Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật adn trong việc giám định hài cốt liệt sỹ

chơng trình khoa học và công nghệ trọng điểm
cấp nhà nớc kc 04

bộ quốc phòng
viện pháp y quân đội

báo cáo tổng kết đề tài m số kc 04.23

nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật adn
trong việc giám định hài cốt liệt sỹ

chủ nhiệm đề tài: pgs.ts. nguyễn trọng toàn

6103
20/9/2006

hà nội - 2006


ADN

C¸c ch÷ viÕt t¾t
Axit deoxyribonucleic

Bp

Base pair

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

dATP

Deoxyadenine triphosphate

dCTP

Deoxycytosine triphosphate

dGTP

Deoxyguanine triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

EDTA

Disodium ethylenediamintetra-acetate dihydrate

HV1

Hypervariable 1

HV2

Hypervariable 2

MtADN

Mitochondrial ADN

NucADN

Nuclear ADN

PA

Polyacrylamide

PCR

Polymerase chain reaction

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

STR

Short tandem repeat

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Themus aquaticus

TBE

Tris Boric EDTA

TE

Tris EDTA

TEMED

N, N, N’, N’- tetramethyl- ethylenediamine

UV

Ultra violet

VNTR

Variable number of tandem repeat

1


lời mở đầu
Nhận dạng cá thể là một nhu cầu tất yếu đối với các lĩnh vực khác nhau
của đời sống xã hội: từ khảo cổ học, nhân chủng học, điều tra tội phạm đến
việc tìm kiếm ngời mất tích cũng nh xác định quan hệ huyết thống của các
hài cốt liệt sĩ. Trớc đây, việc xác định, nhận dạng cá thể chủ yếu dựa vào
các phơng pháp hình thái học, so sánh đối chiếu hồ sơ răng, lồng ảnh vào

xơng sọ bằng hệ thống gơng bán mạ hoặc bằng kỹ thuật vi tính tái tạo lại
khuôn mặt trên cơ sở phân tích hài cốt. Tuy nhiên các kỹ thuật này có độ
chính xác không cao, hơn nữa lại cần có những mẫu hài cốt còn khá nguyên
vẹn và có những đặc thù riêng nh có hồ sơ răng, ...
Các dẫn chứng khoa học đã chứng minh rằng ADN có thể tồn tại trong
các phần sót lại của cơ thể đã chết lâu năm, trong đó phần cơ thể tốt nhất để
nghiên cứu tách chiết ADN, nhân bản các gen là các mẩu xơng và răng. Sử
dụng các mẩu xơng ngời chết từ 500 đến 1200 năm về trớc các tác giả đã
tách chiết đợc các phân tử ADN nguyên vẹn bảo đảm cho việc nhân bản và
nghiên cứu các gen của ngời tiền sử (Hagelberg, 1989; Hanni, 1995,
Kalmar, 2000).
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học công nghệ, đặc biệt trong lĩnh
vực công nghệ sinh học, việc giám định và nhận dạng cá thể nhờ áp dụng kỹ
thuật ADN nh AFLP, RFLP, PCR... đã thu đợc những kết quả tốt với độ
chính xác cao, giải quyết đợc những trờng hợp mà các phơng pháp khác
không thể giải quyết đợc. Sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bản các gen đặc
thù trong nhân hoặc trong các bào quan khác nh ti thể, lục lạp đã giúp cho
việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể cũng nh các nghiên cứu
khác về gen đạt nhiều kết quả tốt.
Sử dụng kỹ thuật ADN để phân tích trình tự nucleotide của vùng siêu
biến trong mtADN, các phòng thí nghiệm của Mỹ The Armed Forces DNA
2


Identification Laboratory (AFDIL) và The U.S.Army Central Identification
Laboratory, Hawaii(CILHI)... đã xác định phả hệ của các hài cốt đợc quy
tập từ các cuộc chiến tranh thế chiến thứ II, chiến tranh Triều tiên, chiến
tranh Việt nam (Stoneking et al., 1991; Holland et al., 1999).
Đối với Việt Nam, mỗi năm có tới hàng trăm các trờng hợp nạn nhân
trong các vụ án mạng, tai nạn, tự sát... cha rõ tung tích, đặc biệt khoảng

200. 000 trờng hợp liệt sĩ vô danh cần xác định phả hệ.
Nhiều hài cốt đã và đang đợc quy tụ từ các chiến trờng xa về các
nghĩa trang liệt sĩ, nhng có rất ít di hài xác định đợc địa chỉ, mối quan hệ
huyết thống, phả hệ. Phần lớn các di hài đều vô danh không thể xác định
đợc địa chỉ, mối quan hệ với các gia đình có con em bị hy sinh trong hai
cuộc kháng chiến trớc đây, các tài liệu liên quan tới các liệt sĩ vô danh (nh
các giấy tờ, bằng chứng liên quan tới ngày nhập ngũ, đơn vi chiến đấu, ngày
hy sinh, chiến trờng đã hy sinh, nơi chôn cất...) hoặc không còn hoặc còn
rất ít và nằm rải rác ở các địa phơng cần đợc tập hợp thành tàng th tạo
điều kiện cho việc xác định hài cốt sau này... Vì vậy, việc xác định tên liệt sĩ
vô danh, những ngời đã anh dũng hy sinh trong hai cuộc kháng chiến bảo
vệ Tổ Quốc trớc đây là một vấn đề mang tính xã hội và nhân văn cao cả.
Đây cũng là chủ trơng lớn của Đảng và Nhà Nớc ta.
Cùng với những thành tựu trong lĩnh vực nghiên cứu về gen của các nhà
khoa học trên thế giới, những thành công ban đầu của Viện Công nghệ sinh
học, Viện Pháp y Quân đội cũng nh các đơn vị nghiên cứu, các trờng Đại
học, chúng tôi mạnh dạn nhận thực hiện đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật ADN trong việc giám định hài cốt liệt sỹ.

