Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ polygonum multiflorum thunb

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG
--------

BÁO CÁO
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB

TRƯƠNG CÔNG PHI
NGUYỄN XUYẾN THÀNH THẮNG

BIÊN HÒA, 12/2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG
--------

BÁO CÁO
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB

Sinh viên thực hiện:

TRƯƠNG CÔNG PHI
NGUYỄN XUYẾN THÀNH THẮNG

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Trịnh Thị Thanh Huyền

BIÊN HÒA, 12/2012


LỜI CẢM ƠN
Bài báo cáo nghiên cứu của chúng em có được thành quả như hôm nay là
nhờ sự giúp đỡ và quan tâm tận tình của các thầy cô và các anh chị đi trước.
Chúng em xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp chân thành và
những lời động viên của các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học và Môi trường –
Trường Đại học Lạc Hồng.
Chúng em xin cảm ơn chị Trịnh Thị Thanh Huyền, người trực tiếp hướng
dẫn đề tài nghiên cứu của chúng em đã quan tâm và tận tình hướng dẫn các thao tác
kỹ thuật, cũng như các kiến thức về lý thuyết chuyên ngành.
Chúng em xin chân thành cảm ơn các anh Ngô Quang Hưởng, chị Phí Thị
Thu Hiền… làm việc tại Phòng Nuôi Cấy Mô Thực Vật, thuộc Trung tâm Ứng dụng
Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai đã hướng dẫn và
giúp đỡ chúng em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu.
Và cuối cùng em xin gửi lời biết ơn đến gia đình, người thân, tập thể các bạn
khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường khóa 2008, đã giúp đỡ và động viên chúng
em trong suốt thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu của mình.


i

MỤC LỤC
Mục

Trang

TRANG PHỤ BÌA
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC ...................................................................................................................i
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... iii
PHỤ LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU .............................................................iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ......................................................................................... v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................vi
PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................ 1
2. Mục tiêu, mục đích của đề tài ........................................................................... 1
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 2
4. Phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài ................................................................. 2
5. Những đóng góp và mặt hạn chế ...................................................................... 2
6. Kết cấu của đề tài ............................................................................................... 2
PHẦN II: NỘI DUNG ............................................................................................... 3
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ..................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và hình thái ........................................................................3
1.1.2. Tác dụng dƣợc lý ..................................................................................3
1.2. Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi ......................................................................... 5
1.2.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật .......................................5
1.2.2. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro ........................................................... 5

ii

1.2.3. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi ................................................................ 6
1.2.4. Tăng sinh cụm chồi in vitro .................................................................6
1.2.5. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm ....................6
1.3. Những vấn đề trong nuôi cấy mô .................................................................. 6
1.3.1. Sự tạp nhiễm ......................................................................................... 6
1.3.2. Tính bất định về mặt di truyền ........................................................... 7
1.3.3. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy ........................................7
1.3.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể .....................................................................8
1.4. Các công trình nghiên cứu liên quan ............................................................ 9
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................10
2.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................... 10
2.2. Trang thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 10
2.3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 11
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và
thời gian xử lý lên mẫu cây hà thủ ô đỏ ..................................................... 11
2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây
hà thủ ô đỏ ....................................................................................................12
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi
cây hà thủ ô đỏ ............................................................................................. 14
2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con
hoàn chỉnh ....................................................................................................15
2.3.5. Thí nghiệm 5: Nuôi trồng trong nhà kính ........................................15
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................ 16
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 17


iii

3.1. Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian xử lý thích hợp để khử trùng
mẫu cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb ....................................... 17
3.2. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ ...... 20
3.3. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô
đỏ ........................................................................................................................... 25
3.4. Kết quả khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con hoàn chỉnh cây
hà thủ ô đỏ ............................................................................................................ 29
3.5. Nuôi trồng trong nhà kính ........................................................................... 32
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 35
4.1. Kết luận.......................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị........................................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Tình trạng mẫu sau xử lý ..................................................................... 18
Biểu đồ 3.2: Biểu diễn sự tương tác giữa các nồng độ javel sử dụng và thời gian xử
lý ................................................................................................................................ 19
Biểu đồ 3.3 : Biểu diễn môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tăng sinh cụm chồi cây hà
thủ ô đỏ ..................................................................................................................................... 26
Biểu đồ 3.4: Biểu diễn môi trường ảnh hưởng đến chiều cao chồi .......................... 27
Biểu đồ 3.5: Biểu diễn số rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy ............................ 30
Biểu đồ 3.6: Biểu diễn chiều dài rễ phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy ................. 31

