Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi vi khuẩn lactic được tuyển chọn từ 4 chủng lactobacillus plantarum w1, w3, w5, n5

PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Khoa học – công nghệ ngày càng tiến bộ đã thúc đẩy con người càng tiếp
cận gần hơn với thế giới sinh vật nói chung và hệ vi sinh vật nói riêng. Điều này
đã tạo nên những thành công trong nghiên cứu ứng dụng vi sinh của các nhà
khoa học. Một trong những thành quả nghiên cứu có thể kể đến đó là ứng dụng
các đặc tính và chế phẩm được tạo ra vi khuẩn lactic vào trong công nghiệp thực
phẩm và nhiều lĩnh vực khác.
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có mặt phổ biến trong các sản phẩm lên
men. Chúng là tác nhân của các quá trình lên men lactic, các loài vi khuẩn này
còn có tiềm năng sinh probiotic, có khả năng tổng hợp bacteriocin và
exopolysaccharide... Trong đó, exopolysaccharide đã mang lại nhiều ứng dụng
quan trong các lĩnh vực khác nhau. Bên cạnh, đóng vai trò cho hoạt động sống
của tế bào, exopolysacchride được sử dụng để làm các chất phụ gia hoàn thiện
cấu trúc của sản phẩm như: chất tạo gel, chất làm dày, chất ổn định và hoàn
thiện tính lưu biến của các sản phẩm thực phẩm [32]. Ngoài ra, EPS còn có các
hoạt động sinh học như hoạt tính chống ung thư, kích thích miễn dịch, hoạt động
giảm cholesterol và các hoạt động chống oxy hóa [40].
Exoplysaccharide có thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau như từ
thực vật hay vi sinh vật. Tuy nhiên việc tách chiết EPS từ nguồn thực vật có
nhiều hạn chế, do chúng liên kết với một số thành phần trong tế bào thực vật nên
quá trình tách khó khăn và khi đưa vào sử dụng thì phải qua xử lí bằng một số
phương pháp hóa học, ezyme để hoàn thiện tính chất của chúng. Trong khi đó
việc tách chiết EPS từ vi sinh vật lại có nhiều ưu điểm hơn như chu kỳ sinh
trưởng và phát triển ngắn, môi trường nuôi cấy tiền, dễ điều khiển quá trình sản
xuất. Nên nếu chúng ta xác định được điều kiện thích hợp nhất để khả năng sinh
exopolysaccharide cao nhất thì sẽ đem lại được nguồn polysaccharide dồi dào và
mở ra được tiềm năng ứng dụng của polysaccharide từ vi sinh vật vào các lĩnh
vực khác nhau.
Sản lượng, kích thước và thành phần hoá học của các polysaccharide được
hình thành exopolysaccharide chủ yếu phụ thuộc vào các chủng, điều kiện nuôi

cấy và thành phần môi trường được sử dụng [15]. Xuất phát từ thực tế nêu trên,
chúng tôi tiến hành để tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường bổ
sung lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide bởi vi khuẩn lactic được
1


tuyển chọn từ 4 chủng Lactobacillus plantarum W 1, W3, W5, N5”. Nhằm xác
định các điều kiện tốt nhất để các chủng Lactobacillus plantarum sinh tổng hợp
EPS, tạo tiền đề cho các quá trình nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide từ bốn chủng
Lactobacillus plantarum (W1, W3, W5, N5) để tuyển chọn được chủng có khả
năng sinh tổng hợp EPS cao nhất.
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại đường bổ sung lên khả năng sinh tổng
hợp exopolysaccharide bởi chủng L. plantarum đã tuyển chọn.
- Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp EPS
bởi chủng L. plantarum đã tuyển chọn.

2


PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
2.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic (LAB) được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Chúng
không đồng nhất về mặt hình thái, các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng
và kích thước khác nhau. Chúng gồm cả vi khuẩn dạng hình que và dạng hình
cầu. Đường kính của các cầu khuẩn lactic từ 0,5- 1,5 µm, các tế bào hình cầu ở
dạng đơn xếp thành cặp, đám hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước các

tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 µm, các tế báo đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc
thành chuỗi. Tuy nhiên về mặt sinh lí, vi khuẩn lactic tương đối đồng nhất.
Chúng đều là các vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử, nhìn chung
không di động, thử nghiệm catalase âm tính, không có các cytochrome và hô
hấp kỵ khí tùy tiện [1], [2], [13]. Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ quá
trình phân giải cacrbohydrate tạo thành axit lactic, ngoài sản phẩm chính là axit
lactic, chúng còn sản sinh ra axit acetic, ethanol, các hợp chất thơm, bacteriocin,
exopolysaccharide và một số enzyme quan trọng khác.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng
không có khả năng lên men các loại cacbonhydrate phức tạp và tinh bột, chỉ có
loài L.delbrueckii là đồng hóa được tinh bột. Một số vi khuẩn lactic dị hình sử
dụng được pentose và axit xitric. Sự phát triển của vi khuẩn lactic cần sự có mặt
của pepton, amino axit hay muối amoni. Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh
dưỡng giàu vitamin, amino axit và khoáng chất. Vì vậy người ta thường nuôi
chúng trên môi trường dinh dưỡng phức tạp chứa số lượng khá lớn cao nấm,
dịch đường [4]. Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì tạo thành axit lactic khác
nhau trong môi trường và sức chịu axit cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn
lactic đồng hình tạo thành axit lactic cao hơn liên cầu khuẩn. Các trực khuẩn này
có thể phát triển ở pH 3,8-4,5 hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở vùng
pH 5,5- 6. Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5 0C
hoặc thấp hơn), các loài ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25-35 0C, các
loài ưa ấm nhiệt độ tối thích là 40-450C.
Chúng được phân bố rộng và có thể tìm thấy trong thực vật, trong các sản
phẩm sữa tươi và sữa được chế biến, các sản phẩm thịt được chế biến và lên men,
các loại rau quả lên men và đường tiêu hóa của người, động vật và chim [1].
3


2.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic
Orla-Jensen sử dụng các đặc điểm sau đây là cơ sở để phân loại vi khuẩn

lactic: hình thái, hình thức lên men đường glucose, khả năng phát triển ở các
nhiệt độ khác nhau, mức độ sử dụng đường. Ông phân chúng thành bốn chi:
Lactobaccillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [13]. Ngày nay
người ta bổ sung thêm một chi nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi.
2.1.2.1. Lactobacillus
Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, có chứa 166
loài [12]. Tế bào của chúng có dạng hình que thay đổi từ trực khuẩn rất ngắn
đến rất dài, mảnh và tương đối dày, thường uốn cong và có thể đứng dưới dạng
các tế bào đơn độc hoặc đứng thành chuỗi từ ngắn đến dài. Chúng kỵ khí không
bắt buộc hay vi hiếu khí. Chúng ưa ấm (nhưng một số loài là dinh dưỡng lạnh),
nhiệt độ sinh trưởng có thể dao động từ 1 đến 50 0C. Nhưng hầu hết những loài
được sử dụng làm giống trong lên men thực phẩm có kiểm soát sinh trưởng tốt
trong khoảng 25- 400C. Một số loài tham gia vào sự lên men tự nhiên của một số
loại thực phẩm ở nhiệt độ thấp, có thể sinh trưởng tốt ở 10-250C.
Lactobaccillus có thể lên men lactic đồng hình hoặc dị hình.Chúng lên men
được đường lactose, saccharose, fructose, glucose hoặc galactose và một số loài
có thể len men được đường pentose. Tùy loài, khi chúng sinh trưởng trên một
nguồn cacbonhydrate có thể làm giảm pH tới giữa 3,5 và 5, 0.
Chúng có vai quan trọng trong việc duy trì sự ổn định và cân bằng hệ vi
sinh trong cơ thể, tạo ra những lợi ích sức khỏe cho vật chủ, ức chế một số vi
sinh vật gây bệnh. Nhiều loài được sử dụng làm chất bảo quản sinh học cho thực
phẩm nhưng cũng có loài gây hư hỏng thực phẩm. L. delbrueckii subsp.
bulgaricus, L. plantarum, L. helveticus được sử dụng trong chế biến sinh học
thực phẩm như được dùng để lên men sữa, rau, thịt và sản xuất bột làm bánh. L.
acdophilus, L. reuteri, L. Casei subsp. casei sử dụng làm chế phẩm probiotic.
L. plantarum, L. fermentum… có thể tổng hợp exopolysaccharide tạo hương vị,
cấu trúc tốt cho các sản phẩm sữa khác nhau. Một số chủng có khả năng sinh
bacteriocin[1],[13].
2.1.2.2. Leuconostoc
Chi Leuconostoc gồm những vi khuẩn có tế bào hình cầu đến hình hạt đậu

