Enterobacter sakazakii mối hiểm họa đối với trẻ sơ sinh

Enterobacter sakazakii

Enterobacter sakazakii
MỐI HIỂM HỌA ĐỐI VỚI TRẺ SƠ SINH

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BPW = Buffer Pepton Water
EE broth = Enterobacteriaceae Enrichment broth
FDA = Food and Drug Administration
IFM = Infant Fomula Milks
IAC = Internal Amplification Control
MRS = DeMann Rogosa Sharpe Agar
ompA = outer membrane protein A
PCA = Plate Count Agar
PCR = Polymerase Chain Reaction

Nhóm 23- 08DSH2

1


Enterobacter sakazakii
TSA = Trypticase Soya Agar
VRBGA = Violet Red Bile Glucose Agar

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY NGỘ ĐỘC
1.1 Lịch sử phát hiện:
Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) mỗi năm có hàng triệu trường hợp

bệnh do thực phẩm xảy ra trên toàn thế giới. Năm 1958 Enterobacter sakazakii lần đầu
tiên liên quan đến một trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Kể từ đó, khoảng 70
trường hợp nhiễm E. sakazakii đã được báo cáo, nhưng đó chỉ có thể là số trường hợp
đáng kể dưới báo cáo trong tất cả các nước và tỷ lệ này có thể là cao hơn. Lúc bấy giờ,
sinh vật này được gọi là “sắc tố màu vàng - Enterobacter cloacae” mãi đến năm 1980
mới được đổi tên là Enterobacter sakazakii (bởi Farmer và cộng sự).
Một cuộc điều tra quy mô về các sản phẩm sữa bột và thức ăn khô cho trẻ đã diễn ra
trên phạm vi 7 quốc gia châu Âu, Mỹ, Hàn Quốc và Nam Phi. Hơn 200 mẫu từ 110 sản
phẩm khác nhau được phân tích cẩn thận để truy lùng dấu vết của các loại khuẩn gây hại.
Kết quả hoàn toàn bất ngờ, 8 trong số 82 mẫu sữa bột dành cho trẻ sơ sinh có chứa các

Nhóm 23- 08DSH2

2


Enterobacter sakazakii
loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột. 12 trong 49 thực phẩm khô cũng ở tình trạng tương tự.
Trong số các loại khuẩn được phát hiện, người ta nhận dạng được 13 dòng vi khuẩn thuộc
họ Enterobacteriaceae gây bệnh viêm dạ dày - ruột, trong đó có cả Enterobacter sakazakii
gây viêm màng não.
Vào năm 2001, một thảm cảnh đã diễn ra tại khu chăm sóc đặc biệt cho trẻ sơ sinh ở
bang Tennessee (Mỹ), - hàng chục bé đã bị viêm màng não. Sau này, người ta mới phát
hiện ra nguyên nhân là từ một lô sữa bột dành cho trẻ. Năm 2004, các chuyên gia của Tổ
chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) đã họp và phát triển hướng dẫn quốc tế qua các thông điệp giáo dục về
Enterobacter sakazakii.
1.2 Vị trí phân loại:
-Kingdom (giới):

Bacteria

-Phylum (ngành):

Proteobacteria

-Class (lớp):

Gamma Proteobacteria

-Order (bộ):

Enterobacteriales

-Family (họ):

Enterobacteriaceae

-Genus (chi):

Enterobacter

-Species (loài):

Enterobacter sakazakii

1.3 Đặc điểm:
1.3.1. Đặc điểm chung:
Enterobacter sakazakii là trực khuẩn hình que,
gram âm, có kích thước chiều dài là 3 micromet và

chiều rộng là 1 micromet, kị khí tuỳ nghi, không có
sự hình thành bào tử, có sắc tố vàng, chịu được áp
suất thẩm thấu cao, di động, cung cấp các viên
nang và có vành lông rung. Ngoài ra nó thuộc loại
vi khuẩn ưa nhiệt ôn hòa.
- Nhiệt độ tối đa của sự phát triển: 41-45oC
- Nhiệt độ tối thiểu của sự phát triển: 5.5-8.0oC

Nhóm 23- 08DSH2

3


Enterobacter sakazakii
- Không phát triển ở nhiệt độ: 4oC
1.3.2. Đặc điểm sinh hóa:
Các chủng Enterobacter đều có sự hoạt động của α-glucosidase và phosphoamidase.
Enterobacter sakazakii sau khi phân lập thấy có sự lên men của đường sucrose, raffinose,
và α-methyl-D-glucozit, nhưng không phải D-sorbitol, dulcitol, adonitol, Daeabinol.
1.4 Cấu trúc:
- Enterobacter sakazakii có cấu trúc gen ompA với trình tự ATCC 51329.
1.5. Yếu tố độc lực:
E.sakazakii tiết ra độc tố enterotoxin (độc tố về đường ruột). Đây là độc tố protein có
trọng lượng phân tử thấp, thường có nhiệt độ ổn định và tan trong nước. Độc tố thường
xuyên gây độc tế bào và giết chết tế bào bằng cách thay đổi tính thấm của màng tế bào
đỉnh (biểu mô) tế bào niêm mạc của thành ruột.