3


Mục tiêu cơ bản của đề tài
Nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích ADN ty thể tách chiết từ các
mẫu hài cốt (răng, xơng) lâu năm qua đó thiết lập mối liên quan di
truyền theo phả hệ dòng mẹ phục vụ cho việc giám định nhận dạng hài
cốt liệt sỹ.
Nội dung chính của đề tài
Nghiên cứu xây dựng qui trình thu thập , giám định kỳ đầu và bảo
quản mẫu hài cốt liệt sỹ, mẫu sinh phẩm phục vụ cho việc tách chiết

mtADN.
Thu thập, lu trữ, và quản lý tàng th các tài liệu liên quan tới liệt sỹ
vô danh cần giám định nhận dạng bằng phần mềm chuyên dụng phục
vụ cho việc truy cập thông tin, xác định phả hệ các liệt sỹ vô danh.
Thiết lập mối quan hệ di truyền theo dòng mẹ của các liệt sỹ vô danh
tạo điều kiện thu thập mẫu sinh phẩm chuẩn xác phục vụ cho việc tách
chiết mtADN của các phả hệ có liên quan.
Nghiên cứu qui trình tách chiết mtADN từ các mẫu hài cốt, sinh phẩm.
Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản đoạn ADN vùng siêu biến
của mtADN từ các mẫu hài cốt, sinh phẩm.
Nghiên cứu qui trình nhân bản vùng siêu biến trong mtADN từ các
mẫu hài cốt, sinh phẩm. Tạo dòng các đoạn gen ADN để giải trình tự
vùng siêu biến.
Tiến hành phân tích mức độ tơng đồng và khác biệt giữa trình tự
vùng siêu biến các mẫu đã giải trình tự bằng phần mềm chuyên dụng
để xác định phả hệ cho các hài cốt liệt sỹ vô danh.
Xây dựng phần mềm quản lý cơ sở dữ liệu.

4


Các sản phẩm KHCN của đề tài
Quy trình thu thập và bảo quản mẫu hài cốt, mẫu sinh phẩm
Quy trình giám định kỳ đầu mẫu hài cốt
Quy trình tách chiết mtADN của các mẫu hài cốt, sinh phẩm
Quy trình nhân bản HV1, HV2 của mtADN từ mẫu hài cốt, sinh phẩm
Quy trình dòng hóa các đoạn gen đặc hiệu phả hệ
Quy trình giải trình tự các đoạn gen đặc hiệu phả hệ, phân tích kết
quả.
Phần mềm quản lý tàng th liệt sỹ, quản lý cơ sở dữ liệu nghiên cứu.

5



- Cột sống: có 32 đốt sống, trong đó có 5 đốt sống cùng dính liền nhau
tạo nên xơng cùng và 3 đốt sống cụt cũng dính liền nhau tạo nên xơng cụt;
- Lồng ngực: Gồm có đoạn cột sống ngực, xơng ức và 12 đối xơng
sờn.
+ Xơng sọ mặt: Gồm 8 xơng sọ và 14 xơng mặt họp thành hộp sọ và
khối xơng mặt
+ Xơng chi trên và xơng chi dới: Chi trên dính vào thân bởi đai vai
(gồm xơng đòn và xơng vai); Chi dới dính vào thân bởi đai chậu (gồm 2
xơng chậu dính thẳng vào xơng cùng của cột sống). Mỗi chi có 3 đoạn:
Cánhtay hoặc đùi, cẳng tay hoặc cẳng chân, bàn tay hoặc bàn chân (gồm có
cổ tay hoặc cổ chân, bàn tay hoặc bàn chân, ngón tay hoặc ngón chân).
1.1.1.2. Phân loại xơng:
a. Về mặt hình thể, xơng đợc phân làm 5 loại:
+ Xơng dài: Xơng ở chi, gồm có 1 thân xơng và hai đầu, phần nối
giữa đầu và thân xơng là cổ xơng;
+ Xơng ngắn: Hình thể nh xơng dài, gồm các xơng bàn tay, ngón
tay, bàn chân, ngón chân;
+ Xơng dẹt: Xơng sọ, xơng bả vai, xơng ức, xơng chậu
+ Xơng khó định hình: Gồm các xơng hình thể phức tạp nh: Xơng
hàm trên, xơng thái dơng, xơng sàng, xơng bớm;
+ Xơng vừng: Các xơng nằm ở giữa các gân cơ
b. Về mặt cấu trúc
+ Đại thể:
- Xơng đặc: Là lớp xơng mịn, chắc, rắn, màu vàng nhạt thờng bao
quanh thân xơng tạo nên một ống xơng dày ở quãng giữa và mỏng dần ở

