Kết quả thực hành môn học thực hành hóa sinh căn bản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN
KHOA DƯỢC
˜™

Môn học : Thực hành hóa sinh căn bản

Nhóm :

2

Năm 2014 – 2015


MỤC LỤC
BÀI 1: KHẢO SÁT ENZYME
BÀI 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ENZYME
BÀI 3: SACCHARIDE
BÀI 4: LIPID
BÀI 5: AMINO ACID VÀ PROTEIN
BÀI 6: TÌM NHỮNG CHẤT BẤT THƯỜNG TRONG NƯỚC TIỂU


BÀI 1:
KHẢO SÁT ENZYME
I/ MỤC TIÊU:
1. Nắm được cơ chế hoạt động của enzyme.
2. Biết được một số enzyme thủy phân cơ bản và những cơ chất tương ứng được
thủy phân bởi các enzyme đó.
II/ THỰC HÀNH:
1. Thí nghiệm 1: Thủy phân tinh bột bằng Amylase
a. Nguyên tắc:

- Tinh bột khi có mặt của Amylase bị thủy phân thành các dextrin.
- Thời gian thủy phân càng kéo dài thì càng tạo các dextrin với phân tử lượng
-

càng nhỏ và cuối cùng là maltose.
Các sản phẩm tạo thành ở mức độ thủy phân khác nhau từ tinh bột tạo thành

màu khác nhau với dung dịch Iốt.
b. Hoá chất và dụng cụ:
- Ống nghiệm
- Nước cất
- Cốc có mỏ
- Nước bọt
- Ống hút
- Hồ tinh bột
c. Tiến hành:
1 ml nước bọt

19 ml nước cất
Lắc đều

Dung dịch nước
bọt 1/20

Cốc có mỏ
1 ml dd hồ 4tinh
bột 1% + 0.5 ml

Ống 1: 0p

dd nước bọt 1/20

Nhỏ 1 giọt

(lần lượt mỗi ống)

dd Iốt 1%

Sau thời
gian

1
•
-

2

3

4

5

d. Kết quả và bàn luận:
Quan sát ta thấy: ( từ trái sang phải)
Ống 1: có màu tím than
Ống 2: có màu tím than nhưng nhạt hơn ống 1
Ống 3: có màu nhạt hơn ống 2 (màu nâu)
3

Ống 2: 5p
Ống 3: 10p
Ống 4: 15p
Ống 5: 20p


-

Ống 4: có màu vàng cam
Ống 5: có màu vàng nhạt

• Giải thích:
Tại thời gian 0 phút, nhỏ một giọt Iốt 1% vào ống 1, ta quan sát được ống 1 có
màu tím than. Và 5 phút sau nhỏ tiếp một giọt Iốt 1% vào ống 2, lúc này ống 2 sẽ có
màu nhạt hơn ống 1. Tiếp tục như vậy 5 phút sau, lại nhỏ một giọt Iốt 1% vào ống
3, ống sẽ có màu nhạt hơn ống 2 (dần chuyển qua màu nâu). Ở ba ống 1, 2, 3: thời
gian từ 0 đến 10 phút màu còn tối là vì lượng tinh bột chưa được thủy phân hết, còn
nhiều nên khi cho Iốt tác dụng với tinh bột cho ra màu nhạt dần từ tím đến nâu.
Vẫn như vậy, sau 5 phút, khi sang ống 4, ống sẽ có màu vàng cam, sự chuyển
đổi màu rõ rệt hơn vì lượng tinh bột đã bị thủy phân gần hết. Cuối cùng là ống 5,
lượng tinh bột đã bị thủy phân hết nên có màu vàng nhạt.
2. Thí nghiệm 2:Thủyphân Urê bằng Urease
a. Nguyên tắc:
CO(NH2)2+ H2O

Urease
CO2 + 2NH3

NH3 làm kiềm hóa môi trường, với sự có mặt của phenolphthalein làm dung dịch
chuyển màu hồng.