1.6. Cơ chế gây bệnh:
Trong tế bào mô của động vật có vú, Enterobacter sakazakii có thể gắn vào đường ruột
của tế bào và tồn tại bên trong các đại thực bào. Tuy nhiên, cơ chế mà adhesions của

Enterobacter sakazakii có khả năng thụ thể trên tế bào chủ thì hiện nay quá trình này vẫn
chưa được xác định rõ ràng. Chủng Enterobacter sakazakii có thể sinh ra các viên nang,
nhờ đó có thể tấn công vào cơ thể tế bào vật chủ mà vẫn tránh được hiện tượng đại thực
bào trong ruột. Hơn thế nữa, viên nang này giúp bảo vệ tế bào trực khuẩn Enterobacter
sakazakii, tạo điều kiện thuận lợi giúp nó tồn tại trong môi trường khô. Sau khi xâm nhập
vào tế bào chủ (nhất là đối với trẻ sơ sinh) sinh vật này sẽ gắn vào bề mặt màng plastics
và lớp silicon, và cứ như thế phát triển bởi lớp màng biofim. Việc nhiễm E. sakazakii đối
với trẻ sơ sinh dễ xảy ra nhất trong quá trình pha chế sữa cho trẻ, trực khuẩn này sẽ tồn tại
với một số lượng lớn dưới núm vú của bình sữa. Trong tế bào chủ, nó được bao bọc bởi
màng biofim có thể tránh được những thay đổi bên trong tế bào chủ làm ảnh hưởng đến
sinh vật này, từ đó khả năng kháng sinh của nó cũng được phát triển.
1.7. Bệnh và các triệu chứng bệnh:

Nhóm 23- 08DSH2

4


Enterobacter sakazakii
1.7.1. Bệnh:
Enterobacter sakazakii là trực khuẩn hình que Gram âm hiếm khi gây bệnh cho người
lớn. Nó chủ yếu gây bệnh cho trẻ nhỏ. Các nghiên cứu chỉ ra rằng trẻ sơ sinh, hoặc những
trẻ vị thành niên khác có những mức độ kháng bệnh khác nhau. Hầu hết các báo cáo đều
cho rằng các trường hợp nhiễm khuẩn đều gây bệnh viêm ruột, nhiễm trùng và nhiễm
khuẩn đường huyết, viêm màng não.Việc tổn hại hệ thần kinh và tỉ lệ tử vong theo báo
cáo lên đến 40-80%.
1.7.2. Các triệu chứng bệnh:
Triệu chứng thông thường ở trẻ:
• Ăn uống kém
• Khó chịu

• Vàng da
• Khó thở
• Nhiệt độ không ổn định

Dấu hiệu của bệnh viêm màng não ở trẻ sơ sinh bao gồm:
• Sốt cao
• Quá buồn ngủ hoặc khó chịu
• Tình trạng trì trệ
• Biếng ăn
• Một lồi ra ở chỗ mềm trên đỉnh đầu
• Độ cứng của cơ thể và cổ
• Động kinh

1.8. Các biện pháp phòng và xử lý bệnh:
- Đối với trẻ sơ sinh dưới 1 tuổi thì biện pháp tốt nhất là cho bé bú bằng sữa mẹ. Việc này
được xem là điều lý tưởng nhất để chăm sóc trẻ sơ sinh.
- Trong trường hợp người mẹ vì một lý do nào đó không trực tiếp cho con dùng sữa thì
bản thân họ phải được trang bị đầy đủ những kiến thức về cách cho trẻ sử dụng sữa ngoài
để có thể chuẩn bị và sử dụng đúng công thức của sữa khi rời khỏi bệnh viện, khi cần
thiết.

Nhóm 23- 08DSH2

5


Enterobacter sakazakii
- Như những báo cáo gần đây bởi cơ quan chính phủ Mỹ FDA cho rằng Enterobacter
sakazakii không chịu nhiệt và có thể dễ dàng giết chết ở nhiệt độ trên 60 0 , như áp dụng
trong các quá trình công nghiệp, ví dụ như phương pháp tiệt trùng Pasteur. Vì vậy trước

