CHUYỂN GEN KHÁNG HIV Ở KHỈ VÔ MÈO

1

SỰ TRAO ĐỔI THÔNG TIN DI TRUYỀN HẠN CHẾ VIRUS AIDS
VÀO TRONG CON MÈO NHÀ.
Pimprapar Wongsrikeao1, Dyana Saenz1, Tommy Rinkoski1,
Takeshige Otoi2 & Eric Poeschla1,3

GIỚI THIỆU
Con mèo nhà là một loài có
hệ thần kinh phức tạp, các loài có thể
truy cập với giá trị cụ thể trong các
tình huống nghiên cứu nơi động vật
gặm nhấm là không phù hợp trên cơ
sở tính dễ mắc bệnh, kích thước, hoặc
các yếu tố khác. Ví dụ, các nghiên
cứu trong con mèo đã tiết lộ nhiều
kiến thức hiện nay của chúng ta về
các tổ chức của bộ não động vật có
vú, đặc biệt là vỏ não, và người và
mèo được mỗi ảnh hưởng với virus
mãn tính AIDS đại dịch nhạy cảm với
các yếu tố hạn chế các loài cụ thể.
Một khả năng cho biến đổi thông tin
di truyền mèo là cần thiết để nhận ra
tiềm năng đặc biệt. Dưới đây chúng
tôi giới thiệu một yếu tố hạn chế
retrovirus, rhesus macaque TRIMCyp
và GFP, vào dòng tế bào mầm mèo
nhà. Phương pháp thiết lập trao đổi
thông tin di truyền bởi biến đổi gen
giao tử trực tiếp lần đầu tiên trong bất

kỳ động vật ăn thịt. Chúng tôi sản
xuất các kết quả thống nhất chuyển
gen và quan sát biểu hiện phổ biến

rộng rãi, không có khảm, và truyền tải
dòng mầm mà không có F1 im lặng.
Tế bào Lympho mèo TRIMCyp
chuyển gen chống FIV nhân rộng.
Cách tiếp cận này mang lại một khả
năng đầu tiên để thử nghiệm thao tác
các yếu tố hạn chế vi rút AIDS tại các
hệ thống, mức độ chăn nuôi toàn bộ
trong một loài nhạy cảm. Ngoài việc
xác định nếu một loài có thể được
thực hiện miễn dịch di truyền virus
AIDS của nó, nó có thể được sử dụng
để kiểm tra HIV-1 gen tiềm năng điều
trị, và để xây dựng mô hình mèo có
liên quan đến các bệnh khác.
Felis catus đã được thuần
hóa trong hơn 9.000 năm và số lượng
0,5-1,0 tỷ trên toàn thế giới. Giám sát
y tế của động vật đồng hành phổ biến
nhất này là rộng lớn, và hơn 250 bệnh
lý di truyền phổ biến cho cả mèo và
con người đã được biết đến. Bộ gen
Felis catus gần đây đã được giải trình
tự và lắp ráp sắp xảy ra. Hơn 90% các
gen xác định con mèo có một
homolog, và so sánh với những con

chuột có ít sắp xếp lại bộ gen. Kích


2

thước trung bình, khả năng sinh sản
nhiều, giống với các hệ thống con
người, sự phong phú, chi phí khiêm
tốn và sự phức tạp của một hệ thần
kinh của thú ăn thịt làm cho con mèo
có giá trị trong các nghiên cứu thử
nghiệm khác nhau, từ sinh học thần
kinh di truyền, nhãn khoa và bệnh
truyền nhiễm khác nhau. Chúng bao
gồm các điều kiện mà trong đó những
con chuột là không hữu ích trên cơ sở
tính dễ mắc bệnh, kích thước cơ quan
hoặc các yếu tố khác. Các biến đổi di
truyền là như vậy, quan tâm cho cả
nghiên cứu sức khỏe con người và
con mèo và có tiềm năng để phát triển
bảo vệ khỏi tác nhân gây bệnh dịch để
giải phóng khác nhau, loài ngoại mèo,
tất cả trong đó 36 con phải đối mặt
với các mối đe dọa tuyệt chủng.
Trên thế giới có hai đại dịch
AIDS, một trong những con mèo nhà
và một đại dịch khác ở người. Các
vius mãn tính là nguyên nhân gây
bệnh, feline immuno- deficiency

virus (FIV) và HIV-1, được đánh giá
cao, chúng tương tự trong cấu trúc
gene, biểu hiện bệnh và tế bào chủ sử
dụng yếu tố phụ thuộc. Sự khác biệt
giữa các lentivirus cũng có nhiều
thông tin và có khả năng khai thác. Ví
dụ, các yếu tố hạn chế lentivirus cific
lentiviral như TRIM và APOBEC3
protein-s6 trình hạn chế FIV và HIV-

1 với mẫu khác biệt. Những gen này
chưa được nghiên cứu một cách có
kiểm soát ở cấp độ hệ thống và các
loài bằng cách giới thiệu vào hệ gen
của một loại virus AIDS dễ mắc các
loài (linh trưởng hoặc thú họ mèo trên
thế giới). Với những thách thức cố
hữu để biến đổi di truyền ở khỉ, virus–
sus- ceptible AIDS mèo sẽ được dùng
riêng cho những nghiên cứu như vậy
nếu nó có thể đưa vào bởi các phương
pháp di truyền được sử dụng ở chuột.
Ngược lại với các loài linh trưởng,
các loài mèo thiếu kháng virus
TRIM5α genes11 nhưng có potently
hạn chế proteins9,10 APOBEC3,
trong đó thiết lập khả năng hấp dẫn để
thử nghiệm gen như vậy ở cấp toàn bộ
động vật, cho trao miễn dịch gen dựa
trên bản thân họ hoặc thiết kế vari ants12, 13 và có khả năng để phát

triển mô hình bệnh.
Để nhận ra tiềm năng của
các loài virus học và mô hình không
virus học, một phương tiện để thực
hành sửa đổi hệ gen của con mèo là
cần thiết. Tế bào soma chuyển nhân
(SCNT) gần đây đã được sử dụng để
tạo ra những con mèo thể hiện
proteins14,15 huỳnh quang. Tuy
nhiên, hiệu quả của nhân bản vô tính
động vật là rất thấp, và kết quả SCNT
bị lỗi trong lập trình lại biểu sinh ở
hầu hết các phôi. Động vật có vú nhân