4


b. Hóa chất và dụng cụ:
- Ống nghiệm
- Ống hút

- Dd Urê 10%
- Dd phenolphthalein 1%
- Bột đậu nành

c. Tiến hành:
Cho 2 ống nghiệm:
1.5 ml dd Urê 10%

1.5 ml dd Urê 10%

1.5 ml dd phenolphthalein 1%

1.5 ml dd phenolphthalein 1%

0.5g bột đậu nành

1

2

Lắc đều (5 – 10 phút)
d. Kết quả và bàn luận:
• Quan sát ta thấy (từ trái sang phải):

- Ống 1: có màu phớt hồng
- Ống 2: tách làm 2 lớp: lớp trên có màu hồng bị vẩn đục, lớp dưới có màu
vàng

5


• Giải thích:
Ở ống 1, khi cho 1.5 ml dd Urê 10% và 2 giọt dd Phenolphthalein 1% tác dụng
với nhau thì ta thấy xuất hiện mà phớt hồng là bởi vì Urê có tính kiềm yếu nên khi
cho phenolphthalein vào sẽ có màu như vậy.
Ở ống 2, vẫn với lượng dd Urê 10% và dd Phenolphthalein 1% như ống 1, và
thêm 0.5g bột đậu nành thì ta thấy sự tách lớp, vì Urê đã bị thủy phân bởi bột đậu
nành tạo ra NH3(môi trường kiềm). Khi cho phenolphthalein vào thì dd sẽ có màu
hồng bị vẩn đục ở lớp trên, lớp dưới sẽ có màu vàng là do bột đậu nành chưa tan
hết.
3. Thí nghiệm 3:Thủy phân Lipid bằng Lipase
a. Nguyên tắc:
Lipid (Triglyceride) bị thủy phân thành glycerol và acid béo, sự giải phóng ra
acid làm acid hóa môi trường phản ứng.
b. Hóa chất và dụng cụ:

6


-

Ống nghiệm
Ống hút

- Dd sữa nhũ tương
- Dd phenolphthalein 1%
- Dd Na2CO3
- Nước cất
- Dịch tụy

c. Tiến hành:
Cho 2 ống nghiệm:
1 ml dd sữa nhũ tương

1 ml dd sữa nhũ tương

2 giọt dd phenolphthalein 1%

2 giọt dd phenolphthalein 1%

Nhỏ từ từ dd Na2CO3 1%

Nhỏ từ từ dd Na2CO3 1%

3 giọt nước cất

3 giọt dịch tủy

1

2

Để 30 phút
d. Kết quả và bàn luận:

• Quan sát ta thấy (từ trái sang phải):
- Ống 1: có màu hồng
- Ống 2: có màu trắng đục

• Giải thích:
7


Trong sữa nhũ tương có lipid nên khi cho phenolphthalein vado thì cả hai ống
đều không đổi màu. Đến khi nhỏ từ từ Na 2CO3 vào hai ống dd bắt màu hồng (vì
Na2CO3có môi trường kiềm).
Tiếp theo khi cho nước cất vào ống 1 và dịch tụy vào ống 2, thì dd trong ống 1
vẫn không đổi màu, còn ống 2: vì trong dịch tụy có enzyme thủy phân lipid thành
glycerol và acid béo (môi trường acid), acid sẽ tác dụng với base tạo ra muối (môi
trường trung tính) nên sẽ làm mất màu hồng
HÌNH ẢNH CẢ BA THÍ NGHIỆM

BÀI 2:
8


XÁC ĐINH HỌAT ĐỘ ENZYME
I/. MỤC TIÊU:
1. Nắm được phương pháp đo quan và ứng dụng.
2. Định lượng sGOT, sGPT, amylase.
II/ THỰC HÀNH:
CÁCH VẬN HÀNH MÁY SH PRIETEST TOUCH
Ở bài thí nghiệm này thì cả 3 thí nghiệm đều có những bước tiến hành giống
nhau, chỉ khác ở tỉ lệ pha mẫu thử:
-