hai đầu

7



- Các tế bào xơng nằm giữa các lá xơng nên đợc bảo vệ rất tốt chống
lại những yếu tố bất lợi của môi trờng. Đây là nguồn cung cấp ADN cho
những giám định hài cốt.
Phơng pháp hình thái học dựa trên sự quan sát các đặc điểm hình thái:
Các đặc điểm mang tính lỡng hình giới tính của xơng sọ (ụ chẩm ngoài,
điểm Glabella, gờ trên ổ mắt, xơng chũm, xơng hàm dới...), xơng chậu
(vùng dới xơng mu, khuyết hông lớn, rãnh trớc diện nhĩ...) (Wilton
Marion, 1903). Các đặc điểm hình thái trong xác định tuổi của xơng sọ (độ
liền khớp xơng sọ), xơng chậu (bề mặt sụn tiếp hợp xơng mu, diện nhĩ
...), độ mòn răng (Jonathan Haas và CS, 1944). Cũng nh các đặc điểm đặc
biệt (chấn thơng, bệnh lý...) và các số liệu đo đạc trên các xơng dài nhằm
trả lời các câu hỏi:
+ Là xơng ngời hay xơng động vật ?
+ Chủng tộc nào?
+ Giới tính nào?
+ Tầm vóc bao nhiêu?
+ Tuổi chừng bao nhiêu?
+Số lợng cá thể ?
Tuy nhiên, phơng pháp này đòi hỏi hài cốt phải còn tơng đối nguyên
vẹn, với những hài cốt bị mủn, mục, gãy, nát thì gần nh không thể tiến hành
đợc. Mặt khác giá trị truy nguyên của phơng pháp này thấp, không chỉ rõ
đợc hài cốt này là của cá thể nào do vậy trong giám định nhận dạng hài cốt
nó chỉ có giá trị sàng lọc.
1.1.2 Phơng pháp nhận dạng hài cốt dựa trên hồ sơ răng

Nguyên lý của phơng pháp này dựa trên sự so sánh đối chiếu các đặc
điểm răng của hài cốt với hồ sơ răng của nạn nhân trớc khi chết ( tình trạng
mọc của răng, tình trạng hàn răng...) để nhận dạng hài cốt. Giá trị truy

9


nguyên của phơng pháp này rất cao, tuy nhiên yêu cầu phải có hồ sơ răng
của nạn nhân trớc khi chết.
* Cấu tạo của răng:
Răng gồm 3 phần: (Hình 3)
+ Thân răng, cổ răng, chân răng.
Trong răng có ống tủy răng, trong tủy có thần kinh và mạch máu. Bao
quanh ống tủy là ngà răng, ngà răng đợc bao bọc ở thân bởi men răng và ở
chân răng bởi chất xi măng.
Răng ngòi đợc chia làm 2 giai đoạn phát triển : răng sữa và răng vĩnh
viễn ( Hình 4).Số lợng răng:
- Răng sữa 20 chiếc cả hàm trên và hàm dới gồm răng cửa, răng nanh và
răng hàm bé. đến thời gian nào đó răng sữa dụng và lớp răng khác mọc lên
gọi là răng vĩnh viễn.
- Răng vĩnh viễn thông thờng có 32 chiếc ở cả hai hàm. Gồm 08răng
cửa, 04 răng nanh, 08 răng hàm bé, 12 răng hàm lớn. Răng ở hàm dới mọc
trớc răng hàm trên theo từng loại một. Răng cửa mọc trớc nhất, trớc tiên
là răng cửa giữa và bên, rồi răng hàm thứ nhất, sau đó mọc răng nanh, sau
nữa là răng hàm bé và răng hàm lớn. Thời gian mọc răng vĩnh viễn ở ngời
Việt Nam thông thờng nh sau:
- 6 tuổi mọc răng hàm lớn 1.
- 6-8 tuổi mọc răng cửa giữa.
- 8-9 tuổi mọc răng cửa bên.

- 9-10 tuổi mọc răng cửa bé 1.
- 10-11 tuổi mọc răng nanh.
- 11-12 tuổi mọc răng hàm bé 2.
- 12-14 tuổi mọc răng hàm lớn 2.
- 16-30 tuổi mọc răng khôn( răng hàm lớn thứ 3).

10


Hình 3. Cấu trúc của răng
Enamel: men răng, dentin: ngà răng, dental pulp: tủy răng, cementum:
xơng răng, periodontal membrane: màng quanh răng. free gingiva: lợi,
alveolar bone: xơng ổ răng.
Có một tỷ lệ ngời nhất định không có răng khôn hoặc là răng khôn
không đầy đủ ( chiếm tỷ lệ 13% ) .
*Phân loại răng: (Hình 4)
+ Răng cửa: Gồm 4 răng cửa trên và 4 răng răng cửa dới. Răng cửa
hình cái xẻng, chân răng hình nón, thân răng dẹt, hơi lồi ở mặt trớc.
+ Răng nanh: Có 2 răng nanh trên, 2 răng nanh dới, hình tháp 4 cạnh.
Đỉnh của nó hơi nhọn, mặt trớc lồi, mặt sau lõm. Chân răng dài gấp 2 lần
thân răng, chân răng nanh trên dài hơn chân răng nanh dới.
+ Răng hàm bé: Thân có 2 mấu, một ở trong, một ở ngoài, đợc chia
cách nhau bởi một rãnh. Hai mặt bên lồi. Chỉ có 1 chân răng (có khi chân
răng tách đôi). Có 4 răng hàm bé trên và 4 răng hàm bé dới.
+ Răng hàm lớn: Có thân răng rất lớn và 4 mấu. Răng hàm trên thờng
có 3 chân (2 chân ngoài và 1 chân trong). Răng hàm lớn dới có 2 chân (1

11

chân trớc và 1 chân sau). Mỗi bên của một hàm trên hoặc dới đều có 3
răng, răng trong cùng là răng khôn.