3

bản với tổng giải phẫu dường như
bình thường có thể có nhiều bất
thường do sự thất bại để xóa và lập
trình lại bộ nhớ biểu sinh hoàn toàn.
Hai phương pháp chính để
tạo ra những con chuột biến đổi gen là
tiêm DNA vào nhân non của phôi thụ
tinh và tiêm tế bào gốc phôi biến đổi
gen (ESC) dòng vào giai đoạn đầu của
phôi. Tuy nhiên, động vật có vú
nonrodent, tiêm vào nhân non là
không hiệu quả, và phương pháp thứ
hai là bị chặn bởi các thiếu ESC

germline có khả năng. Sự biến đổi di
truyền với germline trans - mision đã
đạt được trong một số động vật có vú
bởi vector lentivirus tiêm vào tế bào
trứng hoặc hợp tử đơn bào. Điều này

đã không đạt được ở bất kỳ loài động
vật ăn thịt. Dưới đây chúng tôi trình
bày noãn bào được nhắm mục tiêu
biến đổi di truyền lentivirus trong con
mèo nhà.
KẾT QUẢ
Đa biến đổi gen ở các thể
mèo khảm hệ phôi.
Chúng tôi tối ưu hóa chất
phản ứng, bộ sưu tập giao tử, vi tiêm
para- metter, nuôi cấy phôi và chuẩn
bị nhận để thiết lập mèo biến đổi
gene tối ưu (Fig. 1a). Chúng tôi thu
được từ giao tử cả hai giới mà không
cần thủ tục bổ sung bằng vi phẫu cơ
quan sinh dục động vật bị loại bỏ sau
khi phun hoặc thiến.

Hình 1 | chuyển gen thế hệ phôi mèo.


4

giao thức chuyển gene Tối ưu hóa. PMSG: mang thai hormon

kích thích sinh dục huyết thanh ngựa; HCG: hormon kích thích sinh dục
màng đệm ở người; IU, đơn vị quốc tế; IVM: làm chín invitro; IVC: nuôi
cấy invitro.
(b) Biểu hiện gen trong nuôi invitro phôi trong giai đoạn đầu phát
triển (blastocyst) sau khi tiêm pre – IVF lentiviral vector vào trong noãn bào
mèo. Chuyển gen GFP vào phôi mèo trong giai đoạn đầu phát triển từ noãn
bào trước khi thực hiện IVF với TsinG. Ảnh tiêu điểm của biến đổi gen
(TBDmGpT), phôi nang miễn dịch với virus thấy có gắn tín hiệu HA-tagged
rhTRIMCyp, GFP gene phát huỳnh quang của sứa, DAPI nhuộm thấy hình
ảnh DNA hạt nhân của hai gene được kết hợp.
(a)

(c)
(d)
(e) Trong

các thí nghiệm
tóm tắt trong bảng phụ 1, chúng ta
tiêm 195 lớp vitro-trưởng thành I và II
trứng mèo nhà để tiêm lentivirus
vector TSinG5 quanh bề mặt noãn
bào (PVSMI); chúng tôi thực hiện
tiêm 10-12 h trước hoặc 10-12 giờ sau
khi thụ tinh ống nghiệm (IVF) (Hình
1 bổ sung.). Sau đó chúng tôi nuôi
những phôi đó cho đến giai đoạn phôi
nang (ngày 7). So sánh tỷ lệ phát triển
của phôi (bảng phụ 1 và 2) và tăng
cường biểu hiện GFP (gọi là GFP
trong suốt) (Hình 1b) cho thấy tỷ lệ

chuyển gene thành công đều ở mức
cao (> 75%) và quá trình này được
dung nạp tốt, như sự phân chia và túi
phôi tỷ lệ hình thành không khác biệt
đáng kể giữa PVSMI và phôi chứng
(Bảng 1). Không có khác biệt về hình

thái hoặc tổng số tế bào và không có
ưu tiên cho tiêm vector thời gian
trước hoặc sau khi thụ tinh ống
nghiệm (Bảng 1). Tuy nhiên, khảm
ghi được bằng biểu hiện protein
huỳnh quang không đồng dạng trong
túi phôi là không đáng kể khi chúng
được tiêm vectơ trước khi thực hiện
IVF nhưng là đáng kể với tiêm sau
khi thụ tinh ống nghiệm(Bảng 1).
Để điều tra nhiều hơn
một gen chuyển có thể được thể hiện
trong phôi mèo trong một bước duy
nhất bởi PVSMI, chúng tôi vi tiêm
418 tế bào trứng với các vector
lentivirus đơn hoặc kép gen chuyển.
Tổ hợp gen chuyển là gen mã hóa
GFP, GFP cộng RFP, hoặc GFP cộng
rhesus macaque TRIMCyp (Hình 1.).
Sự kết hợp sau này đã được thể hiện
từ hoặc là một promoter kép hoặc là
(f)

5

một 2A đơn peptide liên kết
preprotein. Sau khi tiêm, chúng tôi
thực hiện tiêm với tinh trùng mèo 10
giờ sau đó. Chúng tôi luôn quan sát
phôi phổ biến, biểu hiện phong phú
của cả hai protein được mã hóa bởi
gen vectơ kép trong phôi nang mèo
khi tiêm vector lentivirus trước khi
thực hiện IVF (hình 1b Và Bảng 2).
Chúng tôi quan sát thấy không có tác
dụng có hại trước IVF trên phát triển
của phôi hoặc biểu hiện GFP không
phân biệt sự kết hợp gen chuyển
(Bảng 2). Ngoài ra, các peptide 2A
hoặc promoter kép là mỗi một cách
hiệu quả để biểu hiện đồng thời.

sáng-tối 14-10 h. Chúng tôi quản lý
để mèo mang thai dưới tác dụng
hormon kích thích sinh dục của huyết
thanh ngựa vào ngày 4 và hormon
kích thích sinh dục trên màng đệm
người vào ngày -1 với lentivirus
vector truyền vào, và giao phối phóng
thích chúng từ ngày tiêm hormon kích
thích sinh dục người vào cho đến
ngày trước khi chuyển phôi và thắt

một ống dẫn tinh đối với mèo đực,
xác nhận không còn tinh trùng mèo
đực để gây rụng trứng và hình thành
thể vàng vì trong khi phẫu thuật sẽ bị
thủng nang với một cây kim, nếu
không phải tự nhiên rụng trứng.

Yếu tố hạn chế mèo
biến đổi gen và thế hệ GFP.

