Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào bằng phương pháp sers
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.56 MB, 72 trang )
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
--------------------------------
NGUYỄN THỊ HÀ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG
TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2015
ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
--------------------------------
NGUYỄN THỊ HÀ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG HẠT NANO ĐA CHỨC NĂNG
TRONG ĐÁNH DẤU TẾ BÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SERS
Chuyên ngành: Vật lý chất rắn
Mã số: 60440104
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀNG NAM
TS. NGUYỄN ĐÌNH THẮNG
Hà Nội - 2015
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Thầy
giáo TS. Nguyễn Hoàng Nam và Thầy giáo TS. Nguyễn Đình Thắng. Trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu, các thầy luôn tận tình chỉ bảo và giúp em định hướng
để hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn NCS Lưu Mạnh Quỳnh, NCS Chu Tiến Dũng đã
trực tiếp hướng dẫn cũng như đưa ra những lời khuyên thực sự hữu ích cho luận
văn. Kết quả của luận văn là một trong những thành quả của quá trình lao động trí tuệ
tích cực của nhóm nghiên cứu “Nghiên cứu chế tạo, chức năng hóa, tính chất của
hạt nano đa chức năng nhằm ứng dụng trong y sinh học” trong định hướng “Nghiên
cứu ứng dụng vật liệu nano trong y sinh” do TS. Nguyễn Hoàng Nam chủ trì và được
tài trợ bởi đề tài “Nghiên cứu chế tạo hạt nano đa chức năng nhằm ứng dụng
trong y sinh” mã số CA.14.11A.
Tôi xin cảm ơn sinh viên Bạch Thị Mai - K58 KHVL, Khoa Vật lý đã hỗ trợ
tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và chế tạo vật liệu. Tôi cũng xin cám ơn học
viên cao học K24 Nguyễn Thị Thơ tại Khoa Sinh học đã hỗ trợ luận văn trong quá
trình nuôi cấy và định lượng tế bào.
Tôi xin được cảm ơn các anh chị và các bạn sinh viên tại Trung tâm Khoa
học Vật liệu và Khoa Sinh học đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt
quá trình làm nghiên cứu của mình.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, tập thể cán bộ của Trung tâm Khoa
học Vật liệu – Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã tạo điều kiện cho em
trong suốt thời gian em làm thí nghiệm tại trường!
Em cũng xin cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật
lý cũng như lãnh đạo Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa
học Tự nhiên đã tạo điều kiện cơ sở vật chất, trang thiết bị để em hoàn thành luận
văn này.
Bản luận văn này được thực hiện tại Trung tâm Khoa học Vật liệu – Khoa
Vật lý, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội. Luận văn sử
dụng một số phép đo thực hiện trên các hệ LABRAM3 hãng HORIBA Jobin Yvon,
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
NanoSEM NOVA NPE 119, kính hiển vi huỳnh quang – trường tối AXIO Scope
A1, Zeiss được đầu tư theo chương trình “Tăng cường năng lực nghiên cứu, đào
tạo lĩnh vực khoa học, công nghệ nano và ứng dụng trong y, dược, thực phẩm,
sinh học, bảo vệ môi trường và thích ứng biến đổi khí hậu theo hướng pháp triển
bền vững”.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã tạo điều
kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn.
Hà nội, năm 2015
Học viên
Nguyễn Thị Hà
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN....................................................................................5
1.1. Tổng quan về hạt nano Fe3O4 và hạt nano kim loại Ag
5
1.1.1. Vật liệu sắt từ.....................................................................................................5
1.1.2. Tính chất siêu thuận từ ......................................................................................5
1.1.3. Vật liệu oxit sắt từ Fe3O4 ...................................................................................7
1.1.4. Ứng dụng của hạt nano từ Fe3O4 .......................................................................7
1.1.5. Hạt nano Bạc và tính chất..................................................................................8
1.1.6. Cộng hưởng Plasmon bề mặt [14] .....................................................................8
1.1.7. Tán xạ Raman [10] ............................................................................................9
1.1.8. Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag ..................................................13
1.2. Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào
14
1.2.1. Bệnh ung thư ...................................................................................................14
1.2.2. Các phương pháp phát hiện bệnh ung thư .......................................................14
1.2.3. Các thụ thể tế bào (ErbB receptors) ................................................................15
1.2.4. EGFR- Epidermal growth factor receptor [49] ...............................................17
1.2.5. Kháng thể ........................................................................................................18
