Phân lập và lưu giữ gen H5 của hai chủng virus cúm AH5N1 thu nhận năm 2013 tại Khánh Hoà – Việt Nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.45 MB, 79 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN VIỆT LINH
PHÂN LẬP VÀ LƢU GIỮ GEN H5
CỦA HAI CHỦNG VIRUS CÚM
A/H5N1 THU NHẬN NĂM 2013 TẠI
KHÁNH HÒA – VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN VIỆT LINH
PHÂN LẬP VÀ LƢU GIỮ GEN H5
CỦA HAI CHỦNG VIRUS CÚM
A/H5N1 THU NHẬN NĂM 2013 TẠI
KHÁNH HÒA – VIỆT NAM
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
M· sè: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Bích Nga
THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Bích Nga –
phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam, PGS. TS. Lương Thị Hồng Vân – Viện Khoa học sự sống – Đại học
Thái Nguyên là người thầy đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt
quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn này.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Lê Thanh Hòa – Trưởng phòng
Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, đã tạo mọi điều kiện và hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể cô, chú, anh, chị Phòng
Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình tiến
hành thí nghiệm cũng như tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Cơ sở đào tạo Đại học Khoa học – Đại học Thái
Nguyên, Ban lãnh đạo Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, cùng các thầy cô trong
khoa Khoa học sự sống tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí đề tài cơ sở: “Nghiên cứu đặc điểm phân
tử virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 và clade 1.1 mới xuất hiện tại Việt Nam và lưu
giữ gen để kiến tạo vacxin thế hệ mới” (2012-2013) của Viện Công nghệ sinh học,
do PGS. TS. Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen về trang thiết bị .
Cuối cùng là lời cảm ơn đặc biệt, tôi xin được dành cho gia đình, người thân
và bạn bè vì tình yêu thương, sự động viên và giúp đỡ hết lòng đối với tôi trong học
tập cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2014
Học viên
Nguyễn Việt Linh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả của luận văn này do chính tôi thực hiện dưới
sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Bích Nga.
Các số liệu, kết quả đã công bố trong luận văn hoàn toàn trung thực và chính xác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
iii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
STT Từ và thuật ngữ viết tắt
1
AI
2
WHO
3
cDNA
4
Ck
5
Dal
6
Dk
7
DMSO
8
DNA
9
EtBr
10
GP
11
HA
12
HEF
13
HPAI
14
Kb
15
LB
16
LPAI
17
M
18
MCS
19
MEGA
20
N
21
NA
22
NP
23
NS
24
ORF
25
PA
26
PB
27
PCR
28
RNA
29
RNP
30
RT-PCR
31
SHPT
32
NJ
Nghĩa đầy đủ của từ và thuật ngữ viết tắt
Avian Influenza
Tổ chức y tế thế giới (World Trade Organization)
Complementary Deoxyribonucleic
Chicken
Dalton
Duck
Dimethyl sulfoxide
Deoxyribonucleic acid
Ethidium bromide
Glycoprotein
Hemagglutinin
Hemagglutinin esterase fusion
Highly pathogenic avian influenza
Kilobase pair
Luria Bertami
Low pathogenic avian influenza
Matrix protein
Mutiple cloning site
Molecular Evolutionary Gentics Analysis
Asparagin
Neuraminidase
Nucleoprotein
Non-structural protein
Open reading frame (Khung đọc mở)
Polymerase acidic protein
Polymerase basic protein
Polymerase chain reaction
Ribonucleic acid
Ribonucleoprotein
Reverse transcription – polymerase chain reaction
Sinh học phân tử
Neighbour Joining
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua các năm
.............................................................................................................. 4
Bảng 2.1: Thành phần chuyển đổi cDNA trong nghiên cứu........................... 28
Bảng 2.2: Danh sách các cặp mồi sử dụng trong thu nhận gen H5 ................ 28
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt ............................... 28
Bảng 3.1: Minh họa kết quả truy cập ngân hàng Gen sử dụng trình tự
nucleotide chuỗi gen H5 của 2 chủng A-Ck-VN-KH23-2013 và ADk-VN-KH24-2013 ........................................................................... 41
Bảng 3.2: Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới
sử dụng gen H5 xác định clade và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ ... 43
Bảng 3.3: Các vị trí nucleotide sai khác trong gen H5 giữa các chủng so sánh.... 46
Bảng 3.4: Tỉ lệ (%) tương đồng về thành phần nucleotid (trên đường chéo);
acid amin (dưới đường chéo) ở gen H5 giữa các chủng H5N1 phân
lập tại Việt Nam và các chủng H5N1 của thế giới............................. 51
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1: Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A . ...................................................... 9
Hình 1.2: Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng vật chủ của biến chủng virus cúm A ..... 13
Hình 1.3: Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào. ........................... 15
Hình 1.4: Mô hình cấu trúc hemagglutinin ................................................................................. 17
Hình 1.5: Sơ đồ minh họa đột biến điểm của các phân đoạn gen virus cúm A ..................... 21
Hình 1.6: Sơ đồ minh họa hiện tượng trộn kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 và
A/H3N2 ......................................................................................................................... 22
Hình 2.1: Sơ đồ qui trình nghiên cứu phân tích gen H5 virus cúm A/H5N1 .......................... 27
Hình 2.2: Cấu trúc của vector pCR 2.1- TOPO (Invitrogen Inc.) ......................................... 30
Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR của gen H5 trên thạch agarose 1% ..................................... 35
Hình 3.2: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp mang gen H5 bằng
enzyme EcoRI................................................................................................................ 37
Hình 3.3: Trình tự chuỗi gen H5 của chủng cúm A-Ck-VN-KH23-2013 .............................. 39
Hình 3.4: Trình tự chuỗi gen H5 của chủng cúm A-Dk-VN-KH24-2013 .............................. 40
Hình 3.5: So sánh đối chiếu trình tự amino acid gen H5 của hai chủng A-Ck-VN-KH23-2013 và
A-Dk-VN-KH24-2013 với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen ................... 49
Hình 3.6: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 xác lập dựa trên
thành phần nucleotide gen H5 . .................................................................................... 54
Hình 3.7: Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 dựa trên thành phần
amino acid của polypeptide H5 ................................................................................... 55
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
vi