Hai mươi hai phôi
chuyển giao có kết quả trong năm
mang thai (có nhãn A-E), năm sinh và
ba chú mèo con sống (Bảng 1). Chúng
tôi đã đạt được một tỷ lệ cao của biến
đổi gen, với 10 trong số 11 con được
sinh ra kiểm tra thấy đã được biến đổi
gen (1/12, một cách tự nhiên bị sẩy
thai 10 ngày non, đã được tiêu thụ bởi
con mẹ thay thế và không thể được
kiểm tra). Ba con đực và hai con mèo
biến đổi gen cái, tên là TgCat1-5,
được sinh tự nhiên và tất cả năm đã
biến đổi gen (Hình. 2, bảng 1 và bổ
sung hình. 2). TgCat1 (đực), TgCat2
(đực) và TgCat3 (cái) sống sót, trong
khi những con mèo thứ tư và thứ năm
chết (Bảng 1). TgCats1-3 là mạnh mẽ

(g)

(h) Quá

trình từ bộ sưu tập
trứng chuyển vào ống dẫn trứng mất
3-4 ngày (Hình 1a.). Chúng tôi lựa
chọn ngẫu nhiên phôi cho cắm sâu
vào từ tế bào trứng phân cắt mà đã
phải chịu tác động của IVF và
chuyển chúng vào ống dẫn trứng bằng
phẫu thuật tiếp xúc lúc 48-72 h sau
lentivirus vector dẫn truyền. Chúng
tôi thực hiện không có sự chọn lọc
trước cho biểu hiện gen sau khi tiêm
(phôi được chọn không có bất kì
huỳnh quang đáng tin cậy vào thời
điểm chuyển giao). Chúng tôi thực
hiện chuẩn bị đồng bộ hormon chuyển
vào mèo bởi một môi trường ánh

(i)


6

từ khi sinh ra, cho ăn, chơi, phát triển
và xã hội hóa bình thường và khỏe
mạnh, con TgCat2 bị ẩn tinh hoàn. Nó
cũng có viêm da ngứa không liên tục,
mà có thể là do dị ứng thực phẩm.

Trong năm đầu tiên phát triển nó đã
được thoát vị bụng và kích thích đưa

tinh hoàn xuống, nó đã được chữa
khỏi bằng phẫu thuật. Mặc dù chúng
ta không thể loại trừ vector chèn gen
độc tính trong TgCat2 nhưng các
điều kiện này không phải là một hội
chứng dễ nhận biết.
(j)

(k)

(l)
Mười lăm đến hai mươi lăm phôi, mỗi một sản phẩm của một tế
bào trứng đã được tiêm vào, đã được chuyển giao cho mỗi ống dẫn trứng để tổng
cộng 30-50 mỗi chuyển giao; 22 chuyển gen như vậy dẫn đến mang thai (A-E).
Lứa tuổi đều tính đến tháng Bảy năm 2011. Trong tổng số của vector TSinT2AG
trên. TgCat5 đã chết lưu sau khi nhau bong non xảy ra, mặc dù nó đã được phát
triển đầy đủ và kiểm tra siêu âm ngày trước khi sinh cho thấy một nhịp tim bình
thường; TgPre7 là không khả thi khi chẩn đoán bằng siêu âm và đã bị phá khoảng
ngày 50 của thai kỳ. Trong tổng số của vector Tsing trên. Ngày 45 chụp X quang
trong thai kỳ C cho thấy năm bào thai. Họ sinh ra sớm khoảng 10 ngày, trên 51-53
ngày của thai kỳ, với hình thái và kích thước thích hợp cho giai đoạn cuối này.
(m)


7

TgPre5 được tiêu thụ bởi người mẹ thay thế và không thể phân tích được. Fan kém

phát triển, thai nhi không chuyển gen giao 6 h sau TgCat3. Không mang thai là kết
quả của hai chuyển phôi vector tải nạp TBDmGpR.
(n)
(o) Souther

blot trên DNA sau khi được cắt bởi enzyme cắt giới hạn từ ba
chú mèo con biến đổi gen sống, từ TgCat4 và từ bốn bào thai bị sẩy thai cho thấy
rằng tất cả tám là biến đổi gen, với 6-12 chèn mỗi con mèo (Fig. 2b). Xét nghiệm
PCR trên bộ gen DNA xác nhận mức độ cao của sự chuyển đổi gen (Hình. 2c).
Băng lai Southern blot là cụ thể, như tất cả là không có sự kiểm soát mèo DNA,
khác nhau từ mèo để mèo lớn hơn so với kích thước tối thiểu dự đoán xác định
bằng khoảng cách từ vị trí hạn chế kết thúc của vector tiền virus, lập bản đồ hệ gen
của con mèo (Bảng phụ 3).
(p)
(q)

(r)

Hình 2 |mèo con mang gen chuyển.

(A) ánh sáng huỳnh quang bao quanh và 485 hình ảnh nM ánh sáng
chiếu sáng cho tín hiệu GFP vào các thời điểm chỉ sau khi sinh cho TgCat3. Trong
30 ngày và 5 tháng hình ảnh đã được chụp ảnh TgCat3với một con mèo đối chứng
không chuyển gen (bên phải). Lông, móng vuốt, râu ria, mũi, lưỡi và niêm mạc
miệng họng huỳnh quang là hiển nhiên; huỳnh quang không rõ ở vùng lông đen.
(s)


8

(B) hiển thị kết Southern blot của DNA từ TgCat1, TgCat2 và
TgCat3. khoảng cách từ ngã ba DNA vật chủ vectơ để gen AflIII gần nhất hoặc vị
trí BamH1trong cặp cơ sở; P, promoter; LTR, lặp lại đoạn cuối dài; G, EGFP
(mẫu dò); T, TRIMCyp. DNA ở đoạn cuối đã được phân giải với AflIII (blot trái).
ADN hệ gen từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi đã được phâng giải với BamH1 (blot
phải). Sau khi điện di và chuyển sang Southern blot, màng được khảo sát cho tổng
hợp DNA vector như được chỉ ra. (C) bản sao DNAđược khuếch đại PCR bán
định lượng của mèo con, DNA sử dụng mồi cho chuỗi rhTRIMCyp.
(t)

(u) DNA

trong mỗi tế bào lưỡng bội và bình thường hóa với tín hiệu thu
được với mồi GAPDH.
(v)


9

(w)


10

(x)

(y)
(z)
(aa)
(ab)