1.2.6. Kháng thể anti-EGFR và cơ chế gắn kết kháng thể anti-EGFR với hạt nano đa
chức năng Fe3O4/Ag-NH2 ........................................................................................19
1.2.7. Tế bào HaCaT và SK-Mel 28 ..........................................................................20
CHƢƠNG 2 – THỰC NGHIỆM ...........................................................................23
2.1. Chế tạo hạt nano chức năng Fe3O4/Ag………………………………...……23
2.1.1. Hóa chất sử dụng .............................................................................................23
2.1.2. Chức năng hóa hạt nano Fe3O4 với 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES)
tạo nhóm amine NH2 tự do Fe3O4-NH2 .....................................................................23
2.1.3. Chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag ............................................................24
2.1.4. Chức năng hóa bề mặt hạt nano composite Fe3O4/Ag bằng 4-aminothiophenol
(4-ATP) - Fe3O4/Ag-NH2 ..........................................................................................25
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
2.2. Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag trong đánh dấu tế
bào…………………………………………………………………………………26
2.2.1. Hóa chất sử dụng .............................................................................................26
2.2.2. Gắn hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 với kháng thể antiEGFR…..…………………………………………………………………………...26
2.2.3 Gắn hạt nano đa chức năng với hai dòng tế bào HaCaT và SK-Mel 28 ..........27
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................33
3.1. Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag………………………………33
3.1.1. Hạt nano Fe3O4 chức năng hóa với 3-aminopropyltriethoxysilane
(APTES)…………………………………………………………………………...33
3.1.2. Hạt nano composite Fe3O4/Ag ........................................................................35
3.1.3 Chức năng hóa hạt nano composite Fe3O4/Ag với 4-aminothiophenol ...........40
3.2. Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag trong đánh dấu tế
bào………………………………………………………………………………….42
3.2.1 Hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag gắn với kháng thể anti-EGFR ...................42
3.2.2 Đưa hạt nano đa chức năng Fe3O4/Ag gắn kháng thể anti-EGFR lên hai dòng
tế bào Hacat và SK-Mel 28 .......................................................................................46
KẾT LUẬN ..............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................56
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Stt
Hình vẽ
Nội dung
Trang
1
Hình 1.1
Đường cong từ hoá sắt từ (---) và siêu thuận từ (---)
6
2
Hình 1.2
Hc phụ thuộc vào đường kính hạt
6
Mô tả hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt của
3
Hình 1.3
4
5
hạt nano kim loại
9
Hình 1.4
Mô hình tán xạ Raman của phân tử CH4
10
Hình 1.5
Mô phỏng hoạt động của các loại ErbB
15
Hình vẽ mô phỏng cấu trúc các loại ErbB và các
6
Hình 1.6
7
8
phối tử của chúng
16
Hình 1.7
Mô hình của một kháng thể điển hình
19
Hình 1.8
Cấu trúc 3 chiều của anti-EGFR
19
Mô hình liên kết giữa hạt nano gắn kháng thể anti9
Hình 1.9
EFGR với các thụ thể trên bề mặt tế bào
20
Mô hình tế bào Keratinocyte và Melanocyte trong
10
Hình 1.10
11
Hình 1.11
Mô hình tóm tắt mục tiêu luận văn
22
12
Hình 2.1
Mô hình phản ứng chức năng hóa Fe3O4 với APTES
23
da
21
Quy trình chế tạo hạt nano composite đa chức năng
13
Hình 2.2
Fe3O4/Ag-NH2
25
Mô tả phương pháp phân tích cường độ sáng của tế
14
Hình 2.3
15
16
bào bằng phần mềm Image J
30
Hình 2.4
Đồ thị tính toán cường độ sáng của tế bào và nền
31
Hình 3.1
Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4
34
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
17
Hình 3.2
Ảnh TEM của các hạt nano Fe3O4
34
18
Hình 3.3
Đường cong từ trễ của mẫu Fe3O4
35
19
Hình 3.4
Nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4/Ag
36
20
Hình 3.5
Phổ tán sắc năng lượng EDS của mẫu Fe3O4/Ag
36
Phổ UV-Vis và ảnh TEM của hạt nano Ag kích
21
Hình 3.6
22
Hình 3.7
thước từ 15-25 nm
37
Phổ UV-Vis và ảnh TEM của hạt nano Ag kích
thước từ 25-50 nm
38
Phổ hấp thụ UV-Vis và ảnh TEM của mẫu hạt nano
23
Hình 3.8
composite Fe3O4/Ag
39
Đường cong mômen từ phụ thuộc từ trường ở nhiệt
24
Hình 3.9
25
Hình 3.10
26
Hình 3.11
27
Hình 3.12
28
Hình 3.13
độ phòng của Fe3O4 (a) và Fe3O4/Ag (b)
40
Phổ Raman mẫu hạt nano đa chức năng Fe3O4/AgNH2
41
Sơ đồ phản ứng của hạt nano Fe3O4/Ag-NH2 với
kháng thể anti-EGFR.
43
Phổ Raman của mẫu hạt Fe3O4/Ag-NH2 trước và
sau khi gắn kháng thể anti-EGFR
44
Phổ Raman của hạt nano gắn kháng thể anti-EGFR
và phổ Raman của Protein
45
Nguyên lý sử dụng phổ SERS trong chẩn đoán tế
29
Hình 3.14
bào mang bệnh
47
Phổ Raman của tế bào HaCaT và kháng thể anti30
Hình 3.15
31
Hình 3.16
32
Hình 3.17
EGFR
47
Phổ Raman của tế bào SK-Mel 28 và kháng thể
anti-EGFR
Phổ SERS của tế bào HaCaT và SK-Mel 28 với tỉ lệ
48
49
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
gắn hạt M1 và M2.
Ảnh hiển vi trường sáng và trường tối của tế bào
33
Hình 3.18
HaCaT.
