Thiết Lập Hệ Thống Tái Sinh IN VITRO Cây Hoa Cúc (Chrysanthemum Sp.)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
************

THIẾT LẬP HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO
CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum sp.)

Giảng viên hướng dẫn : TS. TRẦN THỊ DUNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


TÓM TẮT
Đặng Thị Thu Thảo, Đại học Tôn Đức Thắng, Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 12/2009,
với đề tài “Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro cây hoa Cúc Chrysanthemum
sp.)”, dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Dung. Đề tài được thực hiện tại Khoa
Khoa học ứng dụng, Trường Đại học Tôn Đức Thắng. Thời gian thực hiện từ tháng
10/2009 đến 12/2009.
œMục đích đề tài: Tìm hiểu các thông số môi trường thích hợp cho quá trình tái
sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro, từ đó nuôi cấy thành cây hoa Cúc hoàn
chỉnh in vitro làm cơ sở cho vi nhân giống và các nghiên cứu chuyển gen có lợi ở
cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp.).
œPhương pháp nghiên cứu: Mẫu lá cây hoa Cúc in vitro được sử dụng để tiến hành
khảo sát các thông số sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh chồi từ mẫu
lá cây hoa Cúc in vitro.
- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây Cúc
in vitro trong môi trường agar và môi trường lỏng.
- Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ cây hoa Cúc

in vitro.
œKết quả đạt được: Các mẫu lá cây Cúc in vitro có thể tái sinh chồi trong môi
trường MS cơ bản có bổ sung 2 mg/l NAA + 2 mg/l 2,4-D + 4 mg/l BA. Mỗi mảnh
mô sẹo lá có từ 1 – 2 chồi.
Sau khi tái sinh, chồi được nhân nhanh để tạo số lượng lớn cây con in vitro trong
môi trường MS cơ bản có bổ sung 1 mg/l BA + 0,5 mg/l IBA hoặc môi trường MS
lỏng có bổ sung 5 mg/l GA3 + 0,05 mg/l NAA. Các chồi mọc vươn lên khỏi môi
trường, kích thích sự phát triển thân.
Khi đạt số lượng chồi mong muốn, tiến hành tạo rễ trong môi trường MS cơ bản có
bổ sung 0,5 mg/l IBA. Rễ mập, có nhiều lông hút, thích hợp để chuyển sang giai
đoạn ex vitro tạo cây hoa Cúc hoàn chỉnh.

ii


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Lời cảm ơn .................................................................................................................. i
Tóm tắt ....................................................................................................................... ii
Mục lục...................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt...........................................................................................v
Danh sách các hình.................................................................................................... vi
Danh sách các bảng.................................................................................................. vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU CHUNG ......................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..........................................................................................................1
1.2 Mục đích............................................................................................................2
1.3 Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
2.1 Giới thiệu chung về cây hoa Cúc...................................................................3
2.1.1 Vị trí phân loại thực vật ..............................................................................3
2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố ...........................................................................3
2.1.3 Tình hình sản xuất hoa Cúc ........................................................................4
2.1.4 Giá trị kinh tế của cây hoa Cúc..................................................................5
2.1.5 Đặc điểm thực vật .......................................................................................5
2.1.6 Đặc điểm sinh thái ......................................................................................6
2.1.7 Kỹ thuật trồng ............................................................................................6
2.2 Khái niệm chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật.........................................8
2.2.1 Khái niệm chung.........................................................................................8
2.2.2 Các bước nhân giống in vitro ..................................................................14
2.2.3 Một số kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro ............................................15
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy ......16
2.3 Các nghiên cứu trước đây về nuôi cấy mô cây hoa Cúc ............................25
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................29
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm ...............................................29
3.1.1 Địa điểm...................................................................................................29
iii


3.1.2 Thời gian..................................................................................................29
3.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................29
3.3 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................29
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu ..............................................................................29
3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm .........................................................................29
3.3.3 Môi trường nuôi cấy ................................................................................29
3.3.4 Điều kiện nuôi cấy ...................................................................................31
3.4 Phương pháp thí nghiệm..............................................................................31
3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến

sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro .................................................31
3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến
sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar .................................32
3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến
sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường lỏng.................................33
3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự
tạo rễ cây hoa Cúc in vitro .................................................................................34
3.5 Phương pháp phân tích số liệu .....................................................................34
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................35
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................49
5.1 Kết luận ...........................................................................................................49
5.2 Kiến nghị .........................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................50
PHỤ LỤC .................................................................................................................52

iv


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MS: Môi trường Murashige và Skoog (1962)
BA: Benzyl adenine
IAA: Indole – 3 – acetic acid
IBA: Acid indolebutyric
NAA: 1 – naphthalene acetic acid
2,4-D: 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid
GA3: Acid gibberellic
ĐC: Đối chứng
NSC: Ngày sau cấy
CĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng

v


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Cây hoa Cúc ................................................................................................3
Hình 2.2 Quy trình chuyển gen vào thực vật bằng kỹ thuật đĩa lá nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens ......................................................................................11
Hình 2.3 Một số giống hoa Cúc thuộc chi Chrysanthemum sp...............................28
Hình 4.1 Ảnh hưởng của NAA, 2,4-D và BA đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa
Cúc in vitro sau 40 ngày nuôi cấy.............................................................................37
Hình 4.2 Ảnh hưởng của NAA, 2,4-D và BA đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa
Cúc in vitro sau 60 ngày nuôi cấy.............................................................................38
Hình 4.3 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong
môi trường agar .........................................................................................................42
Hình 4.4 So sánh ảnh hưởng của BA và IBA đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro
trong môi trường agar. ..............................................................................................43
Hình 4.5 Ảnh hưởng của GA3 và NAA đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong
môi trường lỏng.........................................................................................................45
Hình 4.6 Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ cây hoa Cúc in vitro ...........................47
Hình 4.7 Sơ đồ thiết lập hệ thống tái sinh in vitro từ mẫu lá cây hoa Cúc
(Chrysanthemum sp.) ................................................................................................48

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG

TRANG

Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS (Murashige – Skoog, 1962) .........................30
Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
đến sự tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro ..................................................31
Bảng 3.3 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
đến sự nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar..................................32
Bảng 3.4 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến
sự nhân chồi cây Cúc in vitro trong môi trường lỏng ...............................................33
Bảng 3.5 Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng
đến sự tạo rễ cây hoa Cúc in vitro.............................................................................34
Bảng 4.1 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tái sinh chồi từ mẫu
lá cây hoa Cúc in vitro ..............................................................................................35
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây hoa
Cúc in vitro trong môi trường agar ........................................................................... 39
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự nhân chồi cây hoa
Cúc in vitro trong môi trường lỏng ...........................................................................44
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo rễ cây hoa Cúc
in vitro .......................................................................................................................46

vii


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU CHUNG
1.1

Đặt vấn đề
Từ xa xưa, chơi Cúc đã là một thú chơi tao nhã của các bậc học sỹ và các

gia đình giàu có. Trải qua nhiều năm, cùng với các kỹ thuật lai ghép, các phương
pháp trồng hoa mới, chất lượng và chủng loại hoa Cúc đã được cải thiện rất nhiều.
Cho đến nay có khoảng 70 giống Cúc được trồng với mục đích cắt cành. Cây hoa
Cúc (Chrysanthemum sp.) là một loài hoa trang trí phổ biến trên thế giới. Hoa Cúc
rất đa dạng về màu sắc và hình dáng, là loại hoa cắt cành làm cảnh, loại cây hương
liệu và dược liệu.
Hoa Cúc nhanh chóng trở thành một trong những mục tiêu thương mại
đầu tiên trong vi nhân giống, bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để sản xuất
với số lượng lớn. Có nhiều công trình nghiên cứu về nhân giống cây hoa Cúc ở
nhiều quốc gia đã được báo cáo như nuôi cấy mô sẹo và tái sinh thành cây con, nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng in vitro, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy các mô sẹo phát sinh từ
thân và lá và từ các phần của hoa. [9]
Nhân giống sinh dưỡng ex vitro bằng cách cắt cành là một phương pháp
đơn giản được nông dân sử dụng ngoài đồng ruộng. Tuy nhiên, các cây con thu
nhận từ phương pháp này bị thoái hóa sau một vài thế hệ do bị nhiễm virus. Ngoài
nhân giống, các nghiên cứu tạo giống hoa có màu sắc mới lạ, các giống Cúc có
mang gen chống chịu được sâu bệnh hay điều kiện thời tiết khắc nghiệt cũng được
chú trọng, tuy nhiên do thường thực hiện bằng phương pháp lai tạo truyền thống
nên thường gây đột biến, cho kết quả không như mong muốn. Thời gian gần đây,
nhờ sự can thiệp của các kỹ thuật di truyền đã đem lại nhiều kết quả khả quan trong
lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật như chuyển nạp gen gfp nhờ Agrobacterium
tumefaciens vào mẫu lá Cúc đại đóa giúp giống này có khả năng phát sáng. Vì vậy,
đề tài “Thiết lập hệ thống tái sinh in vitro cây hoa Cúc (Chrysanthemum sp.)” nhằm
tìm ra môi trường thích hợp để tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro tạo thuận
lợi cho các nghiên cứu sau này về chuyển nạp gen cũng như các ứng dụng khác trên
cây hoa Cúc.

1

1.2

Mục đích
Tìm hiểu các thông số môi trường thích hợp cho quá trình tái sinh chồi từ

mẫu lá cây hoa Cúc in vitro, từ đó nuôi cấy thành cây hoa Cúc hoàn chỉnh in vitro
làm cơ sở cho vi nhân giống và các nghiên cứu chuyển gen có lợi ở cây hoa Cúc
(Chrysanthemum sp.).
1.3

Ý nghĩa của đề tài
Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự tái

sinh chồi từ mẫu lá cây hoa Cúc in vitro.
Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự
nhân chồi cây hoa Cúc in vitro trong môi trường agar và môi trường lỏng.
Xác định được nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự
tạo rễ cây Cúc in vitro.

2


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Giới thiệu chung về cây hoa Cúc

2.1.1

Vị trí phân loại thực vật [4]
Giới

: Plantae

Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Magnoliopsida

Bộ

: Asterales

Họ

: Asteraceae

Chi

: Chrysanthemum

Tên khoa học: Chrysanthemum sp.