Hình 3 | điểm yếu miễn dịch và thách thức FIV của tế bào máu đơn
nhân (PBMCs) chuyển gen. (a) băng điện di cho GFP chóp HA rhTRIMCyp
trong PBMCs phân lập từ mèo biến đổi gen và kiểm soát. Tất cả PBMC được kích
hoạt ), trừ các mẫu TgCat1 nhãn “không làm phóng xạ”. (b) Dòng chảy đếm tế
bào phân tích của GFP biểu hiện trong PBMCs tỷ lệ tế bào đó là GFP dương
(ac)


11

được chỉ định. (c) biểu hiện GFP trong PBMCs so với mèo ở những tháng tuổi
khác nhau (trái) và biểu hiện GFP trong PBMCs từ một thời điểm duy nhất, như
là một chức năng của các ngày trong nuôi ex vivo; lấy mẫu ở đây là lúc 3-4 tháng
tuổi (mũi tên). (d) PBMCs từ mèo bị nhiễm 105 Crandell (CrFK) tế bào thận mèo
đơn vị tế bào gây lây nhiễm của FIV vào ngày 0, rửa sạch vào ngày 1 và sau đó
theo sau lấy mẫu cho hoạt động sao chép ngược bề mặt xác định sau 48 h như
hình vẽ. RT, sao chép ngược; SSC, phía phân tán.
(ad)
(ae)

.

Biểu hiện kiểu gen
và kiểu hình của gen chuyển
(af)

TgCat3, trong đó
gen chuyển biểu hiện được thúc đẩy
bởi các tiêu chuẩn (0,52-kilobase)
virus gây nhiễm trùng cơ hội ở bệnh

nhân HIV nhanh chóng tiến triển
thành AIDS và tử vong ở con người
(HCMV) promoter của vector
TSinT2AG, đã sáng huỳnh quang và
ổn định màu xanh lá cây trong lớp da
của động vật và bề mặt niêm mạc hầu
họng (Hình 2a.). Nhưng biểu mô bề
mặt ít tươi sáng cho TgCat1 và
TgCat2 (vector TBDmGpT). Đối với
những chú mèo con sống, chúng tôi
thu thập các tế bào cho phân tích
protein bởi sự cạo niêm mạc miệng
(trong đó cho thấy GFP-thể hiện các
tế bào biểu mô vảy), máu và tinh dịch.
Cả hai gen được thể hiện trong hoạt
động bên ngài tế bào đơn nhân máu
(PBMCs) nhưng với sự thay đổi đáng
(ag)

chú ý (Hình. 3a, b). Tỷ lệ phần trăm
của các tế bào GFP dương như được
xác định bởi FACS là 15-80% trong
TgCat1, TgCat2 và TgCat3 và tăng
dần như mèo con trong độ tuổi (Hình
3b., C). TgCat2 có các tế bào tích cực
GFP nhất trong PBMC chia thành
nhiều ngăn, được khoảng 65% GFP
tích cực sớm trong cuộc sống và sau
đó là 70-75% sau (Hình. 3a-c và bổ
sung hình. 3). Một số khía cạnh cụ thể

ở đây là thú vị để phát triển mô hình
mà sẽ phụ thuộc vào tế bào lympho
hoặc biểu hiện dòng tế bào mono. Thứ
nhất, không phân biệt promoter được
sử dụng, FACS và phát hiện
immunoblot của GFP và rhTRIMCyp
trong PBMCs ở mèo sống kích hoạt
theo yêu cầu của phytohemagglutin-E
(PHA-E) và interleukin 2 (IL-2), và
biểu hiện GFP tăng dần theo thời gian
nuôi cấy ( Hình. 3c). Cường độ huỳnh
quang đã biến đổi (Hình 3b 3a và bổ
sung hình..). Thứ hai, biểu hiện GFP
từ một CMV tối thiểu (mCMV) yếu tố
promoter tiếp giáp với promoter PGK


12

có hiệu quả trong TgCat2, nhưng
chúng tôi chỉ quan sát được biểu hiện
GFP thấp với các vector cùng trong
TgCat1, mặc dù ngay cả trong biểu
hiện GFP mèo này tăng đều đặn từ
tích cực hiếm hoi đến 14,8% của 20
tháng (Fig. 3b, c). Thứ ba, tất cả ba
con mèo bày tỏ hemagglutinin epitope
(HA) mỏm gen rhTRIMCyp trong
mèo chuyển gen PBMC số lượng lớn
như phát hiện bởi điểm yếu miễn dịch

(Fig. 3a). TgCat1 luôn hiển thị nhiều
rhTRIMCyp hơn hai con mèo sống
khác bằng cách phân tích dấu vết định
lượng bằng Souther blot. Tuy nhiên,
(ah)

loại protein này là rất khó khăn để
phát hiện GFP, và đã hình dung rõ
ràng bằng miễn dịch huỳnh quang,
bằng cách sử dụng một kháng thể để
các tag HA, chỉ một phần nhỏ của tế
bào (Hình bổ sung. 3). Mặc dù vậy,
rhTRIMCyp của PBMCs mèo biến
đổi gen hiển thị kháng FIV nhân rộng,
với cuộc kháng chiến vĩ đại nhất để
nhân rộng nhìn thấy trong các tế bào
từ những con mèo mà bày tỏ nhất
rhTRIMCyp (TgCat1;. Hình 3d). Các
kháng FIV nhân rộng là một phần,
như dự đoán cho quần thể tế bào thể
hiện như một phầnyếu tố hạn chế này.


13

(ai)
(aj) Hình

4 | truyền dòng mầm và biểu hiện trong đời con F1. Tinh trùng
từ hai con đực (20 tháng) và điều khiển một mèo không chuyển gen mèo đã được

lọc, ăn viên, rửa sạch và sau đó tinh chế bằng các kỹ thuật swim - up. Tinh trùng
DNA đã phải chịu thời gian thực PCR định lượng với mồi khuyếch đại trình tự
GFP. Hình ảnh cho thấy bốn F1 thế hệ con cháu của một giao phối của TgCat1 và
TgCat3, chụp ảnh cho biểu hiện GFP; lông đen như vậy l àm d ừng biểu hiện
huỳnh quang của gen GFP mà trong con mèo đen chỉ móng vuốt đã thấy rõ huỳnh
quang màu xanh lá cây (ở giữa, bên phải).
(ak)
(al) Khả