Hình 4: Răng vĩnh viễn
1.1.3 Phơng pháp lồng ảnh vào xơng sọ

Nguyên lý của phơng pháp này là tiến hành lồng ảnh chân dung của
ngời chết vào xơng sọ mặt. Công việc này đợc tiến hành trên hệ thống
gơng bán mạ hoặc phần mềm xử lý ảnh Photoshop qua đó đánh giá mức độ
phù hợp giữa xơng sọ mặt và ảnh chân dung để nhận dạng hài cốt. Yêu cầu
của phơng pháp này là xơng sọ mặt phải còn tơng đối nguyên vẹn và phải
có ảnh chân dung của ngời chết.
1.1.4 Phơng pháp tái tạo khuôn mặt

Phơng pháp này lần đầu tiên dợc sử dụng trong việc tái tạo khuôn mặt
từ sọ ngời Neanderthal và Cro-Magnon (Jonathan Haas và CS, 1944), tiếp
đó là tái tạo khuôn mặt của các xơng sọ ngời đã hóa thạch. Trong lĩnh vực
pháp y đã có rất nhiều tác giả trên thế giới có các công trình nghiên cứu về
vấn đề này, nổi bật là Eisenfeld và cộng sự -1974, Walker-1976. Nguyên lý

12


của phơng pháp này là tái tạo lại khuôn mặt từ xơng sọ dựa trên các chỉ số
về độ dày mỏng của mô mặt, mối tơng quan giữa nhãn cầu và xơng ổ mắt,
giữa độ cao của mũi với độ rộng của hốc mũi, giữa chiều rộng của miệng với
so với khoảng cách giữa răng nanh và răng hàm bé... Tuy nhiên yêu cầu của
phơng pháp này là xơng sọ phải còn tơng đối nguyên vẹn.
1.1.5. Phơng pháp phân tích gen

1.1.5.1 Các mẫu dùng để tách chiết ADN:
* Máu:

Máu là một dịch lỏng hơi nhớt, vị mặn, chiếm khoảng 1/3 trọng lợng
cơ thể. Bình thờng độ pH của máu ngời đợc cố định ở trong khoảng 7,35
7,45. Tỷ trọng của máu là 1,051 1,060 (Phạm Phan Địch, Nguyễn Văn
Ngọc, Đỗ Kính, 1984) . Cấu tạo của máu gồm 2 thành phần: Huyết tơng và
huyết cầu. Huyết cầu gồm:
+ Hồng cầu
+ Tiểu cầu
+ Bạch cầu (có 2 loại):
- Có hạt: Bạch cầu trung tính, bạch cầu a a xít, bạch cầu a ba zơ
- Không hạt: Lim phô bào, bạch cầu đơn nhân.
Trong máu chỉ các tế bào bạch cầu mới có nhân do vậy tách ADN từ
máu thực ra là tách ADN từ bạch cầu. Trung bình 1 ml máu ngời có khoảng
7000-9000 bạch cầu, mỗi bạch cầu chứa khoảng 5-6 pg ADN, khi tách chiết
1ml máu có thể thu đợc từ 20-50 àg ADN.
* Lông, tóc:

Lông, tóc ngời gồm 2 phần: phần thân và phần chân. Cả 2 phần đều có
ADN, tuy nhiên việc tách chiết ADN từ phần chân của lông tóc (còn bao
gốc) thì dễ dàng hơn. Một gốc tóc chứa khoảng 250 ng ADN (Lorne T
Kirby, 1992) do vậy thậm chí chỉ cần 1 sợi tóc có bao gốc cũng đủ để tiến

13


hành phân tích ADN. Đối với phần thân tóc thì việc tách chiết ADN phức tạp
hơn.
* Tế bào niêm mạc miệng:

Các tế bào niêm mạc miệng bị bong ra và lẫn trong nớc bọt. dấu vết
của tế bào niêm mạc miệng thờng ở dạng nớc bọt nhổ trực tiếp ra, nớc
bọt tẩm tem th, mép bì th, đầu mẩu thuốc lá.
* xơng:

Xơng không những bền vững về mặt vật lý mà còn có khả năng bảo
quản tốt ADN do lợng nớc và các enzym phân hủy trong xơng tơng đối
thấp làm cho các tế bào xơng và nguyên bào xơng bị khô đi nhanh chóng
sau khi chết.
Hơn nữa đặc điểm cấu trúc của xơng (hình 2) tạo thành 1 rào cản vật
lý đối với các yếu tố tác động từ bên ngoài nh tia cực tím, vi sinh vật. Mỗi
mm3 xơng đặc có khoảng 20.000 tế bào xơng (William D. Haglund và
Marcella H. Sorg, 1997). Phần lớn vỏ xơng đợc cấu tạo bằng muối phốt
phát can xi kết tinh (hydroxyapatite) là thành phần liên kết hai sợi của phân
tử ADN. Với mỗi gram xơng đặc còn tơng đối tơi ngời ta có thể thu
đợc tới 1 microgam ADN. Với những xơng xốp còn tơi nh xơng sờn
có thể thu đợc lợng ADN gấp 10-20 lần, xong sau 1 thời gian dài sau chết
thì lợng ADN trong các xơng xốp lại ít hơn xơng đặc. Hochmeister và
cộng sự đã chiết ADN từ xơng của một số xác chết đã thối rữa và nhận thấy
rằng kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các đoạn ADN đợc cắt bằng
enzym giới hạn - RFLP (Restricted Fragment Leng Polimorphism) chỉ thành
công trong 1 số trờng hợp còn đại đa số là không thành công vì ADN bị
phân hủy quá nhiều, trong khi đó kỹ thuật phân tích các đoạn lặp ngắn STR
(Short Tandem Repeat) lại thành công ngay cả với các mẫu sau chết tới 11
năm. Bằng kỹ thuật phân tích ADN ty thể trên xơng ngời ta đã nhận dạng
thành công các thành viên trong gia đình Nga Sa Hoàng bị cách mạng
14