được xếp thành cặp hoặc chuỗi ngắn, kỵ khí không bắt buộc, ưa ấm nhưng một
số loài và chủng có thể sinh trưởng ở (hoặc dưới)3 0C. Các loài sinh trưởng tốt
giữa 200C và 30 0C, với một phạm vi từ 1 tới 37 0C. Một số loài có thể tồn tại ở
4


600C trong 30 phút. Leuconostoc lên men lactic dị hình và lên men glucose với
pH giảm tới 4,5 đến 5,0. Nhiều loài (điển hình là Leu. mesenteroides subsp.
dextranicum) sản sinh dextran khi sinh trưởng trên đường saccharose. Chúng
không thủy phân arginin và sử dụng citrate có trong trái cây, rau, sữa để sản sinh
diaxetyl góp phần hình thành nên hương thơm của bơ.
Leu. mesenteroides đã được ứng dụng sản xuất một loại bacteriocin có tác
dụng chống lại vi khuẩn Listeria monocytogenes (gây ngộ độc thực phẩm)
nhưng không gây ảnh hưởng đến vi sinh vật hữu ích khác. Leu. mesenteroides
ssp. cremoris và Leu. lactic được sử dụng trong lên men sữa và lên men rau [1,],
[16].
2.1.2.3. Pediococcus
Chi Pediococcus là những cầu khuẩn, thường dính lại với nhau thành cặp
đôi hoặc bốn, kỵ khí không bắt buộc, ưa ấm và sinh trưởng tốt giữa 25 0C và
400C. Một số loài sinh trưởng ở 50 0C và có thể sống sót sau khử trùng Pauster.
Chúng lên men lactic đồng hình, lên men glucose và tùy thuộc vào loài, chúng
có thể lên men saccharose, arabinose, ribose và xylose. Một số loài làm giảm pH
xuống 3,6 nên chúng được xem là những vi khuẩn chịu axit. Nhìn chung, chúng
không lên men lactose.
Pediococcus acidilactici và Ped. pentosaceus được dùng để lên men rau,
quả, thịt, ngũ cốc và các loại thực phẩm khác. Chúng cũng tham gia vào sự chín
và sự tạo thành hương vị của một vài loại phomat dưới dạng các giống thứ
cấp,có khả năng sinh bacterioxin và được dùng để sản xuất chế phẩm bảo quản
cá. Ped. damnosus là tác nhân chính làm hỏng bia, vì khi nó phát triển sẽ tạo
thành diacetyl và acetoin làm bia có vị giống bơ [1].

2.1.2.4. Streptococcus
Chi Streptococcus là những vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc hình trứng,
đứng thành cặp hoặc thành chuỗi dài, kỵ khí bắt buộc, ưa ấm và sinh trưởng tốt
ở 37 tới 40 0C nhưng cũng có thể sinh trưởng ở 52 0C. Chúng sống được ở 60 0C
trong 30 phút. Streptococcus chủ yếu lên men lactic đồng hình, lên men đường
glucose và có thể làm giảm pH xuống 4,0. Chúng còn lên men đường fructose,
mannose và lactose nhưng nói chung không lên men galactose và saccharose [1].
Mặc dù có sự phân tách và tạo thành chi mới, chi Streptococcus vẫn là một
chi rất lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo. Nhìn chung chi này được phân
thành ba nhóm: sinh mủ, miệng và liên cầu khuẩn Streptococci “khác”. Nhóm
sinh mủ có chữa một số tác nhân gây bệnh nổi bật như Str. pyogenes và Str.
5


agalactiae. Str. pyogenes là tác nhân gây bệnh và liên quan tới các bệnh phát
sinh từ thưc phầm, có mặt dưới dạng hội sinh trong đường hô hấp của người.
Một tác nhân khác là Str. pneumonia trước đây thuộc nhóm này nhưng đã
chuyển qua nhóm miệng. Streptococcus thermophilus được sử dụng trong lên
men sữa, có thể có mặt trong sữa tươi và được xếp vào nhóm Streptococcus
miệng [19]
2.1.2.5. Bifidobacterium
Bifidobacterium là các trực khuẩn, tế bào có hình dạng và kích thước khác
nhau, đứng đơn độc hoặc thành chuỗi dài ngắn khác nhau, xắp xếp thành dạng
chữ V hoặc dạng ngôi sao. Chúng hô hấp kỵ khí, mặc dù một số loài có thể chịu
được O2 khi có mặt CO2. Các loài sinh trưởng tối ưu ở 37 đến 410C với một biên
độ nhiệt sinh trưởng từ 25 đến 45 0C. Chúng thường không sinh trưởng ở pH trên
8 và dưới 4,5. Chúng lên men glucose, lactose, galactose và một số pentose.
Chúng có ích đối với đường tiêu hóa. Một số loài được sử dụng để tạo chế
phẩm probiotic như Bif. bifidum, Bif. infantis, Bif. adolescentis. Chúng có mặt
với số lượng lớn trong phân của trẻ sơ sinh 2-3 ngày tuổi và thường có mặt với

số lượng lớn ở trẻ đang bú mẹ. Chúng thường gặp trong ruột già. Một số trong
đó Bifidobacterium. bifidum, Bif. infantis, Bif. adolescentis, Bif. brevis và Bif.
Lomgum [1].
2.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic
2.1.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng về cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại cacbonhydrate từ các hexose
(glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccharose, lactose,
maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn
cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất
cho quá trình lên men tổng hợp các axit hữu cơ như axit lactic, axit malic, axit
pyruvic, axit fumaric, axit acetic, etanol và CO2.[6]. Một số vi khuẩn lactic lên
men dị hình, phân lập từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng axit gluconic
và galacturonic làm nguồn dinh dưỡng cacbon nhờ sự xúc tác của hệ enzyme
tương ứng tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic. Quá trình này cũng tạo ra
axit lactic, axit axetic và CO2 [5].

6


2.1.3.2. Nhu cầu dinh dưỡng về nguồn nitơ:
Tất cả các thành phần quan trọng trong tế bào đều chứa nitơ (protein, axit
nucleic…), vì vậy nitơ là thành phần không thể thiếu trong nuôi cấy vi sinh vật.
Phần lớn các vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ
phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Chỉ có một số ít loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ
nguồn nitơ vô cơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển bình
thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần
dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, peptid, cao thịt, cao nấm men…. Trong
công nghiệp, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu
quả nhất [5], [13].

2.1.3.3. Nhu cầu về vitamin:
Đa số các vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được vitamin trong khi vai trò
của vitamin đối với chúng lại rất có ý nghĩa. Vitamin đóng vai trò là các
coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nó vừa kích thích sự phát
triển vừa điều hòa quá trình cân bằng năng lượng của cơ thể. Chính vì vậy trong
môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic người ta thường bổ sung nguồn cơ chất
chứa nhiều vitamin như dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước ngô, cao nấm men và
nhiều chất khác [5].
+ Nhu cầu muối vô cơ :
Để đảm bảo sinh trưởng và phát triển đầy đủ, các vi khuẩn lactic cần đến
rất nhiều chất vô cơ như sắt, đồng, natri, kali, photpho, iot, lưu huỳnh, magie và
đặc biệt là mangan. Mangan là tác nhân ngăn cản sự tự phân của tế bào và cần
thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn. Ion Zn 2+ có thể tham gia vào
quá trình hình thành một hoặc nhiều protein của tế bào (chủ yếu là enzyme ) và
làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme này. Kết quả cũng xảy ra tương tự khi
thay thế Zn2+ bởi các ion Mg2+ và Ca2+. Các ion kim loại có tác động tương hỗ
lẫn nhau. Chẳng hạn việc sử dụng nồng độ thích hợp Mn 2+ sẽ loại trừ được sự
đầu độc các ion kim loại nặng nếu các ion này có mặt trong môi trường [13].
2.1.3.4. Nhu cầu các chất hữu cơ khác
Sự phát triển của vi khuẩn lactic còn cần đến các hợp chất hữu cơ như các
bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến
tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit citric và axit axetic. Nên hiện nay
người ta sử dụng các muối citrat làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập
7


và bảo quản chủng vi khuẩn lactic và sử dụng axit acetic dưới dạng các muối
acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. Các loại
axit béo như axit oleic, linoleic và lionlenic cũng có tác dụng điều hòa sự sinh
trưởng của vi khuẩn lactic. Chính vì điều này trong môi trường đặc hiệu MRS có