50
Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình của tế
34
Hình 3.19
bào HaCaT trước và sau khi gắn hạt nano
51
composite đa chức năng
Ảnh hiển vi trường sáng và trường tối của tế bào
35
Hình 3.20
SK-Mel 28
52
Đồ thị biểu diễn cường độ sáng trung bình của tế
36
Hình 3.21
bào SK-Mel 28 trước và sau khi gắn hạt nano đa
53
chức năng
So sánh cường độ sáng trung bình của hai tế bào
37
Hình 3.22
HaCaT và SK-Mel 28
54
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Stt
Tên bảng
Nội dung
Trang
Bảng các loại HER receptor và các bệnh ung thư
1
Bảng 1.1
2
Bảng 1.2
đi liền với chúng
16
Bảng so sánh % tế bào có đột biến về số lượng
3
Bảng 2.1
EGFR
17
Bảng tỉ lệ hạt nano Fe3O4/Ag-NH2-anti EGFR gắn
với tế bào
27
Khoảng cách d tính được ứng với các mặt nhiễu xạ
4
Bảng 3.1
5
Bảng 3.2
6
Bảng 3.3
tia X
Tỉ phần các nguyên tố trong mẫu Fe3O4/Ag
33
37
Vị trí đỉnh phổ SERS của mẫu hạt nano đa chức
năng Fe3O4/Ag-NH2
42
Vị trí đỉnh dao động của hạt nano gắn kháng thể
7
Bảng 3.4
anti-EGFR
45
Bảng khảo sát hiệu suất gắn kết tế bào với hạt
8
Bảng 3.5
9
Bảng 3.6
nano Fe3O4/Ag-NH2
46
Vị trí đỉnh dao động của tế bào gắn hạt nano đa
chức năng
48
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Kí hiệu
Stt
Chú thích
1 4-ATP
4-aminothiophenol
2 APTES
3-aminopropyltriethoxysilane
3 BSA
Bovine serum albumin
4 EDC
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2 với
5
NPs-anti EGFR
kháng thể anti-EGFR
6 Phổ FTIR
Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier
7 Phổ SERS
Phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt
8 TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua
9 UV-Vis
Phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến
10 VT
Vị trí
11 TB
Trung bình
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
MỞ ĐẦU
Trong lĩnh vực y học hiện nay, tình trạng mắc bệnh ung thư ở các quốc gia
đang trở thành vấn đề quan tâm của toàn thế giới. Theo thống kê của tổ chức y tế
thế giới (World Health Organisation - WHO) năm 2012, đã có khoảng 14
triệu trường hợp ung thư được phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên
quan đến ung thư. Trong đó, số lượng các ca tử vong do ung thư chủ yếu là: ung
thư phổi, ung thư gan, ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng, ung thư vú, ung
thư thực quản, … Dự đoán số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng từ 14 triệu
trong năm 2012 lên 22 triệu trong vòng hai thập kỷ tới [7]. Hơn 60% số các ca ung
thư mới hàng năm trên thế giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và Nam
Mỹ, chiếm 70% tổng số các ca tử vong ung thư [48]. Tại Việt Nam trong những
năm trở lại đây, tình trạng mắc bệnh ung thư đang ở mức báo động đứng đầu trên
thế giới. Cũng trong năm 2012, tổng số ca tử vong do ung thư là 91.600 ca, số
lượng các ung thư gặp phổ biến ở nam giới là gan, phổi, dạ dày, đại trực tràng và
mũi họng; còn các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: ung thư vú, phổi, gan, cổ tử
cung và dạ dày [49].
Với tình trạng phát triển bệnh ngoài kiểm soát như vậy đòi hỏi các y bác sĩ
và các nhà nghiên cứu tìm ra một phương pháp để có thể phát hiện sớm các tế bào
mang bệnh giúp hỗ trợ điều trị hiệu quả hơn. Hiện nay, đã có các phương pháp giúp
chẩn đoán sớm các tế bào ung thư như: phương pháp thử sinh học, phép thử nội soi
tế bào, và đặc biệt là phương pháp đánh dấu bằng lý sinh học nano [50].
Trong vài thập niên trở lại đây, công nghệ nano đang là một hướng nghiên
cứu dành được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học. Một nhánh quan trọng
của công nghệ nano không thể không nhắc tới, đó là lý sinh học nano, trong đó, vật
liệu nano được sử dụng để chẩn đoán và điều trị bệnh. Các nghiên cứu ứng dụng vật
liệu nano trong Y – Sinh ở nước ta đã đạt được một số kết quả đáng khích lệ. Điển
hình là:
- Nhóm của GS.TS. Nguyễn Xuân Phúc với đề tài “Nghiên cứu chế tạo chất
lỏng từ trên nền hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong diệt tế bào ung thư” [4].
1
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
- Nhóm của PGS. TS. Nguyễn Ngọc Long với các kết quả sử dụng hạt nano
vàng trong việc phát hiện sớm tế bào ung thư vú [36].
- Nhóm của GS. TSKH. Nguyễn Hoàng Lương với đề tài nghiên cứu hạt
nano vàng chức năng hóa với các phân tử 4-aminothiophenol trong việc chẩn đoán
tế bào ung thư biểu mô sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt [35].
- Nhóm của PGS. TS. Nguyễn Hoàng Hải với đề tài “Sử dụng hạt nano từ
tính mang thuốc để tăng cường khả năng ức chế vi khuẩn của thuốc kháng sinh
Chloramphenicol” [1].