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Bệnh cúm và cúm gia cầm A/H5N1 ....................................................................3
1.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm ................................................................................3
1.1.2.Bệnh cúm ở người và cúm gia cầm....................................................................5
1.1.3. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và ở Việt Nam ......................................7
1.1.3.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới .....................................................7
1.1.1.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam .......................................................7
1.2. Virus cúm A .........................................................................................................8
1.2.1. Cấu tạo chung và danh pháp .............................................................................8
1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A ....................................................................10
1.2.2.1. Cấu trúc chung hệ gen của virus cúm ..........................................................10
1.2.2.2. Chức năng các phân đoạn trong hệ gen ......................................................11
1.2.3. Độc lực và tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1 ........................12
1.2.4. Sức đề kháng của virus ...................................................................................14
1.2.5. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào .......................14
1.2.6. Phương thức lây truyền của virus cúm gia cầm A/H5N1 ..............................16
1.3. Cấu trúc, chức năng của gen kháng nguyên Hemagglutinin (HA/H5) ..................17
1.4. Các phương thức biến đổi kháng nguyên...........................................................20
1.5. Một số nghiên cứu về virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam ...................................23
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............25
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................25
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất ....................................................................25
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị .....................................................................................25
2.2.2. Hóa chất ..........................................................................................................25
2.3. Quy trình nghiên cứu .........................................................................................26
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................27
2.4.1. Phương pháp chuyển đổi cDNA .....................................................................27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
vii
2.4.2. Phương pháp PCR ...........................................................................................28
2.4.3. Phương pháp điện di kiểm tra và tinh sạch sản phẩm PCR ..............................29
2.4.4. Phương pháp dòng hóa ....................................................................................29
2.4.4.1. Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng ...................................................29
2.4.4.2. Chuyển nạp sản phẩm dòng hóa vào tế bào khả biến..................................31
2.4.4.3. Chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc và tách chiết DNA tái tổ hợp ........................31
2.4.4.4. Kiểm tra DNA tái tổ hợp ..............................................................................31
2.4.5. Phương pháp giải trình tự ................................................................................32
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin-sinh học .....................32
2.4.6.1. Nguyên tắc chung .........................................................................................32
2.4.6.2. Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA) ......................33
2.4.6.3. Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen GeneDoc .............................34
2.4.6.4. Xử lý số liệu trong nghiên cứu .....................................................................34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..............................35
3.1. Kết quả thu nhận và lưu giữ gen H5 của chủng virus cúm A/H5N1 trong vector
tách dòng ...................................................................................................................35
3.1.1. Kết quả chuyển cDNA và thực hiện PCR .......................................................35
3.1.2. Kết quả dòng hóa và lưu gen trong vector tách dòng .....................................36
3.2. Kết quả giải trình tự gen H5 ...............................................................................38
3.3. Kết quả truy cập Ngân hàng Gen (GenBank) ....................................................41
3.4. Kết quả so sánh, phân tích thành phần nucleotide và amino acid của gen H5 với
các chuỗi đăng ký trong Ngân hàng gen ...................................................................43
3.5. Phân tích tương đồng về nucleotide và amino acid của gen H5 ........................50
3.6. Phân tích mối quan hệ phả hệ và xác định kháng nguyên của hai chủng phân
lập năm 2013 .............................................................................................................53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................57
KẾT LUẬN ...............................................................................................................57
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................58
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
/>
1
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nước đang phát triển, phần lớn dân số sinh sống bằng ngành
nghề nông nghiệp, trong đó chăn nuôi gia cầm chiếm một vị trí quan trọng. Tuy
nhiên, cùng với sự gia tăng về nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm thực phẩm gia cầm an
toàn thì sự xuất hiện các bệnh của gia cầm hiện nay đang là một thách thức lớn đối
với ngành chăn nuôi gia cầm. Nhiều nhân tố dịch bệnh làm ảnh hưởng đến chất
lượng và sản lượng thịt, nhiều đàn gia cầm, thủy cầm mắc bệnh bị tiêu hủy toàn bộ
để hạn chế khả năng lây lan dịch.
Năm 2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 đã bùng phát ở nhiều nước trên thế
giới, trong đó có Việt Nam. Dịch cúm gia cầm liên tục tái phát hàng năm với tốc
độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia. Đặc biệt, chủng virus
cúm A/H5N1 có khả năng gây bệnh ở người với tỉ lệ tử vong rất cao và đang trở
thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khoẻ cộng đồng.