Tween 80 là dẫn xuất của axit oleic.
2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn lactic
2.1.4.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Quá trình lên men của vi khuẩn lactic đóng một vai trò quan trọng trong
ngành công nghiệp thực phẩm, bởi vì chúng đóng góp đáng kể vào hương vị, kết
cấu và còn là nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm (McKay và Baldwin,
1990) [38]. Chúng được sử dụng trong chế biến các sản phẩm sữa (như là sữa
chua, kefir, phomat, bơ…), muối chua rau quả, sản xuất bánh mỳ đen, sản xuất
rượu vang, thịt cá đóng hộp và xúc xích. Trong chế biến các sản phẩm sữa,
người ta lợi dụng khả năng đông tụ sữa của vi khuẩn Streptococcus lactic để sản
xuất sữa chua hay lợi dụng khả năng tạo ra các mùi vị, tạo các chất thơm của
chủng Leuconostoc để sản xuất bơ, phomat...Trong chế biến rau quả muối chua,
lên men lactic giúp bảo quản, làm tăng giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan của
sản phẩm. Trong sản xuất bánh mỳ đen, sử dụng quá trình lên men của vi khuẩn
lactic để tạo vị chua và hương thơm đặc trưng cho bánh mỳ đen.
Ứng dụng LAB và sản phẩm chuyển hóa của chúng trong việc phòng ngừa
hư hỏng và kéo dài hạn sử dụng thực phẩm đã được tăng lên trong thập kỉ qua
(Stiles, 1996) [38]. Chúng lên men nguồn cacbonhydrate có trong nguyên liệu
tạo ra axit lactic nên làm tăng nồng độ axit trong nguyên liệu nên có tác dụng ức
chế sự hoạt động của vi sinh vật gây hư hỏng kéo dài thời gian bảo quản.
Vi khuẩn lactic còn có khả năng tạo ra bacteriocin, là một loại kháng sinh,
rất bền nhiệt có khả năng ức chế mạnh với vi khuẩn gây Gram dương gây bệnh
và hư hỏng thực phẩm cũng như nấm men. Bên cạnh đó, bacteriocin cũng ức
chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Gram âm (Arihara et al 1996,; Cardi, 2002;
Stevens et al., 1991) và được sử dụng rộng rãi như chất bảo quản sinh học trong
cả thực phẩm lên men lẫn không lên men. Một số chủng LAB là probiotic có
khả năng cải thiện sức khỏe của con người đặc biệt là hệ tiêu hóa, do đó chúng
thường được bổ sung vào trong các sản phẩm sữa [38,]. LAB có khả năng sinh
exopolysaccharide mà chúng thường được coi là an toàn (GRAS). Do đó, EPS
được bài tiết bởi LAB được xem là polymer sinh học an toàn và cung cấp một

nguồn thay thế cho polysaccharide sử dụng trong thực phẩm hoặc các ngành
8


công nghiệp khác [43]. Ngoài ra, người ta còn sử dụng các LAB như
Lactobacillus delbrueckii để sản xuất một lượng lớn axit lactic và muối lactate
làm chất phụ gia thực phẩm.
2.1.4.2. Ứng dụng trong chăn nuôi
Ủ chua thức ăn rau xanh mà thực chất là quá trình lên men lactic tự nhiên,
vừa có tác dụng chế biến, bảo quản, giảm sự tổn thất chất dinh dưỡng thức ăn và
bổ sung một số vitamin do vi sinh vật tổng hợp. Ủ thức ăn là thức ăn thô xanh
được xếp vào hố kín không có không khí. Trong quá trình ủ, các vi khuẩn biến
đổi các đường saccharose, fructose, pentose thành axit lactic, axit acetic và các
axit hữu cơ khác. Chính các axit này làm hạ môi trường pH của thức ăn xuống
khoảng 3,8- 4,5 nên các loại vi khuẩn và enzyme thực vật đều bị ức chế. Do đó
có thể bảo quản thức ăn được lâu hơn. Ủ xanh thức ăn có ý nghĩa kinh tế lớn,
nhờ đó có thể thu hoạch thức ăn vào bất kì thời điểm nào, ngoài ra thức ăn ủ
xanh còn giữ được chất dinh dưỡng nhiều hơn so với thức ăn phơi khô [9].
2.1.5.3. Một số ứng dụng khác
Bên cạnh các ứng dụng đã nêu trên, vi khuẩn lactic còn được ứng dụng
trong các lĩnh vực khác như: trong y học, công nghiệp vật liệu, trong sản xuất
mỹ phẩm....
2.2. Tổng quan về Lactobaccillus plantarum
Lactobaccillus plantarum là một loài vi khuẩn thuộc một chi rất lớn và
tương đối đa dạng của Lactobacillus [28]. Lactobaccillus plantarum là vi gram
dương, không sinh bào tử, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc chuỗi,
sinh trưởng tốt trong điều kiện vi hiếu khí [47], [48].
L. plantarum lên men dị hình không bắt buộc và có thể lên men nhiều loại
cacbonhydrate khác nhau. L. plantarum có một yêu cầu tăng trưởng cao với
mangan và có thể tích lũy mangan ở mức cao trong nội bào (Archibald và

Fridovich 1981). L. plantarum có khả năng chịu axit (Daeschel và Nes 1995).
Thực tế, L. plantarum có thể chịu được axit khi pH dưới 4,0 trong các thực
phẩm lên men và nó cũng tồn tại trong điều kiện axit ở dạ dày con người
(Johansson và cộng sự, 1993). L. plantarum có một bộ gen tương đối lớn. Điều
này cho thấy khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khác nhau (Kleerebezem
và cộng sự, 2003) . L. plantarum thường gặp với số lượng lớn trong thực phẩm
lên men lactic như dưa cải muối chua, ô liu muối, kim chi... Nó cũng tồn tại
trong nước bọt và đường tiêu hóa của con người [28]. Tính chất đặc trưng duy
nhất của L. plantarum là khả năng dị hóa arginine và sinh ra nitric oxide. L.
9


plantarum không có khả năng phân giải amino axit nào ngoại trừ tyrosine và
arginine và có đến 6 con đường khác nhau chuyển hóa arginine và điều sinh ra
nitric oxide. Việc sinh ra NO giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như
Canidida abicans, E. Coli, Shigella, Helicobacterpylory, các amip và kí sinh
trùng [48].
L. plantarum làm giảm nội độc tố do E. coil tiết ra bằng các ngăn chặn sự
bám dính của E. coli vào màng nhầy. L. plantarum có khả năng giúp tiêu hóa
chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen và trong men bia… Do đó chúng cải thiện
tốt những vấn đề về tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng [48]. L. Plantarum có
thể sản xuất protein có tính chất kháng khuẩn như bacteriocin. Bacteriocin có
tiềm năng mở rộng để bảo quản thực phẩm do nhu cầu ngày càng tăng cho các
sản phẩm thực phẩm tự nhiên và an toàn vi sinh, cũng như để điều trị bệnh con
người như bổ sung hoặc thay thế tiềm năng cho thuốc kháng sinh hiện đang sử
dụng. L. plantarum được sử dụng như là pobiotic làm giảm vi khuẩn có hại để
ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, khả năng bám
dính vào đường ruột và tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và tiêu diệt vi
khuẩn cạnh tranh [28].
2.3. Tổng quan về exopolysaccharide