khi cho trẻ dùng sữa cần tiến hành khử trùng dụng cụ pha chế, đun sôi nước dùng (nhiệt
độ trên 70oC) pha chế sữa hoặc đun hoàn nguyên để đảm bảo các điều kiện an toàn.
- Những chuyên gia về y tế cần được đào tạo với chất lượng cao và được hướng dẫn quản
lý rủi ro hiệu quả, đảm bảo những điều kiện vệ sinh tối ưu cho việc lưu trữ, xử lý, sản
xuất và chuẩn bị các công thức sữa bột với mục đích ngăn chặn sự hiện diện và phát triển
của một số loài vi khuẩn gây bệnh có trong công thức sữa đặc biệt là Enterobacter
sakazakii.
-Các trung tâm chuẩn đoán, phòng trừ và chữa trị bệnh như bệnh viện,… cũng phải đảm
bảo vệ sinh tốt trong khu vực đảm bảo của họ, bao gồm cả việc điều trị chống vi khuẩn
trước khi chuẩn bị các công thức và phối hợp nỗ lực để giảm thiểu thời gian giữa chuẩn bị
và tiêu dùng.
- Về phía các nhà sản xuất thực phẩm cho trẻ sơ sinh cần có biện pháp mở rộng ở cấp dộ
nhà máy để đảm bảo mức độ cao nhất về chất lượng sản phẩm và độ an toàn. Để thực
hiện được yêu cầu này các nhà sản xuất phải:
+Có một quy trình kiểm soát nghiêm ngặt nhằm ngăn ngừa ô nhiễm từ khâu sản xuất
đến các điểm mua hàng của người tiêu dùng.
+ Giám sát chặt chẽ các thành phần, đặc biệt là những gia tăng sau bước cuối cùng của
giai đoạn chế biến nhiệt.
+Có các biện pháp phát hiện, loại bỏ hay xử lý tốt nhất để giảm thiểu sự có mặt của
Enterobacteriaceae hoặc coliform trong môi trường sản xuất.
+Đào tạo, bồi dưỡng và tổ chức cán bộ để đảm bảo tuân thủ những tiêu chuẩn an toàn
trong quy trình công nghệ sản xuất.
+Kiểm tra tiêu chuẩn vi sinh của thành phẩm nhằm đảm bảo chất lượng và sự an toàn
của sản phẩm. Nếu đạt yêu cầu, đủ tiêu chuẩn sẽ được phân phối đưa ra thị trường, còn
không phải xử lý hoặc hủy bỏ tránh ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng.

Nhóm 23- 08DSH2

6

Enterobacter sakazakii

CHƯƠNG II : CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
2.1. Phương pháp truyền thống:
Nhóm chúng tôi sử dụng 2 phương pháp: nuôi cấy và đếm khuẩn lạc.

 Phương pháp nuôi cấy:
2.1.1 Nguyên tắc:
Chỉ sử dụng các thuốc thử thuộc loại phân tích, nước được sử dụng phải là nước cất,
nước đã loại khoáng hoặc có chất lượng tương đương. Nước được sử dụng không chứa
các chất gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện thử nghiệm.
Để tăng độ tái lập của các kết quả, nên sử dụng các thành phần cơ bản khô hoặc môi
trường hoàn chỉnh khô để chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
Các giá trị pH được quy về 25 0 C. Dùng acid clohydric [c(HCL)= 1mol/l] hoặc dung
dịch natri hydroxit [c(NaOH)= 1mol/l] để chỉnh pH nếu cần.
Môi trường nuôi cấy và thuốc thử đã chuẩn bị nếu chua sử dụng ngay thì phải được bảo
quản trong các điều kiện không làm thay đổi thành phần của chúng, nơi tối, ở nhiệt độ từ
0 0 C đến 5 0 C không quá 1 tháng , trừ khi có quy định khác.

Nhóm 23- 08DSH2

7


Enterobacter sakazakii
2.1.2 Môi trường nuôi cấy và thuốc thử:
2.1.2.1 Môi trường nuôi cấy:
-Môi trường pha loãng mẫu nước đệm pepton Buffer Pepton Water (BPW)
-Môi trường thạch đậu tương trypton (TSA)

-Canh thang tryptoza lauryl sunfat cải biến (mLST)/môi trường vancomyxin
-Môi trường thạch phân lập Enterobacter sakazakii(ESIA TM )
-Môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI)
2.1.2.2 Môi trường và thuốc thử về đặc tính sinh hóa:
-Thuốc thử phát hiện oxidaza
-Môi trường L-lysin tách nhóm carboxyl (decarboxylation)
-Môi trường L-Ornithin tách nhóm carboxyl (decarboxylation)
-Môi trường L-Arginin cộng hai hydro (dihydrolation)
-Môi trường để lên men hydrat carbon (nước pepton có đệm phenol, D-sorbitol, L-sobitol,
L-rhamnoza, D-sucroza, D-melibioza và amygdalin)
-Môi trường Simmons xitrat
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ:
-Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (Autoclave)
-Pipet 1ml
-Nồi cách thủy, có thể duy trì ở nhiệt độ 44 0 C ± 0.5 0 C
-Đĩa Petri, đường kính từ 90mm đến 100mm
-Ống nghiệm, đường kính 18mm và dài 160mm
-Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 25 0 C ± 1 0 C, 30 0 C ± 1 0 C và 44 0 C± 1 0 C tương ứng
-Vòng cấy, đường kính 3mm hay vòng cấy sử dụng một lần
-Máy đo pH, có thể đo chính xác đến 0.1 pH ở nhiệt độ 25 0 C ± 1 0 C
2.1.4 Quy trình phân tích:

Nhóm 23- 08DSH2

8


Enterobacter sakazakii

Chuẩn bị mẫu thử/tiền tăng sinh:

Cân 25g mẫu cho vào 225ml môi trường BPW

Ủ ở 37C trong 18h ± 2h
Tăng sinh chọn lọc trong môi trường vancomyxin/mLST:
Chuyển 0.1ml từ BPW đã cấy vào 10ml môi trường vancomyxin/mLST

Ủ ở 44C trong 24h ± 2h
Phân lập trên thạch sinh màu chọn lọc:
Cấy vạch một vòng đầy dịch cấy từ môi trường vancomyxin/mLST lên
thạch sinh màu trong đĩa Petri

Ủ ở 44C trong 24h ± 2h

Khẳng định: Sinh màu vàng
Chọn năm khuẩn lạc điển hình và cấy vạch lên đĩa TSA

Ủ ở 25C trong 48h ± 4h
Khẳng định: Sinh hóa
Chọn một khuẩn lac màu vàng từ mỗi đĩa TSA để thử sinh hóa

9

Nhóm 23- 08DSH2
Diễn giải kết quả


Enterobacter sakazakii

2.1.5 Thuyết minh quy trình:
2.1.5.1 Chuẩn bị mẫu:

Cân 9g mẫu thử cho vào 225ml môi trường BPW. Để yên cho các mẫu khô tan trong
dịch lỏng mà không khuấy trộn. nếu sau 30 phút mà mẫu không hết thì trộn nhẹ nhàng
mẫu với môi trường.
2.1.5.2 Tiền tăng sinh:
Ủ mẫu đã cấy trong môi trường tiền tăng sinh ở 37 0 C ± 1 0 C trong 18h ± 2h
2.1.5.3 Tăng sinh chọn lọc:
Sau khi ủ mẫu thử được cấy trong môi trường tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml dịch cấy thu
được 10ml môi trường vancomyxin/mLST. Ủ ở 44 0 C ± 0,5 0 C trong 24h ± 2h
Nên sử dụng nồi cách thủy hoặc tủ ấm khí cưỡng bức để đảm bảo rằng nhiệt độ tối đa
không vượt quá.
2.1.5.4 Phân lập Enterobacter sakazakiigiả định:
Sau khi ủ trong môi trường vancomyxin/mLST đã cấy, ria cấy một vòng đầy (khoảng
10µl) lên bề mặt đĩa thạch phân lập. Ủ đĩa ở 44 0 C ± 1 0 C trong 24h ± 2h.
Sau khi ủ, kiểm tra đĩa thạch sinh màu về sự có mặt hay không có mặt các khuẩn lạc
điển hình Enterobacter sakazakii giả định. Các khuẩn lạc điển hình có màu xanh lá cây

Nhóm 23- 08DSH2

10


Enterobacter sakazakii
đến màu xanh lục, cỡ nhỏ đến trung bình (1mm-3mm). Các khuẩn lạc không điển hình
thường hoi trong suốt và có màu tím.
2.1.5.5 Khẳng định:
a. Sinh sắc tố vàng
Chọn từ một đến năm khuẩn lạc Enterobacter sakazakii giả định điển hình đã kiểm tra
trên đĩa thạch sinh màu đã ủ.
Cấy vạch các khuẩn đã chọn lên bề mặt đĩa thạch TSA, sao cho sau khi ủ quan sát được
các khuẩn lạc tách biệt. Ủ đĩa này ở 25 0 C ± 1 0 C trong 48h ± 4h. Sau khi ủ, kiểm tra các

đĩa TSA về sự có mặt các khuẩn lạc màu vàng. (Hình 1)

Hình 1. Khuẩn lạc màu vàng phát triển trên môi trường TSA
b. Khẳng định bằng sinh hóa:
Có thể sử dụng các bộ kit thử nhỏ có bán sẵn trên thị trường để nhận dạng bằng sinh hóa
để nhận dạng Enterobacter sakazakii.
Chọn một khuẩn lạc màu vàng từ mỗi đĩa thạch đậu tương trypton để nhận dạng bằng
sinh hóa theo các phép thử sau đây:

Nhóm 23- 08DSH2

11


Enterobacter sakazakii
• Phép thử oxidaza:

Dùng kim cấy sử dụng một lần hoặc que cấy
bằng thủy tinh, lấy một phần của mỗi khuẩn lạc
đặc trưng đã chọn.
Ria cấy lên giấy lọc được làm ẩm bằng thuốc
thử oxidaza. Không sử dụng vòng cấy hoặc que
cấy bằng niken hoặc crom.
Nếu màu của giấy lọc không đổi sang màu tím
hoa cà, màu tím hoặc màu xanh đậm trong 10s
thì phản ứng được xem là âm tính.(Hình 2)
Hình 2. Kết quả phép thử oxidaza

• Phép thử decarboxylaza L-Lysin:
Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay

dưới bề mặt môi trường lỏng L-Lysin decarboxylation. Ủ các ống này ở 30 0 C ± 1 0 C từ
24h ± 2h.
Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng chứng tỏ âm tính.
• Phép thử decarboxylaza L-Ornithin:
Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay
dưới bề mặt môi trường lỏng L-Ornithin decarboxylation. Ủ các ống này ở 30 0 C ± 1 0 C từ
24h ± 2h.
Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng chứng tỏ âm tính.
• Phép thử dihydrolaza L-Arginin:
Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay
dưới bề mặt môi trường lỏng dihydrolaza L-Arginin. Ủ các ống này ở 30 0 C ± 1 0 C từ 24h
± 2h.

Nhóm 23- 08DSH2

12


Enterobacter sakazakii
Sau khi ủ có màu tím chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng chứng tỏ âm tính.
(Hình 3)

Hình 3. Kết quả của phép thử decarboxylaza L-Lysin, L-Ornithing, L-Ariginin
• Phép thử lên men các loại đường khác nhau:
Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay
dưới bề mặt môi trường lỏng lên men hydrat carbon. Ủ các ống này ở 30 0 C ± 1 0 C từ 24h
± 2h.
Sau khi ủ có màu vàng chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu đỏ chứng tỏ âm tính.
• Phép thử sử dụng xitrat:
Dùng vòng cấy, que cấy hoặc đĩa thủy tinh lấy từng khuẩn lạc đã chọn cấy vào ngay

dưới bề mặt môi trường Simmons xitrat. Ủ các ống này ở 30 0 C ± 1 0 C từ 24h ± 2h.
Sau khi ủ môi trường chuyển sang màu xanh chứng tỏ phản ứng dương tính.(Hình 4)

Nhóm 23- 08DSH2

13


Enterobacter sakazakii

Đối chứng trắng

Nhóm 23- 08DSH2

Phản ứng âm tính

Phản ứng dương tính

14


Enterobacter sakazakii

Phản ứng âm tính

Đối chứng trắng

Phản ứng dương tính

Hình 4. Kết quả của thử nghiệm xitrat

2.1.5.6 Diễn giải kết quả:

Nhóm 23- 08DSH2

15


Enterobacter sakazakii

Phép thử khẳng định

Phản ứng dương tính hoặc
âm tính

Phần trăm chủng
Enterobacter sakazakii

Sinh màu vàng

+

cho phản ứng
>99

Oxidaza

-

>99

Decarboxylaza L-lysin

-

>99

Decarboxylaza L-Ornithin

+

±90

Dihydrolaza L-Arginin

+

>99

-lên men D-sorbitol

-

±95

-lên men L-rhamnoza

+

>99

-lên men D-sucroza

+

>99

-lên men D-melibioza

+

>99

-lên men amygdalin

+

>99

+

>95

Axit sinh ra từ việc

-thủy phân xitrat
 Phương pháp đếm khuẩn lạc:
2.1.1. Nguyên tắc:

Nhóm 23- 08DSH2

16


Enterobacter sakazakii
Brilliance™ Enterobacter sakazakii Agar (công thức chuẩn Chromogenic Enterobacter
sakazakii Agar) là môi trường sử dụng cho việc phân lập và đếm Enterobacter sakazakii
từ mẫu thực phẩm.
Công thức *
Tryptone
Soya peptone
Sodium chloride
Ferric ammonium citrate
Sodium desoxycholate
Sodium thiosulphate
Chromogen
Agar
pH 7.3 ± 0.2 @ 25°C