Hình 2.1 Cây hoa Cúc

Tên tiếng Anh: Red – white chrysanthemum

Tên thông thường: Cúc hoa
2.1.2

Nguồn gốc và sự phân bố [25]
Cây hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc. Khoảng 500 năm trước Tây

Lịch Khổng Tử đã đề cập đến việc trồng hoa Cúc. Ở Nhật vào thế kỷ thứ 8 sau Tây
Lịch mới có sự hiện diện của hoa Cúc. Riêng Âu Châu, Cúc được mang vào Hà
Lan năm 1688, nhưng việc trồng hoa Cúc thời này ở đây không thành công. Đến
năm 1789 M. Blancard ở Marseilles đem ba loại Cúc từ Trung Hoa về Pháp, nhưng
chỉ có một trong ba loại này sống được, đó là Cúc “Old Purple” và vì vậy đã được
ghi trong lịch sử hoa Cúc. Ở Anh cuối thế kỷ 18 người ta thấy có 8 loại Cúc được
nhập cảng, đến năm 1824 có 24 loại và năm 1826 lên tới 48 loại. Vào năm 1860,
nhân dịp thăm viếng Nhật Bản, ông Robert Fortune đã đem về nhiều loại Cúc mới
về Châu Âu. Trong sự phát triển hoa Cúc, chính sự lai giống tiếp của các loại Cúc
này mà người ta được thêm nhiều giống mới nữa. Ở Châu Úc, hoa Cúc được trồng
tại Tasmania vào năm 1836, New South Wales 1843, Victoria 1855 và ở New
Zealand 1860. Ở Mỹ cuối thế kỷ 19 Cúc được trồng rất nhiều. Riêng hoa Cúc của
Việt Nam hiện tại có xuất xứ từ Trung Hoa, Nhật và Châu Âu.
Hoa Cúc được trồng phổ biến tại nhiều vùng trồng hoa của nước ta.
Trong đó, các vùng trồng lớn nhất là làng hoa ở Hà Nội, Mê Linh (Vĩnh Phúc),
Nam Định và Đà Lạt. Hoa Cúc được trồng làm cảnh tại Đà Lạt từ lâu nhưng thực sự
3


trở thành sản phẩm kinh tế từ năm 1995. Cho đến nay có khoảng trên 70 giống hoa
Cúc được trồng với mục đích cắt cành tại Đà Lạt. Giống hoa Cúc hiện nay chủ yếu
xuất phát từ Hà Lan và du nhập vào Đà Lạt với nhiều hình thức khác nhau.
2.1.3

Tình hình sản xuất hoa Cúc [4]
œ Trên thế giới
Trong ngành sản xuất hoa toàn cầu, hoa Cúc là loài hoa quan trọng thứ

hai sau hoa Hồng. Cúc được xem là một trong những loài hoa được ưa chuộng trên
toàn thế giới.
Ở Nhật Bản, hoa Cúc là quốc hoa từ năm 910, nên ngành sản xuất hoa
Cúc đã mang lại lợi nhuận tăng lên 2 lần, chỉ trong vài thập niên gần đây, nhờ áp
dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật cũng như do nhu cầu thưởng thức cuộc sống của
người dân tăng nhanh. Hoa Cúc ở Nhật bản chiếm đến 35% tổng sản phẩm hoa cắt
cành trong cả nước.
Trên thế giới, hàng năm Nhật Bản cũng là quốc gia sản xuất hoa Cúc
nhiều nhất với 2 tỷ cành, tiếp theo là Hà Lan với 800 triệu, Columbia 600 triệu,
Italia 500 triệu, Mỹ 300 triệu. Ở Anh, hoa Cúc là loài hòa cắt cành quan trọng đứng
thứ 2 trên thị trường.
Tại Nhật Bản, hoa Cúc cắt cành được sử dụng phổ biến: 40% được dùng
làm quà tặng, 25% được dùng để trang trí trong các khách sạn hay trong các lễ hội,
25% được dùng trang trí trong các gia đình và cúng theo đạo Phật và 10% phục vụ
trong việc giảng dạy, nghiên cứu.
œ Tại Việt Nam
Ở nước ta, có nhiều loài cây dại thuộc họ Cúc mọc ở nhiều nơi. Một số
loài được dùng để làm thuốc trong y học cổ truyền, ví dụ như Bồ Công Anh
(Lactuca laciniata L.). Hoa Cúc làm cảnh được đưa vào trồng ở nước ta vào khoảng
thế kỷ thứ 15 đến đầu thế kỷ thứ 16, lúc đó chủ yếu là dùng làm cảnh. Mãi đến sau
này, Cúc mới được trồng như một loại cây thương mại. Hà Nội là nơi có diện tích
trồng Cúc nhiều nhất với diện tích 450 ha, sau đó là Thành phố Hồ Chí Minh 370
ha. Đà Lạt là vùng có diện tích trồng hoa Cúc lớn thứ 3 với diện tích 160 ha.
Tại Lâm Đồng, hầu hết diện tích trồng Cúc tập trung ở thành phố Đà Lạt,
ở các huyện Đơn Dương, Đức Trọng, Lạc Dương,…diện tích không đáng kể. Mặc
dù được trồng từ khá lâu, nhưng hoa Cúc thành sản phẩm thương mại mới từ 1995.