năng sinh sản,
truyền tải dòng mầm và biểu hiện gen
chuyển F1
Rửa swim-up tinh
trùng tinh khiết từ hai con đực có khả
năng vận động bình thường và mạnh
mẽ thể hiện gen chuyển được xác định
bằng phương pháp PCR (Fig. 4). Phù
hợp với kết quả này và với sự thiếu
phôi khảm khi IVF được thực hiện
sau khi tiêm vector (Bảng phụ 1)
truyền dòng mầm đã được dễ dàng đạt
được bằng cách giao phối trực tiếp,
với tất cả các thế hệ con cháu được
chuyển gen. Do đó, quy trình chuyển
gen đảm bảo khả năng sinh sản, và
các dòng mầm được biến đổi. Biểu
(am)

hiện gen chuyển tồn tại ở con F1 của
cha mẹ F0 chuyển gen, chỉ ra rằng sự

im lặng đã không xảy ra (Hình. 4).
Giao phối của TgCat1 với ba con mèo
cái không chuyển gen sản xuất năm
mèo con bổ sung từ ba thai. Tương tự
như các bố, nó có ít bề mặt xanh
huỳnh quang nhưng đã mạnh mẽ
'PCR- và Southern blot dương' (dữ
liệu không hiển thị); những con chết
quanh kỳ sinh do chứng khó sinh với
một tử cung co bên dưới lại. Như vậy,
tất cả những con mèo F1 là biến đổi
gen; 8 trong số 9 vẫn còn sống và
khỏe mạnh.
(an)


14
(ao)

(ap)


15

(aq)

(ar)


16

(as)


17

(at)
(au)
(av)

(aw)

Hình 5 | Tổng số các phân tích cơ thể của TgCat4 và cuối thai
giai đoạn phát triển. (A)điểm yếu miễn dịch trên lysates từ các cơ quan chỉ định
từ không chuyển gen kiểm soát mèo (làn đường 1); phôi thai non (băng 2-5 và
TgCat4 (băng 6) băng không thu được của những màng này có sẵn trong bổ sung
hình 4.
(ax)

Đây là mức tối thiểu (<1 s) phơi màng của immunoblots;băng
trắng trung tâm trong các băng GFP là một kết quả của biểu hiện GFP nặng gây
cạn kiệt chất phát quang trên bề mặt của protein do gen tạo ra (B) Souther blot
cho tích hợp DNA vector. DNA từ mô tim đã được tiêu hóa để hoàn thành với NdeI
và 5 mg được nạp trên một giếng. Băng cho vector tích hợp nguyên vẹn được dự
đoán sẽ được ≥ 1,6 kb. Dòng tế bào Feline T (FetJ) (điều khiển bên trái); Kiểm
(ay)


18

soát con mèo; TgPre1-4 từ khi mang thai C; và TgCat4 được hiển thị. (C) Cơ tim
từ một con mèo kiểm soát, TgPre1 và TgCat4 đã phải chịu sự miễn dịch huỳnh
quang gián tiếp với một kháng thể đơn dòng để GFP. (D) GFP chụp ảnh trực tiếp
trong phần mỏng tươi của TgPre1 cơ tim bằng kính hiển vi huỳnh quang. (E)
FACS phân tích PBMCs của thai nhi. Thanh quy mô, 100 mm (thanh màu đen) và
20 mM (thanh màu trắng).
(az)


Toàn bộ cơ thể
phân tích cho thấy biểu hiện gen trên
diện rộng
(ba)

TgCat4 được sinh
ra sau khi một mang thai đơn giản tại
một thời điểm mang thai bình thường
(65 d). Đó là hình thái bình thường
nhưng đã chết trong hoặc ngay sau khi
đẻ từ một tai nạn sản khoa liên quan
đến nguyện vọng rõ ràng, mặc dù
nguyên nhân chính xác không thể
được xác định tại khám nghiệm tử thi.
Con mèo này cung cấp cơ hội để
nghiên cứu tất cả các mô (Fig. 5a).
Kiểm tra cơ quan chi tiết và mô học
không xác định bất thường. TgCat4 là
sản phẩm của một noãn bào tải nạp
bởi các vector TsinG, trong đó GFP
đã được thúc đẩy bởi các promoter

HCMV, và đã chèn 10 vector (Fig. 5).
Như đã TgCat3, con mèo là huỳnh
quang màu xanh lá cây rực rỡ trong
bộ lông và da, và immunoblotting tiết
lộ biểu hiện phong phú GFP trong tất
cả các mô thử nghiệm: não, tủy sống,
tim, lá lách, da, cơ, gan, thận, ruột non
và dạ dày (Fig. 5a và bổ sung hình. 4).
Nội tạng rõ ràng huỳnh quang màu
xanh lá cây ở cấp tổng, cũng như các
mô mỡ (ví dụ, tất cả các chất béo
thuộc màng nối và màng ngoài tim) và
ghi nhãn kháng thể của mô cố định
khi thấy biểu hiện thống nhất trong tất
cả các tế bào (Hình. 5c). Khi mô sống
được khúc và chụp ảnh trực tiếp cho
GFP bằng kính hiển vi huỳnh quang
(bb)

biểu hiện phổ biến là tương tự như
vậy (Hình 5d.).
Một thai kỳ thứ tư
(C; Bảng 1), mà chúng xác định năm
cũng được hình thành, phù hợp với
kích thước bộ xương của thai nhi bằng
cách phân tích X quang tại ngày 45
của thai kỳ (bổ sung hình 2d.), Kết
thúc bị sẩy thai nối tiếp giữa ngày 51
và 53 (~ 10 d trước hạn). Chúng tôi
phục hồi bốn trong số những con mèo

non (tên TgPre1-4; Bảng 1) cho gộp
và phân tử khám nghiệm tử thi. Giải
phẫu đã không xác định khuyết tật
bẩm sinh. Đối với TgCat1-4, Souther
blot cho thấy TgPre1-4 đã được
chuyển gen đầy đủ, với 10-13 gen
chèn vector TsinG (Fig. 5b) và biểu
hiện GFP được tương tự được tìm
thấy trong tất cả các mô thử nghiệm
(Hình. 5a, c). Chúng tôi cũng thăm dò
biểu hiện rhTRIMCyp (Hình 5 bổ
sung.) Sử dụng nội tạng từ một con
mèo đã chết yểu sau một đứt nhau thai
(Bảng 1; TgCat5), và quan sát thấy
rằng biểu hiện rhTRIMCyp là phổ
biến tương tự, bao gồm cả trong các
cơ quan lymphoid chính (hạch bạch
huyết, tuyến ức và lá lách). Phù hợp
với các dữ liệu immunoblotting, các
mô của cơ quan cá nhân là huỳnh
quang màu xanh lá cây ở cấp tổng.
FACS của PBMCs thai nhi từ TgPre14 cho thấy 74-100% là GFP dương
(Hình. 5e). Souther blots của DNA từ
các sản phẩm của thai kì không đơn
(bc)