gm/lít
15.0
5.0
5.0
1.0
1.0
1.0
0.1
15.0

2.1.2. Cách tiến hành:
Cân 43.1g Brilliance Enterobacter sakazakii Agar đổ vào một lít nước cất. Lắc đều và

đun sôi đến khi hòa tan hoàn toàn. Thanh trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong vòng 15 phút
làm nguội đến 50°C. Trộn đều và đổ vào đĩa Petri.
2.1.3. Mô tả thí nghiệm:
Brilliance Enterobacter sakazakii Agar (DFI formulation1) dựa trên phản ứng α glucosidase , phản ứng này dựa trên sự kết hợp chặt chẽ giữa cơ chất chromogenic 5bromo-4-chloro-3-indolyl- α -D-glucopyranoside có mặt trong môi trường. Enzyme α glucosidase, hiện diện trong Enterobacter sakazakii, cơ chất hydrolyses sinh ra khuẩn lạc
màu xanh trên đĩa môi trường màu vàng xám.
Proteus vulgaris cũng có hoạt tính α -glucosidase dương tính yếu và cũng có thể phát
triển để sinh ra những khuẩn lạc có màu tương tự như E. sakazakii.
Tuy nhiên, trên môi trường này, Proteus spp mọc lên là những khuẩn lạc màu xám: chúng
sản sinh ra hydrogen sulphide trong sự hiện diện của ferric ions hình thành nên ferrous
sulphide. Desoxycholate có tác dụng làm ẩn đi sự phát triển của hầu hết vi sinh vật Gram
dương.

Nhóm 23- 08DSH2

17


Enterobacter sakazakii
Phương pháp FDA hiện nay cho phép phát hiện Enterobacter sakazakii dựa trên việc
sản sinh ra đốm màu vàng theo nghiên cứu của Muytjens et al.4. Các mẫu được giữ ấm
trong nước qua đêm, sau đó được làm giàu trong môi trường EE broth (CM0317), bước
tiếp theo sử dụng môi trường VBRGA (CM0485) để đồng hóa Enterobacteriaceae. 5
khuẩn lạc được chọn lọc và xếp dãy trên môi trường Tryptone Soya Agar (CM0131), giữ
ấm 3 ngày và quan sát màu vàng của khuẩn lạc, nó đặc trưng cho Enterobacter sakazakii.
(Hình 5).Tuy nhiên , phương pháp này
không cho phép phân lập Enterobacter
sakazakii và việc kết hợp EE broth với
VRBGA có thể cho phép các dòng khác
ngoài Enterobacteria phát triển vượt trội
hơn Enterobacter sakazakii đồng thời

cho kết quả âm tính sai. Điều này chứng
tỏ rằng không thể chọn lọc khuẩn lạc
Enterobacter

sakazakii

từ

thạch

VRBGA.
Hình 5. Khuẩn lạc của E.sakazakii
2.2 Phương pháp hiện đại(PCR):
2.2.1 Chuẩn bị mẫu thử:
- Có tổng cộng 22 mẫu thực phẩm bao gồm các mẫu sữa và các sản phẩm thức ăn khác
nhau cho trẻ sơ sinh lấy từ các siêu thị địa phương ở miền nam Châu Phi.
- Đối với mẫu thực phẩm: Đặt 100g sản phẩm vào bình chứa vô trùng và thêm 900ml
nước cất vô trùng ở nhiệt độ 45oC. Hỗn hợp này được ủ qua đêm ở 37 oC, sau khi có bản
sao thứ ba thì lấy 2ml mẫu để tách chiết DNA.
- Đối với sản phẩm sữa tiệt trùng, các bình chứa được ủ trực tiếp qua đêm ở 37 oC. Sau đó
10ml mẫu ủ này được chuyển vào canh trường EE và ủ qua đêm ở 37 oC và khi mẫu được
nhân lên ba lần thì được lấy để chiết xuất DNA.
2.2.2 Tách chiết DNA:

Nhóm 23- 08DSH2

18


Enterobacter sakazakii

Tách DNA được thực hiện theo phương pháp sửa đổi của Van Elsas. Trước khi chiết
xuất DNA, 2ml mẫu được ly tâm ở mức 5900 x g trong 10 phút. Sau khi ly tâm ta loại bỏ
phần lỏng, lấy phần cặn rồi bỏ thêm các thành phần sau:
+ hạt thủy tinh tiệt trùng (0.6g) (có đường kính 0.2-0.3 mm)
+ 800 µl đệm phosphat (1 phần 120 mM NaH2PO4 và 9 phần 120 mM Na2HPO4)
+ 700 µl phenol
+ 100 µl sodium dodecyl sulfate (SDS) 20%(m/v)
Sau đó hỗn hợp này được ly tâm trong 2 phút và ủ ở nhiệt độ 60 oC trong 20 phút và lặp
lại bước tiến hành này 2 lần. Sau khi ủ, mẫu được ly tâm trong 5 phút ở mức độ 1500 x g.
Dịch được thu lại và các protein được tách chiết với 600 μl phenol. Tiếp theo ta cho 600
µl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1) cho đến khi kỳ trung gian được