Đối với thí nghiệm xác định hoát độ sGOT, sGPT:
+ Thuốc thử : 500 µl
+ Huyết thanh: 50 µl

-

Đối với thí nghiệm xác định α amylase huyết thanh:
+ Thuốc thử: 500 µl
+ Huyết thanh: 5 µl

Bước 1: Khởi động máy
•
•
•
•

Vệ sinh máy, kiểm tra dây cáp điện, ống dẫn hóa chất… đã sẵn sàng.
Bật công tắt nguồn.
Hệ thống khởi đông xong màn hình chính hiển thị MENU.
Rửa máy: đưa nước cất đến vị trí hút mẫu, chọn WASH ( tương tự lặp lại 3
lần)

Bước 2: Chạy mẫu thử bệnh nhân
• Chuẩn bị mẫu bệnh nhân (hút hóa chất, huyết tương, ủ)
• Trên màn hình chính MENU di chuyển con trỏ đến xét nghiệm cần làm
(sGOT, sGPT, Amylase) sau đó chọn ENTER
chọn SEL
• Chờ màn hình hiển thị “Press ASP Switch to sip”
• Đưa nước cất đến vị trí hút mẫu, nhấn nút bên dưới ống hút.

chọn RUN

Sau đó tùy loại xét nghiệm màn hình sẽ hiển thị một trong hai trường hợp sau:
TH1:
 Màn hình hiển thị “Use stored result?”, chọn Yes.
 Chờ màn hình hiển thị “Use blank stored result?” chọn Yes.
 Chờ màn hình hiển thị “Read sample”, đưa mẫu bệnh nhân đến vị trí hút
mẫu, nhấn nút bên dưới ống hút.
 Kết quả sẽ hiện ra trong 3 phút.
9


TH2:
 Màn hình hiển thị “Read sample”, đưa mẫu bệnh nhân đến vị trí hút mẫu,
nhấn nút bên dưới ống hút.
 Kết quả sẽ hiện ra trong 3 phút.
Chú ý:
+ Sau mỗi loại xét nghiệm rửa nước cất lại trước khi làm xét nghiệm khác.
+ Bấm ESC trở về màn hình chính MENU.
+ Vệ sinh máy sau mỗi lần thí nghiệm.
1. Thí nghiệm 1:Xác định hoạt độ sGOT (ASAT) và sGPT (ALAT)
a. Nguyên tắc:
- ASAT (GOT) được xác định dựa trên phản ứng:
L-Aspartate + α-Ketoglutarate

Oxaloacetate + L-Glutamate

Oxaloacetate + NADHH+L-Malate + NAD+
• MDH – Malate dehydrogenase

- ALAT (GPT) được xác định dựa trên phản ứng :
Alanine + α-Ketoglutarate Pyruvate + L-Glutamate
Pyruvate + NADHH L-Latate + NAD
• LDH – Latate dehydrogenase
b. Dụng cụ và hóa chất:
• Hóa chất.
- Huyết tương được li tâm thành huyết thanh.
- Thuốc thử Sgot và sgop.
• Dụng cụ.
- Ống nghiệm thủy tinh.
- Ông hút thuốc thử và huyết thanh.
- Máy đo quang.

c. Tiến hành:
• Định lượng hoạt độ sGOT trong huyết thanh.
- Đo bước sóng 340nm (334 – 365nm)
- Nhiệt độ : 30 – 37ºC.
- Đọc đối chiếu với nước cất.
- Trong ống nghiệm cho vào:
+ Thuốc thử : 500 µl.
+ Huyết thanh : 50 µl.
- Trộn đều và sau khi ủ 1 phút, đọc giá trị.
10


•
-

Định lượng hoạt độ sGPT trong huyết thanh.
Đo bước sóng 340nm (334 – 365nm).