Bolsheviks xử bắn năm 1918. Phân tích ADN ty thể trên xơng còn đợc sử
dụng để nhận dạng hài cốt các quân nhân Mỹ bị mất tích trong chiến tranh
Việt Nam trong điều kiện các hài cốt đã chịu sự tác động khắc nghiệt của
môi trờng với thời gian vài chục năm.
Mối tơng quan giữa ADN tách từ xơng với hình thái học của xơng:
Đối với ADN tách từ xơng, ít có sự liên quan giữa mức độ thành công của
việc nhân bản ADN với tuổi của mẫu nhng có sự liên quan giữa sự thành
công của việc nhân bản với hình thái học của xơng cũng nh các đặc điểm
vi thể của tế bào xơng và vỏ xơng. Năm 1993 Hagberger Clegg đã nhân
bản ADN ty thể của 38 mẫu xơng, thành công 21 mẫu và nhận thấy rằng:
đối với những mẫu xơng đặc, chắc, có màu sáp ong tỷ lệ thành công rất cao.
Trong khi những xơng dòn, bị rỗ, màu nâu thờng là khó thành công.
* răng:

Răng với đặc điểm cấu trúc của nó (hình 3) đợc coi là nguồn cung cấp
ADN ty thể tốt bởi những lý do sau:
- Răng có khả năng chịu đựng cao và gần nh không bị ảnh hởng bởi
những tác động bất lợi của môi trờng (răng chỉ tiếp xúc duy nhất với môi
qua lỗ chân răng).
- Độ cứng và nồng độ muối phốt phát can xi ở ngà răng cao, sự làm khô
và khử nớc của mô tuỷ răng giúp cho việc bảo quản ADN tốt hơn cả xơng;
Degusta và cộng sự năm 1994 đã nhân bản mtADN từ rất nhiều răng
khảo cổ có độ tuổi 4700 năm với lợng chất liệu răng rất nhỏ, khoảng 0,01g.
1.1.5.2. Cấu trúc và vai trò của ADN
Ngời đầu tiên đặt nền móng cho cho ngành di truyền học là một tu sĩ
đồng thời là nhà thực vật học ngời Séc Johann Mendel (Phạm Thành Hổ,
2001). Năm 1865 trong khi lai tạo giống đậu Hà Lan và nghiên cứu kết quả
của các cuộc lai tạo đó đã chứng minh rằng các tính cách di truyền đã đợc
truyền lại thông qua trung gian là các yếu tố rất rõ ràng mà ngày nay ngời
15

ta gọi là gen. Từ những quan sát của mình ông đã rút ra các định luật mang
tên ông và khi cho xuất hiện sự tách riêng của các tính cách thì các định luật
đó chứng minh rằng các nhân tố kế thừa đã tồn tại và xử sự một cách độc lập.
Từ di truyền học đã đợc nhà sinh học ngời Anh Wlliam Bateson dùng
để chỉ môn này năm 1902. Đợc áp dụng theo kinh nghiệm từ lâu vào khâu
chăn nuôi súc vật và trồng trọt các giống cây ăn qủa cũng nh giống cây hoa.
Tuy nhiên di truyền học chỉ thực sự phát triển mạnh kể từ năm 1919 với
những công trình nghiên cứu của nhà Phôi học Thomas Hunt Morgan, ngời
Mỹ về giống ruồi giấm (drosophila melanogaster). Năm 1944, nhà vi
khuẩnhọc ngời Mỹ O. T. Avery thuộc viện Rockefeller ở New York đã
chứng minh rằng việc di truyền các đặc tính di truyền của một vi khuẩn này
sang một vi khuẩn khác đợc thực hiện thông qua trung gian của các phân tử
ADN.
Năm 1953, bằng cách sử dụng nhiễu xạ tia X, phơng pháp hiển vi điện
tử và phép sắc ký, James Dewey Watson ngời Mỹ và Francis Hary Compton
Crick ngời Anh đã miêu tả trong tạp chí Nature của Anh cấu trúc chính xác
của phân tử ADN là một chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch đơn, mỗi mạch đơn là
một chuỗi nucleotide, có 4 nucleotide ký hiệu là T, A, G, C. Mỗi nucleotide
có 3 thành phần: Nhóm Phosphat, đờng Deroxyribose và 1 trong 4 Base hữu
cơ (Adenine, Thymidiê, Cytosine, Guanidiê) (hình 5) (Tạp chí KH&CN,
2002).
Trình tự gen chính là trình tự 4 nucleotide xắp xếp trong tế bào.
1.1.5.3. ADN nhân:
ADN nhân nằm trên 23 cặp nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể là những cấu
trúc hiển vi nằm trong nhân tế bào, có khả năng tự nhân đôi và có số lợng
không đổi đối với mỗi loài sinh vật (Nghiêm Xuân Dũng, 2004). Các nhiễm
sắc thể sắp xếp thành 23 cặp, trong đó có 22 cặp nhiễm sắc thể thờng, cặp
thứ 23 là nhiễm sắc thể giới tính.