Các công trình nghiên cứu về hệ gen virus cũng như về dịch tễ học dịch cúm
gia cầm A/H5N1 đã cho thấy, chủng virus cúm A/H5N1 hiện đang lưu hành gây bệnh
có độc lực cao, thích ứng lây nhiễm gây bệnh chủ yếu ở quần thể chim hoang dã và
gia cầm, mặc dù chưa có được khả năng dễ dàng thích ứng lây nhiễm trên người,
nhưng trong quá trình tiến hóa các chủng virus cúm A/H5N1 luôn có sự biến đổi hệ
gen, đặc biệt là các gen kháng nguyên hemagglutinin (HA(H5)) và neuraminidase
(NA(N1)), để có thể trở thành virus cúm thích ứng lây truyền ở người.
Hai protein (H5 và N1) trên bề mặt vỏ capsid của hạt virus cúm A/H5N1, có
vai trò quan trọng liên quan đến khả năng xâm nhiễm, độc lực gây bệnh của virus
trên vật chủ và mang đặc tính kháng nguyên đặc trưng của chủng virus. Trong đó,
protein kháng nguyên H5 được mã hóa bởi phân đoạn 4, có vai trò quyết định độc
lực, tính gây bệnh và khả năng thích ứng xâm nhiễm của virus ở các loài vật chủ
khác nhau tại vị trí qui định trình tự các nucleotide của gen H5 ở điểm cắt protease
(chuỗi nối HA1-HA2).
Sự xuất hiện và tích lũy các đột biến nucleotide trong trình tự gen H5, có thể
dẫn đến sự thay đổi amino acid trong trình tự protein H5 được mã hóa, làm thay đổi
2
khả năng glycosyl hóa, đặc tính kháng nguyên, khả năng xâm nhiễm và độc lực gây
bệnh của virus trên vật chủ.
Nghiên cứu đặc tính phân tử của gen H5, không những cho phép tìm hiểu
đặc tính biến đổi thành phần nucleotide và amino acid của gen H5 của virus cúm
A/H5N1, ảnh hưởng của những biến đổi đó đến độc lực, khả năng xâm nhiễm trên
vật chủ cũng như tương quan kháng nguyên-miễn dịch, mà còn cho phép phân tích
mối quan hệ tiến hóa, xác định phân type của virus. Qua đó, cho phép dự báo dịch
tễ học virus A/H5N1 ở mức độ sinh học phân tử, giúp định hướng sử dụng vaccine
phù hợp và chiến lược phát triển vaccine thế hệ mới (đặc biệt là vaccine tái tổ hợp
sử dụng kĩ thuật di truyền ngược (reverse genetics-based vaccine), ngoài ra còn là
cơ sở để nghiên cứu xây dựng các bộ kit chẩn đoán sớm chính xác cúm A/H5N1,
nhằm sớm áp dụng các biện pháp điều trị phù hợp cứu sống bệnh nhân bị nhiễm
virus cúm A/H5N1.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và lưu
giữ gen H5 của hai chủng virus cúm A/H5N1 thu nhận năm 2013 tại Khánh Hoà –
Việt Nam”.
Mục tiêu của đề tài:
1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen H5 chủng virus cúm A/H5N1 mới thu
nhận năm 2013 tại Việt Nam.
2- Lưu giữ gen H5 trong vector tách dòng để làm nguồn nguyên liệu cho các
nghiên cứu tiếp theo.
3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của H5 và xác định mối quan hệ
nguồn gốc phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
Nội dung nghiên cứu:
1. Thu nhận, giải trình tự gen mã hóa cho kháng nguyên H5 của chủng virus
cúm A/H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2013.
2. Phân tích so sánh tương đồng về nucleotide và amino acid suy diễn của gen
H5, xác định mối quan hệ phả hệ của các chủng thu nhận được với các chủng đăng ký
trong Ngân hàng gen.
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Bệnh cúm và cúm gia cầm A/H5N1
1.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm
Bệnh cúm gia cầm lần đầu tiên được mô tả như là bệnh dịch tả gia cầm và
được Perroncito báo cáo vào năm 1878 ở Italia, khi đó bệnh bị nhầm lẫn với dạng
nhiễm trùng huyết cấp tính của bệnh tụ huyết trùng gia cầm [3].
Từ những năm 1500 – 1978 có khoảng 13 đại dịch cúm đã được ghi nhận,
điển hình là các năm 1878, 1918, 1957, 1968 và 1977 [43].
Theo lịch sử ghi nhận, đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918 – 1919 do virus
cúm A/H1N1, đại dịch cúm châu Á năm 1957 – 1958 do virus cúm A/H2N2, dịch
cúm Hồng Kông năm 1968 – 1969 do virus cúm A/H3N2, đại dịch cúm Nga năm
1977 do virus cúm A/H1N1 [9].
- Năm 1959: phát hiện virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gà tại Scotland, có
thể coi đây là chủng cổ điển đầu tiên trên thế giới [23].
- Năm 1996: virus cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông [29].
- Năm 1997: Dịch cúm tại Hồng Kông do virus cúm A/H5N1 lần đầu tiên
gây bệnh cho cả người và gia cầm [20].
Cuối năm 2003, những đợt cúm gà do virus cúm A/H5N1 đã liên tiếp xảy ra
ở nhiều quốc gia trên thế giới và các nước thuộc Đông Nam Á và Đông Á (Trung
Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Campuchia, Indonesia...)
virus gây bệnh đã được phân lập và định type, chủ yếu là H5N1 có độc lực cao.
(theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO))
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số người bị nhiễm cúm gia
cầm từ năm 2003 đến ngày 24/01/2014 thì toàn thế giới đã có 650 trường hợp người
mắc cúm A/H5N1, trong đó có 386 trường hợp đã tử vong, riêng Việt Nam có 125
người mắc, trong đó có 62 người tử vong (Bảng 1.1).
4
Bảng 1.1: Thống kê số lƣợng ngƣời bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua các năm
Năm 2003
Năm
Năm
Năm
Năm
Năm
- 2009
2010
2011
2012
2013
2014
Quốc gia
Tổng số
M
C
M
C
M
C
M
C
M
C
M
C
M
C
Azerbaijan
8
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
8
5
Bangladesh
1
0
0
0
2
0
3
0
1
1
0
0
7
1
Campuchia
9
7
1
1
8
8
3
3
26 14
0
0
47
33
Canada
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
0
0
1
1
Trung Quốc
38
25
2
1
1
1
2
1
2
2
0
0
45
30
Djibouti
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
Ai Cập
90
27
29 13 39 15 11
5
4
3
0
0
173
63
Indonesia
162
134
9
7
12 10
9
9
3
3
0
0
195 163
I rắc
3
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
2
Lào
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
2
Myanmar
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
Nigeria
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
Pakistan
3
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
1
Thái Lan
25
17
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
25
17
Thổ Nhĩ kỳ
12
4
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
12
4
Việt Nam
112
57
7
2
0
0
4
2
2
1
1
1
125
62
Tổng số
468
282
48 24 62 34 32 20 39 25
1
1
650 386
Ghi chú: M: số người mắc, C: số người chết
(Nguồn: Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza
A/(H5N1) Reported to WHO, January 24, 2014).
Cho đến nay chỉ có hai chủng virus có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 là
loại có độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, đã tạo nên tái tổ hợp phân type H7N7 gây
đại dịch cúm gà ở châu Âu và H5N1 ở châu Á. Chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất
hiện trong khoảng hơn mười năm gần đây ở các nước châu Á đã được xác định là
một phân type có độc lực cao, được chứng minh là có khả năng lây nhiễm từ động
5
vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gia cầm giai đoạn
những năm 1996 – 2010 [35].
Tháng 06/2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố đại dịch cúm do
virus cúm A/H1N1 trên toàn thế giới.
1.1.2. Bệnh cúm ở ngƣời và cúm gia cầm
+ Bệnh cúm ở người (Human Influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính
do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae đã thích nghi trên người gây
nên. Bệnh xuất hiện trong quần thể người, gia tăng theo mùa cúm hằng năm ở từng
địa phương, và có thể phát triển thành dịch [10].
-
Virus thuộc họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm:
1/ Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài vật
(gia cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp
xúc với con người và gây bệnh ở người. Virus cúm A có thể gây nên những vụ dịch
hoặc những trận đại dịch toàn cầu [21].
2/ Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con
người, chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu [21].
3/ Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn.
Ba nhóm virus cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc
kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên
động vật có xương sống. Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein
hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion) [21].
4/ Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không
xương sống (muỗi, rận biển). Kháng nguyên bề mặt của Thogotovirus là GP
(glycoprotein) [21].
Virus cúm A tồn tại chủ yếu trong các quần thể vật chủ tự nhiên là các loài
chim hoang dã và gia cầm, đặc biệt là thủy cầm. Do đặc tính của virus cúm A có
khả năng biến đổi kháng nguyên và thích ứng trên nhiều loài vật chủ mới, tạo nên
tính thích ứng vật chủ đa dạng. Đặc biệt, nhóm virus này có khả năng thích nghi lây
nhiễm trên người gây ra các đại dịch cúm. Hiện nay, Tổ chức Y tế thế giới đã xác
6
định chu trình biến đổi khả năng xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A từ gia cầm
sang người theo các thời kỳ biến đổi của virus nhằm theo dõi và ngăn chặn đại dịch
cúm ở người trong tương lai [46].
- Bệnh do virus cúm có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi với các biểu hiện lâm sàng
tùy theo sức đề kháng của mỗi cá thể từ nhẹ đến nặng, bao gồm: Hội chứng viêm
đường hô hấp trên, viêm phế quản, giảm bạch cầu lympho…. Thông thường, bệnh
nhân tự khỏi sau 7 – 10 ngày, hiếm khi tiến triển nặng, do con người đã có đề kháng
miễn dịch đối với các chúng virus này. Biến chứng hay gặp là viêm phổi do bội
nhiễm vi khuẩn ở đường hô hấp. Virus được bài thải ra môi trường trong dịch tiết
mũi họng của cơ thể người bệnh thông qua ho, hắt hơi… và lây truyền rộng rãi
trong cộng đồng [28].
+ Bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia
cầm do virus cúm A gây ra. Bệnh còn có tên gọi khác như: Bệnh cúm chim (Bird
flu), cúm A, và ở Việt Nam dân gian gọi là “Cúm gà” [3].
Quần thể chim hoang dã (chủ yếu là vịt trời) và gia cầm (vịt, gà tây, gà…) là
các vật chủ tự nhiên của virus cúm A. Virus cúm A thường không gây bệnh hoặc
chỉ gây bệnh nhẹ cho chim và gia cầm. Song một số biến thể cường độc (H5, H7…)
có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở chim và gia cầm. Bệnh lây
truyền qua đường hô hấp (thông thường các hạt aerosol có chứa virus trong không
khí); và qua đường tiêu hóa; hay tiếp xúc trực tiếp với các bề mặt (không khí, đất,
nước…) bị ô nhiễm (dịch, chất thải…) của cơ thể bệnh [3].
