chủng 25 theo thời gian ...................................... 44
Biểu đồ 7. Hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn khảo sát .................. 45
Biểu đồ 8. Hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 ở các nhiệt độ khác nhau ..... 46

viii


MỞ Đ ẦU


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp đại học 2012

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú, chúng có mặt ở khắp mọi
nơi trong đất, nước, không khí… Ngoài những tác hại như gây ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe của con người và động thực vật, vi sinh vật còn mang lại một nguồn lợi to
lớn nếu chúng ta hiểu biết và sử dụng chúng hợp lý. Các loài vi sinh vật nói chung
và các loài sinh bào tử nói riêng đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rất nhiều
trong các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, công nghiệp và y học… nhờ khả
năng sản sinh các loại enzyme thủy phân của chúng.
Enzyme là chất xúc tác sinh học, ngoài tính chất của một chất xúc tác nó còn
đặc biệt hơn ở chỗ chúng có khả năng xúc tác ở nhiệt độ và áp suất bình thường, có
tính đặc hiệu cao. Chính vì thế, enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi với quy
mô sản xuất lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển công nghệ enzyme. Việc sử
dụng enzyme không chỉ mang lợi ích về kinh tế mà còn góp phần giải quyết hiệu
quả việc làm sạch và bảo vệ môi trường.
Trước kia, enzyme thường được khai thác chủ yếu ở thực vật và động vật, như
amylase từ malt, papain từ đu đủ hay các protease từ động vật… Tuy nhiên, việc thu
nhận enzyme từ hai nguồn này còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như thời tiết,
bệnh tật, năng suất và hơn hết đây chưa phải là sản phẩm chính của ngành trồng trọt
và chăn nuôi của nước ta. Vì vậy, việc dùng tế bào động vật và thực vật làm nguồn
nguyên liệu để thu nhận enzyme khá hạn chế, thiếu tính kinh tế và khó nâng lên quy

mô công nghiệp.
Khắc phục được các nhược điểm trên, enzyme từ vi sinh vật trở thành nguồn
thu nhận lý tưởng nhờ hệ enzyme phong phú, nguyên liệu nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm,
điều kiện nuôi cấy dễ dàng và đặc biệt enzyme lại có hoạt tính cao. Các chế phẩm
enzyme từ vi sinh vật dần thay thế cho các enzyme có nguồn gốc động vật và thực
vật.
Một trong số các enzyme được ứng dụng nhiều nhất là enzyme amylase. Nó
xúc tác thủy phân tinh bột thành các đơn vị nhỏ hơn. Được nghiên cứu từ những
năm đầu thế kỉ 18, đến nay, các nhà khoa học đã biết khá rõ về amylase. Sản xuất

Mở đầu

1


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp đại học 2012

amylase công nghiệp đã được chú ý từ rất lâu và ngày càng được phát triển trên thế
giới. Việt Nam chúng ta cũng là một trong những nước đã và đang có rất nhiều
nghiên cứu về ứng dụng amylase trong công nghiệp, tuy nhiên nền công nghiệp sản
xuất enzyme ở nước ta vẫn chưa thực sự phát triển.
Xuất phát từ các cơ sở trên, việc chọn được những chủng vi sinh vật có khả
năng sản sinh ra amylase có hoạt tính cao, ứng dụng được trong công nghiệp là một
vấn đề hết sức cần thiết.
w Mục tiêu cần đạt
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập và khảo sát khả năng sinh
amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử, xác định hoạt tính amylase thu
được để làm tiền đề cho các nghiên cứu về sau.

w Nội dung nghiên cứu
Bao gồm nội dung chính:
- Phân lập và tuyển chọn các chủng sinh bào tử có khả năng sản sinh
amylase hoạt tính cao trong môi trường đất.
- Nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái bào tử của các chủng tuyển chọn.
- Khảo sát thời gian nuôi cấy để thu được enzyme có hoạt tính cao.
- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel.
- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme thu được.

Mở đầu

2


T Ổ N G Q U AN


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

1. ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME [2][3]
Enzyme là những phân tử protein đặc hiệu có khả năng xúc tác các phản ứng
chuyên biệt.
Cấu trúc không gian của enzyme có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc
tác của enzyme. Tuy nhiên, hoạt động của enzyme liên hệ trực tiếp với một phần
xác định trong phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động - phần của phân tử
enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất trung gian giữa enzyme và
cơ chất.