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tỷ lệ emodin và physcion .......................................................................... 4
Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng mẫu ................................ 11
Bảng 2.2: Khảo sát môi trường tối ưu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ .................. 12
Bảng 2.3: Khảo sát môi trường tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ........................ 14
Bảng 2.4: Khảo sát môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh.................................. 15
Bảng 3.1: Tình trạng mẫu hà thủ ô đỏ sau khi khử trùng 3 tuần .............................. 18
Bảng 3.2: Kết quả tái sinh chồi sau 4 tuần nuôi cấy ................................................ 21
Bảng 3.3: Kết quả tăng sinh cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy...................................... 25
Bảng 3.4: Kết quả chồi tạo rễ sau 4 tuần nuôi cấy ................................................... 29


v

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây hà thủ ô đỏ .......................................................................................... 3
Hình 3.1: Mẫu hà thủ ô đỏ phát triển từ đốt thân mang chồi ngủ sau 3 tuần nuôi
cấy .................................................................................................................19
Hình 3.2: Các chồi tái sinh phát triển trên các môi trường nuôi cấy sau 4 tuần nuôi
cấy ............................................................................................................................. 24
Hình 3.3: Cụm chồi phát triển trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy ................. 28
Hình 3.4: Rễ tái sinh trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy ................................ 31
Hình 3.5: Rễ tái sinh trên các môi trường sau 4 tuần nuôi cấy ................................ 32
Hình 3.6: Cây con hà thủ ô trồng trên giá thể xơ dừa .............................................. 33
Hình 3.7: Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum
multiflorum Thunb .................................................................................................... 34


vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DNA: Deoxyribonucleic acid
ĐHSTTV: Điều hòa sinh trưởng thực vật
NAA: Naphthaleneacetic acid
KIN: Kinetin
BA: N6-benzyladenin
MS: Murashige & Skoog, 1962


1

PHẦN 1: PHẦN MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thảo dược là một nguồn nguyên liệu thực vật quý giá, cung cấp dược liệu để sản
xuất và chế biến các loại thuốc hữu ích phục vụ cho việc chữa bệnh và phục hồi sức
khỏe cho con người. Trong đó, hà thủ ô đỏ được tìm thấy ở Trung Quốc vào năm 713
và được sử dụng như một loại thảo dược trường sinh của con người. Trên thế giới, hà
thủ ô đỏ có nhiều ở Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Ấn Độ. Ở Việt Nam, cây hà
thủ ô phân bố chủ yếu ở miền núi phía Bắc như Hà Giang, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ
An… hà thủ ô đỏ chủ yếu được biết đến như là một vị thuốc bổ, trị suy nhược thần
kinh, ích huyết, khỏe gân cốt, đen râu tóc. Trong y học cổ truyền, hà thủ ô đỏ có tác
dụng thông tiểu, giải độc, chữa đau mỏi tay chân, chữa tóc hay rụng, sớm bạc, làm đen
tóc và kéo dài tuổi thọ [3].
Trong cây hà thủ ô đỏ có một số hợp chất quan trọng như: emodin, physcion,
rhein, lecithin, catechin… Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được trồng bằng hạt hoặc
dâm cành [3]. Tuy nhiên, Lin (2003), đã xác định các cây hà thủ ô đỏ có nguồn gốc
in vitro sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên
[1]. Trước đây, nguồn hà thủ ô đỏ tự nhiên ở nước ta khá dồi dào nhưng gần đây do
bị khai thác quá mức và do nạn phá rừng nên lượng hà thủ ô đỏ bị giảm sút, không
cung cấp đủ nguồn dược liệu cho việc sản xuất và chế biến các loại thuốc để chữa
bệnh cho con người. Do đó, việc nhân nhanh số lượng cây hà thủ ô đỏ bằng phương

pháp nuôi cấy in vitro để đáp ứng nhu cầu cung cấp nguồn dược liệu là hết sức cần
thiết.
Để góp phần vào việc đáp ứng nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây
dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum multiflorum Thunb”.
2. Mục tiêu, mục đích của đề tài
-

Mục tiêu: xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ.