Nhiệt độ : 30 – 37ºC.
Đọc đối chiếu với nước cất.
Trong ống nghiệm cho vào:
+ Thuốc thử : 500µl.
+ Huyết thanh : 50µl.
- Trộn đều và sau khi ủ 1 phút, đọc giá trị.
d. Kết quả và bàn luận:
 Định lượng hoạt độ sGOT trong huyết thanh:
* Kết quả:
- Vũ ĐứcAnh : 30,48 U/L.

- Kiều My : 22,43 U/L.

11


*Biện luận:
- Đối với Vũ Đức Anh, trị số 30,48 U/L là bình thường vì trị số sGOT
bình thường đối với nam là từ 13-46 U/L. Nếu sGOT nhỏ hơn 13 U/L
hoặc lớn hơn 46 U/L thì trị số sGOT là không bình thường.
- Đối với Kiều My, trị số 22,43 U/L là bình thường vì trị số sGOT bình
thường đối với nữ là từ 11-39 U/L. Nếu sGOT nhỏ hơn 11U/L hoắc lớn
hơn 39 U/L thì trị số sGOT là không bình thường.
 Định lượng hoạt độ sGPT trong huyết thanh:
*Kết quả:
- Vũ Đức Anh : 24,21 U/L.

-Kiều My : 15,44 U/L.

12

*Biện luận:
- Đối với Vũ Đức Anh, trị số 24,21 U/L là bình thường vì trị số sGPT
bình thường đối với nam là từ 11-59 U/L. Nếu trị số sGPT nhỏ hơn 11
U/L hoặc lớn hơn 59 U/L là không bình thường.
- Đối với Kiều My, trị số 15,44 U/L là bình thường vì trị số sGPT bình
thường đối với nữ là từ 9-37 U/L. Nếu trị số sGPT nhỏ hơn 9 U/L hoặc
lớn hơn 37 U/L là không bình thường.
Từ két quả tên ta có được tỉ số Deritis (ASAT/ALAT).
- Vũ Đức Anh :
- Kiều My :
e. Nhận định kết quả:
- Hoạt độ ezyme sGOT và sGPT trong huyết thanh của Vũ Đức Anh và
Kiều My là bình thường.
- Trong một số trường hợp sgop và sgtp tăng quá cao, quá thấp hoặc 2 trị
số chênh lệch nhau quá nhiều thì có thể mắc 1 số bệnh như : viêm gan
cấp tính, viêm gan mãn, xơ gan, nhồi máu cơ tim, tăng trọng lượng
dưởng cơ xương, viêm xương, tiêu myglobin.
* Những yếu tố ảnh hưởng đến trị số sGOT và sGPT trong huyết thanh.
- Yếu tố gây giảm: thiếu vitamin B6.
- Yếu tố gây tăng: thuốc điều trị tiểu đường, giảm đau, chống thống
phong,trợ tim, chống động kinh, ngừa thai.
2. Thí nghiệm 2:Xác định α amylase huyết thanh
a. Nguyên tắc:
13


5CNPG3

α amylase

3CNP + 2CNPG2 + 3G3 +2G

CNPG3 : 2-chloro-4-nitrophenyl-maltotrioside
CNP: 2-chloro-4-nitrophenol
b. Dụng cụ và hóa chất:
• Hóa chất.
- Huyết tương được li tâm thành huyết thanh.
- Enzyme amylase
• Dụng cụ.
- Ống nghiệm thủy tinh.
- Ông hút thuốc thử và huyết thanh.
- Máy đo quang.
c. Tiến hành:
- Thuốc thử: dung dịch RGT đã pha sẵn
- Mẫu thử: huyết thanh
- Bước sóng đo:400 – 410 nm
- Nhiệt độ : 25ºC - 37ºC.
- Đọc đối chiếu với nước cất.
- Trong ống nghiệm cho vào:
+ Thuốc thử : 500 µl.
+ Huyết thanh : 5 µl.
- Trộn đều, cho vào máy đo và đọc giá trị sau 3p.
d. Kết quả và bàn luận:
*Kết quả:
- Vũ Đức Anh: 272,5 U/L