4


Diện tích trồng hoa Cúc tại Đà Lạt đã tăng nhanh trong những năm gần đầy. Diện
tích trồng chiếm đến 40 – 50% diện tích trồng hoa nói chung. Trong việc trồng hoa
Cúc, bà con nông dân đã áp dụng nhiền biện pháp kỹ thuật như dùng hệ thống đèn
chiếu sáng, hệ thống tưới phun sương, nhà kính,…Đa số hoa Cúc ở Đà Lạt được
trồng với mục đích cắt cành. Mỗi năm, Đà Lạt cung cấp cho thị trường 10 – 15 triệu
cành. Đà Lạt hiện có khoảng 70 giống được du nhập chủ yếu ở Hà Lan, theo nhiều
con đường khác nhau: chính thức và không chính thức. Do đó, việc xác định tên
thương phẩm và chủng loại cho từng chủng loại Cúc là rất khó khăn.
2.1.4

Giá trị kinh tế của cây hoa Cúc [ 24, 25]
Cây hoa Cúc là một trong những loài hoa có giá trị kinh tế cao được trồng

phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới. Hoa Cúc được chơi nhiều cách, trồng đại trà
để cắt hoa cắm bình, lọ, bát, trồng trong bồn nhậu để trang trí trong nhà, đặt trên
bồn ghế hay ngoài sân, ngoài hiên, trên ban công. Có những giống trồng trên ban
công, thân lá rũ xuống trông xa như một dòng suối, màu hoa vàng gọi là kim tuyền
(suối vàng), màu hoa trắng gọi là ngân tuyền (suối bạc). Đặc biệt hoa Cúc không
rụng cánh như hoa Hồng và nhiều loài hoa khác nên rất ưa được trang trí trên bàn
thờ, nóc tủ, hơn nữa đa số các giống Cúc hoa đều có màu sắc thanh nhã và dịu dàng.
Việc trồng cây hoa Cúc đã đang và sẽ mang lại lợi nhuận cao cho nghề trồng hoa.
Hoa Cúc còn có tác dụng thanh nhiệt, giải nhiệt và mụn nhọt nên được
ứng dụng rộng rãi trong việc ăn uống để chữa bệnh, như pha chế thành đồ uống,
bánh điểm tâm, làm món ăn trong bữa ăn hàng ngày. Trong thức ăn hàng ngày,
dùng hoa Cúc bày ở xung quanh mép đĩa, dùng cánh hoa làm món rau xào, nước
hoa Cúc đem nấu canh. Hoa Cúc nấu với bột cua là một trong những món ăn nổi
tiếng của Trung Quốc.

Có người dùng hoa Cúc phối hợp với những vị thuốc như bạch chỉ chẳng
hạn làm thành gói thuốc, dùng để điều trị cho trên 1,000 bệnh nhân mất ngủ, đã kéo
dài thêm giấc ngủ được trên 2 giờ, tỷ lệ hữu hiệu trên 90 %, không có bất cứ một
phản ứng phụ nào. Đối với người già và người huyết áp cao lại càng thích hợp. Trẻ
em dùng gói thuốc hoa Cúc có thể phòng chữa bệnh rôm sảy.
2.1.5

Đặc điểm thực vật [4, 19, 20]
Rễ: Cúc có hệ rễ chùm, mọc cạn theo chiều ngang, đâm sâu khoảng 10 –

20 cm, rễ Cúc có kích thước khá đều nhau, với số lượng rễ lớn nên khả năng hút
5


nước và chất dinh dưỡng rất mạnh. Do Cúc được nhân giống bằng phương pháp vô
tính, nên rễ mọc ngang từ các mấu thân ở gần mặt đất.
Thân: thân hoa Cúc là thân thảo nhỏ, mọc nhiều đốt, mọng nước, giòn,
dễ gãy. Trên thân non một số loài có phủ một lớp lông tơ, một số loài có dạng thân
bò. Chiều cao thân tùy loài, nhưng đa số các giống nhập thì có thân to, giòn, thẳng.
Các giống nội địa có thân nhỏ, mảnh, cong.
Lá: lá Cúc thuộc loại lá đơn, không có lá kèm, mọc sole. Bản lá có xẻ
thùy hình lông chim. Phiến lá mỏng, phía dưới có phủ một lớp lông tơ, mặt trên
nhẵn. Gân lá hình mạng. Mỗi cây có từ 30 – 50 lá.
Hoa, quả: hoa Cúc về cơ bản là hoa lưỡng tính, có nhiều màu sắc khác
nhau, thích nghi với việc thụ phần nhờ sâu bọ. Hoa nhỏ, sít nhau và luôn tập trung
thành cụm hoa đầu để một sâu bọ có thể thụ phấn nhiều hoa cùng một lúc. Đế hoa
lồi lên. Hoa ở giữa là hoa hình ống, hoa ở ngoài là hoa thìa lìa giả.
Ở Cúc, quả là quả bế, chỉ có một hạt mầm nằm trong khoang của quả và đôi khi
dính với vỏ quả. Vỏ hạt rất mỏng, phôi lớn và thẳng, không có nội nhủ. Quả phát
tán nhờ gió và động vật.