Có thể thấy các hạt nano với các tính năng đặc biệt của chúng đã được chú ý
nghiên cứu nhằm ứng dụng trong y sinh tại Việt Nam. Trong số đó, các hạt từ Fe3O4
có kích thước nano, micro mét được ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, sắp xếp thứ
tự DNA và phân tách tế bào, … [11, 46]. Vật liệu nano Fe3O4 được biết đến như
một loại vật liệu với những tính năng vượt trội được kể đến đó là hiệu ứng kích
thước và tính siêu thuận từ. Khi kích thước của vật liệu giảm đến cỡ nano mét thì tỉ
số giữa diện tích bề mặt và thể tích của vật liệu tăng cao đáng kể do đó làm tăng khả
năng kết dính giữa bề mặt hạt nano với các phân tử hữu cơ [19]. Cùng với đó với
tính siêu thuận từ, hạt nano Fe3O4 có thể dễ dàng được tập trung lại bằng từ trường
ngoài và điều này được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như tách chiết, chẩn
đoán…[11]. Các hạt nano từ Fe3O4 có xu hướng kết đám lại với nhau trong chất
lỏng mang bởi tồn tại sự tương tác lưỡng cực từ mạnh giữa các hạt và lực
VanderWaals, ngoài ra chúng còn dễ bị oxi hóa. Để ngăn ngừa sự kết đám và sự oxi
hóa cũng như làm tăng khả năng tương thích sinh học của chúng, hạt nano từ Fe3O4
cần được chức năng hóa bề mặt bởi những lớp vỏ là các chất có hoạt tính bề mặt
hoặc polymerđể có thể đáp ứng cho nhiều ứng dụng khác nhau.
Trong các nghiên cứu nói trên, bên cạnh hạt nano từ tính và nano bán dẫn thi
các hạt nano kim loại quý cũng đóng vai trò quan trọng về ứng dụng. Một trong
những kim loại quý hiếm có thể kể đến đó là kim loại bạc (Ag). Các hạt nano Ag
với hiệu ứng plasmon bề mặt điển hình cho tín hiệu Raman đặc trưng ở các liên kết
gần bề mặt hạt nano. Ngoài ra, việc chức năng hóa thêm nhiều lớp vỏ trên bề mặt
của hạt nano cũng không làm thay đổi cường độ của các đỉnh tán xạ đặc trưng này.
2
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
Nhằm mục tiêu ứng dụng các tính năng đặc biệt của nhiều loại hạt nano cùng
một lúc, nhóm nghiên cứu đã kết hợp cả hai loại hạt nano từ Fe3O4 và hạt nano kim
loại Ag được chức năng hóa với các phân tử 4-ATP tạo thành hạt nano composite
đa chức năng Fe3O4/Ag-NH2. Thông qua nhóm chức năng (-NH2), các hạt nano
composite đa chức năng này có thể liên kết đồng hóa trị với các protein như human
serum albumin (HSA), kháng thể, bovine serum albumin (BSA)…[10, 46, 51], sau
đó sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) và phương pháp chụp ảnh hiển
vi trường tối để đánh dấu tế bào mang bệnh.
Trong khuôn khổ luận văn này, với mong muốn chế tạo ra một vật liệu nano
mang đầy đủ cả hai tính chất kim loại và từ có thể ứng dụng để đánh dấu và tách
chiết tế bào trong y sinh, đồng thời có thể sản xuất với giá thành rẻ và quy trình đơn
giản, nhóm nghiên cứu đã định hướng sử dụng phương pháp hoá ướt để chế tạo hạt
nano đa chức năng Fe3O4/Ag. Hạt nano đa chức năng này mang đầy đủ tính chất
kim loại quý của hạt nano Ag gắn 4ATP cho tín hiệu Raman và tính chất từ của vật
liệu Fe3O4 nên vừa có thể sử dụng tìn hiệu Raman để đánh dấu vừa có thể khắc
phục được khả năng tập trung hạt theo mong muốn, giảm thời gian lọc rửa. Nhóm
chức –NH2 được gắn trên bề mặt hạt nano Ag có tính tương thích sinh học cao, dễ
dàng gắn kết với các protein kháng thể anti-EGFR sau đó được đưa thử nghiệm lên
hai dòng tế bào HaCaT và tế bào ung thư da SK-Mel 28 để nhận biết và đánh giá
mức độ biểu hiện EGFR của hai dòng tế bào bằng hai phương pháp vật lý là chụp
ảnh hiển vi trường tối và đo phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS).
Đề tài luận văn: “Nghiên cứu ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh
dấu tế bào bằng phương pháp SERS” có bố cục như sau:
Mở đầu
Mục lục
Chƣơng 1 - Tổng quan: Trình bày sơ lược về hạt nano composite đa chức
năng Fe3O4 /Ag-NH2, hạt nano có cấu trúc lõi vỏ và ứng dụng của hạt nano trong y
sinh học.
Chƣơng 2 - Thực nghiệm: Trình bày phương pháp chế tạo mẫu, các thiết bị
thực nghiệm được sử dụng để nghiên cứu các tính chất và ứng dụng của vật liệu nano
3
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 trong đánh dấu tế bào HaCaT và SK-Mel 28.
Chƣơng 3 - Kết quả và thảo luận: Những kết quả đạt được trong quá trình
chế tạo và ứng dụng hạt nano composite đa chức năng Fe3O4 /Ag-NH2 trong đánh
dấu tế bào. Các kỹ thuật khảo sát tính chất và những biện luận kết quả.
Kết luận
Tài liệu tham khảo
4
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về hạt nano Fe3O4 và hạt nano Ag
1.1.1. Vật liệu sắt từ
Vật liệu sắt từ là các vật liệu trong đó có các mô men từ sắp xếp song song
với nhau. Vì vậy trạng thái sắt từ cũng là trạng thái từ hoá tự phát. Theo lý thuyết
Weiss thì ngay cả khi không có từ trường ngoài trong vật liệu sắt từ đã có sự từ hoá
tự phát đến bão hoà. Nguyên nhân của sự từ hoá tự phát đó là do các mô men từ
tương tác với nhau rất mạnh mẽ. Tương tác này tương đương với tác dụng của từ
trường ngoài lớn cỡ 104 - 105 Oe làm cho các mô men từ có xu hướng sắp xếp song
song với nhau [5].