-

Mục đích: Tạo cây giống hà thủ ô đỏ có chất lượng cao bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro.


2

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum
multiflorum Thunb”, được thực hiện trên giống hà thủ ô đỏ do Trung tâm Ứng dụng
Công nghệ Sinh học – Sở Khoa học Công nghệ - Tỉnh Đồng Nai cung cấp.
Phạm vi nghiên cứu của đề tài là nuôi cấy từ đoạn thân có chứa chồi ngủ cho
đến tái sinh được hoàn chỉnh trong điều kiện in vitro và chuyển cây ra vườn ươm.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu của đề tài
-

Tổng quan tài liệu

-

Thực nghiệm
+ Bố trí thí nghiệm
+ Nuôi cấy mô thực vật

-

Phân tích và xử lý số liệu thống kê

5. Những đóng góp và mặt hạn chế
Đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hà thủ ô đỏ Polygonum
multiflorum Thunb”, đã được thực hiện và thu được những kết quả thiết thực trong
việc tìm ra các môi trường thích hợp cho việc tái sinh chồi, nhân nhanh cụm chồi,
tạo rễ và tìm ra được quy trình khử trùng mẫu. Từ đó nhân giống được số lượng cây
nhiều có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu về giống cây hà thủ ô đỏ của thị trường.
Tuy nhiên đề tài còn một số hạn chế chưa khắc phục được như: chưa khảo sát
được một số yếu tố có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây hà thủ ô
trong điều kiện in vitro như: độ pH, ánh sáng và nhiệt độ nuôi cấy.
6. Kết cấu của đề tài
Đề tài “ Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Hà thủ ô đỏ Polygonum
multiflorum Thunb ” được chia làm 3 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị


3

PHẦN II: NỘI DUNG

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ
1.1.1. Nguồn gốc và hình thái
Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora, đồng nghĩa: Polygonum multiflorum Thunb)
-

Ngành (Division) : Magnoliophyta

-

Lớp (Class) : Eudicots

-

Bộ (Ordo)

-

Họ (Familia) : Polygonaceae

-

Chi (Genus) : Fallopia

-

Loài (Species): Fallopia multiflora

: Caryophyllales

Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp.

Hình 1.1: Cây Hà thủ ô đỏ

Hà thủ ô đỏ là loài dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ, thân
quấn, mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so
le, có cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4 – 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm, đầu nhọn, mép
nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm
lấy thân. Hoa tự chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2 mm, mọc cách xa nhau
ở kẽ những lá bắc ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy
hơi dài hơn). Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ
xuống. Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao
hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng, nguyên [8].
Trên thế giới, hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc Lào.
Ở Việt Nam, chúng phân bố chủ yếu ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát như: Hà Giang,
Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…[3].
1.1.2. Tác dụng dƣợc lý
Hà thủ ô đỏ có tác dụng hạ Cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô
hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol
của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol. Thuốc


4

có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch. Có thể tác dụng giảm xơ
cứng động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin [3].
Thuốc làm chậm nhịp tim. Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và
bảo vệ được cơ tim thiếu máu.
Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị teo mà giữ được mức như lúc
chuột còn non, tác dụng này có ý nghĩa chống lão hóa nhưng cơ chế còn cần nghiên cứu thêm.

Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng
nhu động ruột. Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ ô chín.
Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn
lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner. Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm.
Ngoài ra, sử dụng hà thủ ô đỏ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với
người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng [3].
Thành phần hoá học: Thân rễ hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin,
chrysophanol, rhein, physcion; protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin,
ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside. Tanin…
Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được trồng bằng cách giâm cành hoặc trồng bằng hạt.
Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối với cây hà thủ ô đỏ là
khả năng nảy mầm hạt lâu, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm cành tạo ra cây con
có tuổi thọ ngắn. Và Lin (2003) đã xác định các cây hà thủ ô đỏ có nguồn gốc in vitro
sẽ cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên.
Bảng 1.1: Tỷ lệ emodin và physcion [1]
Hàm lượng Emodin

