Nghiên cứu khả năng đối kháng với VIBRIO và đánh giá tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú của một số chủng BACILLUS phân lập từ trùn quế

i

LỜI CẢM ƠN
Thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học là một trong những cơ hội giúp chúng tôi
học hỏi thêm nhiều kỹ năng, nâng cao tinh thần kỹ luật, luôn học hỏi, tìm tòi để thực
hiện công việc, đồng thời cũng giúp chúng tôi có thêm kỹ năng giải quyết vấn đề. Để
đạt được kết quả này, ngoài sự cố gắng của bản thân phải kể đến sự giúp đỡ của thầy
cô, gia đình và bạn bè.
Trước tiên, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình đã luôn
luôn ủng hộ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi học tập, nghiên cứu.
Tiếp đến chúng tôi xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học,
trường đại học Mở TP. HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, những kinh
nghiệm quý giá làm nền tảng cho chúng tôi có thể ứng dụng vào thực hiện đề tài
nghiên cứu.
Và đặc biệt chúng tôi xin cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh và Cô Dương Nhật
Linh, người đã tận tình chỉ dẫn, động viên, tạo cho em niềm say mê nghiên cứu.
Bên cạnh đó chúng tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẻ động
viên, giúp chúng tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian qua.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 05 năm 2011
Nhóm 3

i


ii

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................11
Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................14

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH PHÒNG TRỊ
BỆNH TRÊN TÔM ................................................................................................15
1.1.1 Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]......................................15
1.1.2 Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5]........................................15
1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41]....................................................................16
1.2.1 Phân loài......................................................................................................16
1.2.2 Các giai đoạn phát triển...............................................................................17
1.2.3 Tuổi thành thục............................................................................................18
1.2.4 Tập tính ăn...................................................................................................18
1.2.5 Lột xác.........................................................................................................19
1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]..............................19
1.4 TÌNH HÌNH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ BỆNH CHO
TÔM [34, 36]...........................................................................................................22
1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 23
1.5.1 Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]..............................................................23
1.5.2 Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]...................24
1.5.3 Ưu điểm của probiotic trong phòng trị bệnh cho tôm ...............................28
1.5.4 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản [35,
39, 22, 9, 30]..............................................................................................29
1.6 TRÙN QUẾ, MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG TRONG NUÔI
TRỒNG THỦY SẢN ..............................................................................................35
1.6.1 Trùn quế và phân trùn quế [38, 5]...............................................................35

ii


iii

1.6.2 Chế phẩm sinh học từ trùn quế trong nuôi trồng thủy sản ........................38
1.7 VI KHUẨN BACILLUS .....................................................................................40
1.7.1 Đặc điểm chủng vi khuẩn Bacillus ............................................................40
1.7.2 Cấu trúc bào tử của vi khuẩn [12]...............................................................40
1.7.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus [17]........................................................41
1.7.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản [40, 19, 20, 24, 28]......42
Chương 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU..............................................................................................................................44
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU......................................................45
2.2 VẬT LIỆU.............................................................................................................45
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu..................................................................................45
2.2.2 Môi trường - hóa chất..................................................................................45
2.2.3 Thiết bị - dụng cụ........................................................................................46
2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM.........................................................................................48
2.4 TÁI PHÂN LẬP BACILLUS...............................................................................49
2.5 THỬ ĐỐI KHÁNG...............................................................................................50
2.5.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc [26].....................50
2.5.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp [26]...........................51
2.6 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY [27]............................................................52
2.7 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS
..................................................................................................................................54
2.7.1 Thử khả năng gây dung huyết [1]...............................................................54
2.7.2 Thử nghiệm tính an toàn cho các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú [11]
...................................................................................................................54
2.8 XỬ LÝ KẾT QUẢ................................................................................................57
Chương 3.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...............................58

iii


iv

3.1 KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP BACILLUS............................................................59
3.2 KẾT QUẢ THỬ ĐỐI KHÁNG............................................................................62
3.2.1 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc.............................62
3.2.2 Thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp...................................65
3.3 THỬ NGHIỆM ĐỒNG NUÔI CẤY....................................................................71
3.3.1 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. parahaemolyticus. 71
3.3.2 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. alginolyticus.........81
3.3.3 Kết quả đồng nuôi cấy của các chủng Bacillus với V. harveyi..................88
3.4 THÍ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CÁC CHỦNG BACILLUS: 97
3.4.1 Thử khả năng gây dung huyết.....................................................................97
3.4.2 Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus lên ấu trùng tôm sú.......99
100
Chương 4.