+ Chẩn đoán: Chẩn đoán bệnh cúm ở người và cúm gia cầm thường dựa chủ
yếu vào các dấu hiệu lâm sàng, dịch tễ và các xét nghiệm phát hiện sự hiện diện của
virus cúm trong cơ thể bệnh: Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu, test chẩn đoán
nhanh (Capillia Flu A/B test của hãng Nippon Becton Dickinson…). Chẩn đoán xác
định dựa vào các xét nghiệm huyết thanh miễn dịch học và phân lập virus. Kĩ thuật
RT-PCR trực tiếp, cho phép chẩn đoán xác định và phân biệt sự hiện diện của các
chủng virus cúm A gây bệnh, có độ chính xác và tin cậy [21].
+ Điều trị: Hiện nay, chưa có thuốc điều trị đặc hiệu với virus cúm A, các thuốc
đang lưu hành chủ yếu là thuốc ức chế virus không đặc hiệu. Do vậy, tiêm vaccine
7
phòng bệnh là biện pháp chính trong phòng chống cúm nhằm ngăn chặn sự lây
truyền virus cúm cả ở người và gia cầm, bên cạnh các biện pháp hỗ trợ nâng cao
sức đề kháng cho cơ thể [39].
1.1.3. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.3.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
Virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại
Scotland vào năm 1959, có thể coi đây là chủng virus cổ điển (danh pháp: A-CkScotland-59(H5N1), số đăng ký trong Ngân hàng gen: X07869).
Dòng virus A/H5N1 năm 1996 phân lập từ ngỗng (Quảng Đông - Trung
Quốc) là virus cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện [24]. Đặc biệt sự khác biệt của
gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) đã có những thay đổi lớn trong thành phần
chuỗi gen và kháng nguyên miễn dịch. Kể từ khi xuất hiện tại Quảng Đông (1996)
và Hồng Kông (1997), đến nay virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi không
những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết ở người. Mặc dù về cấu trúc
vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh,
tính kháng nguyên miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và
khác với nhiều biến chủng H5N1 đã được phát hiện trước đây [48].
Một biến thể mới của H5N1 khác biệt so với chủng virus Gs-Gd11996(H5N1) (dòng Quảng Đông) xuất hiện từ 2005 đó là chủng Phúc Kiến và đã
trở thành chủng cúm gia cầm phổ biến tại nhiều tỉnh ở Trung Quốc và lây lan sang
Hồng Kông, Lào, Malaysia, Thái Lan, Việt Nam [7]. Từ cuối năm 2005, cúm
A/H5N1 chủ yếu là các chủng virus thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng
Bắc Trung Quốc) bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi
tràn ngập Đông Âu và xâm nhập vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ,
các nước Bắc- Trung Phi và đến nay cũng đã được phát hiện tại Việt Nam.
1.1.3.2. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên gà lần đầu tiên bùng phát tại
Việt Nam ở các tỉnh phía Bắc, trong một thời gian ngắn dịch bệnh đã nhanh chóng
lây lan ra 57/64 tỉnh, thành trong cả nước, hàng chục triệu gia cầm bị chết và tiêu
8
huỷ, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm [10]. Dịch bệnh cúm
A/H5N1 vẫn thường xuyên tái phát hàng năm tại nước ta. Từ khi dịch bệnh xuất hiện
đến nay đã có nhiều trường hợp người bị mắc cúm gia cầm và tử vong (Bảng 1.1).
Cuối năm 2013, dịch cúm gia cầm đã rải rác xảy ra ở các tỉnh/thành phố:
Khánh Hòa, Nam Định, Tiền Giang, Tây Ninh, Ninh Thuận, Hồ Chí Minh và một
số địa phương khác. Có rất nhiều clade mới đã xuất hiện, đặc biệt như clade 2.3.4;
2.3.2.1A, B, C thậm chí cả clade 7…. Mỗi clade lại có sự thay đổi tính kháng
nguyên nhất định, vì vậy vaccine phòng bệnh nếu không có kháng nguyên phù hợp
với virus gây bệnh sẽ kém hoặc không có hiệu quả, và ngày càng làm cho tình hình
dịch tễ và phòng chống trở nên phức tạp trong định hướng đối phó dịch bệnh [50].
1.2. Virus cúm A
1.2.1. Cấu tạo chung và danh pháp
Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà [12] có tên khoa
học là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại
(Basic Taxomomy) [25].
Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu
đường kính từ 50 – 100 nm (Hình 1.1A). Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm
và dài từ 200 – 300 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dalton (Dal) [4].
Hạt virus có cấu tạo gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi chứa
RNA. Vỏ virus với bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào để gắn protein
màng của virus vào, bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và
một số protein dạng trần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein) [37].
Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết
hồng cầu HA, protein enzyme cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập
trung ở màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol,
glucolipid và một ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose,
fructose, glucosamin. Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và
các sợi RNA nối với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn [37].
Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt
(Hình 1.1B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp
9
xếp theo trật tự: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS
(NS1 và NS2) . Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối
xứng dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP)
với bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) [37].
Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối
peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một
sợi RNA duy nhất có độ dài từ 10.000 – 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng
virus cúm A) và có cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus [37].
HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm thụ và làm xâm nhập
vật liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào. NA có chức năng thúc đẩy sự lắp
ráp để giải phóng virus từ các tế bào cảm thụ. Các glycoprotein HA và NA quyết
định tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị
trí để các loại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng
diệt virus. Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính
kháng nguyên trong sản xuất vaccine [37].
Hình 1.1: Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A [4].
Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dưới
kính hiển vi điện tử 4.000.000X.
Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng
hầu như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những
vụ dịch cúm trong lịch sử ở động vật và người [32]. Do đặc tính biến đổi nội gen
10
nhanh chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể
sinh vật, cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang
người (zoonotic infections). Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức
độ độc lực cao nhất cho các loài động vật và người, có nhiều minh chứng khoa học
là chủng này bắt nguồn từ H6N2 hoặc trao đổi gen thông qua H9N2 (trên lợn) [31].
H5N1 thể độc lực cao gây chết phôi gà gần như ngay lập tức nên không thể
sử dụng nguồn phôi gà để sản xuất vaccine vô hoạt cho gia cầm. Để khắc phục điều
này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các mạng lưới phòng thí nghiệm của WHO đã
kiến tạo thành công hướng sản xuất vaccine H5N1 bằng phương pháp di truyền
ngược (reverse genetics -based technology). Đây là phương pháp tạo virus nhân tạo
tái tổ hợp gen của virus cúm A/H5N1 đương nhiễm có khả năng gây miễn dịch
nhưng không gây bệnh. Tuy nhiên do virus cúm gia cầm A/H5N1 có nhiều biến đổi
nội gen và xảy ra nhanh nên việc sản xuất vaccine cũng gặp không ít khó khăn.
1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A
1.2.2.1. Cấu trúc chung hệ gen của virus cúm
Nhóm virus cúm A có hệ gen là RNA, chứa 8 phân đoạn mã hoá cho 11
protein, có độ dài tùy từng phân type, được nối với nhau thành một sợi RNA liên
tục, nhưng hệ gen lại phân thành nhiều đoạn, mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã
hóa cho một loại protein của virus.
Hai đầu 5' và 3' của RNA của hệ gen có hai chuỗi nucleotide bảo tồn, đó là
5'-AGUAGAACAAGG... và 3'-UCG(U/C)UUUCGUCC.... Sáu phân đoạn (từ 1- 6)
mỗi phân đoạn chịu trách nhiệm mã hoá cho một loại protein riêng biệt, phân đoạn
7 và 8 mã hoá cho từng phần của gen, mỗi gen mã hoá cho một phân tử RNA thông
tin và mỗi phân tử RNA thông tin này sau khi được xử lý nhờ cơ chế nối-ghép
(splicing) sẽ được dịch mã tổng hợp protein [32]. Mỗi đoạn RNA được bao xung
quanh bởi nucleoprotein (NP) tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). RNP kết
hợp với 3 loại polymerase PB2, PB1, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao
chép RNA của virus.
Protein kháng nguyên bề mặt là HA thuộc protein màng type I liên quan đến sự
bám dính của virus và là thụ thể của virus, có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, hợp
nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hoà virus [14].
11
Nucleocapsid protein (NP) là một loại protein được photphoryl hoá, có biểu
hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus theo dạng
liên kết với mỗi phân đoạn RNA, cho nên NP còn được gọi là ribonucleoprotein [35].
Protein mang hoạt tính enzyme là NA thuộc protein màng type II có chức năng
của một enzyme cắt thụ thể để virus thực hiện quá trình giải phóng ra khỏi tế bào.
Chỉ có các phân đoạn HA, NA (glycoprotein màng) của virus có chức năng
"gắn" vào màng tế bào chủ bị tấn công rồi sau đó tiếp tục thực hiện quá trình nhân
lên và giải phóng virus [14].
Protein màng không được glycosyl hóa là MA mang tính chất protein đệm,
bao gồm M1 và M2 có vai trò bao gói RNA của hệ gen virus và là kênh vận chuyển
các thành phần của virus qua màng.
Một protein khác là protein không cấu trúc NS (non-structural protein) gồm
hai tiểu phần NS1và NS2, có vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus
sinh ra không hoàn chỉnh, trở thành virus thiểu năng [35].
1.2.2.2. Chức năng các phân đoạn trong hệ gen
Phân đoạn 1 mã hoá cho enzyme polymerase PB2 (polymerase basic protein
2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) chịu trách nhiệm khởi đầu
phiên mã, có độ dài 2341 nucleotide, có trọng lượng phân tử theo tính toán là 84
kDa (thực tế là: 87 kDa) [32].
Phân đoạn 2 mã hoá cho enzyme polymerase PB1 (polymerase basic protein 1) là
tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase), có độ dài 2341 nucleotide, với
trọng lượng phân tử tính toán là 87 kDa (thực tế: 96 kDa) [18].
Phân đoạn 3 mã hoá cho enzyme kéo dài phiên mã PA (polymerase acidic
protein 2) là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase) tham gia tổng hợp
RNA, có độ dài 2233 nucleotide, trọng lượng phân tử theo tính toán là 83 kDa (thực
tế: 85 kDa) [18].