2.3.1 Khái niệm
Vi sinh vật tổng hợp nhiều loại các polysaccharide đa chức năng bao gồm
polysaccharide nội bào, polysaccharide tạo cấu trúc cho thành tế bào
(lipopolysaccharide, peptidoglycan…) và polysaccharide ngoại bào hay còn gọi là
exopolysaccharide [30], [35]. Exopolysaccharide (EPS) là các polymer có trọng
lượng phân tử cao bao gồm dư lượng đường và được tiết bởi vi sinh vật vào môi
trường xung quanh. Exopolysaccharide thường được cấu tạo bởi
monosaccharide và một số nhóm thế không phải cacbonhydrate (như acetate,
pyruvate, succinate và phosphate) [46]. EPS thường tồn tại ở hai dạng tùy thuộc
vào vị trí của nó: ở dạng liên kết, các EPS như là một vỏ bao (c-EPS) liên kết
với bề mặt của tế bào của vi khuẩn và ở dạng tự do, các EPS được vi khuẩn tiết
ra môi trường như một chất nhờn (r-EPS)[20].
Các vi khuẩn lactic, tảo, nấm và thực vật có khả năng tổng hợp
polysaccharides ngoại bào và bài tiết ra khỏi tế bào như là polymer hòa tan
hoặc polymer không hòa tan [ 47]. Vi khuẩn và vi tảo có khả năng bài tiết EPS
tốt hơn so với nấm men và nấm mốc.Vi khuẩn lactic (LAB) thường được coi là
an toàn. Do đó, EPS được bài tiết bởi LAB có thể được coi là polymer sinh học
10


an toàn và polysaccharide của vi sinh vật cung cấp một nguồn thay thế cho các
polysaccharide sử dụng trong thực phẩm hoặc các ngành công nghiệp khác
[43]. EPS là polysaccharides tiết ra từ các tế bào, hoặc sản xuất bên ngoài tế
bào bởi các enzyme ngoại bào [40].
2.3.2. Phân loại exopolysaccharide
EPS thường khác nhau bởi thành phần monosaccharide, mối liên kết giữa
đơn vị đường, chiều dài chuỗi, sự hiện diện của các mạch nhánh lặp lại và thay
thế [24]. Dựa vào thành phần monosaccharide có trong mạch chính của EPS,
EPS được chia làm hai loại gồm homopolysaccharide (như cellulose, dextran,
mutan, alternan, pullulan, levan, inulin, curdlan…) và heteropolysaccharide (như

gellan, xanthan, kefiran) [40].
 Homopolysaccharide
Homopolysaccharide bao gồm một loại monosaccharide duy nhất (Dglucose hoặc D-fructose ) và được tổng hợp từ saccharose ở ngoài tế bào bởi
enzyme glycansucrase hoặc levansucrase được tiết ra bởi các vi khuẩn. Sự khác
nhau giữa các homopolysaccharide chủ yếu là do cấu trúc mạch, trọng lượng
phân tử và cấu trúc nhánh [27], [40]. Homopolysaccahride được chia thành bốn
nhóm: (1)α-D- Glucans gồm dextran (Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides
và Leu mesenteroides subsp. Dextranicum) chứa liên kết α-1,6 dư lượng glucose
thay đổi mức độ phân nhánh thường xuyên ở vị trí 3, ít hơn ở các vị trí 2 và 4;
mutan( Str. mutans và Str. Sobrinus) và alternan (Leu. Mesenteroides) gồm có
liên kết α-1,3 và α-1,6. Khả năng hòa tan của mutan phụ thuộc vào tỷ lệ khác
nhau của các loại mối liên kết; mutan tan trong nước chứa nhiều mối liên kết α1,6 và mutan không tan trong nước chứa nhiều mối liên kết α-1,3. (2)β-Dglucans gồm của liên kết β -1,3 phân tử glucose với liên kết β -1,2 nhánh, sản
xuất bởi Pediococcus spp. và Streptococcus spp. (3)Fructan gồm liên kết β-2,6
phân tử D-fructose như Levan sản xuất bởi Streptococcus salivarius, levan gồm
các phân tử fructose liên kết β-2,6 với một số nhánh liên kết β-2,1. (4)Những
loại khác như polyglycan [40], [23].
 Heteropolysaccharide
Heteropolysaccharide bao gồm các loại monosaccharide khác nhau, chủ
yếu là D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, và các dẫn xuất của chúng. Nó được
tổng hợp bên trong tế bào từ đường nucleotide và sau đó được vi khuẩn tiết ra
ngoài [27],[40]. Mối liên hệ giữa các đơn vị monosaccharide trong mạch

11


polymer của heteropolysaccharide là mối liên kết β-1,4 hay mối liên kết β-1,3 và
α- 1,2 hay mối liên kết α -1,6 [40].
Xanthan gum: được tiết ra bởi vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas và bao
gồm glucose trong mạch chính với mạch nhánh là trisaccharide có chứa dư
lượng acid glucuronic, mannose, pyruvate và acetyl Gellan và polymer có liên

quan: sản xuất bởi chi Sphingomonas, mạch chính là tetrasaccharide có chứa
rhamnose, glucose và acid glucuronic. Gellan, welan, rhamsan và diutan được
phân biệt bởi sự thay đổi trong thành phần và mối liên kết của các mạch nhánh
(ví dụ: gellan chứa nhóm thế acetyl và glyceryl, trong khi welan có nhóm
rhamnose hoặc mannose trong mạch nhánh) [27].
Kefiran tan trong nước được sản xuất bởi Kefiranofaciens Lactobacillus, L.
kefirgranum, L. parakefir, L. kefir và L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Kefiran
cấu tạo glucose và galactose với tỉ lệ xấp xỉ bằng nhau [30].
2.3.3. Tính chất của exopolysaccharide
Các tính chất lưu biến của EPS được sản xuất bởi LAB được cho là do khối
lượng phân tử của nó, phân tử phân phối rộng rãi, các dư lượng đường trong thành
phần, mối liên kết giữa các monomer đường và sự hiện diện của nhóm bên [20].
Các tính chất đặc biệt của các exopolysaccharide có được là do các thành phần cấu
trúc đặc biệt của EPS gồm glucose và mannose liên kết bởi α và β (1,3) [24]. EPS
có tính chất hóa lý đặc biệt và tính chất lưu biến như chất tạo độ nhớt, chất ổn
định, chất tạo gel hoặc chất nhũ hóa, làm cho nó như là một chất phụ gia thực
phẩm tiềm năng [43].
Tính chất tạo độ nhớt của EPS phụ thuộc vào cấu trúc và khối lượng của nó
và bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như muối, cường độ ion, pH và nhiệt độ. Để sử
dụng EPS trong cho các sản phẩm khác nhau, các kiến thức về tính chất lưu biến
của nó tại các pH khác nhau và ion có thể cung cấp các điều hữu ích ứng dụng
cho các sản phẩm thực phẩm khác nhau. Các thuộc tính lưu biến của EPS này
mới được khám phá trong nước, sữa, muối và cũng có lúc pH khác nhau. EPS
tạo độ nhớt trong môi trường dung dịch CaCl 2 tương đối cao hơn trong dung
dịch NaCl. Sự khác nhau về độ nhớt này có thể là do sự sắp xếp khác nhau giữa
các phân tử polymer tích điện ở trong dung dịch, mà gây ra mức độ khác nhau
của lực đẩy tĩnh điện hoặc lực hút tĩnh điện giữa các chuỗi polymer. Trong khi
nghiên cứu tác động của pH đến độ nhớt của polysaccharide. Gauri và cộng sự
(2009) đã báo cáo về độ nhớt của EPS tăng trong dung dịch pH axit so với
những dung dịch có tính kiềm pH. Kết quả tương tự cũng được báo cáo bởi

12


Kanmani và cộng sự (2011), ông cũng quan sát thấy độ nhớt giảm khi pH=6 và
độ nhớt tăng khi pH giảm xuống bằng 3(pH có tính axit). Điều này có ý nghĩa
quan trọng trong ứng dụng EPS trong sản xuất các sản phẩm sữa lên men khi mà
pH cuối cùng của sữa lên men là pH có tính axit [11].
EPS tan trong nước, có khả năng giữ nước tốt và liên kết với dầu. Các tính
chất này là do cấu trúc của các chuỗi polymer trong EPS mà có thể giữ một
lượng nước lớn thông qua liên kết hydro [11]. Khả năng giữ nước của EPS để
giúp chống hiện tượng khô bột nhào, hiện tượng đông đặc của các sản phẩm
tinh bột nấu chín và sữa lên men. Các thí nghiệm cho thấy rằng sự kết hợp của
exopolysaccharides ở nồng độ cụ thể khác nhau, từ 0,1 đến 1% trong các loại
thực phẩm giàu tinh bột có thể làm tăng độ nhớt của thực phẩm, cải thiện kết
cấu của các thực phẩm. Sự kết hợp của EPS ở nồng độ 1% có thể làm giảm sự
khô cứng 50% và tăng độ nhớt của 28%. Mali và cộng sự (2003) đã mô tả việc
giảm sự khô cứng của bột nhão khi bảo quản lạnh về lạnh, sau khi thêm
xanthan gum [24].
2.3.4. Cơ chế sinh tổng hợp exopolysaccharide
Hầu hết EPS được vi khuẩn tổng hợp trong tế bào và được tiết ra môi
trường ở bên ngoài tế bào như là các đại phân tử. Một vài trường hợp ngoại lệ
như evan và dextran được vi khuẩn tổng hợp bên ngoài tế bào do hoạt động của
các enzym ngoại bào làm chuyển đổi các chất nền vào mạch polymer ở môi
trường ngoại bào. Con đường sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn bao gồm hấp thụ
cơ chất, con đường chất chuyển hóa trung tâm và tổng hợp polysaccharide
(hình 2,1).
Hấp thụ cơ chất: Tùy thuộc vào loại cơ chất, nó có thể được đưa vào bên
trong các tế bào thông qua một hệ thống vận chuyển thụ động hay chủ động
(Hình 2.1a). Ví dụ, glycerol đi qua màng tế bào nhờ quá trình khuếch tán do sự
giảm nồng độ của nó; trong khi đó, sự vận chuyển của hầu hết các loại đường