- Kiều My: 274,8 U/L
14

*Biện luận:
- Đối với Vũ Đức Anh, giá trị amylase huyết thanh cao hơn so với giá trị
bình thường ( >220 U/L).
- Đối với Kiều My, giá trị amylase huyết thanh cũng cao hơn so với giá
trị bình thường ( >220 U/L).
e. Nhận định kết quả:
- Giá trị bình thường: Amylase huyết thanh, huyết tương <220U/L.
- Huyết thanh, huyết tăng có thể nhận định kết quả là:
+ Suy thận tiến triển: thường tăng, thậm chí cả khí không có viêm tụy.
+ Tăng tiết amylase.
+ Loét dạ dày tá tràng thủng vào tủy.
- Amylase giảm khi tụy bị hoại tử lan rộng, ngoài ra nó còn giảm trong
một số bệnh lý như:
+ Viêm tụy mạn tính.
+ Viêm tụy mạn tính tiến triển.
+ Xơ hóa ống dẫn tụy tiến triển.

15


BÀI 3:
XÁC ĐINH HỌAT ĐỘ ENZYME
I/ MỤC TIÊU:
1. Khảo sát các tính chất hóa học cơ bản của saccharide.
2. Định lượng saccharide bằng phương pháp enzyme.
II/ THỰC HÀNH:
1. Thí nghiệm 1: Phản ứng Fehling
a. Nguyên tắc:

- Ở nhiệt độ nóng trong môi trường kiềm, tất cả những chất đường có nhóm
chức aldehyde có tính khử, khử những muối của vài kim loại nặng như: Cu 2+,
Pb2+, Ag+. Fe3+
- Những đường có chứa nhóm –OH bán acetal tự do cũng cho phản ứng này.
b. Dụng cụ và hóa chất:
- Fehling A và B

- Ống nghiệm

- Glucose 5%

- Ống hút

- Fructose 5%

- Máy cách thủy
16


- Lactose 5%
- Saccarose 5%
- Formol 5%
c. Tiến hành:
0.5 ml Fehling A + 0.5 ml
\ Fehling B
Trộn đều

Đun cách thủy 5
phút

1

2

3

4

5

Thêm vào mỗi ống nghệm
Ống nghiệm
Hóa chất
1
Glucose 5%
2
Fructose 5%
3
Lactose 5%
4
Saccarose 5%
5
Formol 5%
Trộn đều, đun sôi cách thủy 5 phút.

Lượng
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml

0.5 ml

d. Kết quả và bàn luận:
- Khi cho 0.5 ml Fehling A + 0.5 ml Fehling B vào các ống nghiệm thì dung
dịch trong ống nghiệm có màu xanh dương, sau khi đun cách thủy 5 phút thì màu
dung dịch không đổi.
- Sau khi thêm vào mỗi ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt là 0.5 Glucose 5%,
0.5 ml Fructose 5%, 0.5 ml Lactose 5%, 0.5 ml Saccarose 5%, 0.5 ml Formol 5%
thì màu dd không đổi.

17


- Sau khi đun cách thủy lần 2 màu dung dịch lần lượt là:
+ Ống 1: Ban đầu dd phớt đỏ, để một thời gian thì có màu hơi xanh, kết tủa
gạch đỏ.
+ Ống 2: Lớp trên có màu phớt đỏ, phía dưới có màu xanh, sau một thời gian
dd có màu xanh đậm hơn ống 1.
+ Ống 3: Lớp trên màu vàng nhạt, phía dưới có màu xanh. Sau một thời gian
có kết tủa đỏ gạch.
+ Ống 4: Có màu xanh, sau một thời gian có kết tủa đỏ gạch.
+ Ống 5: Có màu xanh, sau một thời gian có kết tủa đỏ gạch nhưng ít hơn
ống 4.