Nhiệt độ Curie trong các chất sắt từ là nhiệt độ chuyển pha sắt từ - thuận từ.
Dưới nhiệt độ Tc tương tác giữa các mô men từ thắng được kích thích nhiệt do đó
vật liệu thể hiện tính sắt từ. Trên nhiệt độ Tc năng lượng kích thích nhiệt đủ lớn để
phá vỡ trạng thái liên kết sắt từ giữa các mô men từ làm cho phân bố các mô men từ
trở lên hỗn loạn và vật liệu thể hiện tính chất thuận từ [9].
1.1.2. Tính chất siêu thuận từ
Đối với một vật liệu sắt từ khi ở kích thước lớn, các hạt có xu hướng phân
chia thành các domain từ để giảm năng lượng dị hướng và ta có các hạt đa domain.
Khi kích thước hạt giảm xuống dưới một giá trị nào đó và hạt chuyển thành đơn
domain sẽ xảy ra tình huống trong đó năng lượng kích thích nhiệt (có xu hướng phá
vỡ sự định hướng mô men từ của các hạt) trở nên trội hơn năng lượng dị hướng từ
(có tác dụng định hướng mô men từ của các hạt). Khi đó mô men từ của các hạt sẽ
định hướng một cách hỗn độn do đó mô men từ tổng cộng bằng không. Chỉ khi có
từ trường ngoài tác dụng thì mới có sự định hướng của mô men từ của các hạt và
tạo ra mô men từ tổng cộng khác không. Tính chất này là đặc trưng cho các vật liệu
thuận từ nhưng ở đây mỗi hạt nanô có chứa nhiều nguyên tử nên có mô men từ lớn
hơn mô men từ nguyên tử nhiều lần, vì vậy tính chất này được gọi là tính chất siêu
thuận từ.
5
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
Đường cong từ trễ của vật liệu siêu thuận từ cũng tuân theo hàm Langevin
như trường hợp thuận từ. Đường cong này có hai đặc điểm đó là: lực kháng từ Hc = 0,
từ độ dư Mr = 0 nghĩa là không có hiệu ứng trễ. Hình 1.1 diễn tả sự thay đổi đường
cong từ hoá của vật liệu sắt từ khi kích thước hạt giảm. Trong giới hạn đơn domain khi
kích thước hạt giảm thì Hc giảm cho đến khi Hc = 0, kích thước tại đó Hc = 0 chính là
giới hạn siêu thuận từ. Hình 1.2 biểu diễn sự thay đổi của Hc khi đường kính hạt giảm.
H
Đ
Đa
ơn domạin
S
c
iêu
domain
thuận
từ
d
d
Hình 1.1. Đường cong từ trễ sắt từ (-
Hìnhp 1.2. Hsc phụ thuộcmvào
--) và siêu thuận từ (---)
đường kính hạt
d
Do sự cạnh tranh giữa năng lượng dị hướng và năng lượng kích thích nhiệt
mà các hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ khi kích thước thoả mãn điều kiện (1.1):
Vp
25kBT
K
(1.1)
với Vp là thể tích hạt, kB là hằng số Boltzmann (kB = 1,38.10-23 J/mol.K), T là nhiệt
độ của mẫu, K là hằng số dị hướng từ. Dựa vào điều kiện (1.1) ta có thể đánh giá
giới hạn kích thước để hạt thể hiện tính chất siêu thuận từ ở nhiệt độ phòng khi biết
giá trị của K. Ngược lại với các hạt có kích thước xác định (có Vp xác định) tồn tại
nhiệt độ chuyển pha sắt từ - siêu thuận từ còn gọi là nhiệt độ Blocking (TB):
TB
6
KVp
25kB
(1.2)
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
Trên nhiệt độ TB điều kiện (1.1) được thoả mãn hạt thể hiện tính chất siêu
thuận từ, dưới nhiệt độ này điều kiện đó không được thoả mãn và hạt thể hiện tính
chất sắt từ [31].
1.1.3. Vật liệu oxit sắt từ Fe3O4
Vật liệu Fe3O4 kích thước < 20 nm là vật liệu siêu thuận từ. Khi ở kích thước
hạt lớn, hệ ở trạng thái đa đômen (tức là mỗi hạt sẽ cấu tạo bởi nhiều đômen từ).
Khi kích thước hạt giảm dần, Fe3O4 sẽ chuyển sang trạng thái đơn đômen (mỗi hạt
sẽ là một đômen). Hiện tượng siêu thuận từ xảy ra khi kích thước hạt giảm quá nhỏ,
năng lượng định hướng nhỏ hơn nhiều năng lượng nhiệt, vì vậy năng lượng nhiệt
phá vỡ sự định hướng song song của các mômen từ, và các mômen từ của hệ hạt sẽ
định hướng hỗn loạn như trong chất thuận từ.
1.1.4. Ứng dụng của hạt nano từ Fe3O4
Ứng dụng của hạt nano từ được chia làm hai loại: ứng dụng trong cơ thể và
ngoài cơ thể. Các ứng dụng trong cơ thể gồm: dẫn thuốc, nung nóng cục bộ và tăng
độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ. Phân tách và chọn lọc tế bào là ứng dụng
ngoài cơ thể nhằm tách những tế bào cần nghiên cứu ra khỏi các tế bào khác [3].
Đây cũng chính là ứng dụng được chúng tôi nghiên cứu sử dụng trong luận văn này.