....................................................................101

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................................101
4.1 KẾT LUẬN.........................................................................................................102
4.2 KIẾN NGHỊ........................................................................................................102
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................104
PHỤ LỤC.................................................................................................................108

iv

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

One-way analysis of variance

CFU

Đơn vị khuẩn lạc

Cs

Cộng sự

DC

Đối chứng

LB

Luria Bertani

NA

Nutrient Agar

NB

Nutrient Broth

PL

Postlarvae (hậu ấu trùng)

TCBS

Thiosulphate citrate bile salts sucrose

v


vi

DANH MỤC CÁC ĐƠN VỊ ĐO
%
µl
‰
cm
g
g/L
L
m
mg
mL
nm
o
C

pH

Phần trăm
Microlít
Phần nghìn
Centimét
Gam
Gam/lít
Lít
Mét
Miligam
Millilít
nanomet
Nhiệt độ bách phân
Độ pH

vi


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kết quả tái phân lập......................................................................................60
Bảng 3.2 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp vạch vuông góc.........................63
Bảng 3.3 Kết quả thử đối kháng bằng phương pháp đổ thạch hai lớp........................66
Bảng 3.4 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)..................................................................................................71
Bảng 3.5 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)..................................................................................................73
Bảng 3.6 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. parahaemolyticus (tính

trên LOG10 CFU/mL)..................................................................................................74
Bảng 3.7 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)..................................................................................................76
Bảng 3.8 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)..................................................................................................77
Bảng 3.9 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. parahaemolyticus (tính
trên LOG10 CFU/mL)..................................................................................................78
Bảng 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL).........................................................................................................81
Bảng 3.11 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL).........................................................................................................82
Bảng 3.12 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. alginolyticus ( tính trên
LOG10 CFU/mL).........................................................................................................83
Bảng 3.13 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL).........................................................................................................84
Bảng 3.14 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL).........................................................................................................86

vii


viii

Bảng 3.15. Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. alginolyticus (tính trên
LOG10 CFU/mL).........................................................................................................87
Bảng 3.16 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F2 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)........................................................................................................88
Bảng 3.17 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F10 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)........................................................................................................89
Bảng 3.18 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F11 với V. harveyi (tính trên

LOG10 CFU/ mL)........................................................................................................90
Bảng 3.19 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F27 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)........................................................................................................92
Bảng 3.20 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F28 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)........................................................................................................94
Bảng 3.21 Kết quả đồng nuôi cấy chủng vi khuẩn F33 với V. harveyi (tính trên
LOG10 CFU/ mL)........................................................................................................95
Bảng 3.22 Kết quả khả năng gây dung huyết..............................................................97
Bảng 3.23 Tỷ lệ sống của ấu trùng tôm sú sau 24 giờ bổ sung Bacillus.....................99

viii


ix

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

ix


x

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú...............................................18
Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio.....................................................................................20
Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm.............................................22
Hình 1.4 Vi khuẩn Bacillus...............................40
Hình 1.5 Cấu trúc của bào tử .......................................................................................41
Hình 2.6 Quy trình thí nghiệm.....................................................................................48

Hình 2.7 Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc......................................................51
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đồng nuôi cấy.........................................................53
Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghệm đánh giá tính an toàn cho các chủng vi khuẩn thử
nghiệm lên ấu trùng tôm sú..........................................................................................55
Hình 2.10 Thuần hóa tôm.............................................................................................55
Hình 2.11 Toàn cảnh bố trí thí nghiệm........................................................................56
Hình 2.12 Hộp bố trí thí nghiệm..................................................................................56
Hình 3.13 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus trên NA sau 24h nuôi cấy............................59
Hình 3.14 Nhuộm gram Bacillus.................................................................................59
Hình 3.15 Thử đối kháng bằng phương pháp cấy vạch vuông góc.............................65
Hình 3.16 Thử nghiệm khả năng đối kháng bằng phương pháp đổ thạch 2 lớp.........70
Hình 3.17 Trải đĩa kiểm tra mật độ của V. harveyi khi đồng nuôi cấy với F27 mật độ
107 ở ngày 5.................................................................................................................97
Hình 3.18 Kết quả thử khả năng gây dung huyết........................................................98

x


TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

11


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Thủy sản là một trong những ngành mang lại lợi nhuận cao cho nền kinh tế quốc
dân và thu hút nhiều lao động. Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói
chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ.