gắn với động lực proton thông qua hệ thống vận chuyển ATP (ví dụ, các nhóm
vận chuyển các loại đường), theo đó quá trình thủy phân ATP cung cấp năng
lượng để vận chuyển cơ chất ngược dòng gradien nồng độ của chúng. Sau đó,
các cơ chất được chuyển hóa bởi phosphoryl hóa trong tế bào, hoặc nó có thể
được vận chuyển và bị oxy hóa thông qua một con đường periplasmic oxy hóa
trực tiếp. Những con đường periplasmic oxy hóa chỉ tồn tại trong một số vi
khuẩn nhất định, trong khi đó con đường phosphoryl hóa trong tế bào này rất
phổ biến ở nhiều vi khuẩn. Cả hai hệ thống này đã được báo cáo trong một số
chủng sản xuất EPS và chúng có thể hoạt động cùng một lúc nếu có sẵn cơ chất.
13


Con đường chất chuyển hóa trung tâm: trong tế bào chất, các cơ chất được
chuyển qua quá trình đường phân tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí,
sau đó pyruvate được chuyển thành Acetyl-CoA rồi đi vào chu trình Krebs
(Hình 2.1b). Các chất chuyển hóa chính được hình thành từ những chuyển hóa
này, chủ yếu là chất chuyển hóa cấp 1 sẽ được sử dụng như tiền chất để tổng
hợp các phân tử sinh học nhỏ (ví dụ axit amin hoặc monosaccharide).
Tổng hợp các polysaccharide đòi hỏi sự sinh tổng hợp các tiền chất đã hoạt
hóa như là monosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu đường nucleoside
diphosphate (đường NDP), nó có nguồn gốc từ các loại đường phosphoryl hóa.
Những tiền chất này (ví dụ như UDP-Glc, UDP-Gal và GDP-Man) được
chuyển hóa tương tác qua thông qua những phản ứng đồng phân hóa, phản ứng
oxi hóa, phản ứng decarboxy hóa, phản ứng khử, và phản ứng chuyển vị (Hình
2.1c). Sự tiết EPS của vi khuẩn là một quá trình khó khăn, polymer có trọng
lượng phân tử cao được lắp ráp trong tế bào chất phải đi qua màng tế bào, mà
không ảnh hưởng các tính chất quan trọng rào chắn. Ngược lại, với sự đa dạng
của cấu trúc phân tử của EPS, những con đường cho polymer hóa, sinh tổng hợp
EPS và bài xuất EPS ra môi trường ở hầu hết các vi khuẩn Gram âm đã được
báo cáo theo một trong hai cơ chế (hình 2.1 d):

Hình 2.1. Cơ chế sinh tổng hợp exopolysacharide [14]
14


- Con đường vận chuyển phụ thuộc Wzx-Wzy, đơn vị lặp lại được tổng hợp
bởi quá trình chuyển tuần tự các monosaccharide từ đường NDP thành chất
mang polyprenylphosphate lipid. Các đơn vị lặp lại trưởng thành được vận
chuyển qua màng nằm trong tế bào (Wzy) đến bề mặt tế bào chất nơi mà quá trình
polymer hóa diễn ra do hoạt động của một polymerase giả định (Wzy). Đối với
nhiều loại vi sinh vật, con đường chuyển vị mở rộng vỏ tế bào được hình thành do
enzyme polysaccharide copolymerase (PCP) quyết định chiều dài chuỗi polymer và
một protein giải phóng màng polysaccharide bên ngoài tế bào (OPX) dẫn đến sự
hình thành các kênh.
- Con đường vận chuyển phụ thuộc ABC, polysaccharide được polymer
hóa ở bề mặt tế bào chất của màng nằm bên trong tế bào thông qua việc bổ sung
liên tục các đơn vị đường đến đầu không khử của chuỗi polymer. Polymer được
giải phóng qua màng bên trong tế bào thông qua hệ thống vận chuyển ABC, tiếp
đến là sự chuyển vị của nó trên toàn bào chất và màng tế bào nằm ở ngoài thông
qua và protein giải phóng OPX [14]
2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất exopolysaccharide của vi
khuẩn [36]
Các yếu tố của môi trường và điều kiện nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến
năng suất sản xuất exopolysaccharide, kích thước và thành phần hoá học của các
polysaccharide được hình thành. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất
exopolysaccharide bao gồm nguồn cacbon, nguồn nitơ, tỷ lệ oxy, nhiệt độ, giai
đoạn tăng trưởng của vi khuẩn và pH.
2.3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Exopolysaccharide có thể được được hình thành từ nhiều loại cơ chất
carbon. Sản lượng EPS khác nhau dựa trên loại cacbon được sử dụng. Một số

nghiên cứu đã tìm thấythành phần hóa học của exopolysaccharide là không thay
đổi đối với việc sử dụng cơ chất cacbon khác nhau, trong khi những người khác
đã tìm thấy là nó có thay đổi khi sử dụng các cơ chất carbon khác nhau [36]. Các
monosaccharde cấu thành EPS sản xuất bởi chủng Lactobacillus helveticus là
như nhau khi thay đổi nguồn cacbonhydrate (Torino và cộng sự, 2005), nhưng
các monosacchire cấu thành EPS sản xuất bởi L.delbrueckii subsp. bulgaricus
thay đổi khi thay đổi nguồn cacbonhydrate (Petry và cộng sự, 2000) [20].
2.3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Vi sinh vật sản xuất exopolysaccharide có thể sử dụng nhiều nguồn nitơ
như: amoni, nitrat, nitrit và các axit amin. Theo Sutherland, muối amoni và các
15


axit amin là phổ biến nhất. Sản lượng EPS khác nhau khi sử dụng nguồn nitơ
khác nhau. Khi thay đổi nguồn nitơ ban đầu sẽ ảnh hưởng đến kích thước phân
tử của exopolysaccharide được hình thành.
2.3.5.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ Cacbon : Nitơ
Trong khi cacbon và nitơ đều cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào bình
thường, tỷ lệ của chúng trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến khả
năng sản xuất polysaccharide. Nhiều nghiên cứu khác nhau cho thấy rằng sản
xuất EPS chiếm ưu thế hơn trong những điều kiện hạn chế nitơ ( tỷ lệ cacbon :
nitơ cao) [36]Corpe đã báo cáo rằng sản lượng exopolysaccharide được tối đa
khi tỷ lệ cacbon : nitơ là 10:1[35]
2.3.5.4. Ảnh hưởng sự có mặt của oxy
Sự tăng trưởng của vi khuẩn có xu hướng tăng khi khuấy với tốc độ cao
trong điều kiện kị khí không bắt buộc. Tuy nhiên, tác động của việc khuấy đảo
môi trường nuôi ảnh hường đến sản xuất EPS là không rõ ràng. Dudman và
Kucuk chỉ ra rằng sản xuất EPS là tối ưu trong điều kiện tốc độ khuấy thấp. Tuy
nhiên, những người khác đã chỉ ra rằng sản xuất polysaccharide tối đa trong điều
kiện khuấy cao trong điều kiện kị khí không bắt buộc.