Giống như trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ
được các kháng thể hoặc các phân tử khác như các hoóc-môn, a-xít folic tìm thấy.
Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên. Đây là cách rất hiệu quả và chính
xác để đánh dấu tế bào. Các hạt nano từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa
tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào
hồng cầu, tế bào ung thư phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi
[4]. Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradient từ trường ngoài. Từ
trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào được đánh dấu. Các
tế bào không được đánh dấu sẽ không được giữ lại và thoát ra ngoài.
7
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
1.1.5. Hạt nano Bạc và tính chất
Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và
nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể
hiện tính độc với con người.
Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện
tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật
liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn. Tương tự các hạt nano kim
loại quý khác, các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt.
1.1.6. Cộng hƣởng Plasmon bề mặt [16]
Một trong những tính chất quan trọng của các hạt nano kim loại, đó là hiện
tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiệu ứng cộng hưởng Plasmon bề mặt là hiệu
ứng đặc trưng của các hạt nano kim loại. Vì trong kim loại có nhiều điện tử tự do
nên khi hấp thụ ánh sáng chiếu vào các điện tử tự do này sẽ dao động tập thể
cùng pha với điện trường ánh sáng. Dao động đó gọi là dao động Plasma điện tử.
Khi quãng đường tự do trung bình của các điện tử nhỏ hơn kích thước của
chúng, các dao động này thông thường bị dập tắt bởi các sai hỏng mạng hay
chính các nút mạng trong tinh thể nguyên tử kim loại. Nhưng khi kim loại ở kích
thước nano thì kích thước của chúng lại nhỏ hơn quãng đường tự do trung bình
do đó hiện tượng dập tắt không còn nữa mà các điện tử sẽ dao động cộng hưởng
vói ánh sáng kích thích.
Do vậy tính chất quang của hạt nano kim loại có được do sự dao động tập thể
của các điện tử dẫn đến quá trình tương tác với bức xạ sóng điện từ. Khi dao động
như vậy, các điện tử sẽ phân bố lại trong hạt nano làm cho hạt nano bị phân cực
điện tạo thành một lưỡng cực điện. Do vậy xuất hiện một tần số cộng hưởng phụ
thuộc vào nhiều yếu tố nhưng hình dáng, kích thước, độ lớn của hạt nano và môi
trường xung quanh là các yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Ngoài ra mật độ hạt nano
cũng ảnh hưởng đến tính chất quang. Nếu mật độ loãng có thể coi như gần đúng các
hạt tự do, nếu nồng độ cao thì phải kể đến tương tác giữa các hạt (Hình 1.3).
8
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
Hình 1.3. Mô tả hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề
mặt của hạt nano kim loại.
1.1.7. Tán xạ Raman [12]
Tán xạ Raman là một quá trình tán xạ không đàn hồi giữa photon (lượng tử
ánh sáng) và một lượng tử dao động của vật chất hay mạng tinh thể. Sau quá trình
va chạm, năng lượng của photon giảm đi (hoặc tăng lên) một lượng bằng năng
lượng giữa hai mức dao động của nguyên tử (hoặc mạng tinh thể) cùng với sự tạo
thành (hoặc hủy) một hạt lượng tử dao động. Dựa vào phổ năng lượng thu được, ta
có thể có những thông tin về mức năng lượng dao động của nguyên tử, phân tử hay
mạng tinh thể.
1.1.7.1. Cơ sở lý thuyết tán xạ Raman
Trong quang phổ Raman, mẫu được chiếu xạ bởi chùm laser cường độ mạnh
trong vùng tử ngoại-khả kiến ( v0 ) và chùm ánh sáng tán xạ thường được quan sát
theo phương vuông góc với chùm tia tới. Ánh sáng tán xạ bao gồm hai loại : một
được gọi là tán xạ Rayleigh, rất mạnh và có tần số giống với tần số chùm tia tới
( v0 ); loại còn lại được gọi là tán xạ Raman, rất yếu (10-5 chùm tia tới) có tần số là
v0 vm , trong đó vm là tần số dao động phân tử. Vạch
v0 vm được gọi là vạch Stockes
và vạch v0 vm gọi là vạch phản Stockes. Do đó, trong quang phổ Raman, chúng ta đo
tần số dao động ( vm ) như là sự dịch chuyển so với tần số chùm tia tới ( v0 ) (Hình 1.4).
Khác với phổ hồng ngoại, phổ Raman được đo trong vùng tử ngoại-khả kiến mà ở đó
các vạch kích thích (laser) cũng như các vạch Raman cùng xuất hiện.
9
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
Hình 1.4. Mô hình tán xạ Raman của phân tử CH4.
Theo lý thuyết cổ điển, tán xạ Raman có thể được giải thích như sau: Cường
độ điện trường E của sóng điện từ (chùm laser) dao động theo thời gian có dạng:
E E0 cos2v0t
Trong đó, E0 là biên độ dao động và v0 là tần số laser. Nếu một phân tử hai
nguyên tử được chiếu bởi ánh sang này thì một momen lưỡng cực điện sẽ xuất hiện
do cảm ứng có dạng sau: P E E0 cos2v0t
Trong đó là hằng số tỷ lệ được gọi là hệ số phân cực. Nếu phân tử dao
động với tần số vm , thì sự dịch chuyển q của hạt nhân có dạng sau:
q q0 cos2vmt
Trong đó q0 là biên độ dao động. Với biên độ dao động nhỏ, là hàm tuyến
tính theo q. Do đó, chúng ta có thể viết:
q ...
q 0
0
Suy ra : P E0 cos2 v0t 0 E0 cos2 v0t
qE0 cos2 v0t
q 0
10
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
P 0 E0 cos 2 v0t
q0 E0 cos 2 v0t.cos 2 vmt
q 0
1
P 0 E0 cos 2 v0t
q0 E0 cos 2 (v0 vm )t cos 2 (v0 vm )t
2 q 0
Theo lý thuyết cổ điển, số hạng thứ nhất mô tả một lưỡng cực dao động mà
nó bức xạ tần số v0 (tán xạ Rayleigh); số hạng thứ hai là tương ứng với tán xạ
Raman với tần số v0 vm (phản Stockes) và v0 vm (Stockes).