Hàm lượng Physcion

(mg/g sấy khô)

(mg/g sấy khô)

Phần thân ngoài tự nhiên

0. 075±0. 000

0. 078±0. 00

Phần rễ ngoài tự nhiên

0. 077±0. 002

0. 084±0. 001

Phần chồi nhân giống in vitro

0. 381±0. 060

0. 277±0. 044

Cây trong nhà kính sau in vitro

0. 392±0. 060

0. 413±0. 064

Sản phẩm Hà thủ ô đỏ


5

Vì vậy, nhân giống in vitro là phương pháp rất hiệu quả và phù hợp với cây
hà thủ ô đỏ.
1.2. Nuôi cấy in vitro từ mẫu chồi
1.2.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình
thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một cách
có định hướng dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật [2].
Các bước cơ bản:

Tạo mẫu in vitro vô trùng.
Tăng sinh mẫu in vitro và tạo cây hoàn chỉnh.
Nuôi trồng thực nghiệm trong nhà kính với các điều kiện có kiểm soát và ngoài tự nhiên.
1.2.2. Quy trình tạo mẫu chồi in vitro
Quy trình tạo chồi in vitro quá trình khử trùng mẫu chồi bằng các thuốc khử
trùng có sẵn: kháng sinh, thuốc diệt nấm, javel hoặc calcihypochloride, cồn. Quá
trình này được xây dựng từ quá trình khử trùng mẫu chuẩn với các thí nghiệm thay
đổi thời gian quá trình khử trùng đối với từng chất khử trùng dựa vào tỷ lệ nhiễm.
Chọn mẫu từ tự nhiên: Mẫu chồi được chọn cần phải khỏe mạnh, không có
biểu hiện bệnh sẽ được cắt đem vào phòng thí nghiệm và rửa sơ bộ với xà phòng và
nước sạch.
Quy trình khử trùng:
Toàn bộ chất khử trùng đều được pha với nước cất vô trùng, khi thay đổi dung
dịch khử trùng thì phải thao tác trong tủ cấy.
Đánh giá kết quả và xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu:
Dựa vào kết quả tỷ lệ nhiễm và tỷ lệ sống sau 15 ngày của quá trình khử trùng
lần đầu chúng ta sẽ xây dựng nghiệm thức khử trùng mẫu.
Nếu mẫu bị nhiễm nấm nhiều thì chúng ta sẽ tăng thời gian lắc thuốc kháng
nấm thêm 15 phút, 30 phút và tương tự với nhiễm khuẩn. Ngoài ra, chúng ta có thể
tăng thời gian lắc javel vì đây là một chất khử trùng có thể tiêu diệt cả hai tác nhân
nhiễm trên [6].


6

1.2.3. Sự tái sinh chồi từ mẫu chồi
Là quá trình tạo chồi bất định phát triển trực tiếp từ mẫu chồi ngoài tự
nhiên đã được vô trùng.
Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy tế mô tế bào thực vật:
Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy tế bào

thực vật là MS hoặc B5 [5].
1.2.4. Tăng sinh cụm chồi in vitro
Chồi sau khi được tái sinh sẽ được cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh
được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, mục đích tạo ra thêm nhiều
chồi con để phục vụ cho quá trình ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.
1.2.5. Tạo rễ và cây con hoàn chỉnh và chuyển ra vƣờn ƣơm
Từ cụm chồi tiến hành tách thành các chồi đơn và được cấy vào các môi
trường tạo rễ (chứa Auxin riêng lẽ hoặc Auxin kết hợp Cytokinin).
Sau khi hình hành rễ, môi trường sẽ được khảo sát với nồng độ Auxin và
Cytokinin phù hợp nhất cho ra các cây hoàn chỉnh với hình thái khỏe nhất, lá to
thân khỏe và khoảng cách 2 đốt ngắn. Chỉ có những cây này mới có tỷ lệ sống cao
khi nuôi trồng ở trong nhà kính.
1.3. Những vấn đề trong nuôi cấy mô
1.3.1. Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,
gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm
như từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy
móc thiết bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy [6].
Trong giai đoạn vô mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đây cũng được
xem là giai đoạn khó nhất trong vi nhân giống. Mẫu cấy có thể là đốt thân, đỉnh sinh
trưởng, mẫu lá hay rễ non. Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô
trùng thì không phải dễ. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên
bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy…. của cây mẹ, đây là nơi cư ngụ khá vững
chắc mà chất khử trùng không dễ tiếp xúc được chúng. Đặc biệt, vi khuẩn thường