1.1. Enzyme ngoại bào [3]
Enzyme tiết vào môi trường xung quanh để phân hủy các cơ chất có cấu tạo
cao phân tử, biến những chất này thành những chất có phân tử thấp mà vi sinh vật
có thể đồng hóa được. Đây là những enzyme ngoại bào. Ví dụ: protease thủy phân
protein và polypeptid thành acid amin; amylase thủy phân tinh bột thành maltose và
glucose…

1.2. Enzyme nội bào [3]
Enzyme tạo ra trong tế bào cơ thể sống để xúc tác các phản ứng nội bào. Muốn
thu được các enzyme này ta cần phải phá vỡ cấu trúc tế bào của nó.

2. ENZYME AMYLASE [3][10][15][18][20]
Hệ enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác.
Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme nói chung cũng như enzyme amylase
nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814. Những nghiên cứu này gắn liền
với tên tuổi nhà bác học người Nga- viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình
phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận
thấy rằng trong malt có chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, hai nhà
Tổng quan

3


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột đó từ
đại mạch nảy mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dịch chiết malt và

thu được enzyme ở dạng bột đồng thời đặt tên là diaslase (theo tiếng Hy Lạp có
nghĩa là phân giải). Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột
được gọi là amylase [3].
Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,
trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn [3]. Trong đó,
amylase từ vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất nhờ những đặc
điểm ưu việt của chúng.
Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đặt nền móng cho việc sản xuất các
chế phẩm enzyme này và là cơ sở để sử dụng chúng trong sản xuất và đời sống
Hiện nay, kỹ thuật nghiên cứu về enzyme amylase đã hoàn thiện hơn và mở ra
những phương hướng mới, triển vọng mới trong việc ứng dụng amylase trong các
ngành kinh tế quốc dân.

2.1. Định nghĩa [3][10]
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:
RR’ + H-OH

→

RH + R’OH

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.

2.2. Phân loại [3][20]
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và
exoamylase (enzyme ngoại bào).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme
khử nhánh này được chia thành 2 loại:

- Khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6–glucosidase).
Tổng quan

4


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

- Khử gián tiếp là transglucosylase và amylo-1,6-glucosidase.
Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân
tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

2.3. Một số enzyme amylase phổ biến [3][20]
2.3.1. Enzym α–amylase (EC 3.2.1.1) hay 4-α-D-glucan glucanohydrolase

Hình 1. Sơ đồ cấu trúc không gian của α–amylase [20]
α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng
phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn. α-amylase phân cắt tinh bột ở vị trí ngẫu
nhiên trên chuỗi carbohydrate, sản phẩm cuối cùng là các maltotriose và maltose từ
amylose hoặc maltose, glucose và "dextrin giới hạn" từ amylopectin.
Nó có thể hoạt động ở bất kì vị trí nào trên cơ chất, do đó xu hướng tác động
của α-amylase nhanh hơn so với β-amylase.
Ở động vật, α-amylase là enzyme tiêu hóa chính và pH tối ưu là 6.7-7.0. Đối
với con người, α-amylase được tìm thấy trong nước bọt và trong tuyến tụy. Ngoài
ra, nó còn được tìm thất trong thực vật, nấm (Ascomycetes và Basidiomycetes) và vi
khuẩn (Bacillus).
Tổng quan

5


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

2.3.1.1. Cơ chế tác dụng
Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:
- Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành
một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh
(các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Tinh bột à dextrin phân tử lượng thấp.
- Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp
tục tạo ra các tetra-trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi αamylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dextrin à tetra- và trimaltose à di- và monosaccharide.
Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide (gồm 6-7 gốc glucose). Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp
tục tạo nên các mạch cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của
amylose chứa 13% glucose và 87% maltose.
Amylose à oligosaccharide à polyglucose à maltotetrose à maltotriose à
maltose.
Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không
phân cắt được liên kết α-1,6- glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường
nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose
8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường αamylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít
maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì

Tổng quan

6


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch
hóa.
2.3.1.2. Đặc tính
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine,
tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm
khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme. α-amylase có ít
methionine và có khoảng 7 – 10 gốc cysteine.
Trọng lượng phân tử của α- amylase malt: 59.000 kDa (Knin 1956; Fisher,
Stein, 1960).
Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4.2 – 5.7 (Bernfeld P., 1951).
α-amylase là một metaloenzyme. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định
cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme. Ca còn có vai trò duy trì
sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của
các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ
hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn

các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và
nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+,
Ag+, Hg2+…
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với αamylase từ vi sinh vật.
Ví dụ: pH tối thích cho α-amylase từ malt là 5.3 (khoảng hoạt động từ pH 4.75.4), α-amylase từ nấm sợi là 4.8 (khoảng hoạt động từ pH từ 4.5-5.8).
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau.
Tổng quan