độc một mìn mà có tạp nhiễm (hình
2b. Và 5b), cũng cho thấy mỗi sản
phẩm là độc đáo về mặt di truyền của

một noãn bào tải nạp khác nhau, và
không tạo một sản phẩm của song tính
sau khi dẫn truyền.
(bd)

Thảo luận

Kết quả của chúng
tôi chỉ ra rằng những con mèo biến
đổi gen có thể được sử dụng như là
vật thí nghiệm cho nghiên cứu y sinh
học. Cách tiếp cận này cho phép thực
hiện chuyển đổi gen bởi biến đổi gen
tế bào mầm cho lần đầu tiên trong loài
này và trong bất kỳ động vật ăn thịt.
Đáng chú ý, chúng ta đã đạt được
những kết quả thống nhất chuyển gen,
trong đó giảm chi phí sàng lọc và thời
gian. Một ý nghĩa thứ hai của hiệu quả
cao và số bản sao đạt được là nó nên
có thể để chuẩn độ vector liều xuống
hoặc để tiêm vào tế bào một kết hợp
của vectơ vào một tế bào trứng để sản
xuất phức tạp đa chuyển gien. Cách
tiếp cận này có thể mở đường: tế bào
trứng mèo có thẩm quyền cho chuyển
gen hiệu quả, thì dễ dàng thu được
không xâm lấn và không làm quá trình
gia súc gia tăng từ buồng trứng bị loại
bỏ trong quá trình phun định kỳ (nội

soi hoặc thu hồi trứng qua da siêu âm
dẫn đường cũng là khả thi). Trong túi
phôi trong ống nghiệm tốc độ phát
triển cao hơn đã được nhìn thấy trước
đây với phôi chuyển gen tế bào soma
(be)

chuyển nhân (SCNT) phát triển (1920% so với 3%) 14. Chúng ngăn cản
khảm bằng vi tiêm trước khi thụ tinh
ống nghiệm và quan sát truyền dòng
mầm. Sự tồn tại của các biểu hiện gen
chuyển ở mèo F1 đang khuyến khích
cho việc thiết lập đường dây hữu ích
biến đổi gen. Việc thiếu các chủng đa
dạng bẩm sinh của con mèo, một hạn
chế hiện nay, có thể được giải quyết
trong một dự án chăn nuôi tập trung.
Giới thiệu một yếu
tố hạn chế lentivirus (s) vào hệ gen
của con mèo có tiềm năng cụ thể bởi
vì loài này là tự nhiên dễ bị nhiễm
trùng lentivirus (và AIDS) trong khi
những con chuột, chưa sửa đổi hoặc
biến đổi gen, không bị nhiễm với
virus này. Một số câu hỏi có thể do đó
được giải quyết. Đầu tiên, nó không
biết liệu giới thiệu một yếu tố hạn chế
hoạt động duy nhất vào hệ gen của
một loài vi rút AIDS nhạy cảm có thể
bảo vệ nó, và nếu như vậy, mà ở đó

trong ba mức độ rộng rãi xem xét việc
đến khía cạnh: truyền, thành lập các
virus trong máu được duy trì và phát
triển bệnh. Khi gen vi-rút đang bị
thẩm vấn ở cấp toàn bộ động vật
chuyển gen trong một vật chủ tự
nhiên, kết quả có thể tạo ra ngạc nhiên
và cung cấp một số thông tin. Ví dụ,
một sự can thiệp chuyển gen gần đây
chống lại cúm ở gà ngăn ngừa lây
truyền vi rút thứ cấp để liên lạc
chuyển gen và không chuyển, nhưng
(bf)


nó không có tác dụng trên tử vong sau
khi kiểm tra khả năng mẫn cảm với
virus. Bởi vì các yếu tố hạn chế
lentivirus loài cụ thể chưa được kiểm
tra bằng cách giới thiệu thử nghiệm
kiểm soát thành một con vật, những
câu hỏi cơ bản nhất trực tiếp với cách
tiếp cận này là cho dù yếu tố hạn chế
chuyển gen là bắt chước các thí
nghiệm tự nhiên mà thường diễn ra
trong rộng lớn mà thời gian tiến hóa,
với lựa chọn bởi loại thải siêu vi, và
đưa ra một loài miễn dịch di truyền để
lentivirus riêng của mình. Nó không
phải là có thể đưa ra dự đoán rõ ràng.

Ví dụ, có khỉ tự nhiên và khỉ mặt
TRIM5 mà không chặn khỉ truyền
virus suy giảm miễn dịch đối với động
vật họ này, nhưng xuất hiện để hạn
chế mức độ nhân rộng trong cơ thể và
gây áp lực lựa chọn trên vỏ capsid.
Khi lai mở rộng được hoàn thành với
yếu tố hạn chế mèo biến đổi gen,
những thách thức FIV có thể được
thực hiện.
Dù có hay không
nhiều hơn một yếu tố hạn chế sẽ là
cần thiết để đạt được bảo vệ chống vi
rút, các khái niệm của việc sử dụng
chúng cho mục đích này trong liệu
pháp gen đã kích thích nỗ lực để đưa
ra không thích miễn dịch của con
người và mèo. Cả hai TRIMCyps gần
đây các kĩ sư công nghệ sinh học hạn
chế FIV và có thể được kiểm tra
trong hệ thống của chúng tôi. Thật
(bg)

vậy, FIV là duy nhất trong số các
lentivirus ở bị hạn chế bởi cả
TRIMCyps khỉ già và trẻ của thế giới.
Chúng tôi cho rằng mèo chuyển gen
với các phân tử bảo vệ vật chủ cũng
có thể trao bảo vệ từ virus gây bệnh
cho loài mèo hoang dã, tất cả đều phải