7

nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm
khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và

quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Vài loài vi khuẩn thường gây
nhiễm:

Acinebacter,

Aerococcus,

Agrobacterium,

Bacillus,

Clostridium,

Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…. [6].
Điều kiện trồng cây mẹ và vị trí lấy mẫu từ cây mẹ là yếu tố quan trọng thiết lập
quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm vi sinh vật hơn ngoài đồng
ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác.
Môi trường không khí, phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu
không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong
trường hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng
nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều.
Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá
trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường
chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp:
Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra [2].
1.3.2. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng
nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào qua nuôi
cấy mô sẹo. Những biến dị này cũng là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện
giống cây trồng nhưng thực tế có rất ít biến dị có lợi được báo cáo. Nuôi cấy mô sẹo

cho biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh [2]. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được
làm sáng tỏ nhưng được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây
ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ
biến dị cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài [7]. Số lần cấy
chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị.
1.3.3. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy
Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu làm sinh
trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có


8

chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô
non. Các phân tử Phenol làm nâu mẫu Cattleya là Eucomic acid và Tyramine. Có
vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
- Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay
đen, đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya
và Aeridesvới nồng độ thường dùng 0,1 – 0,3 %. Tuy nhiên than hoạt tính
cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích
tăng trưởng và các chất khác [2].
- Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol
qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau.
- Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi
trường ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng
như ascorbic acid, citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol,
glutathione và mecaptoethanol.
Để hạn chế ảnh hưởng phenol các nhà khoa học đưa ra vài kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:
- Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non.
- Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng.
- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy.

- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần.
1.3.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy.
Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp.
Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn,
đặc biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây [7].
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể một phương pháp hiệu quả nhất được nhiều
người ủng hộ là làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi
cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh
sáng, trao đổi khí) thích hợp.


9

1.4. Các công trình nghiên cứu liên quan
Ở trong nước, năm 2004, Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống
vô tính cây hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro.
Sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây hà thủ ô đỏ của Huỳnh Thị Đan San
và Võ Thị Bạch Mai vào năm 2009.
Hoàng Thị Kim Hồng, năm 2011 đã nghiên cứu và tìm ra môi trường thích hợp
cho việc tái sinh chồi và cụm chồi trong môi trường nuôi cấy in vitro cây hà thủ ô đỏ.
Lương Văn Thủy, năm 2007, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số
chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân chồi và tạo callus của cây hà thủ ô đỏ.
Trần Thị Kim Thu, Trương Thị Bích Phượng, năm 2008, nghiên cứu nhân
giống in vitro cây hà thủ ô đỏ.
Trên thế giới, năm 2003, Li Chang Lin và cộng tác viên đã xây dựng một quy
trình nhân giống hà thủ ô đỏ và đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong cây
được nhân giống với cây trồng tự nhiên. Đây là nghiên cứu có giá trị quan trọng đối
với các công ty dược muốn chiết xuất hai chất này cho mục đích thương mại.
Tất cả các nghiên cứu trên, đều có đóng góp quan trọng cho việc nhân nhanh

cây hà thủ ô đỏ cho mục đích thương mại, bảo tồn cây hà thủ ô đỏ.