7


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

Ví dụ: α-amylase của A.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của
malt và vi khuẩn B.subtilis.
Độ bền của α-amylase cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH. Tuy nhiên, so
với các loại enzyme amylase khác thì α-amylase có độ bền nhiệt hơn.
Ví dụ: Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn
khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác
động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50oC và bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 1991).
Trong dung dịch đệm pH= 4,7 thì α-amylase của A.oryzae rất nhạy với tác động của
nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt tính dextrin hóa của nó chỉ còn 2229%, hoạt tính đường hóa còn 27-85%. Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi
này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).

2.3.2. Enzyme β – amylase (EC 3.2.1.2) hay 4-α -D-glucan maltohydrolase

Hình 2. Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase [20]

β–amylase được tổng hợp từ vi khuẩn, nấm và thực vật. β–amylase xúc tác
phản ứng thủy phân tinh các liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột, glycogen và
polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch.
Maltose tạo thành do sự xúc tác của β–amylase có cấu hình β.
Trong quá trình chín của trái cây, β–amylase thủy phân tinh bột thành đường
maltose tạo vị ngọt cho trái. Cả α-amylase và β-amylase đều có mặt trong hạt
Tổng quan

8


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

giống nhưng β-amylase hoạt động trước khi hạt nảy mầm, trong khi đó αamylase xuất hiện khi hạt đã nảy mầm.
2.3.2.1. Cơ chế tác dụng:
β–amylase xúc tác từ đầu không khử của mạch, thủy phân các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng.
Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α1,6-glucoside, gọi là β–dextrin.
Tác dụng của β–amylase lên tinh bột như sau:
Tinh bột à maltose (54-58 %) + β–dextrin (42-46 %)
Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α-amylase và β–amylase thì lượng
tinh bột bị thủy phân lên tới 95%.
2.3.2.2. Đặc tính
β–amylase là một albumin, tâm phản ứng có chứa nhóm –SH, nhóm –COOH
và vòng imidazol của các gốc histodine.
β–amylase không bền khi có Ca2+, β–amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, urea,
iodoacetamide, iodin, ozon…
β–amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn. β–amylase
bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích là 55 oC, pH 5.1-5.5.

Tổng quan

9


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

2.3.3. Enzyme γ - amylase (EC 3.2.1.3) hay 4- α-D-glucan glucohydrolase

Hình 3. Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase.
γ - amylase có khả năng thủy phân liên kết α -1,4 lẫn α-1,6-glucoside từ đầu
không khử của mạch .
Ngoài ra, γ - amylase còn có khả năng thủy phân liên kết α -1,2-glucoside và α
-1,3-glucoside. Do đó, nó có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại
enzyme amylase khác.
γ – amylase hoạt động hiệu quả trong môi trường acid, pH 3.5-5.5, ở nhiệt độ
50 oC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton.

2.3.4. Pullulanase (EC 3.2.1.41) hay α-dextrin 6–glucosidase
Pullulanase có khả năng thủy phân liên kết α -1,6-glucoside trong các polyose
và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen.
Cơ chất đặc trưng của enzyme này là pullulan-một polysaccharide tách ra từ
giả nấm men Aureobasidium pullulana.
Phân tử lượng là 145.000 Da, pH hoạt động tối ưu là pH = 5, nhiệt độ tối ưu là
47.5 oC.

Tổng quan

10


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

2.3.5. Transglucosyldase (EC 2.4.1.3) hay 4-α-glucanotransferase
Trans-glucosyldase có cả hoạt tính tranferase lẫn hoạt tính thủy phân. Nó thực
hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang nhóm mono, di- và oligosaccharide, xúc tác
tạo thành các liên kết α -1,4 và α -1,6 glucoside.
Trans-glucosyldase không những thủy phân maltose thành glucose mà còn
tổng hợp izomaltose, izotriose và panose, tức là khả năng chuyển gốc glucose và
gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α -1,6
glucoside thành panose và izomaltose.