2.3.5.5. Giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn
Đối với nhiều vi khuẩn, sản xuất EPS cũng thay đổi theo thời gian, như là
một hàm số của giai đoạn tăng trưởng. Một số exopolysaccharides được sản xuất
trong suốt giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn, một số khác chỉ được sản xuất
trong giai đoạn logarit và giai đoạn cố định. Đối với nhiều loài vi khuẩn, giai
đoạn tăng trưởng và sản xuất exopolysaccharide xảy ra đồng thời. Một số loài
sản xuất EPS đạt tối đa trong giai đoạn hàm số mũ, trong khi đối với loại khác,
sản xuất EPS đạt tối đa trong giai đoạn cố định. Các nghiên cứu khác nhau đã
chỉ ra rằng trong khi sản lượng EPS thay đổi theo giai đoạn tăng trưởng của vi
khuẩn, thành phần exopolysaccharide không thay đổi theo chu kỳ tăng trưởng
hàng loạt.
2.3.5.6. Ảnh hưởng của pH
Cả sự tăng trưởng và tỷ lệ sản xuất exopolysaccharide của vi khuẩn phụ
thuộc theo độ pH của môi trường phát triển. PH tối ưu cho sản xuất
exopolysaccharide có thể khác với pH tối ưu cho vi khuẩn phát triển. Kucuk và
Kivanc chỉ ra rằng giá trị giới hạn của pH giảm xuống đáng kể trong sản lượng
EPS, đặc biệt là trong phạm vi có tính axit. Kết quả tương tự đã được quan sát
16


bởi Virmani và cộng sự, Williams và Wimpenny; trong khi pH tối ưu cho sản
xuất exopolysaccharide phụ thuộc vào các loài vi khuẩn riêng biệt, đối với hầu
hết loài pH ở gần trung tính.
2.2.5.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Vai trò nhiệt độ tăng trưởng của vi khuẩn trong sản xuất exopolysaccharide
là biến số. Sản xuất exopolysaccharide thường chiếm ưu thế khi tăng trưởng ở
nhiệt độ tối ưu. Sutherland cho thấy rằng khi tăng trưởng tế bào chậm lại (tức là
tại nhiệt độ tăng trưởng thấp hơn), tế bào tổng hợp polymer sẽ bị chậm lại. Vì
vậy, nhiều isoprenoid phosphate có sẵn sẽ hoạt động vận chuyển lipid cho tổng
hợp exopolysaccharide. Đó là đề xuất rằng sự sẵn có của các isoprenoid lipid

kiểm soát tỷ lệ tổng hợp EPS; do đó, nếu điều này đúng, thì nên tăng sản xuất
EPS ở nhiệt độ thấp hơn. Tuy nhiên, các nghiên cứu khác được tìm thấy sản xuất
EPS tối đa xảy ra ở điều kiện nhiệt độ tối ưu hoặc nhiệt độ trên tối ưu. Macedo
và cộng sự, tìm thấy mối quan hệ giữa tăng trưởng và sản xuất EPS như một
hàm của nhiệt độ. Ở nhiệt độ dưới tối ưu, EPS sản xuất có liên quan sự tăng
trưởng; tuy nhiên, ở nhiệt độ trên tối ưu, sản lượng EPS đã không được kết hợp
với sự tăng trưởng tế bào.
2.3.4. Ứng dụng của exopolysaccharide
2.3.4.1.Ứng dụng của EPS trong công nghệ thực phẩm
EPS có chức năng như tác nhân tạo nhớt, chất ổn định, chất nhũ hoá, các
tác nhân tạo gel hoặc các tác nhân giữ nước trong thực phẩm [35]. EPS được sản
xuất bởi LAB được ứng dụng trong việc cải thiện tính lưu biến, tính ổn định,
kết cấu và các đặc tính cảm quan của sữa chua và các sản phẩm sữa lên men
khác. Các vấn đề thường gặp trong sản xuất sữa chua như độ nhớt thấp, trạng
thái gel bị phá vỡ hoặc sự đông đặc cao trong quá trình lên men hay lưu trữ sản
phẩm (Whey bị tách) có thể được giải quyết bằng cách sử dụng các giống khởi
động có khả năng sinh EPS [29]. Sữa chua có chứa EPS thì kết cấu ít bị phá
hủy hơn khi bơm có học, khuấy trộn và làm đầy máy. Ứng dụng EPS sản sinh
từ LAB vào sản xuất sữa chua sẽ dẫn đến việc sản xuất sữa chua mà không cần
bổ sung chất ổn đinh và đáp ứng được yêu cầu người tiêu dùng là sản phẩm
hoàn toàn từ tự nhiên. Vì vậy EPS đóng vai quan trọng trong sản xuất sữa chua
uống, sữa chua creamy với hàm lượng thấp chấy béo hoạc không có chất
béo[ 40]. EPS từ LAB cung cấp một chất làm đặc sinh học thay thế cho các
chất phụ gia hóa học và cải thiện kết cấu của sản phẩm sữa ít chất béo. Độ nhớt
biểu kiến trong sữa gầy lên men bởi chủng Lc. Lactis subsp. Lactis sinh EPS
17


cao hơn so với khi lên men sử dụng chủng không sinh EPS. Người ta cũng
chứng minh rằng sử dụng kết hợp chủng sinh EPS và không sinh EPS thì sản

phẩm có chất lượng tốt hơn, tăng khả năng giữ nước và tăng độ nhớt [29].
Phomát sản xuất bằng cách sử dụng các chủng sinh EPS thì phomat mịn màng,
béo, ẩm và mềm. Trong khi các loại phomat được sản xuất mà không dùng
chủng sinh EPS thì có khuynh hướng khô và dạng hạt rời. Các EPS sản xuất
bởi vi khuẩn lactic cải thiện các tính chất cảm quan của nhiều loại pho mát
giảm và ít chất béo khác nhau.Nó kéo dài thời gian lưu lại của sản phẩm sữa ở
trong miệng và nâng cao hương vị của sản phẩm [30].
EPS hiệu quả cải thiện các thông số lưu biến của bột và chất lượng bánh
mì. Việc hình thành tại chỗ của EPS từ saccharose dẫn đến các chất chuyển hóa
tiếp tục như manniitol, glucose, và acetate có thể đóng góp vào việc cải thiện
chất lượng bánh mì [ 29]. EPS được sản xuất bởi Lactobacillus ảnh hưởng tốt
đến các thuộc tính của bánh mì như tạo điều kiện hấp thụ nước, làm mềm các
thành phần gluten của bột, cải thiện cấu trúc, tăng khối lượng của bánh, làm
chậm sự ôi bánh mì và kéo dài hạn sử dụng. EPS được sản xuất từ bột lên men
chua bởi LAB sẽ cải thiện tính lưu biến bột, kết cấu bánh mì và có thể thay thế
cho các hydrocolloid đắt tiền thường được dùng để cải thiện kết cấu bánh mì
[30]. EPS được sản xuất bởi một số loại vi khuẩn biển có thể tạo nhũ tương ổn
định. EPS này đã được chứng minh là hiệu quả hơn so với các chất nhũ hoá
thương mại có sẵn [35].
2.3.4.2. Ứng dụng của EPS trong y học và một số lĩnh vực khác
 Tác dụng prebiotic: EPS tăng nồng độ của Bifidobacteria cho thấy một
tiềm năng prebiotic. Nghiên cứu của Salazar và cộng sự cho thấy rằng EPS được
tổng hợp bởi Bifidobacteria trong đường ruột đóng vai trò như cơ chất lên men
vi sinh vật trong môi trường ruột người, thay đổi tương tác giữa các quần thể vi
sinh ruột [29].
 Chống viêm loét dạ dày và giảm cholesterol: EPS tinh khiết từ S.
thermophilus CRL 1190 đã được tìm thấy hiệu quả trong việc phòng ngừa viêm
dạ dày mãn tính. Các tác giả chứng minh rằng tương tác của EPS và protein có
tác dụng bảo vệ dạ dày. Nagaoka và cộng sự đã báo cáo tác dụng chống loét dạ
dày bởi các EPS được sản xuất từ các chủng Bifidobacteria, Lactobacillus và

Streptococcus [29]. Sữa lên men bởi chủng Lc. Lactis ssp. cremoris SBT0495
sản xuất EPS có tác dụng làm giảm cholesterol. Nghiên cứu đã chứng minh với
0,1% Xanthan gum có thể hấp thụ 2.9 mg/dl cholesterol [29].
18