2.1.6

Đặc điểm sinh thái [4]
Khí hậu: Đa số loài Cúc thích nghi với khí hậu ôn hòa, mát mẻ, lượng

mưa đầy đủ, nhất là những hoa được nhập từ vùng ôn đới. Với nhiệt độ trên 250C,
Cúc sinh trưởng và phát triển kém.
Đất đai: Cúc ít đòi hỏi về điều kiện đất đai. Thích hợp với đất acid nhẹ,
pH khoảng 6,0 – 6,5. Phát triển tốt trên đất có độ ẩm tốt, thoáng khí, giàu chất hữu
cơ, đặc biệt có phân chuồng. Trước khi trồng, cần làm đất tốt, cày sâu 20 – 40 cm
để đảm bảo thoáng khí và bón lót đầy đủ phân hữu cơ. Cần chú ý không bón phân
khi cây bước vào giai đoạn ra hoa.
2.1.7

Kỹ thuật trồng [4]
Nước tưới: Cúc chỉ có thể sống sót trong thời gian khô hạn ngắn, nếu

khô hạn kéo dài sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Vì vậy, tưới
nước rất quan trọng với Cúc nhất là vào mùa khô. Cần tưới một cách đều đặn và kỹ
lưỡng, đảm bảo nước thấm xuống đất ít nhất 12 – 15 cm, cần chú ý tránh làm tổn
thương cây do những tia nước quá mạnh. Những tổn thương này là nguyên nhân để
virus xâm nhập, các vi khuẩn và nấm phát triển.
6


Bón phân: Bón phân đúng phương pháp không những làm tăng năng
suất, phẩm chất mà còn cải thiện được lý, hóa tính của đất, tiết kiệm được phân.
Trái lại, không những lãng phí phân bón mà còn làm cho cây sinh trưởng, phát triển
không cân đối, bị sâu bệnh tấn công. Phải tuân theo nguyên tắc bón phân: đúng lúc,
đúng cách, đúng liều lượng.

œ Công thức bón cho 1000 m2 cây hoa Cúc:
Bón lót: 50 – 100 kg vôi bột (bón trước khi bón phân hữu cơ 5 – 7 ngày),
100 kg phân hữu cơ sinh học Better HG01, 0,5 – 1 tấn phân chuồng hoai.
Bón thúc:
Tưới thúc (sau trồng 10 và 20 ngày): hòa tan 10 – 15 kg phân NPK Better và TE
trong nước để tưới vào gốc.
Bón thúc lần 1 (sau trồng 25 – 30 ngày): 10 – 15 kg phân NPK Better và TE.
Bón thúc lần 2 (sau trồng 40 – 45 ngày): 10 – 15 kg phân NPK Better và TE.
Bón thúc lần 3 (sau trồng 55 – 60 ngày): 10 – 15 kg phân NPK Better và TE.
Ngoài ra còn có thể kết hợp phun phân bón lá Better HG – Best farm, Better HG –
Best plant.
Phòng trừ bệnh
Bệnh virus: Hiện nay chưa có thuốc phòng chống các loại bệnh do virus gây ra.
Biện pháp tốt nhất là loại bỏ cây bị nhiễm bệnh virus ngay từ vuờn giống và thường
xuyên phun thuốc phòng ngừa để loại bỏ các vectơ lây truyền.
Bệnh nấm-khuẩn: Có nhiều nguyên nhân gây bệnh, cần xác định rõ từng loại bệnh
để có biện pháp phòng ngừa hữu hiệu. Các dạng bệnh thường gặp là:
- Gốc cành giâm bị thối ướt, màu đen nhạt, do Pythium debaryanum gây ra.
- Vết chết hoại màu nâu: do Rhizoctonia solanii và Phytophtora cryptoyea.
- Vết thối ở gốc, có màng tơ trắng: do Sclerotinia minor và

Sclerotinia

sclerotiorum.
- Trên lá xuất hiện bột phấn trắng, do Erysiphe cichoracearum gây ra.
- Mặt trên lá có những đốm màu vàng sau đó chuyển thành nâu đen, lá bị khô héo.
Bệnh do Septoria chrysanthemi gây ra.
- Mặt dưới lá có những mụn tập trung, màu nâu: do Puccinia chrysanthemi gây ra.
- Vết tổn thương bị loét, gây ra sự nứt thân, lá khô héo và lây nhiễm mạnh. Bệnh
gây ra do Erwinia chrysanthemi.