Bên cạnh những thành tựu và sự phát triển của ngành thì vấn đề nuôi tôm ở Việt
Nam còn nhiều vấn đề tồn đọng mà vấn đề quan trọng nhất là dịch bệnh gây chết hàng
loạt đã gây nhiều tổn thất cho người nuôi tôm nói riêng và ngành thủy sản nói chung.
Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản do
phần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọng lại dưới
đáy ao nuôi.
Có rất nhiều nghuyên nhân dẫn đến bệnh tôm, đáng quan tâm là nhóm vi khuẩn
Vibrio spp., thường xuyên hiện diện và gây hại nghiêm trọng trên tôm sú, trong nhóm
này có V. harveyi và V. parahaemolyticus là các lòai vi khuẩn có độc lực cao, gây bệnh
phát sáng trên ấu trùng tôm sú. Các lòai Vibrio khác như: V. vulnificus, V.
alginolyticus, V. splendidus,.. được xem là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm sú
thương phẩm. Khi Vibrio xuất hiện trong nước với mật độ cao, có thể gây chết hàng
loạt ấu trùng và tôm sú, đôi khi tỷ lệ chết lên đến 100 % . [2, 7]
Mặc dù phải đương đầu với những bất lợi nhưng tôm nói riêng và sản phẩm
thủy sản nói chung vẫn là mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn đem lại nhiều lợi ích kinh tế.
Vấn đề đặt ra hiện nay là tìm ra những giải pháp hạn chế tối đa các tác nhân gây bệnh
cũng như nỗ lực thực hiện các kỹ thuật nuôi hợp lý và hiệu quả mà vẫn đảm bảo được
sự phát triển bền vững.
Ngày nay, sử dụng chế phẩm sinh học được xem như là giải pháp thay thế
kháng sinh, được coi là một công cụ hữu hiệu để giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường
trong ao nuôi, khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng và đã tạo nền tảng vững chắc
cho phần lớn hoạt động nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Khác với biện pháp hóa học
và kháng sinh, chế phẩm sinh học cung cấp một phương thức an toàn, bền vững đối với
người nuôi và tiêu dùng.

12


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có rất nhiều hệ vi sinh vật đã được dùng trong sản xuất chế phẩm sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản. Nhưng Bacillus vẫn được xem là đối tượng quan trọng vì đã có
nhiều tài liệu cho rằng chế phẩm có sử dụng Bacillus giúp thủy sản sinh trưởng nhanh,
tăng sức đề kháng, chống lại một số loài gây bệnh - được báo cáo nhiều nhất là khả
năng đối kháng với Vibrio và khả năng tạo bào tử của nó.
Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh và cs (2010) thì một số
chủng Bacillus phân lập được từ trùn quế và phân trùn quế có khả năng chịu muối mật,
pH acid dạ dày và khả năng đối kháng tốt đối với một số vi khuẩn gây bệnh cho động
vật thủy sản. [5]
Trên cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI
KHÁNG VỚI VIBRIO VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN ĐỐI VỚI ẤU TRÙNG
TÔM SÚ CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS PHÂN LẬP TỪ TRÙN QUẾ”
Trong nghiên cứu này, các chủng Bacillus đã được phân lập từ trùn quế tiếp tục
được nghiên cứu khả năng đối kháng với một số vi khuẩn Vibrio gây bệnh và đánh giá
tính an toàn đối với ấu trùng tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm. Thành công của
đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở khoa học cho việc phát triển thành chế phẩm vi sinh
trong việc phòng và trị bệnh do vi khuẩn, đặc biệt do nhóm Vibrio spp. gây ra trên
động vật thủy sản.
Mục tiêu
− Tái phân lập Bacillus từ trùn quế và phân trùn quế.
− Thử khả năng đối kháng của Bacillus với V. harveyi, V. parahaemolyticus, V.
alginolyticus.
− Đồng nuôi cấy Bacillus với 3 loài vi khuẩn gây bệnh, kiểm tra sự thay đổi mật
độ của vi khuẩn Vibrio theo thời gian nuôi cấy.
− Thử nghiệm tính an toàn của các chủng Bacillus.