16


.

H×nh 5. CÊu tróc ho¸ häc cña ph©n tö ADN

17


Các cặp nhiễm sắc thể này qui định các tính trạng khác nhau của cơ thể,
đợc bảo tồn, duy trì trong thế hệ và di truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác.
Con cái bao giờ cũng thừa hởng các đặc tính di truyền thông qua 23 nhiễm
sắc thể từ tinh trùng của bố và 23 nhiễm sắc thể từ tế bào trứng của mẹ.
Sự khác nhau về trình tự của 4 loại nucleotid trong phân tử ADN của 23
đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định
gen để xác định cá thể. Tinh đa hình theo trình tự ADN có 2 dạng:
+ Đa hình theo trình tự: Sự khác nhau ngẫu nhiên giữa các nucleotide
trong đoạn ADN, ví dụ ở locus A:
Cá thể thứ nhất có trình tự: - AGACTGCTAG Cá thể thứ hai có trình tự: - AGCCTGCGAG
Nh vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 đã đợc thay thế A bằng C và T
bằng G.
+ Đa hình theo chiều dài (kích thớc): Một số gốc nucleotide đợc lặp
đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn ADN.
Ví dụ: Cá thể thứ nhất :
- ATAT ATAT ATAT -

3 đoạn lặp ATAT

Cá thể thứ hai:

- ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT -

5 đoạn lặp ATAT

Khi nghiên cứu cấu trúc các trình tự lặp lại, các nhà khoa học đã tìm ra
trong hệ gen ngời có những đoạn ADN đợc lặp lại liên tiếp nhau. Các đoạn
ADN này đợc gọi là VNTR (Variable number of tandem repeats) hay còn
gọi là các minisatellite DNA do cấu trúc này phần lớn phân bố theo kiểu vệ
tinh so với ADN genom trong quá trình tách chiết bằng siêu li tâm trong
CsCl. Các locus VNTR là các đoạn ADN có độ dài từ 1 đến 5 Kb và có các
đơn vị lặp lại thay đổi từ 15 đến 100 nucleotide.

18


Các đoạn ADN có cấu trúc với các đoạn lặp lại từ 2- 6 bp đợc gọi là
các đoạn lặp ngắn hay STRs (short tandem repeats). Các cấu trúc VNTR hay
STR đều mang tính bảo thủ cao, đợc di truyền qua các thế hệ và mang tính
đặc trng cho cá thể.
Những trạng thái (dạng) khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus gọi là
alen. Mỗi cá thể đều nhận đợc 2 alen, một alen từ bố và một alen từ mẹ.
Nếu hai alen của locus có kích thớc và trình tự hoàn toàn giống nhau ngời
ta gọi là đồng hợp tử, còn khác nhau gọi là dị hợp tử. Trong quá trình hình
thành và phát triển của loài và cá thể, có sự đột biến trình tự nucleotide trên
sợi kép ADN do vậy đối với mỗi locus gen, ngời ta đã ghi nhận đợc rất
nhiều alen (ví dụ locus D1S80 có 28 alen ký hiệu từ 14 đến 41). Chính cơ sở
của sự khác nhau về kích thớc của các alen trên cùng 1 locus của các phân
tử ADN trong nhiễm sắc thể là cơ sở cho giám định gen xác định cá thể.
1.1.5.4. Phân tích ADN nhân trong giám định nhận dạng cá thể
Phân tích ADN nhân trong giám định nhận dạng cá thể là phân tích

các locus ADN có tính đa hình cao nằm trên các nhiễm sắc thể trong nhân tế
bào (nucDNA). Một Locus ADN đợc xem là một locus có tính đa hình cao
nếu nh có một số lợng các Alen khác nhau đợc quan sát trong cộng đồng
dân c (ví dụ 5-10 hoặc hơn) ví dụ locus D1S80, D17S5, TH01, D5S818,
D9S820, D13S317 .... Theo nguyên lý, càng nhiều locus đợc phân tích thì
sự xác định nguồn gốc của sinh phẩm phát sinh từ một nguồn nào đó có độ
chính xác càng cao. Có 2 phơng pháp phân tích ADN nhân:
+ Phơng pháp so sánh chiều dài các đoạn ADN đợc cắt bằng enzym
giới hạn RFLP (Restriction Fragement Length Polymorphism)
+ Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phơng pháp PCR là phơng pháp đợc sử dụng phổ biến trong các
phòng thí nghiệm nhận dạng hiện nay.
1.1.5.5. Ti thể và hệ gen ti thể
19