7


Biện pháp phòng chống tốt nhất là xử lý đất canh tác, bổ sung dinh dưỡng cân đối
và đúng thời gian để cây tăng sức chống chịu, giữ ẩm độ vừa phải (không quá khô
và quá ẩm), phun phòng định kỳ bằng các loại thuốc chống nấm bệnh với liều lượng
khuyến cáo.
Với một số bệnh thường gặp, sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật như sau:
- Bệnh lở cổ rễ sử dụng Benlat, Topsin M, Monceren… phun vào gốc cây.
- Bệnh rỉ sắt: sử dụng các thuốc Daconil, Sumi eight, Score, Bayfidan, Bonaza,
Anvil…
- Bệnh cháy lá do Alternaria sp. sử dụng Rovral, Anilazine.
2.2

Khái niệm chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô

tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận khác nhau của thực vật trong ống nghiệm
trên môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường bao gồm các nhân tố
thiết yếu đa lượng và vi lượng, chất điều hòa sinh trưởng, đường, vitamin và một số
hợp chất hữu cơ cần thiết khác.
Tế bào thực vật có tính toàn thế, tế bào đơn hoặc protoplast thực vật đều
có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là điều kiện quan trọng để ứng dụng trong
nuôi cấy mô thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ
các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ tạo thành cây hoàn chỉnh nhờ vào sự điều chỉnh
môi trường nuôi cấy in vitro.
2.2.1

Khái niệm chung

2.2.1.1

Lịch sử hình thành và phát triển nuôi cấy mô [1]
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schneiden và Shwann đã đề

xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: tất cả các sinh vật đều cấu tạo từ tế bào, những
tế bào mới được tạo nên từ sự phân chia của những tế bào trước nó có sự giống
nhau căn bản về thành phần hóa học và các hoạt tính trao đổi chất giữa tất cả các
loại tế bào và hoạt động của cơ thể là sự tích hợp hoạt tính của các đơn vị tế bào độc
lập.
Ý kiến cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in vitro)
đã được nhà khoa học Haberlandt thử nghiệm rất sớm (từ những năm 1902) nhưng
ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công. Mô động vật được cấy

8


trước tiên do A. Carrel (1919), đến năm 1934 mô thực vật được chọn làm đối tượng
nuôi cấy mô mới thử nghiệm thành công.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn
của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua.
Năm 1937, Gautheret và Nobecourt đã tạo ra và duy trì được sự sinh
trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một khoảng thời gian dài trên môi trường thạch
cứng.
Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất điều hòa sinh
trưởng trong nuôi cấy mô phôi cà. Trong thời gian này chất điều hòa sinh trưởng
nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công.
Năm 1948, Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi
cấy mô sẹo cây cà rốt.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều hòa

sự nhân chồi.
Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin. Sau
đó các chất cytokinin khác như BAP, 2IP, zeatin cũng được phát hiện.
Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về tỷ lệ giữa
kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá.
Năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đã phát triển, các
tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh.
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu
một bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ
sở cho việc nuôi cấy nhiều loại cây và vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay.
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính cây Lan
bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, cây Lan được xem là cây nuôi cấy
mô lần đầu tiên được thương mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào
thực vật đã phát triển với tốc độ nhanh trên nhiều loại cây khác nhau và được ứng
dụng thương mại hóa.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi
ngọn và ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây Sen cạn và cây Đậu
trắng từ môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa

9


hoàn thiện. Sau đó, nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh
dưỡng quan trọng cần thiết cho sự phát triển của tế bào được nuôi cấy.
2.2.1.2

Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô [1]

- Tạo được số lượng cây giống lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích
và không gian nhỏ trong phòng thí nghiệm, có thể kiểm soát được các điều kiện vật

lý và hóa học.
- Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến.
- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy hạt phấn.
- Tạo dòng lai soma và lai tế bào trần.
- Tạo được nhiều cây con từ các mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa,
hạt phấn, noãn, chồi, phát hoa và rễ) mà ngoài tự nhiên không thực hiện được.
- Cố định nitrogen.
- Cải thiện hiệu quả quang tổng hợp.
- Bảo quản các nguồn gen.
- Loại bỏ được các mầm bệnh như: nấm, virus, một số vi sinh vật khác gây bệnh
cho cây thông qua phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt.
- Cải thiện tính trạng thực vật.
Ngoài những ứng dụng trên, các nghiên cứu cải tiến giống cây trồng bằng
công nghệ sinh học cũng rất được quan tâm. Trong những cải tiến đó, chuyển nạp
gen vào thực vật đã và đang mang lại nhiều lợi ích cho các giống cây trồng.
Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ
thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens vẫn được ứng dụng
rộng rãi. Agrobacterium tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật
sống trong đất, trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để
chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các
đặc tính mong muốn.
Để thực hiện việc chuyển gen nhờ vi khuẩn người ta sử dụng kỹ thuật đĩa
lá. Tạo các đĩa lá của thực vật cần chuyển gen sau đó xử lý các đĩa lá trong dung
dịch vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang các plasmid chứa gen mong muốn
đã được thiết kế lại trong vài chục phút, trong dung dịch có bổ sung acetosyringone
để tăng cường khả năng hoạt hoá gen vùng vir qua đó thúc đẩy thêm quá trình
chuyển gen. Sau giai đoạn này rửa sạch lá bằng dung dịch kháng sinh cefotaxime để
10

diệt hết khuẩn. Nuôi cấy đĩa lá trên môi trường tái sinh và tạo cây. Chọn lọc các cây
mang gen chuyển vào qua sự phát hiện các gen bị chỉ thị. Phát hiện các gen chuyển
vào qua phân tích ADN và đánh giá sự thể hiện của gen qua biotest.