Nếu bằng không thì sự dao động không thể tạo ra phổ Raman. Nói
q 0
chung, để có phổ Raman thì tỷ số này phải khác 0.
1.1.7.2. Tán xạ Raman tăng cƣờng bề mặt – (Surface Enhanced Raman ScateringSERS) [44]
So với các quá trình tán xạ đàn hồi (năng lượng của photon không đổi) thì
xác suất xảy ra tán xạ Raman là rất nhỏ. Như vậy, để quan sát được vạch Raman, ta
phải tăng cường độ của vạch Raman và tách vạch Raman khỏi vạch chính.
Việc tách phổ có thể thực hiện khá đơn giản bằng một kính lọc, hay phức tạp hơn
một chút là phép biến đổi Fourier.
Để có được cường độ vạch Raman lớn, hiện nay có 2 phương pháp cộng
hưởng thường được áp dụng trong tán xạ Raman để khuyếch đại vạch Raman lên.
Phương pháp đầu tiên được dùng là CARS, viết tắt của Coherent Antistokes
Raman Scattering. Nguyên tắc của phương pháp này là chiếu hai chùm sáng (laser)
có độ chênh lệch năng lượng và xung lượng đúng bằng năng lượng và xung lượng
của lượng tử dao động. Tương tác giữa hai chùm này sẽ làm số hạt lượng tử dao
động tăng lên nhiều, dẫn đến xác suất va chạm không đàn hồi tăng lên. Tuy nhiên
hiệu quả của phương pháp này không cao.
Phương pháp thứ hai là SERS (viết tắt của Surface Enhanced Raman
Scattering – tán xạ Raman tăng cường bề mặt) tức là tăng cường độ vạch Raman
bằng plasmon bề mặt (surface plasmon). Plasmon bề mặt là một dạng lượng tử của
trường điện từ trong môi trường plasma có hằng số điện môi âm, ví dụ như trong
11
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
kim loại với tần số sóng điện từ nhỏ hơn tần số plasma của electron trong kim loại.
Khi sóng điện từ truyền dọc bề mặt một tấm kim loại với tần số sóng nhỏ hơn tần số
plasma của electron trong kim loại, tương tác của sóng và plasma electron (một
trạng thái mà tất cả các electron chuyển động như một thể thống nhất) làm sóng
điện từ có thể thâm nhập vào môi trường (gần bề mặt) và định xứ ở đó. Dùng
plasmon bề mặt có thể tăng cường độ điện trường một cách cục bộ. Vì thế, khi đưa
nguyên tử cần đo phổ Raman vào khu vực điện trường cao đó, tương tác giữa
nguyên tử và trường điện từ sẽ mạnh hơn, dẫn đến phổ Raman có cường độ lớn hơn.
1.1.7.3. Ứng dụng của SERS
Do đặc tính của hiệu ứng tán xạ Raman tăng cường bề mặt chỉ xảy ra trên bề
mặt các hạt nano [26]. Và những liên kết càng gần bề mặt hạt nano sẽ cho các đỉnh
tán xạ đặc trưng của các liên kết đó. Ngoài ra, việc bọc thêm nhiều lớp vỏ trên bề
mặt của hạt nano cũng không làm thay đổi cường độ của các đỉnh tán xạ đặc trưng.
Vì vậy một trong những ứng dụng quan trọng của phương pháp tán xạ Raman tăng
cường bề mặt là có thể được dùng để đánh dấu chẳng hạn đánh dấu tế bào ung thư
vú [36] , tế bào ung thư da [6] và nhận biết các tế bào mang bệnh trong y sinh [38].
Bên cạnh đó, phương pháp tán xạ Raman tăng cường bề mặt còn được ứng
dụng để nghiên cứu quá trình động học trên bề mặt hạt nano kim loại, trong đó hạt
nano kim loại quý như vàng, bạc được ưu tiên nhờ khả năng tăng cường hiệu ứng
rất mạnh.
Ngoài những ứng dụng kể trên, thì phương pháp này cũng được sử dụng để
kiểm tra lại cơ chế của các phản ứng đã biết, đồng thời nghiên cứu quá trình động
học của các phản ứng chưa biết. Thông thường, trong một phản ứng việc xác định
sự tồn tại của các liên kết và độ bền của các liên kết trong sản phẩm sau phản ứng là
rất quan trọng. Bằng phương pháp tán xạ Raman tăng cường bề mặt ta hoàn toàn có
thể chỉ ra sự tồn tại đồng thời của các chất ở trạng thái trung gian với sản phẩm sau
phản ứng. Đồng thời đưa ra đánh giá về hiệu suất phản ứng và kết luận về sản phẩm
sau phản ứng hoàn toàn phù hợp với các dự đoán ban đầu.