a. Những nghiên cứu đầu tiên về ti thể
Năm 1890, Robert Altman quan sát thấy trong tế bào chất có các cấu
trúc dạng hạt dới mức tế bào có kích thớc tơng tự vi khuẩn hình que , do
vậy ông đã đặt tên là "Bioblast". Thuật ngữ ti thể (mitochondria) do nhà
nghiên cứu Bender C. đặt cho bào quan này vào năm 1898 khi quan sát các
bào quan trong tế bào bằng kính hiển vi quang học có độ phóng đại cao hơn .
Theo tiếng la tinh "mitos" có nghĩa là sợi dây mảnh, "chondros" có nghĩa là
hạt.
Năm 1900, Michaelis đã nhuộm ti thể bằng thuốc nhuộm Jenus Green
B, đây là một chất ôxy-hoá, nó cần oxy hoá để tạo mầu và Ông đã giả thuyết
rằng ti thể là một tác nhân ôxy hoá của tế bào. Có thể nhuộm ti thể bằng một
chất nhuộm khác, đó là chất nhộm huỳnh quang rôdamin 123 (chất nhuộm
này không gây chết tế bào). Bằng phơng pháp nhuộm mầu ti thể trong tế
bào sống ngời ta đã chứng minh đợc tính linh động của ti thể: Ti thể là một

bào quan có thể thay đổi hình dạng, di chuyển, kết hợp với nhau thành khối
và có khả năng phân chia.
b. Cấu tạo và chức năng của ti thể trong cơ thể sống:
* Cấu tạo của ti thể
Ti thể là một bào quan có dạng hình cầu hoặc hình que với chiều dài 12 àm và chiều rộng là 0.3-1 àm (hình 6). Số lợng ti thể trong các tế bào là
rất khác nhau phục thuộc vào dạng tế bào, tế bào càng có sự trao đổi chất
mạnh càng có nhiều ti thể, ví dụ tế bào gan điển hình có 1300 ti thể, chiếm
tới 20% tổng thể tích của tế bào.

20


Hình 6: cấu tạo ti thể dới kính hiển vi điện tử

+ Màng ti thể

Màng ngoài và màng trong (hình 6) của ti thể đã chia ti thể thành 2
khoang: Khoang nền và gian màng. Trong tế bào gan, hầu hết protein của ti
thể (70%) nằm trong khoang nền, 21% nằm ở màng trong, 8% nằm ở màng
ngoài và 4% nằm ở gian màng
- Màng ngoài có lỗ nhỏ thông với tế bào chất (cytoplasm): Màng ti thể
gồm 40% lipid và 60% protein. Các protein đặc hiệu là các protein tạo thành
lỗ (đờng kính 2nm) ở màng ngoài. Các phân tử có kích thớc 5000 Dalton
hoặc nhỏ hơn (chẳng hạn các phân tử đờng, nucleotide, các peptid nhỏ) đi
qua màng ngoài một cách tự do để vào gian màng. Theo cách thức này màng
ngoài ti thể đợc xem nh một cái rây phân tử. Các protein khác của màng
ngoài bao gồm: enzym tham gia vào quá trình tổng hợp lipid của màng, các
enzym chuyển hoá các cơ chất là lipid vào các dạng cơ chất đơn giản hơn của
quá trình chuyển hoá tiếp theo xảy ra trong khoang nền (monoamine
oxidase, axit béo dài 14, 16 nguyên tử cacbon (C14 và C16) và glycerophosphate acyl transferase).

21


Gian màng chứa các enzym tham gia vào việc chuyển ATP ra khỏi
khoang nền để photphoryl hoá các nucleotide khác (adenylate kinase,
nucleoside monophos-phokinase và nucleoside diphosphokinase).
- Màng trong ti thể (hình6) là màng không thấm ion (ion-impermeable):
chứa 20% lipid, 80% protein. Màng trọng cuộn lại tạo nên cấu trúc gọi là
Cristae(vách ngăn) vì thế diện tích của bề mặt màng trong tăng lên đáng kể.
Trong ti thể của tế bào gan diện tích bề mặt màng trong gấp 5 lần diện tích
bề mặt màng ngoài. Protein của màng trong thực hiện các chức năng sau:
Tiến hành nhiều phản ứng ôxy hoá của chuỗi hô hấp (chẳng hạn phức hệ
NADH dehydrogenase), số khác tham gia tổng hợp ATP (chẳng hạn phức hệ
F0F1ATPase hoặc ATP synthase). Các protein vận chuyển điều khiển sự luân
chuyển các chất trao đổi ra vào khoang khoang nền (chẳng hạn các chất
mang nucleotide adenine).
* Khoang nền của ti thể
Khoang nền của ti thể chứa ADN và hàng trăm enzym khác nhau với
nồng độ cao. Bình thờng một ti thể chứa vài nghìn bản sao ADN giống
nhau. Hệ phiên mã và dịch mã của ti thể (ribosom ti thể, các ARN vận
chuyển,...) đợc định vị ở khoang nền.
* Chức năng của ti thể:
Ti thể là bào quan chuyển hoá năng lợng tạo ATP cho tế bào. Do vậy,
ti thể là trạm năng lợng của tế bào. Ti thể là bào quan có mặt trong tất cả
các tế bào hô hấp hiếu khí. Ti thể có chức năng vô cùng quan trọng là trạm
chuyển hoá năng lợng từ các phân tử hữu cơ thành dạng năng lợng tích luỹ
trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lợng cần thiết cho tất cả các hoạt
động sống của tế bào. Ti thể có chứa ADN và nó là một hệ di truyền độc lập
so với với hệ di truyền của nhân tế bào. Trong ti thể có riboxom và các loại
ARN cần thiết do vậy ti thể có hệ thống tổng hợp protein riêng của mình.