Hình 2.2 Quy trình chuyển gen vào thực vật bằng kỹ thuật đĩa lá nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
2.2.1.3

Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát sinh hình thái của cây
[11]
Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy
Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy là một nhân tố môi trường quan

trọng, nó ảnh hưởng đến mối quan hệ về nước của mẫu cấy bởi vì mối quan hệ này
tác động lên các quá trình sinh hoá và sinh lý. Tanaka và cộng sự (1992) đã thấy
rằng có sự liên hệ tích cực giữa việc giảm độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy với
việc gia tăng sự kháng của lá đối với sự thoát hơi nước của cây Khoai tây nuôi cấy
in vitro. Sự điều khiển độ ẩm tương đối thích hợp có thể góp phần vào việc cải thiện
chất lượng và năng suất của cây được nuôi cấy in vitro. Độ ẩm tương đối trong bình
nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào số lần trao đổi khí trong một giờ và độ ẩm tương
đối của phòng nuôi cấy. Việc giảm độ ẩm tương đối trong môi trường nuôi cấy sẽ
11


cải thiện được chức năng của khí khổng. Những bằng chứng thu được cho thấy rằng
độ ẩm tương đối đóng vai trò chính trong hiện tượng thủy tinh thể.
Hộp nuôi cấy kín gây điều kiện bất lợi cho sự tăng trưởng của cây in vitro
do độ ẩm trong hộp tăng cao so với độ ẩm ngoài hộp. Độ ẩm ảnh hưởng đến khả
năng hấp thu nước, các chất khoáng và khả năng sống của cây khi ra khỏi ống
nghiệm. Độ ẩm cao làm lá phát triển không bình thường, thay đổi về hình thái cấu

trúc và chức năng sinh lý, như hiện tượng thủy tinh thể, lớp cutin mỏng, chức năng
đóng mở của khí khổng giảm.
Ánh sáng
Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong phản ứng quang hợp có dải
bước sóng từ 400 – 700 nm với đỉnh từ 600 – 680 nm. Sự phát sinh hình thái do ánh
sáng (sự nảy mầm, kéo dài đốt thân,...) xảy ra ở những dải bước sóng từ 400 – 500
nm (xanh lam), 600 – 700 nm (đỏ), 700 – 800 nm (siêu đỏ).
Nhu cầu ánh sáng của cây được phân tích ở những thông số khác nhau:
độ sáng bởi đơn vị diện tích (hoặc cường độ) thể hiện bởi w/m2, thời gian chiếu
sáng thể hiện bằng giờ/ngày và chất lượng phổ của ánh sáng nhận được. Trước đây,
cường độ ánh sáng được đo bằng đơn vị lux, nhưng nó lại tùy thuộc vào sinh lý của
mắt người đo, mắt người lại nhạy với ánh sáng xanh lá cây hơn là xanh lam và đỏ
nên hoàn toàn không phù hợp với nhu cầu của thực vật. Do đó, hiện nay, trong các
nghiên cứu về thực vật người ta sử dụng đơn vị đo cường độ ánh sáng là PPF
(photosynthesis photon flux), tính bằng µmol m-2 s-1, nghĩa là số lượng photon tham
gia trong quá trình quang hợp đồng thời cũng tham gia trong quá trình phát sinh
hình thái, tính trên đơn vị diện tích 1 m2 lá trong thời gian 1 giây. Chất lượng ánh
sáng (light quality), thời gian chiếu sáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng
đóng vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô.
Cường độ ánh sáng mà cây hấp thụ được là rất quan trọng và được tính
toán ở khoảng ngang với cây. Tuy nhiên, cũng có những báo cáo tính theo cường độ
ánh sáng bên ngoài, phía trên hộp nuôi cấy hoặc trên kệ trống của phòng sáng.
Cường độ ánh sáng trên kệ trống xấp xỉ gấp 2 lần cường độ ánh sáng ở mức ngang
với cây trong bình, do đó loại vật liệu được dùng để làm hộp và nút đậy bình phải
đảm bảo cho những ánh sáng khác nhau đi qua.