10

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 05/ 2012 đến tháng 10/ 2012 tại Trung
tâm ứng dụng công nghệ sinh học Sở Khoa học - công nghệ tỉnh Đồng Nai.
2.2. Trang thiết bị và dụng cụ
Đèn cồn

Nồi hấp khử trùng

Tủ Lạnh

Hóa chất

Hệ thống phòng cấy

Máy cất nước

Chai và ống nghiệm

Hệ thống phòng nuôi

Máy đo pH

Hệ thống nhà kính

Cân tiểu ly

Tủ cấy
Ben, kẹp

Phòng rữa chai lọ cách biệt

Pipet, ống đong, ống hút

Hệ thống phòng cấy: là phòng nuôi cấy có kiểm soát không khí không để sự
tạp nhiễm xãy ra. Phòng này thuờng kín và trang bị máy lạnh để tránh nhiệt độ nóng
ảnh huỡng đến năng suất làm việc.
Hệ thống phòng nuôi: là hệ thống phòng có kểm soát nhiệt độ và độ chiếu
sáng ổn định, và có nhiều kệ để tăng diện tích. Ánh sáng được kiểm soát theo quang
kì của cây và tắt theo hệ thống điện tự động.
Hệ thống phòng rửa chai lọ cách biệt là hệ thống phòng dùng để rửa chai lọ và
pha môi trường và làm các việc lặt vặt. Do công việc pha môi trường thường làm
vương vãi dung dịch dinh duỡng nên nồng độ vi sinh vật trong không khí rất cao,
cần được lau chùi, khử trùng thường xuyên.
Hệ thống nhà kính: sẽ giảm cường độ ánh sáng bằng lưới lan và cách ly
côn trùng, sâu hại.
Với tất cả thiết bị, dụng cụ trên bạn đã có một phòng nuôi cấy mô hoàn chỉnh.


11

2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất khử trùng và
thời gian xử lý lên mẫu cây hà thủ ô đỏ
- Vật liệu:

+ Đốt thân (1-1,5 cm) mang chồi ngủ của cây hà thủ ô đỏ trưởng thành
ngoài tự nhiên.
+ Chất khử trùng: javel
- Cách tiến hành:
+ Các thao tác ngoài phòng thí nghiệm:
Rửa mẫu bằng xà phòng
Rửa mẫu dưới vòi nước sạch trong khoảng 15 – 20 phút
Lắc với thuốc kháng sinh 1 giờ
+ Các thao tác tiếp theo được thực hiện trong tủ cấy:
Rửa mẫu bằng cồn 70o
Lắc mẫu với javel trong 5, 10 và 15 phút
Rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần
Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ javel và thời gian khử trùng mẫu
NT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Nồng độ javel (%)
20
20
20
25
25

25
30
30
30

Thời gian xử lý (phút)
5
10
15
5
10
15
5
10
15


12

Cắt bỏ phần mô bị trắng hoặc đen, sau đó cấy vào môi trường MS + 30g
đường + 8g agar và có bổ sung 10% nước dừa.
- Số nghiệm thức: 9
- Tổng số bình: 81
- Tổng số mẫu: 243
 Mục đích thí nghiệm:
Xác định nồng độ javel và thời gian xử lý thích hợp nhất để khử trùng mẫu đốt thân
mang chồi ngủ cây hà thủ ô đỏ, tạo nguồn mẫu ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp theo.
 Chỉ tiêu theo dõi:
Tỉ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = (Tổng số mẫu sống không nhiễm /tổng số mẫu cấy) x 100
 Thời gian theo dõi: 3 tuần.

2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi cây hà
thủ ô đỏ
Mẫu chồi sau khi khử trùng không bị nhiễm sẽ được nuôi cấy trên môi trường
cơ bản MS + 30g đường + 8g agar và có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng
thực vật (ĐHSTTV) BA, NAA, KIN.
Vật liệu là các mẫu đốt thân mang chồi ngủ lấy từ cây in vitro 3 tuần tuổi của
thí nghiệm 1, được cắt thành những đoạn ngắn (1 – 1,5 cm) mang chồi ngủ và được
nuôi cấy trên môi trường MS nhưng bổ sung thêm các chất kích thích sự tạo chồi.
BA có nồng độ từ (1 – 5 mg/l), KIN có nồng độ từ (0,2 – 2 mg/l), NAA có nồng độ
từ (0,2 – 2 mg/l).
Bảng 2.2: Khảo sát môi trường tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ
NT
T0 (ĐC)
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9

Nồng độ BA (mg/l)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0

1,0
2,0
3,0
4,0

Nồng độ KIN (mg/l)
0,0
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,5
0,5
0,5
0,5