sạch sẽ. DNA được kết tủa bằng 0,1g sodium acetate 3M (NaOAc) (pH 5.5) và 0,6 g
isopropanol. Các mẫu được lưu giữ trong tủ lạnh trong khoảng 1 giờ và sau đó ly tâm
trong 10 phút ở 15000 x g.
2.2.3 Khuếch đại PCR:
2.2.3.1 Thiết kế mồi:
Các cặp mồi Esak2 (5 'CCC GCA TCT CTG CAG TCT GAT C 3') và Esak3 (5 'CTA
ATA CCG CAT AAC GTC TAC G 3') được phát triển cho khuếch đại đặc trưng của E.
sakazakii.
2.2.3.2 Phản ứng PCR:
a) Chuẩn bị mẫu phản ứng:
- Phản ứng phát hiện PCR được thực hiện trong tổng thể tích phản ứng 25 µl có chứa 1U
(0,35 µl ) Taq ADN polymerase, 2,5 µl đệm magie tự do được cung cấp với enzyme, 2
mM (1,5 ml)MgCl2, 1 µl dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 mM (1 µl ) dNTPs, 0.5 μM (0,5
ml) mỗi mồi và 750 μg / ml (1 µl ) mẫu DNA.
- Đối với mẫu đối chứng dương thì ta lấy 1 µl chiết xuất DNA từ môi trường tinh sạch của
E. sakazakii và mẫu đối chứng âm thì ta thay thế DNA mẫu bằng 1 µl nước cất vô trùng.
b) Cách tiến hành PCR:

Nhóm 23- 08DSH2

19


Enterobacter sakazakii
Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện bằng cách sử dụng một Mastercycler
(Eppendorf, Đức) và điều kiện khuếch đại như sau:
- Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 95 ° C trong 2 phút cho các biến tính ban đầu, tiếp theo là
35 chu kỳ trong 35 giây ở 95 ° C cho biến tính thêm.
- 1 phút ở 61 ° C cho mồi ủ.
- 1 phút tại 72 ° C để kéo dài chuỗi và chuỗi cuối cùng kéo dài trong 10 phút ở 72 ° C.
c) Kết cấu của IAC (internal amplification control):
Một phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Esak2 và Esak3 được thực hiện trên
DNA lấy từ tế bào tinh sạch E. sakazakii phát triển trên môi trường TSA. 10 µl của 850
bp PCR amplicon đã được phân giải với 1 U (1 µl ) của các enzym AluI endonuclease cắt
hạn chế, với sự hiện diện của 1 bộ đệm hạn chế (1,5 µl ) và 2,5 µl nước cất vô trùng. Sau
đó hỗn hợp phản ứng đã được ủ qua đêm ở 37 ° C. Các sản phẩm tiêu hóa được điện di
trên 3% (m / v) agarose gel có chứa Ethidium bromide và biểu diễn dưới tia UV.
Hai kết quả phân đoạn chứa vị trí liên kết của các mồi tương ứng được cắt ra từ gel
agarose và làm sạch bằng cách sử dụng bộ sản phẩm làm trong PCR tinh sạch cao theo
đặc điểm kỹ thuật của nhà sản xuất (Hình 1).

Nhóm 23- 08DSH2

20


Enterobacter sakazakii

Sau khi làm sạch, 10 µl mỗi đoạn được nối lại khi sử dụng 1 U (1 ml) T4 DNA
ligase. Một phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trên đoạn nối
bằng cách sử dụng PCR mồi Esak2 và Esak3 như mô tả. Các kết quả
Sản phẩm PCR đã được nhân bản vô tính bằng cách sử dụng Inst / AcloneTM bộ sản
phẩm PCR nhân bản. Các tế bào biến đổi đã được sàng lọc các chèn kích thước đúng bằng
mồi T7 (5'-GTA ATA ATA CGA CTC ACT GGG-3 ') và SP6 (5'-TAC GAT TTA GGT
GAC ACT ATA G-3 '). PCR đã được thực hiện trong một tổng thể tích phản ứng 50 μl có
chứa 0,5 μM (2μl) của mỗi mồi, 0.5 mM (2μl) dNTPs,1 U (1,5 ml) Taq ADN polymerase,
bộ đệm chứa MgCl2 (5 ml) cung cấp với các enzyme và các tế bào chuyển đổi.
Plasmid DNA được phân lập từ các chủng tái tổ hợp bằng cách sử dụng Qiagen Midi
plasmid kit. Các DNA plasmid được sử dụng như một IAC trong tất cả các PCR phản ứng
để phát hiện E. sakazakii ở Nam Phi trong sữa và thức ăn cho trẻ. Việc xây dựng IAC đã
được lập trình tự với Esak3 mồi bằng cách sử dụng chuỗi DNA ABI PRISM 377 tại các
cơ sở trình tự DNA tại Đại học Stellenbosch. Điều này đã được thực hiện để xác nhận sự
hiện diện của vị trí kết nối hai mồi và kích thước chính xác của IAC.