13


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chương 1.

T

ỔNG QUAN TÀI LIỆU

14


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.1 SƠ LƯỢC VỀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, BỆNH VÀ CÁCH
PHÒNG TRỊ BỆNH TRÊN TÔM
1.1.1

Tình hình nuôi trồng thủy sản trên thế giới [3, 6]
Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng thủy sản có giá trị thương phẩm cao và

cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở Châu Á như
Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Việt Nam và Ecuador. Nghề nuôi tôm không
chỉ góp phần lớn làm tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản cho các nước nêu trên mà còn
có tác động tích cực đến quá trình phát triển kinh tế xã hội, cải thiện đời sống cho
người nuôi thủy sản. [6] Hiện nay, nghề nuôi tôm nước lợ ở nhiều nước trên thế giới đã
và đang chịu ảnh hưởng nghiêm trọng do môi trường nuôi ô nhiễm và dịch bệnh phát
sinh, đặc biệt là mô hình nuôi tôm sú thâm canh. Hậu quả là có nhiều vùng nuôi tôm bị
thất bại liên tục đã bị bỏ hoang, gây nên những tác động nghiêm trọng về kinh tế xã
hội. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ
733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến
năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. [3]

1.1.2

Tình hình nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam[3, 5]
Trong khoảng 10 năm gần đây, ngành thủy sản nói chung và nuôi trồng thủy sản

nói riêng của nước ta đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo thống kê của Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2008, diện tích nuôi trồng thủy sản đã được
mở rộng lên trên 1 triệu ha và sản lượng đạt gần 2,45 triệu tấn, tăng gấp 12 lần so với
năm 1980. Bên cạnh đó, giá trị xuất khẩu thủy sản của Việt Nam ngày càng tăng mạnh,
năm 2008 đạt trên 4,5 tỷ USD, đứng thứ tư trong những ngành hàng có kim ngạch xuất
khẩu cao nhất của cả nước.[5]
Tuy nhiên, thực tế cho thấy giá cả hấp dẫn và ổn định của con tôm trên thị
trường thế giới cùng với giá đất tương đối thấp của vùng Duyên Hải đã đưa đến sự
bùng nổ việc phát triển nghề nuôi tôm. Điều đáng lưu ý là kỹ thuật nuôi tôm tuy không
quá phức tạp, nhưng bản thân hệ sinh thái khá biến động đối với việc nuôi thâm canh,

15


TÀI LIỆU THAM KHẢO

hệ thống sản xuất thiếu tính bền vững đã dẫn đến nhiều thiệt hại cho nghề nuôi tôm.
Tại Việt Nam, trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan
rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng.
Theo sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Bạc Liêu năm 2008 - 2009, nhiều hộ dân
tại 3 đơn vị của tỉnh đã chuyển gần 1.000 ha đất nuôi tôm công nghiệp kém hiệu quả
sang làm muối. Trước tình hình trên, nhiều chương trình nghiên cứu liên quan đến việc
xác định các tác nhân gây bệnh chính trên tôm nuôi, cụ thể ở Đồng bằng Sông Cửu
Long cho thấy ngoài tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio còn ghi nhận sự xuất hiện

của hai tác nhân gây bệnh virus quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV
(White Spot Syndrom Virus) .[3]

1.2 KHÁI QUÁT VỀ TÔM SÚ [33, 41]
Tôm Sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tiếng Anh là Giant Tiger
Shrimp.
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản,
Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi. Nhìn chung, tôm
sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nước vùng
xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippin và Việt Nam.
Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và
rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di chuyển xa bờ vì chúng thích sống
vùng nước sâu hơn.

1.2.1

Phân loài
Ngành: Arthropoda
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: Monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

16


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.2.2

Các giai đoạn phát triển
Nauplli: 6 giai đoạn: 36-51 giờ, các Nauplli bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ, lột vỏ