Phân đoạn 4 mã hóa cho hemagglutinin (HA) điều khiển quá trình tổng hợp
hemagglutinin (protein gây ngưng kết hồng cầu). Có 16 loại HA, trong đó chỉ có
H1, H2, H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. Virus mang gen H5, H7 và H9
12
có thể lây nhiễm từ chim sang người. HA được phân bố rải rác trên bề mặt của
virus, là protein gắn virus vào thụ thể của tế bào, gây ngưng kết hồng cầu và tham
gia vào quá trình khởi đầu xâm nhiễm của virus. HA có phân tử lượng là 63 kDa
(nếu không được glycosyl hoá), 77 kDa (nếu được glycosyl hoá, trong đó HA1 là 48
kDa và HA2 là 29 kDa) [45], chuỗi nucleotide có độ dài thay đổi tùy từng phân type
virus, đối với H5N1 là 1704 – 1707 bp, H7N1 là 1683 – 1695 bp, H9N1 là 1683 bp,
H1N1 là 1701 bp [37].
Phân đoạn 5 mã hoá cho protein nucleoprotein (NP) có trọng lượng phân tử
tính toán là 56 kDa, gen NP của H5N1 có độ dài là 1497 bp [36].
Phân đoạn 6 mã hóa cho protein neuraminidase (NA). NA là các gai hình nấm
trên bề mặt của virus, NA vừa có vai trò kháng nguyên vừa có hoạt tính enzyme phân
cắt liên kết giữa thụ thể acid sialic và HA, nhờ vậy mà đẩy nhanh quá trình lan
truyền virus trong tế bào chủ. NA có trọng lượng phân tử theo tính toán 50 kDa (thực
tế: 48 – 63 kDa), độ dài cũng rất thay đổi, đối với H5N1 là 1350 – 1410 bp [19].
Phân đoạn 7 mã hoá cho phần đệm matrix protein MA, gồm 2 tiểu phần M1
và M2. Tiểu phần M1 là protein nền, là thành phần chính của virus, có chức năng
bao gói và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus. Tiểu phần M2 là protein nội
màng, có chức năng là kênh ion vận chuyển sản phẩm của virus, trọng lượng phân
tử tính toán của M1 là 28 kDa (thực tế: 25 kDa), và M2 là 11 kDa (thực tế: 15 kDa),
phân đoạn M có độ dài khoảng 1027 bp [29].
Phân đoạn 8 là gen NS có độ dài ổn định trong tất cả các chủng cúm A, mã
hoá cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2. Tiểu phần NS1 có chức
năng vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon và tiểu
phần NS2 có vai trò vận chuyển RNP ra khỏi nhân, trọng lượng phân tử tính toán
NS1 là 27 kDa (thực tế: 25 kDa), của NS2 là 14 kDa (thực tế: 12 kDa), NS có độ
dài 890 bp [36].
1.2.3. Độc lực và tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1
* Độc lực gây bệnh của virus cúm A được chia làm 2 loại: Loại độc lực cao
(HPAI, Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI, Low pathogenic
avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại ở mỗi phân type virus cúm A [31].
13
- HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội
tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia cầm bị
nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm. Loại này rất nguy hiểm gây lo ngại cho cộng
đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và tế bào thận chó trong
môi trường nuôi cấy không có trypsin [13].
- LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm có thể gây ra bệnh cúm
nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ. Đây là loại
virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên của virus cúm A, loại
này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng
một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy hiểm [36].
* Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1
Virus cúm A có phổ thích ứng rộng trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau như:
chim, gia cầm, thuỷ cầm, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và người (Hình 1.2).
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang dã
(chủ yếu là vịt trời và ngỗng), tàng trữ nguồn virus gây nhiễm, và là nguyên nhân
lan truyền virus trong tự nhiên rất khó kiểm soát. Hơn nữa, virus cúm A có khả
năng gia tăng biên độ vật chủ trong quá trình lây truyền trong tự nhiên [24].
Hình 1.2: Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng vật chủ
của biến chủng virus cúm A [37].
14
Đặc điểm thích ứng đa vật chủ là điều kiện thuận lợi cho virus cúm A trao đổi
hoặc tái tổ hợp các phân đoạn gen (đặc biệt là gen kháng nguyên HA và NA) giữa các
chủng để tạo ra chủng virus cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ
mới, đặc biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” (species-barrier) dễ dàng thích
ứng lây nhiễm gây bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [31].
Trong lịch sử, các đại dịch cúm xảy ra ở người được vật chủ trung gian là lợn
thường có vai trò chuyển tiếp giúp cho virus cúm A biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang
người gây nên dịch bệnh [47]. Virus cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của
virus cúm A/H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng
nhiễm trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 [35].
Một số biến thể cường độc (H5, H7) xuất hiện gần đây do tái tổ hợp với nhiều
gen khác nhau, có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt cả ở chim và gia cầm
và ở các loài động vật có vú khác như hổ, mèo, ngựa, lợn và người.
1.2.4. Sức đề kháng của virus
Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các yếu tố vật lí hay hoá học. Các hạt
virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9. Ở pH quá acid hay quá kiềm,
khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh [33]. Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là
lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi
hoà tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng: formaldehyde, phenol, βpropiolacton, natri hypoclorid, acid loãng và hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới
ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất
hoạt được virus nhưng không phá hủy được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus
cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn ở 100oC và ở 60oC/30 phút, tồn tại ít nhất 3
tháng ở nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm) và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (70oC). Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn tại 25 – 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7
– 8 ngày ở nhiệt độ cơ thể người (37oC), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở
nhiệt độ 30oC [45].