12
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
1.1.8. Hạt nano composite đa chức năng Fe3O4/Ag
Hạt nano composite Fe3O4/Ag kết hợp cả hai loại hạt nano đơn lẻ Fe3O4 và hạt
nano kim loại Ag, mang đầy đủ những tính chất đặc biệt lý thú bao gồm: tính siêu
thuận từ của vật liệu Fe3O4 giúp phân tách và chọn lọc tế bào, tính chất quang của
hạt nano kim loại nói chung và hạt bạc nói riêng có khả năng ứng dụng để đánh dấu
tế bào [13, 32].
Hiện nay, việc nghiên cứu các hạt nano có cấu trúc lõi-vỏ đang được rất nhiều
nhóm nghiên cứu trong nước và trên thế giới quan tâm, đồng thời đã đạt được
những thành tựu nhất định có thể kể đến như:
- Nhóm nghiên cứu Xueping Zhang đã chế tạo thành công hạt nano composite
bằng phương pháp hóa ướt đơn giản [52].
- Nhóm nghiên cứu E. Iglesias-Silva của trường đại học Santiago đã tổng hợp
thành công hạt nano Fe3O4 bọc Ag sử dụng chất khử Glucose [21].
- Hay nhóm nghiên cứu Ling-Yan Zhang và Ting Chu tại trung tâm kiểm định
pháp y Trung Quốc đã chế tạo thành công vật liệu composite cấu trúc lõivỏ Fe3O4@Ag sử dụng chất khử NaBH4 đồng thời khảo sát ở các pH từ 3-9
nhằm ứng dụng trong việc nhận biết dấu vân tay [28].
- Nhóm nghiên cứu Wansong Yu thuộc đại học khoa học và công nghệ thực
phẩm tại Trung Quốc đã nghiên cứu và chế tạo hạt nano Hybrid Fe3O4/Ag,
sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) để phát hiện hàm lượng
Furazolidone tồn dư trong thức ăn cho cá [47].
Trong đề tài này, chúng tôi chế tạo hạt nano composite Fe3O4/Ag-NH2 dùng
chất khử NaBH4 để khử các ion Ag+ thành Ag bám trên bề mặt của hạt nano từ
Fe3O4 thông qua liên kết NH2 trên bề mặt hạt nano sắt từ đồng thời khảo sát ở các
pH khác nhau tương ứng là 5, 7, 9 và 11. Tuy nhiên, việc khảo sát tính chất hạt nano
composite phụ thuộc vào pH không được trình bày cụ thể trong luận văn này, qua
khảo sát tính chất vật lý của các mẫu có pH khác nhau, chúng tôi thấy rằng: tại
pH=11, hạt nano composite có sự ổn định từ tính, các hạt nano Ag bám tốt hơn trên
bề mặt của hạt từ Fe3O4 đảm bảo điều kiện ứng dụng trong sinh học. Tuy nhiên, để
có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa bề mặt
13
Luận văn thạc sỹ
Nguyễn Thị Hà
bởi các nhóm chức để có thể gắn kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng
thể, enzyme,… Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, streptavidin,
cacboxyl, thiol…[2]. Trong luận văn này chúng tôi sử dụng nhóm chức amin -NH2
phục vụ cho mục đích gắn kết với kháng thể trước khi đưa lên tế bào.
1.2.
Thử nghiệm ứng dụng hạt nano đa chức năng trong đánh dấu tế bào
1.2.1. Bệnh ung thƣ
Bệnh ung thư khởi nguồn từ sự biến đổi đột ngột DNA của các tế bào bình
thường. Khi phát hiện lỗi trên DNA, lập tức cơ thể sẽ có phản ứng sửa chữa, phá
hủy, hoặc ngăn chặn quá trình phát triển của tế bào mang mầm DNA lỗi đó. Nhưng
trong các tế bào bị ung thư cơ chế sửa lỗi hoặc hạn chế phát triển của tế bào không
hiệu nghiệm [33]. Đây là một trong những nguyên nhân gây bệnh ệnh ung thư, hay
sự phát triển không thể kiểm soát của một nhóm tế bào. Thông thường các bệnh ung
thư bắt nguồn từ sự đột biến gene do các tác nhân môi trường, ví dụ như chất độc
hại trong khói thuốc là, tia X hoặc tia phóng xạ ...Các tế bào ung thư thường tập hợp
lại thành những khối u riêng biệt. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp các tế bào
này không tích tụ lại như trong trường hợp của ung thư bạch cầu. Những trường hợp
phát triển mạnh của ung thư xuất hiện khi các tế bào mang mầm bệnh xâm nhập vào
trong máu hoặc các cơ quan sản sinh ra hồng cầu, rồi phát triển lan ra các mô tế bào
khác. Chúng ta thường gọi trường hợp này là di căn.
Những hiện tượng u, viêm chưa thể qui kết là các bệnh ung thư. Ví dụ những
khối u lành tính không gây hiệu ứng lan ra các bộ phận khác trong cơ thể, và trong
một vài trường hợp hiếm có, chúng không gây nguy hiểm đến tính mạng [41].
1.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh ung thƣ
Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện bệnh ung thư. Khi gặp các hiện
tượng u, viêm, sau khi khám sơ bộ và nghi ngờ là bệnh nhân mắc phải bệnh, bác sĩ
có thể áp dụng các phương pháp thử sinh học (biopsy), phép thử nội soi tế bào
(endoscopy), và các phép chụp (imaging) [50].
Với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, cũng như Công nghệ sinh
học hiện đại, các phương pháp phân tử (molecular diagnostics) không những giúp
14