4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ, tự sống bằng noãn hoàng, không cần cho ăn.
N1:dài khoảng 0,40 mm, dày 0,20 mm.
N2: dài khoảng 0,45mm, dày 0,20 mm.
N3: dài khoảng 0,49 mm, dày 0,20 mm.
N4: dài khoảng 0,55 mm, dày 0,20 mm.
N5: dài khoảng 0,61 mm, dày 0,20 mm.
Zoea: 3 giai đoạn: 105-120 giờ, các Zoea bơi liên tục gần mặt nước, lột vỏ 2 lần,
mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vất phiêu sinh.
Z1: dài khoảng 1 mm, dày 0,45 mm, xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt.
Z2: dài khoảng 1,9 mm, xuất hiện mặt và chủy.
Z3: dài khoảng 2,7 mm, xuất hiện gai trên bụng.
Mysis: 3 giai đoạn : 72 giờ, các Mysis bơi hướng xuống sâu, đuôi đi trước, đầu
đi sau.
M1: dài khoảng 3,4 mm, có hình dạng của tôm trưởng thành, xuất hiện các cặp
chân bụng, đuôi và quạt đuôi, các gai bụng thu nhỏ lại.
M2: dài khoảng 4,0 mm.
M3: dài khoảng 4,4 mm, chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng
trên chủy.
Postlarvae: giai đoạn gần trưởng thành.
Juvenile: giai đoạn trưởng thành.

1. Trứng tôm

Giai đoạn 1: Naupli

Giai đoạn 2: Zoeal

17


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Giai loạn 3: Mysis

Giai đoạn 4: Postlarva

Giai đoạn 5: Juvenile

Hình 1.1 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm sú

1.2.3

Tuổi thành thục
Tuổi thành thục sinh dục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định

sự thành thục của tôm cái dễ hơn, chỉ cần quan sát có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ.
Phương pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn, chỉ khi nào tìm thấy được tinh
trùng ở cuối ống dẫn tinh.
Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (GIH, gonal inhibiting hormone)
được sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt, vận chuyển tới
tuyến giáp sinap đưa vào kho dự trữ và khi cần thì tiết ra. Sự thành thục sinh dục của
tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết, khi cắt mắt sẽ thúc đẩy chu kỳ lột xác,
đem lại sự thành thục mau chóng hơn.
Số lượng trứng đẻ của tôm cái: nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng buồng

trứng và trọng lượng cá thể: trọng lượng lớn cho trứng nhiều hơn. Khi con cái thành
thục ngoài tự nhiên có trọng lượng từ 100 - 300 g cho 300.000 - 1.200.000 trứng. Nếu
cắt mắt nuôi vỗ trong bể xi măng thì cho số lượng trứng từ 200.000 - 600.000 trứng.
Tôm cái đẻ trứng vào ban đêm (thường từ 22 giờ đến 2 giờ) trứng sau khi đẻ
được 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-28 oC sẽ nở thành ấu trùng (Nauplii). Tôm sú đẻ quanh
năm, nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3-4 và tháng 7-10.
Tuổi thọ tôm sú con đực khoảng 1,5 năm, con cái chừng 2 năm.

1.2.4

Tập tính ăn
Tôm sú là loại ăn tạp, thích các động vật sống và di chuyển chậm hơn là xác

thối rữa hay mảnh vụn hữu cơ, đặc biệt ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, mảnh vụn
hữu cơ, giun nhiều tơ, loại 2 mảnh vỏ, côn trùng. Tôm sống ngoài tự nhiên ăn 85% là

18


TÀI LIỆU THAM KHẢO

giáp xác, cua nhỏ, động vật nhuyễn thể hai mảnh vỏ, còn lại 15% là cá, giun nhiều tơ,
thuỷ sinh vật, mảnh vụn hữu cơ, cát bùn.
Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thuỷ triều rút. Nuôi tôm sú trong
ao thì hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối. Tôm bắt mồi bằng càng, sau
đó đẩy thức ăn vào miệng để gặm, thời gian tiêu hoá 4-5 giờ trong dạ dày.

1.2.5

Lột xác

Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên mức độ

nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm.
Sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp lột xác nhưng không tăng
thể trọng.
Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau: Lớp biểu bì
giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo
sau là phần bụng và các phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn
cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ với tôm nhỏ, 1-2 ngày
đối với tôm lớn. Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với môi
trường sống thay đổi đột ngột. Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này, có
thể điều chỉnh môi trường nuôi kịp thời.
Hormone hạn chế sự lột xác lột xác (MIH, molt - inhibiting hormone) được tiết
ra do các tế bào trong cơ quan của cuống mắt, truyền theo sợi trục tuyến xoang, chúng
tích luỹ lại và chuyển vào trong máu, nhằm kiểm tra chặt chẽ sự lột xác. Các yếu tố bên
ngoài như ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, đều có ảnh hưởng tới sự lột xác của tôm.