3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE [3][20]
Amylase có trong nhiều nguồn khác nhau như động vật (enzyme pancreatic
trong tụy tạng), thực vật (malt đại mạch, tiểu mạch, lúa, ngô…) và vi sinh vật.
So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi
sinh vật có những ưu thế quan trọng như:
- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh.
- Enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa khối
lượng vật chất rất lớn.
- Nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ kiếm.
- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và điều kiện
địa lý như nuôi, trồng động vật và thực vật.
- Hoàn toàn có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp và kiểm soát được quá

trình sản xuất.
Do đó nó đã trở thành đối tượng được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất để
thu nhận enzyme.
Những chủng vi sinh vật sinh nhiều amylase thường được phân lập từ các
nguồn trong tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,
giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Tổng quan

11


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

Vi khuẩn thường sử dụng các chủng như Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis,

Baccillus

diastaticus,

Bacillus

stearothemophilus,

Bacillus

circulans…
Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus và Rihzopus…

Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase.
Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng
có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt như Micromonospora vugaris có khả năng tạo
một lượng nhỏ α-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác.

4. ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI
SỐNG VÀ SẢN XUẤT [2][3]
Ngày nay do nhận thấy được các nhược điểm của việc thủy phân bằng acid
như gây hư tổn thiết bị, gây ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm cũng như sức khỏe
con người, do đó amylase trở thành nguồn enzyme chủ đạo để tham gia các quá
trình thủy phân quan trọng trong các quá trình sản xuất công nghiệp đặc biệt là
trong công nghệ thực phẩm.

4.1. Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm
4.1.1. Ứng dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng cả α-amylase và β–amylase. Các
enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường. Nhờ đó, nấm men
Saccharomyces cerevisiae dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể
tích bánh và tạo ra hương vị, màu sắc tốt cho bánh.

Tổng quan

12


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

4.1.2. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo
Mục đích đưa enzyme vào sản xuất bánh quy là làm tăng mùi vị của bánh.
Amylase hoạt động làm tăng lượng đường khử, đường này sẽ tham gia phản ứng
oxy hóa khử và kết quả tạo bánh quy có màu và mùi hấp dẫn.

4.1.3. Ứng dụng trong sản xuất bia
Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử
dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai
đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp.
Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch
chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được
tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng
và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ
enzyme của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để
phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản
xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm.
Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không
sử dụng hoàn toàn 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một
công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên
men. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm
enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột. Enzyme này có ý nghĩa
rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp.

4.1.4. Ứng dụng trong sản xuất siro
Ứng dụng trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường- phôi bắp được xử
lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm, ra khỏi khối bột bằng li tâm.
Enzyme amylase chỉ được sử dụng sau khi tinh bột hòa vào nước.

Tổng quan

13


Hồ Thị Mỹ Linh

Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

Ngoài tinh bột bắp, người ta còn sử dụng tinh bột khoai tây, tinh bột mì, tinh
bột sắn. Tùy theo nguồn nguyên liệu tinh bột mà người ta áp dụng kĩ thuật khác
nhau cho phù hợp.
Enzyme sử dụng trong công nghệ sản xuất siro phải là những enzyme chịu
nhiệt, những enzyme này thường được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis,
Bacillus stearothermophilus.
Đặc điểm quan trọng nhất của enzyme amylase là chúng hoạt động ở pH gần
trung tính (pH=6), đặc điểm này giúp thực hiện các quá trình đường hóa rất dễ
dàng.

4.2. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác [3]
4.2.1. Ứng dụng trong công nghiệp dệt
Sau khi vải được hồ hóa để làm mịn, người ta phải tiến hành quá trình rũ hồ
vải. Phương pháp làm sạch hồ tinh bột được sử dụng là enzyme amylase.
Trước đây, người ta sử dụng enzyme a-amylase của malt hay pancreatic
amylase. Để phá hủy nhanh lượng tinh bột thừa, người ta đưa nhiệt độ đến nhiệt độ
sôi sau đó làm giảm xuống 50°C hay 60°C và cho enzyme amylase vào.
Ngày nay người ta sử dụng a-amylase của vi khuẩn. Enzyme amylase của vi
khuẩn chịu nhiệt cao, chúng hoạt động mạnh ở nhiệt độ 85°C-90°C. Một số enzyme
amylase của Bacillus subtilis có khả năng hoạt động ở 105°C-115°C.
Tuy nhiên còn tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, sản xuất, nguồn amylase mà
người ta tiến hành chọn lựa enzyme rũ hồ vải cho phù hợp.

4.2.2. Ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa
Chất tẩy rửa bao gồm những chất kiềm, sodium silicate, sodium bicarbonate,
sodium tripolyphosphate.

Tổng quan

14