 Đặc tính chống gây đột biến: EPS liên kết với các tế bào của chủng L.
Plantarum, liên kết với các chất gây đột biến và các amin dị vòng ; làm bất hoạt
chúng. Một số ít nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm trên động vật về tác dụng
sinh lý hoặc miễn dịch khi cho chúng ăn hoặc dùng thuốc EPS [29]
 Đặc tính chống ung thư và chống oxy hóa : EPS từ các nguồn tự nhiên
an toàn như LAB có thể phục vụ như là một thay thế tốt với các tác nhân chống
khối u nhân tạo[41]. EPS sản xuất Lactobacillus plantarum C88 có khả năng
nhặt (scavenging) cAC gốc hydroxyl, gốc tự do DPPH, và khả năng giảm H2O2
gây oxy hóa dẫn đến thiệt hại trong 2 tế bào Caco [46]. EPS của L. paracasei
subsp. paracasei NTU 101 và L. plantarum 102 NTU được chứng minh chất
chống oxy hóa tiềm năng [29]
 Ngoài ra, EPS được ứng dụng trong quy trình xử lí nước thải công
nghiệpvà thành phố. EPS là tác nhân keo tụ được sử dụng để thay thế cho các
chất keo tụ có nguồn gốc hóa học (Al 2O3 và các polymer hữu cơ) vì thế đảm bảo
an toàn cho sức khỏe con người. EPS cũng tham gia vào sự hấp thụ của các ion
kim. Các EPS có thể liên kết nhiều ion kim loại, bao gồm Fe 2+, Zn2+, Cu2+ và
Co2+[29]
2.3.4.3. Ứng dụng của một số loại EPS
Dextran được sử dụng trong ngành công nghiệp bánh kẹo để cải thiện độ
ẩm, duy trì độ nhớt và ngăn chặn sự kết tinh đường. Trong kẹo cao su và kẹo
jelly, nó hoạt động như một chất tạo gel. Trong kem nó hoạt động như một
chất ức chế sự hình thành tinh thể và trong các hỗn hợp bánh nó tạo ra cấu trúc
bánh và tính chất cảm quan như mong muốn [29]. Trong y học là tác nhân
giảm cholesterol, chất thay thế huyết tương, chất tăng cường lưu thông máu.

Ngoài ra, nó cũng được ứng dụng ứng dụng trong công nghệ phân tách, trong
hệ thống nhũ tương, vận chuyển vi mô trong mô hay nuôi cấy tế bào,trong
phương pháp sắc kí, trong ngành công nghiệp giấy, quá trình mạ kim loại, giúp
thu hồi dầu tốt hơn và được sử dụng để sản xuất vật liệu sinh học [40]. Dextran
được sản xuất bởi Mesenteriodes Leuconostoc, đã được sử dụng để chuẩn bị
một trong những sản phẩm thay thế huyết tương hiệu quả nhất cho ứng dụng bị
sốc và mất máu [39].
Levan là làm đặc sinh học trong ngành công nghiệp thực phẩm, chất tạo
nhớt và chất ổn định sử dụng trong sản xuất bánh kẹo, kem. Các Levan từ L.
sanfranciscensis LTH 2590 thể hiện tác dụng probiotic [29]. Trong y học, levan

19


thể hiện đặc tính chống ung thư, giảm cholesterol trong máu [40]. Nó cũng được
ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, mỹ phẩm và thuốc [39].
Xanthan gum được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm với các tính
năng như chất tạo nhớt, chất ổn định,chất nhũ hóa và chất đình chỉ đối với thực
phẩm. Nó được sử dụng trong các sản phẩm từ sữa, đồ uống, bánh kẹo, quần áo,
bánh mì, xi-rô [ 29]. Đặc tính lưu biến cao của xanthan gum cho phép nó được
sử dụng như tác nhân kiểm soát tính lưu biến trong các hệ thống chứa
nước(aqueous)và làm chất ổn định cho nhũ tương và huyền phù [35]. Trong y
học, nó như tác nhân kháng virus và chống ung thư, tác nhân giảm cholesterol,
chất thay thế huyết tương, chất độn máu trong huyết tương. Xanthan gum còn
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác. Nó được sử dụng trong các sản
phẩm thức ăn chăn nuôi, cũng như khai thác dầu, sản xuất dược phẩm, mỹ
phẩm, giấy, sơn và các ngành công nghiệp dệt may. Nó được sử dung trong thu
hồi dầu mỏ loại hai và ba, trong sơn, thuốc trừ sâu và chất tẩy rửa, dược phẩm,
mỹ phẩm, mực in để kiểm soát độ nhớt, sự lắng cặn và sự tạo gel [39 ].
Alginate có khả năng tạo gel, tạo màng trong thực phẩm [39]. Nó được ứng

dụng trong y học để làm băng gạc phẫu thuật, điều trị vết thương và phát hành
thuốc có kiểm soát [30].
Gellan là chất ổn định và tác nhân khuấy đục đối với thực phẩm. Gellan là
tác nhân tạo gel làm đặc môi trường nuôi cấy, đặc biệt là trong nghiên cứu vi
sinh vật biển[ 29]. Nó đang được nghiên cứu để làm chất thay thế agar, gel điện
di cũng được và cũng ứng dụng trong dược phẩm[40].
Curdlan và Succinoglycan là một tác nhân tạo gel trong thực phẩm.
Curdlan được ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm. Nó cùng với
zidovudine (AZT) thể hiện hoạt động kháng virus cao và đầy hứa hẹn (làm
thuốc chống AIDS) [29]. Ngoài ra, nó có tác dụng loại bỏ kim loại nặng và được
sử dụng làm chất phụ gia trong sản xuất bêtông [40]. Succinoglycan có ứng
dụng trong thu hồi dầu và nhiều ứng dụng khác tương tự như curdlan [29].
Inulin thay thế chất béo trong các sản phẩm thực phẩm. Inulin có tác dụng
probiotic, nuôi dưỡng các tế bào niêm mạc ruột và ức chế tác nhân gây bệnh,
phân phối thuốc chống bệnh ung thư ruột kết, thay thế chất béo trong các sản
phẩm thực phẩm . Kefiran cải thiện tính đàn hồi nhớt của gel sữa chua [30].
Cellulose được sử dụng trong y học để làm da nhân tạo tạm thời của con
người để chữa lành các vết bỏng hoặc vết thương phẫu thuật. Cellulose có vai

20


trò trong hình hành các mô mạch máu. Nó được ứng dụng trong công nghệ phân
tách và sản xuất màng âm thanh trong thiết bị nghe nhìn [29].
2.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu về exopolysaccharide
Exopolysaccharide đem đến nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, y
học và nhiều lĩnh vực khác. Vì thế, trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa
học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy và thu
nhận EPS thích hợp, nghiên cứu về tính chất và ứng dụng các hợp chất này.
Một số công trình đã được nghiên cứu như:

Cerning (1995) đã nghiên cứu sản xuất EPS bởi vi khuẩn lactic và
propionibacteria sữa và nhận thấy rằng điều kiện lên men (nhiệt độ và thời gian
lên men), thành phần môi trường (nguồn carbon, nitơ) ảnh hưởng đến năng suất
polymer và thành phần đường của chúng. Thí nghiệm được tiến hành trên các vi
khuẩn lactic được sử dụng nhiều trong lên men sữa như Streptococcus
thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus và Lactococcus lactis
subsp cremoris [14].
Torino và cộng sự (2005) đã công bố rằng quá trình sinh tổng hợp
exopolysaccharide của chủng Lactobacillus helveticus ATCC 15807 đạt cao hơn
khi pH của môi trường nuôi cấy là 4,5 và có bổ sung nguồn carbon là đường
lactose. Exopolysaccharide được sinh tổng hợp trong điều kiện này có phân tử
lượng đạt 1,2-1,9x106 Da và có thành phần các monomer bao gồm glucose và
galactose theo tỉ lệ 2:1 [39].
Wang và cộng sự (2008)công bố kết quả nghiên cứu về tính chất lý hóa của
EPS sinh tổng hợp bởi chủng Lactobacillus kefiranofaciens ZW3. Công trình
này sử dụng chủng L. kefiranofaciens ZW3 nuôi trong trong môi trường chứa
whey. Sau khi ủ 48 giờ đến 72 giờ, được ly tâm ở 12.000 rpm 4 oC trong 15 phút
để loại bỏ các tế bào, lượng EPS trong dịch nổi được xác định bằng phenol
sulfuric. Phương pháp sử dụng đường chuẩn glucose. Kết quả chủng ZW3 sản
xuất EPS đạt hiệu quả cao lên đến 1215mg/l. Và nó được sản xuất thậm chí còn
cao hơn lên đến 1675mg/l nếu môi trường ủ được gia nhiệt ở 100 oC trong 30
phút và sau đó ly tâm và định lượng EPS [42].
Wang cùng cộng sự (2010) tiếp tục nghiên cứu về khả năng sinh EPS của
chủng Lactobacillus plantarum KF5 được phân lập từ nấm Kefir Tây Tạng.
Chủng L. plantarum KF5 nuôi trong môi trường sữa lỏng, ủ trong 24-48 giờ,
được ly tâm ở 10000 rpm 4oC trong 15 phút. Sau khi loại bỏ các tế bào, các dịch
nổi được thẩm tách và định lượng EPS được xác định bằng phenol sulfuric.
21