1.3 BỆNH DO VI KHUẨN VIBRIO TRÊN TÔM [31, 4, 5, 23]
Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau

19


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hình 1.2 Vi khuẩn Vibrio
Vibrio có hình que, ngắn, mảnh, kích thước khoảng 0,5×3μm, hai đầu không
đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, qua nhiều lần cấy truyền thì tính chất phẩy khuẩn
biến mất, là vi khuẩn gram âm.Vibrio không tạo bào tử, không tạo giáp mô, di động
nhờ tiêm mao ở đầu. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tăng trưởng nhanh trong

môi trường có tính kiềm (8,5 - 9), ưa môi trường có muối với nồng độ khác nhau tùy
theo loài. Sống được ở nhiệt độ 16-42 oC. Chết nhanh trong môi trường acid, dễ bị diệt
bởi các chất tẩy uế, đặc biệt nhạy cảm với sự khô, chỉ tồn tại 10 phút ở 55oC. [4]
Vibrio là một trong những tác nhân gây ra dịch bệnh lớn ở động vật giáp xác và
cá. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng
thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100%.
Bệnh do Vibrio là một trong những nguyên nhân chính gây chết cho tôm nuôi
trên toàn thế giới. Loài vi khuẩn Vibrio phân bố rộng rãi , thường gây nhiễm trùng
trong các trại trại sản xuất giống cũng như trong ao nuôi tôm gây thiệt hại nghiêm
trọng. Bệnh do Vibrio gây ra chủ yếu là do một số loài như: V. harveyi, V. vulnificus,
V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. penaeicida …
Sự bùng nổ dịch bệnh có thể xảy ra khi nhân tố môi trường làm tăng nhanh số
lượng vi khuẩn tồn tại sẵn trong máu tôm ở mức thấp, hoặc bằng cách xâm nhập qua
rào cản vật chủ.
Vibrio xâm nhập vào cơ thể vật chủ qua nhiều con đường như sau:

20


TÀI LIỆU THAM KHẢO

− Lớp vỏ ngoài của động vật thủy sản là hàng rào bảo vệ hiệu quả chống lại mầm
bệnh. Tuy nhiên, Vibrio có thể gây bệnh trên vỏ và có thể xâm nhập qua vết thương ở
lớp vỏ ngoài hay lỗ chân lông.
− Mang dễ bị tổn thương dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn bởi vì mang chỉ được
bao bọc bởi lớp vỏ mỏng.
− Tuyến tiêu hóa và ruột giữa không được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài nên mầm
bệnh từ nước, thức ăn, chất thải có thể xâm nhập vào trong cơ thể. [23]
Bệnh do Vibrio gây ra có thể là kết quả của môi trường nuôi xấu, do tôm đã yếu
vì mắc bệnh khác và trong một số trường hợp do độc lực mạnh của một số loài Vibrio.

Nếu tôm bị nhiễm cục bộ ở một số nơi trên bề mặt cơ thể do bị trầy xướt hay ở
đường ruột thì có thể thấy các triệu chứng như: tạo thành chổ viêm có bao và có thể có
màu đen trên thân, viêm ruột hay hoại tử đốm ở gan. Nếu tôm bị nhiễm toàn diện thì có
thể thấy các đốm đen ở cơ quan lympho, tim, mang,... [31]
Một số bệnh do Vibrio gây ra
−

V. salmonicida gây bệnh ở vùng nước lạnh.

−

V. parahaemolyticus, V. harveyi gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú.

−

V. alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân ấu trùng tôm sú.

−

V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. anguillarum... gây bệnh đỏ

thân ở tôm sú thịt, ăn mòn vỏ giáp xác, gây bệnh máu vón cục ở cua, gây bệnh ấu trùng
nhuyễn thể. [5]

21


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hình 1.3.Bệnh đỏ dọc thân và bệnh phát sáng trên tôm