1.2.5. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào
Virus cúm A khi xâm nhập vào tế bào động vật hay người qua đường hô hấp
trên hoặc hệ tiêu hóa, ngay lập tức virus sẽ bám vào lớp màng nhày niêm mạc vật
15
chủ. Virus được gắn vào bề mặt của tế bào thích ứng nhờ có cơ quan cảm thụ mà
bản chất là glycoprotein chứa acid sialic, sau đó virus qua màng tế bào nhờ loại
enzyme đặc biệt để vào nguyên sinh chất và nhân tế bào (Hình 1.3). Tại đây, protein
HA bề mặt của virus gắn vào thụ thể chứa neuraminic acid của tế bào chủ và tiến
hành nhập bào tạo nên endosome (“khoang ẩm bào”). Tiếp theo là quá trình dung
hợp giữa vỏ ngoài của virus với màng endosome, điều này thực hiện được nhờ gai
HA chồi lên khi pH trong endosome thấp. Sau khi dung hợp, ribonucleoprotein
(RNP) và RNA-polymerase vào tế bào chất. RNA-polymerase của virus được hoạt
hoá ở giai đoạn này [37].
Hình 1.3: Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào [4].
Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 phân đoạn RNA từ hệ gen sợi âm của
virus là tạo ra 10 phân tử protein. Sáu phân đoạn (từ 1 đến 6) RNA thông tin
(mRNA) được tạo ra và chịu trách nhiệm tổng hợp thành 6 loại protein: HA, NA,
NP, PB1, PB2, PA, còn phân đoạn 7 và phân đoạn 8 do có hai khung đọc trên mỗi
phân đoạn, nên có hai mRNA tạo ra cho mỗi phân đoạn để tổng hợp các protein
M1, M2 và NS1, NS2 [1].
Sau khi hợp nhất màng đã được thực hiện trong “khoang ẩm bào”,
nucleocapsid của virus được chuyển vào trong nhân tế bào để thực hiện quá trình
tổng hợp RNA nguyên liệu hệ gen cho các virus mới. Hệ thống enzym sao chép của
virus ngay lập tức tạo nên các RNA thông tin.
16
Đối với virus cúm, để tổng hợp RNA thông tin, các phân đoạn RNA hệ gen
được mũ hoá ở 10 – 13 nucleotide ở đầu 5‟ với nguyên liệu mũ hoá lấy từ RNA tế
bào, nhờ vào hoạt tính enzym PB2 (polymerase basic protein 2) của virus. RNA sợi
đơn âm được chuyển thành RNA sợi đơn dương theo cơ chế bổ sung, và sợi dương
này lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA đơn âm mới nhờ RNA
polymerase. Các sợi RNA được tạo ra là một sợi hoàn chỉnh, không được mũ hóa ở
đầu 5' và không được adenyl hóa ở đầu 3', chúng sẽ được bao gói lại để hình thành
nên ribonucleocapsid. Sau khi được bao gói, ribonucleocapsid được vận chuyển đến
màng tế bào mà ở đó các gai HA, NA, M2 đã được gắn sẵn nhờ hệ thống Golgi
chuyển ra và hạt virus mới được hình thành, lúc này NA sẽ cắt thụ thể sialic acid
giải phóng virus khỏi tế bào chủ, bắt đầu một quá trình lây nhiễm mới [15].
Quá trình phiên mã, sao chép của virus cúm đặc biệt khác với các RNA virus
khác là quá trình này chỉ xảy ra trong nhân tế bào bị nhiễm. Thời gian xâm nhiễm và
giải phóng hạt virus mới của virus cúm kéo dài trong vài giờ, các hạt virus mới được
tạo thành không làm tan tế bào bị nhiễm, nhưng các tế bào này dường như không còn
khả năng sống sót do rối loạn ở hệ thống tổng hợp các đại phân tử sinh học.
1.2.6. Phƣơng thức lây truyền của virus cúm gia cầm A/H5N1
Các loài chim di trú là một trong những nguồn phát tán virus cúm A/H5N1.
Chim bị nhiễm giải phóng virus H5N1 ở trong nước bọt, dịch mũi và phân. Những
con khác có thể bị lây nhiễm do tiếp xúc trực tiếp với các chất tiết của con bệnh
hoặc gián tiếp qua môi trường bị ô nhiễm. Những đợt bùng phát dịch cúm gia cầm
thường xuất phát từ những khu vực ở Đông Á và Đông Nam Á, nơi mà con người
và lợn, gia cầm sống rất gần gũi với nhau. Các loài động vật có vú nhiễm bệnh sẽ
giải phóng virus ra ngoài dưới dạng các hạt nhỏ lơ lửng trong không khí có chứa
virus. Virus dễ dàng lan truyền tới những vùng khác do con người thông qua các
phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi [1].
Nguy cơ lây nhiễm virus cúm gia cầm sang người phụ thuộc vào nhiều yếu tố:
số lượng virus, vật liệu phơi nhiễm và chủng virus. Đường xâm nhập chính của virus
cúm A là đường hô hấp trên và kết mạc. Kết mạc có thể là đường xâm nhập quan
trọng của virus A/H7N7 và A/H7N3. Virus xâm nhập trực tiếp vào đường hô hấp
dưới có thể xảy ra trong trường hợp phơi nhiễm nhiều.