Phương pháp sử dụng glucose làm chuẩn (Dubois et al., 1956). Năng suất chủng
KF5 được xác định là 75,57mg/l dưới điều kiện ủ ban đầu. Để tăng năng xuất
EPS, tiếp tục nghiên cứu thay đổi các điều kiện. Nuôi cấy trong 30 giờ, pH ban
đầu 6,3, nồng độ cấy 3%, số lượng EPS được sản xuất bởi KF5 có thể lên tới
95,58mg/l, tăng 26,48% so với trong điều kiện lên men ban đầu. Nhiều nhà
nghiên cứu đã báo cáo rằng có ý nghĩa về mối quan hệ giữa các thành phần, điều
kiện nuôi cấy và pH (Kim et al., 2008; Santivarangkna et al., 2008). Lượng EPS
được sản xuất bởi chủng L. plantarum và L. Paraplantarum dao động 140297mg/l nuôi ở MRS chứa maltose (Zotta et al., 2008) [43]
Seesuriyachan và cộng sự(2011) đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp
exopolysaccharide bởi Lactobacillus confusus TISTR 1498 khi sử dụng nước dừa
như là nguồn C thay thế và nghiên cứu ảnh hưởng của pepton, cao thịt, cao nấm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp exopolysaccharide đạt
cao nhất khi môi trường có chứa 100% nước dừa, 20g/l saccharose và 5g pepton,
2,5g/l cao thịt, 2,5g/l cao nấm và nuôi cấy ở 350C với pH=5,5 trong 24 giờ [33].
Ismail và Nampoothirid (2013)đã cho thấy tính chất của exopolysaccharide
được sinh tổng hợp bởi chủng Lactobactillus plantarum MTCC 9510 là có tiềm
năng probiotic và các tác dụng của hợp chất này lên tính chất lưu biến tinh
bột[24]. Cũng trong năm này, Zhang và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động
chống oxy hóa của EPS được sinh tổng hợp từ chủng L. plantarum C88. Kết quả
phát hiện thấy rằng EPS này là một chuỗi heteropolysaccharide, có cấu trúc bao
gồm galactose và glucose với tỉ lệ 1:2, khối lượng phân tử trung bình của EPS này
là 1,15x106 Da. Kết quả này cũng cho thấy EPS này có tác dụng chống oxy hóa
vô cùng quan trọng và có tiềm năng trong ngành công nghệ thực phẩm [46].
Wang và cộng sự (2014) nghiên cứu tính chất của EPS mới với hoạt tính
chống lại khối u từ L. plantarum 70810. Kết quả cho thấy EPS đạt cực đại
khi lên men ở 31oC, 22 giờ và khối lượng phân tử EPS 169,6 kDa. EPS này
có khả năng chống ung thư cho thấy hợp chất exopolysaccharide này có khả
năng ức chế các tế bào ung thư gan HepG-2, ung thư dạ dày BGC-823 và ung
thư ruột kết HT-29. Từ kết quả đạt được này, nhóm tác giả đã kiến nghị rằng
có thể sử dụng hợp chất này để sản xuất thực phẩm chức năng và thuốc chống

ung thư [41]

22


PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi sinh vật nghiên cứu là 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum
W1, Lactobacillus plantarum W3, Lactobacillus plantarum W5, Lactobacillus
plantarum N5 được cấp từ Phòng thí nghiệm vi sinh của Khoa Cơ khí – Công
nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế.
3.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu
3.2.1. Thiết bị và dụng cụ
- Nồi hấp cao áp.
- Cân điện tử T/R 200.
- Máy ly tâm ống fancol để bàn K241R.
- Máy đo quang phổ (UV/VIS)- Nhật Bản.
- Máy đo pH điện tử (HANNA)- Ý.
- Tủ ấm (WB)- Đức.
- Tủ an toàn sinh học Labgard - Nhật Bản.
- Tủ lạnh Sanyo - Nhật Bản.
- Lò vi sóng.
Và những dụng cụ thông dụng trong phòng thí nghiệm như: ống fancol
50m, fancol 15ml, eppendorf, nhiệt kế, ống nghiệm, đĩa peptri, que cấy,
pipetman 1000 µl , pipetman 200µl....
3.2.2. Hóa chất:
- Các hóa chất để pha môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic và giữ
giống: pepton, cao thịt, cao nấm, glucose, sorbitan monooleate (Tween),
K2HPO4, MgSO4.7H2O, NH4, MnSO4, CH3COONa, agar, glycerol, NaCl.

- Các loại hóa chất khác như cồn 990, cồn 960, H2SO4 đậm đặc, Phenol 5%, các
loại đường (glucose, saccharose, lactose),axit tricloacetic (TCA)...
Tất cả các hóa chất trên được cung cấp bởi hãng Merk và Trung Quốc.

23


3.3. Qúa trình bố trí thí nghiệm
Qúa trình bố trí thí nghiệm được thực hiện theo sơ đồ sau:
Khảo sát tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus
plantarum W1, W3,W5,N5 có khả năng
sinh tổng hợp EPS cao

Chủng
thích hợp

Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung loại đường khác nhau với
nồng độ khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy đến khả
năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi khuẩn Lactobacillus
platarum đã tuyển chọn

Môi
trường
thích hợp

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy (12, 24, 36, 48,
60, 72 giờ) đến khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng vi
khuẩn Lactobacillus platarum đã tuyển chọn

Thời gian

thích hợp

Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm theo nội dung nghiên cứu
3.3.1. Khảo sát tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum W1,
W3,W5,N5 có khả năng sinh tổng hợp EPS cao.
Qúa trình nuôi cấy để sinh EPS được tiến hành trong các ống fancol có
chứa 10 ml môi trường MRS có bổ sung 1% glucose và 2 % lactose, mỗi chủng
Lactobacillus plantarum được tiến hành nuôi lặp lại 3 lần. Mật độ tế bào của các
chủng L.plantarum W1, L.plantarum W3, L.planarum W5, L.platarum N5 trong
môi trường nuôi cấy là 106 CFU/ ml, nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 370C.
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung loại đường khác nhau với nồng độ
khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp EPS
của chủng vi khuẩn Lactobacillus platarum đã tuyển chọn.
Qúa trình nuôi cấy để sinh EPS được tiến hành trong các ống fancol có
chứa 10ml môi trường MRS có bổ sung glucose, lactose, saccharose và đường
trong nước dừa với nồng độ khác nhau. Mật độ tế bào của chủng L. plantarum
đã tuyển chọn trong môi trường nuôi cấy là 106 CFU/ ml, nuôi trong 48 giờ ở
nhiệt độ 370C.

24


3.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung saccharose với nồng độ khác nhau vào
trong MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L. plantarum đã tuyển chọn
Tiến hành bổ sung đường saccharose vào môi trường MRS theo 5 công
thức sau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng. Mỗi công thức được tiến hành nuôi
lặp lại 3 lần.
Môi trường 1: MRS+ 2% saccharose.
Môi trường 2: MRS+ 3% saccharose.
Môi trường 3: MRS+ 4% saccharose.

Môi trường 4: MRS+ 5% saccharose.
Môi trường 5: MRS+ 6% saccharose.
3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung glucose với nồng độ khác nhau vào trong
MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L. plantarum đã tuyển chọn
Tiến hành bổ sung đường glucose vào môi trường MRS theo 5 công thức
sau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng. Mỗi công thức được tiến hành nuôi lặp lại
3 lần
Môi trường 6: MRS+ 2% glucose.
Môi trường 7: MRS+ 3% glucose.
Môi trường 8: MRS+ 4% glucose.
Môi trường 9: MRS+ 5% glucose.
Môi trường 10: MRS+ 6% glucose.
3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng khi bổ sung lactose với nồng độ khác nhau vào trong
MRS đến khả năng sinh tổng hợp EPS bởi chủng L. plantarum đã tuyển chọn
Tiến hành bổ sung đường lactose vào môi trường MRS theo 5 công thức
sau, với mẫu đối chứng là MRS lỏng. Mỗi công thức được tiến hành nuôi lặp lại
3 lần.
Môi trường 11: MRS+ 2% lactose.
Môi trường 12: MRS+ 3% lactose.
Môi trường 13: MRS+ 4% lactose.
Môi trường 14: MRS+ 5% lactose.
Môi trường 15: MRS+ 6% lactose.
25