1.4 TÌNH HÌNH DÙNG HÓA CHẤT, KHÁNG SINH ĐIỀU TRỊ
BỆNH CHO TÔM [34, 36]
Nuôi trồng thủy sản với quy mô công nghiệp không thể tránh khỏi dịch bệnh
làm tôm chết, gây tổn thất cho người nuôi. Để đối phó với tình trạng dịch bệnh người
ta thường sử dụng kháng sinh (Tetracycline, Streptomycin....). Tuy nhiên khi sử dụng
một loại thuốc quá lâu, sử dụng không đúng liều lượng, thời điểm sẽ gây ra hiện tượng
kháng thuốc. Đáng lo ngại hơn là gen kháng có thể truyền cho thế hệ sau hoặc truyền
ngang giữa các tế bào vi khuẩn thông qua tiếp hợp, tải nạp, tạo những chủng vi khuẩn
mang gen kháng kháng sinh và có thể gây bệnh cho người. Khi đã xảy ra hiện tượng
kháng thuốc thì sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc phòng và điều tri bệnh cho vật nuôi,
dễ bùng phát các trận dịch khó kiểm soát, gây thiệt hại kinh tế.
Bên cạnh đó dư lượng thuốc kháng sinh ảnh hưởng đến giá trị xuất khẩu tôm.
Tôm xuất khẩu thường bị trả về do dư lượng kháng sinh còn quá nhiều. Dư lượng
thuốc còn lại trong thịt, nội tạng của vật nuôi, khi sử dụng vật nuôi làm thực phẩm
chúng sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Ngoài kháng sinh người nuôi còn dùng nhiều hóa chất độc hại khác để tiêu diệt
các loài không mong muốn như dùng Sulfat đồng để diệt tảo, các chất diệt cá tạp như
Nicotin, các loại thuốc trừ sâu..... Các hóa chất này có thể tiêu diệt các loài không
mong muốn nhưng đồng thời cũng tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật có lợi cho ao nuôi.
[36]
Bên cạnh đó, mô hình nuôi tôm hiện nay đa phần không có hệ thống xử lý nước
thải. Do vậy lượng hóa chất cùng với nước thải của hệ nuôi đưa trực tiếp ra môi trường
ngoài gây ô nhiễm nguồn nước. Tiến sĩ khoa học Nguyễn Văn Trương - Viện Tài
Nguyên Sinh Thái cho rằng nếu chỉ có một vài hộ nuôi xả bỏ chất thải ra biển thì
không sao, nhưng vài chục ngàn hộ dân cùng thải nước như vậy ắt hẳn cả vùng biển bị

22

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ô nhiễm, biển lại thông với sông nên ảnh hưởng càng thêm nghiêm trọng hơn. [34] Đặc
biệt, cần thận trọng khi sử dụng thuốc trừ sâu hữu cơ vì chúng có độc tính, gây ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm và sức khỏe con người do cơ chế tích lũy sinh học.
Tóm lại, vấn đề sử dụng hóa chất cũng như kháng sinh chỉ giải quyết tình trạng
bệnh trong nhất thời nhưng nó lại mang đến không ít tác hại trong đời sống và kinh tế.
− Hóa chất và kháng sinh không chỉ tiêu diệt vi sinh vật có hại mà còn diệt luôn vi
sinh vật có lợi.
− Hóa chất, kháng sinh có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tôm.
− Nguy cơ tạo ra vi sinh vật kháng thuốc, có thể truyền tính kháng thuốc cho tác
nhân gây bệnh cho người.
− Ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái, đến quần thể sinh vật trong hệ sinh thái…

1.5 PROBIOTIC-CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG NUÔI TRỒNG
THỦY SẢN
1.5.1

Định nghĩa probiotic [13, 5, 25, 8]
Probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp bao gồm hai từ "pro" có nghĩa là dành

cho và "biosis" có nghĩa là sự sống.[25] Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều định nghĩa
khác nhau, nó được sử dụng lần đầu tiên năm 1965 để mô tả một chất được tạo ra bởi
một protozoon để kích thích sự tăng trưởng của một con khác.
Đến những năm 1970 nó được mô tả chất chiết từ mô có tác dụng tăng sinh mô.
Năm 1974, Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các vi
sinh vật và chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng hệ vi sinh vật
ruột.
Fuller (1989) đã đưa ra định nghĩa rất gần với hiện nay là “một vi sinh vật sống
bổ sung qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện vi sinh vật

đường ruột”. [8]
Năm 1992, Havenaar và Huis In’t Veld đưa ra định nghĩa về probiotic như sau:
“Probiotic là chế phẩm hay sản phẩm chứa vi sinh vật sống xác định với số lượng đủ