18


Giải thích:
Các chất glucose, fructose, lactose, saccarose, formol đều có tính khử, tuy
nhiên tính khử của các chất giảm dần từ glucose > fructose > lactose >

saccarose > formol nên khi hử Cu2+có trong Fehling thành Cu+màu đậm dần từ
ống 1 đến 5.
Sau khi đun nóng CuOH tạo thành Cu2O có màu đỏ gạch
R-CHO + 2 Cu(OH)2R-COOH + 2CuOH + 2H2O
2CuOH

Cu2O + H2O

2. Thí nghiệm 2: Phản ứng Furfural (Phản ứng Molisch)
a. Nguyên tắc:
- Những nhóm –OH rượu bậc 2 trong phân tử đường có thể bị khử có thể
khử nước bởi axit mạnh như HCl, H2SO4 đậm đặc tạo nối đôi.
- Những chất thu được này là dẫn xuất của furfural, với sự có mặt của
polyphenol tạo thành phức hợp có màu đặc trưng khác nhau.
b. Dụng cụ và hóa chất:
- Thuốc thử Molisch

- Ống nghiệm

- Glucose 5%

- Ống hút

- Fructose 5%
- Lactose 5%
19


- Saccarose 5%
- H2SO4 đậm đặc

c. Tiến hành:
- Cho vào ống nghiệm 1ml một dung dịch saccharide, thêm vào 2 giọt thuốc
thử Molisch.
- Sau đó nghiêng thành ống, cho từ từ theo dọc thành ống nghiệm khoảng
1ml H2SO4 đậm đặc.
- Phản ứng dương tinh khi xuất hiện vòng tròn màu tím ở mặt phân cách
giữa 2 lớp chất lỏng.
d. Kết quả và bàn luận:
- Ống Saccarose: chia thành 2 lớp, ở giữa có 1 vòng màu xanh tím ở bề mặt
phân cách giữa hai lớp chất lỏng, lớp trên không màu, lớp dưới có màu tím.

Trước khi cho axit:

20


Sau khi cho axit:

- Ống Glucose: chia thành 2 lớp, ở giữa có 1 vòng màu tím nhạt phân cách
giữa 2 lớp chất lỏng, lớp dưới màu phớt tím, lớp trên không màu.

Trước khi cho axit:
21


Sau khi cho axit:

- Ống Fructose: chia thành 2 lớp, lớp trên không màu, lớp dưới xanh tím.
Trước khi cho axit:

22


Sau khi cho axit:

- Ống Lactose: ở giữa có 1 vòng màu tím ở bề mặt phân cách 2 lớp chất
lỏng, lớp trên màu
Trước khi cho axit:

23


Sau khi cho axit:

Giải thích:
- Khi cho H2SO4 thì các nhóm OH rượu bậc 2 của glucose, fructose, lactose,
saccarose, formol sẽ bị khử nước tạo thành furfural hoặc chuyển hóa chất
furfural.
- Furfural phản ứng với các polyphenol (Molish) cho ra nhũng màu đặc
trưng theo từng loại đường.
24


3. Thí nghiệm 3: Khảo sát Polysacccharide (Khảo sát tinh bột)
a. Nguyên tắc:
- Tinh bột không tan trong nước lạnh, trong nước nóng tạo thành dung dịch
keo gọi là hồ tinh bột.
- Hồ tinh bột cho phản ứng Molisch, khppng cho phản ứng khử, với Iốt tạo
dd màu xanh tím.
b. Dụng cụ và hóa chất:

- Hồ tinh bột

- Ống nghiệm

- Dung dịch Iốt

- Ống hút
- Máy cách thủy

c. Tiến hành:
Tinh bột với Iốt: Cho vào ống nghiêm 1 ml hồ tinh bột, thêm vài giọt Iốt,
quan sát màu xuất hiện, đun sôi vài phút (đun cách thủy), quan sát hiện tượng,
sau đó làm lạnh dưới vòi nước, quan sát.
d. Kết quả và bàn luận:
Khi cho Iốt vào tinh bột có màu tím than, sau khi đun sôi dung dịch mất màu,
dung dịch keo làm lạnh dưới vòi nước thì dd lại có màu tím than, nhưng nhạt
hơn lúc ban đầu.
Ban đầu:

25