22


Ti thể ở động vật và lục lạp ở thực vật là những bào quan tổng hợp năng
lợng cần thiết cho mọi hoạt động của tế bào. Các enzym và các màng ti thể
đóng vai trò trung tâm đối với các quá trình tạo năng lợng của tế bào. Lục
lạp tiến hành quang hợp nhờ sử dụng năng lợng ánh sáng mặt trời để tổng
hợp glucose và ôxy từ CO2 và nớc. Ti thể sử dụng ôxy, chuyển hoá năng
lợng tích luỹ trong glucose thành năng lợng tích luỹ trong ATP.
ADN ti thể (mtDNA) là sợi kép với cấu trúc vòng, chiều dài khoảng
5àm, chiếm từ 1-5% ADN của tế bào. mtADN tự tái bản theo kiểu bán bảo
toàn nhờ hệ enzim ADN polymeraza có trong chất nền ti thể và xảy ra ở gian
kỳ của chu kỳ phân chia tế bào. Khác với ADN của nhân, mtADN không liên
kết với protein histon, điều này làm cho mtADN tơng tự với ADN của vi
khuẩn. mtADN là một trong các nhân tố quyết định tính di truyền tế bào
chất. Ti thể phân chia thành 2 phần: Chất nền ti thể và khoang trong màng.
c. Cấu trúc hệ gen ti thể:
Nhân, ti thể và lục lạp, tất cả đều chứa ADN. Sự phát sinh ti thể có sự
tham gia của cả hệ gen nhân và hệ gen ti thể của tế bào. Hệ gen ti thể là một
phân tử ADN mạch vòng. ở ngời, phân tử ADN ti thể ở dạng mạch vòng có
kích thớc là 16569 nucleotit đợc Anderson và cộng sự (1981) xác định
toàn bộ (hình 7). Còn hệ gen ti thể của động vật cũng là một phân tử ADN
mạch vòng với kích thớc từ 16-19Kb, nhng đối với thực vật thì kích thớc
lớn hơn nhiều từ 10 đến 100 lần. Mặc dù hầu hết ADN ti thể là mạch vòng,
nhng cũng có một số là mạch thẳng (ví dụ, Chlamydomonas and
Paramecium). Trong các tế bào động vật có vú, ADN ti thể chỉ chiếm
khoảng dới 1% tổng số ADN của tế bào, mỗi ti thể có từ 5-10 phân tử
ADN.
ADN ti thể (mtDNA) của động vật có vú không chứa bất kỳ một vùng

intron nào, có một vùng 1121 bp không mã hoá, vùng D-loop, kéo dài từ vị
trí 16024 đến 00575. Vùng này còn đợc gọi là vùng điều khiển, bởi vì nó
23


chứa vùng khởi đầu sao chép cả 2 sợi ADN ti thể và vùng điều khiển sự nhân
bản và sao chép (Larsson và Clayton, 1995; Lightowlers và cs., 1997). Có
một số gen tiếp giáp hoặc chồng lên nhau trong ADN ti thể và không đầy đủ
các bộ mã kết thúc. Đầu 3'-của mARN đợc adenyl hoá tạo nên đuôi poly A.
Kích thớc hệ gen ti thể của ngời nhỏ và tất cả trình tự nucleotit của hệ gen
này đợc sử dụng để mã hoá cho các sản phẩm cụ thể. Hệ gen ti thể của
ngời và động vật không có vùng intron, trong khi đó lục lạp của một số thực
vật và nấm (fungi) lại có intron.
Phân tử ADN ti thể của ngời chứa 37 gen: Hai ARN riboxom 16S và
12S (16S rARN và 12S rARN) tìm thấy trong các riboxom ti thể đợc mã
hoá trong ADN ti thể, trong khi phần lớn protein của riboxom lại do các gen
trong nhân quy định. ADN ti thể cũng mã hoá cho 22-23 loại ARN vận
chuyển (tARN) và 10-12 loại protein có trong thành phần của màng ti thể.
Mã di truyền của ti thể không hoàn toàn giống mã di truyền trong nhân và
cũng không giống nhau ở các loài. Do đó không thể có mã di truyền chung
cho các bào quan này. So với mã di truyền của nhân, mã di truyền của ti thể
có tính linh hoạt cao hơn. Tính linh hoạt thể hiện ở chỗ nhiều tARN trong ti
thể có thể đọc cả 4 cụm mã trong một khung. Chính vì vậy chỉ cần có 22
loại tARN trong ti thể làm nhiệm vụ nhận biết 61 bộ ba (codon) mã hoá cho
các axit amin trong khi ở nhân cần tới 32 loại tARN. Sự xắp xếp các gen
trong ti thể của ngời đợc biểu hiện tại hình 7.
d. Đặc trng của hệ gen ti thể
Số lợng các bản sao ADN ti thể (mtADN) lớn và phân bố trong tế bào
chất là những khác biệt chủ yếu so với ADN nhân. Vùng điều khiển (còn gọi
là vùng thay thế, D-loop) chỉ là một đoạn ADN không mang gen mã hoá cho

đoạn polypeptit nào và không có đoạn trình tự không mã hoá giữa các gen.
Sự nhân bản mtADN không phụ thuộc vào giai đoạn phân chia tế bào và cho
đến nay ngời ta cha xác định đợc hiện tợng tái tổ hợp giữa các phân tử
24