đối mặt với các mối đe dọa tuyệt
chủng nhanh chóng và đó là một trong
những đơn vị phân loại hệ sinh thái
mang tính biểu tượng có sức lôi cuốn
nhất trong động vật ăn thịt.
Mèo chuyển gen
có thể có tác động bổ sung. Như
chúng ta đã đề xuất gần đây, mèo nhà
có thể có tiềm năng cho mô hình HIV1 bệnh vì, ngoại trừ cho các thụ thể
nhập bào của virus, bộ gen con mèo
có thể cung cấp các yếu tố phụ thuộc
cần thiết cho HIV-1 nhân rộng. Đây là
một sự khác biệt cơ bản so với các
con chuột. Gen dễ tháo lắp và nhắm
mục tiêu là có thể dự đoán bằng cách
kết hợp phương pháp tiếp cận của
chúng tôi với các công nghệ hiện nay.
Hơn nữa, trong tiếp cận chuyển gen
này, các loài phong phú với kích
thước trung gian và các tế bào có liên
quan đến hệ thần kinh phức tạp sẽ cho
phép các vật mẫu khác có liên quan
trong các lĩnh vực như sinh học thần
kinh, nơi mà con mèo đã là một mô
hình tối quan trọng. Các nghiên cứu
trong con mèo đã tiết lộ nhiều kiến
thức hiện nay về tổ chức của bộ não
động vật có vú, đặc biệt là vỏ não thị
(bh)

giác; làm việc trong lĩnh vực này đã
được quan trọng để làm sáng tỏ các cơ
chế thần kinh thị giác. Mặc dù chuyển
gen ở các loài này sẽ không được phổ
biến như ở loài gặm nhấm, việc tạo ra
một số lượng nhỏ các đường với công
cụ di truyền có thể xây dựng trên cơ
sở tri thức lớn trong loài để làm thay
đổi đáng kể khả năng cho sự hiểu biết
của vỏ não
(bi) Những

con chuột biến
đổi gen có nhiều lợi thế, nhưng sự
khác biệt cơ bản với sinh lý con người
hạn chế sử dụng chúng trong nhiều
cách. Nhiều căn bệnh không thể được
mô hình hóa ở chuột. Transgenesis đã
được thực hiện trong marmosets28, và
cho đến nay không có chứng minh
nào về truyền dòng mầm, trong
macaques29. Hai mô hình động vật
linh trưởng tương đối rõ ràng, nhưng
hạn chế phát sinh do sự khan hiếm,
chi phí, thời gian mang thai dài hơn
của khỉ, thời gian kéo dài đến tuổi
trưởng thành (4-8 năm) và các yêu cầu
để bảo vệ xử lý từ việc truyền
cercopithecine herpesvirus 1. Đối với

các mục đích của việc AIDS có liên
quan, New World khỉ như loài khỉ
đuôi sóc không nhạy cảm với bất kỳ
lentivirus.
(bj)Ngay

cả với một
promoter virus generic chúng tôi cũng
đã quan sát biểu hiện gen chuyển ở 16
trong số 16 bộ phận cơ thể con mèo

thử nghiệm. Chúng tôi quan sát thấy
biểu hiện rhTRIMCyp trong các mô
bạch huyết AIDS có liên quan chính
(hạch bạch huyết, lá lách và tuyến ức).
Mature lưu thông dòng máu đã nổi
tiếng là chuyên môi trường phiên mã,
nhưng 15-80% của PBMCs trong
những con mèo sống là GFP-dương
trong nuôi cấy. Biến thể phản ánh hiệu
ứng định vị gen. Trong khi đó, mô-cụ
thể hoặc promoter hoặc tăng cường
các yếu tố khác có thể được sử dụng,
mèo với một phần biểu hiện PBMC
cũng cung cấp một cơ hội thử nghiệm
tốt, vì họ cho phép các câu hỏi về lựa
chọn dòng tế bào vi rút qua trung gian
trong vivo30 được giải quyết, một mô
hình dựa trên tế bào thực tế tình hình
điều trị, ví dụ, liệu pháp gen HIV-1

bệnh. Một vấn đề quan trọng là liệu có
phải nhiễm FIV sẽ dẫn đến sự lựa
chọn lâu dài của 1 chủng tế bào
lympho của virus-refrac- tory như đã
được quan sát thấy trong sự thiếu thốn
nonobese gây tiểu đường nặng kết hợp
miễn dịch với (NOD-SCID) IL2Rγ ở
chuột vô cấy với CCR5 - / - CD34
trong cells30. Ngược lại, nếu hệ thống
virus nhân lên, chúng ta có thể xác
định đột biến có phát sinh hay không?
(bk)
(bl) Các

Phương pháp

phương pháp và bất
kỳ tài liệu tham khảo liên quan có sẵn
trong các phiên bản trực tuyến của bài
báo này ở


/>/.
Lưu ý: thông tin bổ
sung có sẵn trên trang web của Nature
Methods.
(bm)

(bn)

Lời cảm ơn

Tài trợ từ Viện
Quốc gia Hoa Kỳ Y tế cấp AI47536
và EY14411 hỗ trợ trước khi phát
triển công nghệ then chốt. Chúng tôi
cảm ơn các Helen C. Levitt
Foundation tài trợ thí điểm ban đầu và
A. Keller phối hợp đó, các thành viên
của phòng thí nghiệm của chúng tôi
cho các cuộc thảo luận và trợ giúp
hữu ích, H. Fadel cho việc hỗ trợ với
trang web hướng đột biến, các thành
viên của loài chuột biến đổi gen của
chúng tôi để chia sẻ vi tiêm thiết bị,
G. Towers (University College
London) cho một rhTRIMCyp cDNA,
và Mayo Clinic cán bộ thú y để được
tư vấn và hỗ trợ phẫu thuật.
(bo)

(bp)

Tác giả đóng góp

Tất cả tác giả thiết
kế thí nghiệm, phân tích dữ liệu và
phê bình các bản thảo. E.P. hình thành
dự án và tuyển dụng P.W. và T.O.
E.P. và T.O. giám sát dự án. P.W. và

D.S. sản xuất vector và giao tử lấy;
P.W. microinjected vector và các kỹ
thuật nuôi cấy làm phôi. P.W. phôi
chuyển với sự hỗ trợ từ T.R. và E.P.
bằng phẫu thuật. P.W., D.S và T.R.
(bq)

mèo theo dõi, đã làm xét nghiệm tế
bào và mô và virus. P.W., D.S. và E.P.
đã viết bản thảo.
(br)

Lợi ích cạnh tranh

tài chính
Các tác giả tuyên
bố không có lợi ích tài chính cạnh
tranh.
(bs)

(bt)

Được đăng trực

tuyến tại
/>/.
in lại và cho phép
các thông tin có sẵn trực tuyến tại
http: //www.nature. com / in lại /
index.html.