Nhóm 23- 08DSH2

21


Enterobacter sakazakii
Sau khi xác định nồng độ DNA của DNA plasmid bị cô lập, nồng độ tối ưu là tạo ra một
tín hiệu dương tính cho cả hai E. sakazakii DNA và các IAC đã được xác định. Phần phân
ước của 1 ml của IAC được thêm vào tất cả các phản ứng PCR được thực hiện, không bao
gồm mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.
2.2.4 Kết quả PCR:

Sau khi cắt các cặp base có kích thước 850 (bp) từ sản phẩm PCR E. sakazakii, hai
đoạn chứa các vị trí liên kết của các cặp mồi (79 và 161 bp kích thước) được gắn với một

IAC kích thước 240 bp. IAC được phát triển để ngăn ngừa kết quả âm tính giả (Hoorfar et
al., 2004) và một đoạn dương tính cho cả hai DNA mục tiêu (850 bp) và IAC (240 bp) với
nồng độ tối thiểu là 0,72 pg.ml-1 của IAC đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng PCR. IAC
có giá trị để ngăn chặn kết quả âm tính giả và là một chỉ thị khi phản ứng PCR thất bại.
Trong kết quả của thí nghiệm này, sự hiện diện của 850 bp sản phẩm khuếch đại PCR cho
thấy sự có mặt của E. sakazakii, trong khi một đoạn 240 bp cho thấy sự khuếch đại PCR
đã thành công.

Nhóm 23- 08DSH2

22


Enterobacter sakazakii
 Kết luận:
Enterobacter sakazakii được phát hiện trong 4 mẫu trên tổng số 22 mẫu ( chiếm 18%
sản phẩm thử nghiệm)(Bảng 1). Điều này chứng minh sử dụng phương pháp PCR có hiệu
quả sau khi mẫu tăng sinh trong canh trường EE. Như vậy trong tương lai phương pháp
PCR kết hợp với IAC có thể được dùng như là một phương pháp nhanh chóng và chính
xác để phát hiện E. sakazakii trong các sản phẩm từ IFM hơn là phương pháp xác định
truyền thống như hiện nay.

Nhóm 23- 08DSH2

23


Enterobacter sakazakii

CHƯƠNG III. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

3.1 Kết luận:
Sự hiện diện của Enterobacter sakazakii trong IFM nên được coi là một nguy cơ
nghiêm trọng vì tiềm năng của vi sinh vật này được nhân lên trong quá trình chuẩn bị và
bảo quản sữa trước khi tiêu thụ các sản phẩm sữa hoàn nguyên (Anon., 2004).
Enterobacter sakazakii là một vi sinh vật môi trường và do đó phải khuyến cáo rằng tất cả
các nguyên liệu thô và các sản phẩm cuối cùng phải được kiểm tra và đánh giá cao về sự
hiện diện của trực khuẩn này để ngăn chặn sự lây nhiễm có trong các sản phẩm sữa bột
được phân phối. Thậm chí việc nhiễm E. sakazakii với tỷ lệ thấp vẫn có thể gây rủi ro cho
trẻ sơ sinh, do đó, điều quan trọng là phải giáo dục mọi người nhất là những bậc cha mẹ
về cách chăm sóc đối với trẻ sơ sinh và các nguy cơ tiềm ẩn liên quan đến việc sử dụng
không phù hợp của IFM.
3.2 Đề nghị:
Đối với bài báo cáo này nhóm chúng tôi đã gặp một ít khó khăn về việc tìm kiếm nguồn
thông tin để xác định cấu trúc và cơ chế gây bệnh của loài này chưa được xác định cụ thể.
Chúng tôi hy vọng sẽ được cung cấp thêm tài liệu để hoàn thành tốt hơn bài báo cáo này.
Hiện nay trên thế giới việc nhiễm trùng IFM bởi Enterobacter sakazakii đã được báo cáo
nhưng ở Việt Nam thì con số này chưa được thống kê rõ ràng. Chính vì thế, nước ta nên
có một con số cụ thể về số lượng trẻ sơ sinh bị nhiễm bởi E. sakazakii nhằm mục đích
khuyến cáo đến người tiêu dùng trong việc lựa chọn sản phẩm IFM trong và ngoài nước.
Việc sản xuất sữa chỉ quan tâm đến hàm lượng chỉ tiêu các chất dinh dưỡng như DHA,
sắt, các loại vitamin, protein, lipit… mà không chú trọng đến chỉ tiêu vi sinh (sự hiện diện
của các loài vi khuẩn có hại, đặc biệt là Enterobacter sakazakii) đã phần nào làm ảnh
hưởng đến chất lượng sữa đe dọa sức khỏe đối với trẻ sơ sinh.

CHƯƠNG IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Nhóm 23- 08DSH2

24

Enterobacter sakazakii
1- Lê Văn Mẫn(chủ biên), Lại Mai Hương - Thí nghiệm vi sinh vật học thực
phẩm- NXB ĐH Quốc Gia TPHCM
2- Sữa và sản phẩm sữa- Phát hiện Enterobacter sakazakii – TCVN 7850:2008
3- Các trang web tham khảo:
/> /> /> /> />
/>
Nhóm 23- 08DSH2

25