Nồng độ NAA (mg/l)
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0

13

T10
T11
T12
T13
T14
T15
T16
T17
T18
T19
T20
T21
T22
T23
T24
T25
T26
T27
T28
T29
T30
T31
T32
T33
T34
T35
T36
T37

T38
T39
T40
T41
T42
T43
T44
T45
T46
T47
T48
T49
T50

5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0

1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0

0,5
1,0
1,0
1,0

1,0
1,0
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0

0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0

0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,5

0,5
0,5
0,5
0,5
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,5
1,5
1,5
1,5
1,5
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0

(Nghiệm thức đối chứng: môi trường MS không bổ sung chất ĐHSTTV)


14

- Số nghiệm thức: 51
- Tổng số bình: 459
- Tổng số mẫu: 1377
 Mục đích thí nghiệm: Xác định môi trường tối ưu để tái sinh chồi cây hà thủ ô đỏ.
 Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi trung bình trên 1 mẫu cấy.

 Thời gian theo dõi: 4 tuần.
2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tăng sinh cụm chồi
cây hà thủ ô đỏ
Mẫu chồi khi tái sinh được chuyển qua môi trường thích hợp nhằm tăng số chồi
trong một chồi ban đầu. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS + 30g đường + 8g
agar bổ sung thêm BA kết hợp NAA với nồng độ thay đổi theo bảng sau:
Bảng 2.3: Khảo sát môi trường tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ
NT
N0 (ĐC)
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
N11
N12
N13
N14
N15
N16

Nồng độ BA (mg/l)
0,0
1,0
2,0

3,0
4,0
1,0
2,0
3,0
4,0
1,0
2,0
3,0
4,0
1,0
2,0
3,0
4,0

Nồng độ NAA (mg/l)
0,0
0,2
0,2
0,2
0,2
0,5
0,5
0,5
0,5
0,8
0,8
0,8
0,8
1,0

1,0
1,0
1,0

(Nghiệm thức đối chứng: môi trường MS không bổ sung chất ĐHSTTV)
- Số nghiệm thức: 17
- Tổng số bình: 153
- Tổng số mẫu: 459


15

 Mục đích thí nghiệm: Xác định môi trường tối ưu để tăng sinh cụm chồi cây hà thủ ô đỏ
 Chỉ tiêu theo dõi: + Hệ số nhân chồi: Tổng số chồi hình thành trên 1 mẫu đã cấy.
+ Chiều cao chồi (cm).
 Thời gian theo dõi: 4 tuần.
2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát môi trƣờng tối ƣu để tạo rễ và cây con
hoàn chỉnh
Từ cụm chồi 4 tuần tuổi ở thí nghiệm 3, tiến hành tách thành từng chồi đơn
cao 1,5 cm trở lên và cấy vào môi truờng MS + 30g đường + 8g agar và bổ sung
thêm chất kích thích tạo rễ NAA có nồng độ từ (0,5 – 2 mg/l).
Bảng 2.4: Khảo sát môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh
NT
R0 (ĐC)
R1
R2
R3
R4

Nồng độ NAA (mg/l)

0,0
0,5
1,0
1,5
2,0

(Nghiệm thức đối chứng: môi trường MS không bổ sung chất ĐHSTTV)
- Số nghiệm thức: 5
- Tổng số bình: 45
- Số mẫu chồi cấy: 135
 Mục đích thí nghiệm: Xác định môi trường tối ưu để tạo rễ và cây con hoàn
chỉnh cây hà thủ ô đỏ.
 Chỉ tiêu theo dõi: + Số rễ trung bình trên 1 chồi.
+ Chiều dài rễ (cm): đo từ gốc đến hết chiều dài rễ.
2.3.5. Thí nghiệm 5: Nuôi trồng trong nhà kính
Chồi sau khi tạo rễ và cây con hoàn chỉnh sẽ được nuôi trồng trong nhà kính.
Cây con có chiều cao 2 – 3 cm, lá hoàn chỉnh sẽ được chọn lọc và trồng trên giá thể
xơ dừa ẩm ngoài vườn ươm.


16

2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được tính toán và xử lý trên máy tính bằng phần mềm Excel 2010 và
chương trình thống kê Statgraphics 3.0. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng
trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (bằng phương pháp
LSD0,01 – 0,05).