(bu)

1. MenottiRaymond, M. & O'Brien, S.J. Mèo
nhà, Felis catus, như là một mô hình
của bệnh di truyền và nhiễm trùng.
Thông tin về các mô hình trong
Nghiên cứu Y sinh (ed., Conn, PM)
221-232 (Humana Press, 2008).
(bv)

2. O'Brien, S.J. et
al. Nghiên cứu về genomics mèo. Xu
hướng Genet. 24, 268-279 (2008).
(bw)

3. Meli, M.L. et
al. Virus bệnh bạch cầu mèo và các
mầm bệnh khác như các mối đe dọa
quan trọng đối với sự tồn tại của linh
miêu Iberian cực kỳ nguy cấp (Lynx
pardinus). PLoS ONE 4, e4744
(2009).
(bx)


4. Willett, B.J. et
al. Sử dụng chung của các thụ thể
chemokine CXCR4 của mèo và virus
suy giảm miễn dịch của con người. J.
Virol. 71, 6407-6415 (1997).

(by)

5. Llano, M. et
al. Một vai trò thiết yếu cho LEDGF /
p75 trong hội nhập HIV.
(bz)

(ca)

Khoa học 314,

10. Stern , M.A. et
al . Nhân rộng sản xuất Vif - khảm
HIV - 1 trong tế bào mèo. J. Virol . 84
, 7378-7395 (2010 ) .
(cg)

11. McEwan ,
W.A. et al . TRIM5 trong phân bộ
dạng Mèo giải thích sự vắng mặt của
virus giới hạn trong các tế bào của con
mèo nhà. J. Virol . 16 ,
(ch)

461-464 (2006).

(ci) 8270-8275

6. Huthoff, H. &
Towers, G.J. Hạn chế sự sao chép

virus bởi

(cj) 12.

(cb)

APOBEC3G / F và
TRIM5alpha. Xu hướng Microbiol.
16, 612-619 (2008).
(cc)

7. Saenz, DT,
Teo, W., Olsen, JC & Poeschla, E.
Hạn chế vi rút suy giảm miễn dịch ở
mèo bởi Ref1, LV1 và protein
TRIM5a linh trưởng. J. Virol. 79,
15.175-15.188 (2005).
(cd)

8. Wilson, S.J. et
al. Tiến hóa độc lập của một
TRIMCyp kháng virus ở khỉ nâu.
Proc. Natl. Acad. Khoa học viễn
tưởng. USA 105, 3557-3562 (2008).
(ce)

(cf) 9.

Munk , C. et al .
Chức năng, cấu trúc , và cách đọc

thông qua nối thay thế của gen
APOBEC3 trên mèo . Genome Biol .
9 , R48 (2008 ) .

(2009 ) .

Dietrich, I. et al.
Potent hạn chế lentivirus bởi một
giống mèo TRIM5, tổng hợp
cyclophilin A phản ứng tổng hợp. J.
Virol. 84, 8980-8985 (2010).
13. Neagu, M.R.
et al. Ức chế mạnh HIV-1 bởi
TRIM5-cyclophilin, protein phản ứng
tổng hợp từ các thành phần của con
người. J. Clin. Đầu tư. 119,
(ck)

(cl) 3035-3047

(2009).

14. Yin, X.J. et al.
Thế hệ của những con mèo biến đổi
gen nhân bản biểu hiện protein huỳnh
quang màu đỏ. Biol. Reprod. 78, 425431 (2008).
(cm)

15. Gomez, M.C.
et al. Thế hệ của mèo con chuyển gen

nhân bản sử dụng các vector
lentivirus. Nhân bản tế bào gốc 11,
167-176 (2009).
(cn)


16. Meissner, A.
& Jaenisch, R. chuyển nhân động vật
có vú. Dev. Dyn. 235,
(co)

(cp)

2460-2469 (2006).

17. Yamanaka, S.
& Blau, H.M. Tái tạo nhân bằng ba
phương pháp tiếp cận. Nature 465,
704-712 (2010).
(cq)

(cr)18.

Pfeifer, A. lentivirus
transgenesis-một công cụ đa năng cho
nghiên cứu cơ bản và liệu pháp gen.
Curr. Gene Ther. 6, 535-542 (2006).
19. Richardson,
M.W. et al. Phương thức lây truyền
ảnh hưởng đến sự suy giảm miễn dịch

virus loại 1ở người hạn chế bởi
TRIM5alpha rhesus. J. Virol. 82,
11.117-11.128 (2008).
(cs)

(ct) 20.

Lyall, J. et al. Ngăn
chặn lây cúm gia cầm ở gà biến đổi
gen. Khoa học 331, 223-226 (2011).
21. Lim, S.Y. et
al. TRIM5alpha điều khiển virus suy
giảm miễn dịch ở khỉ Rhesus. PLoS
Pathog. 6, e1000738 (2010).
(cu)

22. Bieniasz, P.D.
& Cullen, B.R. Nhiều tác nhân để suy
giảm miễn dịch của con người từ virus
loại 1 trong các tế bào động vật gặm
nhấm. J. Virol. 74, 9868-9877 (2000).
(cv)

23. Hubel, D.H. &
Wiesel, T.N. Các lĩnh vực về kiến trúc
(cw)

chức năng vỏ não thị giác của con
mèo. J. Physiol. (Lond.) 160, 106-154
(1962).

24. Hubel, D.H. &
Wiesel, T.N. Các giai đoạn nhạy cảm
với các tác động sinh lý với mèo. J.
Physiol. (Lond.) 206, 419-436 (1970).
(cx)

25. Blakemore, C.
& Văn Sluyters, R.C. Yếu tố bẩm sinh
và môi trường trong sự phát triển của
vỏ não thị giác của con mèo con. J.
Physiol. (Lond.) 248, 663-716 (1975).
(cy)

26. Blakemore,
C., Van Sluyters, RC, Peck, CK &
Hein, A. Sự phát triển của vỏ não thị
giác sau của một mắt con mèo. Nature
257, 584-586 (1975).
(cz)

27. Douglas, R.J.
& Martin, K.A. Mạch thần kinh của
vỏ não. Annu. Rev. Neurosci. 27, 419451 (2004).
(da)

28. Sasaki, E. et
al. Thế hệ của các loài linh trưởng
(không phải con người) biến đổi gen
với khả năng di truyền dòng mầm.
Nature 459, 523-527 (2009).

(db)

29. Yang, S.H. et
al. Chú ý đến mô hình biến đổi gen
của bệnh Huntington ở một động vật
linh trưởng (không phải con người).
Nature 453, 921-924 (2008).
(dc)

30. Holt, N. et al.
Tế bào gốc/máu tổ tiên của con người
(dd)