23


TÀI LIỆU THAM KHẢO

có thể làm thay đổi hệ vi sinh vật tại một phần của cơ thể ký chủ và nhờ đó tạo ra các
hệ quả có lợi cho sức khỏe ký chủ”.
Trải qua lịch sử, probiotic được định nghĩa ngày càng cụ thể hơn. Theo định
nghĩa hiện được thông qua bởi FAO/WHO năm 2001: “probiotic là những vi sinh vật
sống mà khi dùng với lượng thích hợp, kiểm soát chặt chẽ sẽ đem lại lợi ích sức khỏe
cho vật chủ”. [13, 5]

1.5.2

Cơ chế tác dụng của probiotic trong nuôi trồng thủy sản [40]

1.5.2.1 Tiết ra các hợp chất ức chế[40]
Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn in-vitro kìm
hãm được các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Những nghiên cứu này
cũng chứng minh khả năng kìm hãm vi khuẩn khác của những dòng vi khuẩn
thông thường dễ tìm thấy trong môi trường.
Theo Sugita và cs (1997) những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi
trường những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm hãm vi khuẩn gây ảnh hưởng
đến quần thể vi sinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dưỡng và năng
lượng có sẵn trong môi trường. Sự hiện diện những vi khuẩn này sản sinh chất
kìm hãm, có thể tiết trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trường

nước làm rào cản sự nhân lên của vi khuẩn cơ hội, gây ức chế các vi sinh vật
gây bệnh. Sản phẩm có thể là chất kháng sinh, siderophore, men phân hủy,
H2O2, acid hữu cơ…
Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định được nên được gọi chung là chất
ức chế. Vi khuẩn lactic từ lâu được biết là loại tiết ra chất kháng vi khuẩn
(bacteriocin) chống lại các vi khuẩn Gram (+). Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh
trong thủy sản là nhóm Gram (-). Vì vậy, tác động ức chế của vi khuẩn lactic
trong nuôi trồng thủy sản bị hạn chế nhưng nó là vi khuẩn không có hại và là
đối tượng cạnh tranh chỗ cư trú.
Nhiều vi khuẩn khác cũng tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh
như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus. Cơ chế tiết ra chất
24


TÀI LIỆU THAM KHẢO

chống lại vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất
phổ biến trong môi trường nước.
1.5.2.2 Cạnh tranh nơi cư trú[40]
Olsson và cs (1992) khẳng định cạnh tranh chỗ bám trong ruột của vật chủ có
ảnh hưởng rất quan trọng đến sức khoẻ của vật chủ. Việc bám dính được vào
lớp màng nhầy của ruột là rất cần thiết để vi khuẩn thiết lập quần thể trong hệ
ruột của cá. Khả năng bám dính lên thành ruột là tiêu chuẩn lựa chọn đầu tiên
của vi khuẩn hữu ích. Sự bám dính trên màng ruột có thể là chuyên biệt, không
chuyên biệt.
Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng
cách tranh giành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô khác. Người ta đã
chứng minh được khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt hoặc bên trong ruột, hay
niêm mạc ngoài của chủng Carnobacterium K1 làm cho chủng này cạnh tranh vượt trội
và ngăn cản được sự lan rộng của các vi khuẩn gây bệnh ở cá như V. anguillarum và A.

hydrophila.
1.5.2.3 Cạnh tranh dinh dưỡng và năng lượng[40]
Nhiều quần thể vi sinh vật cùng tồn tại trong cùng một hệ sinh thái thì sẽ có sự
cạnh tranh về dinh dưỡng và năng lượng. Cạnh tranh trong giới vi sinh vật chủ
yếu là xảy ra ở nhóm dị dưỡng như cạnh tranh các chất hữu cơ mà chủ yếu là
nguồn carbon và năng lượng. Rico-Mora (1998) đã cho một dòng vi khuẩn
được chọn lọc có khả năng phát triển trên môi trường nghèo hữu cơ. Tác giả
cấy vi khuẩn này vào bể nuôi tảo khuê cùng với Vibrio alginolyticus thì vi
khuẩn Vibrio này không phát triển và thử nghiệm in-vitro không thấy có sự ức
chế. Do đó chứng tỏ vi khuẩn được chọn lọc cạnh tranh lấn át Vibrio trong
điều kiện nghèo hữu cơ. Do vậy những dòng vi khuẩn chọn lọc sẽ có ưu thế
trong việc cạnh tranh năng lượng và dinh dưỡng.

25