12


Để sự quang hợp của cây là tối đa, trong nuôi cấy thoáng khí và quang tự

dưỡng người ta kết hợp nồng độ CO2 cao với cường độ ánh sáng cao (từ 200 – 300
µmol m-2 s-1). Tuy nhiên khi cường độ ánh sáng cao sẽ làm tăng nhiệt độ trong
những bình nuôi cấy, làm thay đổi môi trường xung quanh cây, ảnh hưởng lên sự
tăng trưởng và phát triển của cây. Do đó, khi sử dụng ánh sáng cao, cần có biện
pháp để giảm tối đa sự tăng của nhiệt độ.
Nhiệt độ
Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác có ảnh hưởng rõ ràng là nhiệt độ.
Nhiệt độ phòng nuôi cây thường được điều chỉnh ổn định từ 20 – 250C, vì nhiệt độ
bên trong bình nuôi cấy thường cao hơn 20C so với nhiệt độ của phòng nuôi do tác
động của hiệu ứng nhà kính.
Môi trường in vitro
Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi
cấy. Môi trường in vitro có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của
cây in vitro. Một số vấn đề của môi trường in vitro là mức độ quang hợp thấp không
cân bằng CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dưỡng hạn chế,... Vì
vậy, cây con in vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị về hình thái và chất lượng
mẫn cảm với stress ở giai đoạn thuần hóa.
Đặc tính của môi trường in vitro và phản ứng của cây con in vitro với môi
trường có mối tương quan. Do đó việc kiểm soát môi trường in vitro được đặt ra để
điều khiển sự sinh trưởng.
Hiện tượng thủy tinh thể
Những cây thân thảo và thân gỗ nhân giống in vitro thường xuyên bị ảnh
hưởng bởi sự dư thừa của nhiều nhân tố nuôi cấy. Điều này dẫn đến sự rối loạn biến
dưỡng và hình thái. Những bất thường về hình thái giải phẫu và sinh lý trong nuôi
cấy mô đã được miêu tả bằng rất nhiều thuật ngữ: hiện tượng thủy tinh thể, sự tích
lũy nước quá mức, sự mọng nước và hiện tượng trong vắt như thủy tinh. Mặc dù
vậy, thuật ngữ “vitrification” là thuật ngữ chính vì nó đề cập được một quá trình
sinh lý chứ không phải là một quá trình sinh học, nó là thuật ngữ được dùng nhiều
nhất để diễn tả sự thay đổi của lá dẫn đến hiện tượng thủy tinh thể. Một vài đặc
điểm có thể thấy rất rõ trên lá của cây Cẩm chướng: sự rối loạn mà nó biểu hiện chủ

yếu trên lá, tác động lên hai quá trình chính được thực hiện bởi lá, đó là sự quang
13


hợp và sự trao đổi khí (CO2, hơi nước). Sự bất thường về hình thái giải phẫu cũng
được biểu hiện với mức ít phổ biến hơn trên thân và rễ. Những rối loạn tiếp tục
ngăn cản những cây vi nhân giống có thể phát triển trong điều kiện ex vitro. Các
điều kiện đặc biệt cần thiết cho việc nhân nhanh chồi in vitro như độ ẩm cao, dư
thừa chất dinh dưỡng, có mặt các chất khoáng, đường và các chất điều hòa sinh
trưởng ở nồng độ cao, cường độ ánh sáng thấp là nguyên nhân chính được chứng
minh là có khả năng cảm ứng việc hình thành những chồi biến dị. Những bằng
chứng hiện nay xác định rằng độ ẩm tương đối và thế nước là những nhân tố chủ
yếu tham gia vào quá trình phát sinh hình thái bất thường trong điều kiện in vitro.
Hiện tượng thủy tinh thể có thể xảy ra cả ở trong môi trường rắn cũng
như môi trường lỏng. Hiện tượng này đặc biệt phổ biến nếu cây có quá nhiều lượng
nước sẵn có, điều này thường thấy ở trường hợp nuôi cấy trong môi trường lỏng hay
môi trường có hàm lượng thạch thấp.
2.2.2

Các bước nhân giống in vitro [1]
Nhân giống cây trồng in vitro gồm các bước cơ bản sau:
- Tạo thể nhân giống in vitro
- Nhân giống in vitro
- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

2.2.2.1

Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân

giống in vitro. Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân
giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối
với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng
cách tạo cụm chồi từ callus (mô sẹo). Trong môi trường nhân giống thường bổ sung
cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Trước khi tạo các thể nhân giống, các mẫu
ban đầu thường được khử trùng bằng hóa chất để loại bỏ những mầm bệnh gây hại
cho cây.
2.2.2.2

Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương

pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng số lượng mẫu trong nhân
giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi
14


trường tạo thể chồi. Giai đoạn này cây cần có một lượng cytokinin ngoại sinh cao
để kích thích sự hình thành cụm chồi, đôi khi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng
giảm thấp làm cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy
thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở
trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài.
2.2.2.3

Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn

bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi
trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các

chất điều hòa quá trình tạo rễ thuộc nhóm auxin. Điều kiện nuôi cấy gần với điều
kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi tách ra khỏi điều kiện in
vitro.
2.2.2.4

Chuyển cây in vitro ra vườn ươm
Đây là một giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì nó

quyết định chi phí sản xuất cây giống. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn
định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự
nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ cao, nhiệt độ
cao, độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình
trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ
không khí mát, ẩm độ cao. Cây con thường được trồng trong các luống ươm, trên
các vĩ xốp hoặc trên các bầu đất cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm,
trong những ngày đầu cần được phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường
7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần
lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay
phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ.
2.2.3

Một số kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro [5]

2.2.3.1

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương pháp tạo ra cây giống sạch

bệnh và trẻ hóa hiệu quả nhất trong nhân giống vô tính in vitro. Sau khi vô trùng,
mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng

khoáng vô cơ, hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng. Từ một đỉnh sinh trưởng mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay cụm chồi.
15


Chồi tiếp tục phát triển và phân hóa tạo tán cây và rễ. Cây con được chuyển ra đất
dần dần thích nghi và phát triển thành cây trưởng thành.
2.2.3.2

Nuôi cấy mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản

biệt hóa của các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường
được bổ sung nồng độ auxin cao. Mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh
trong điều kiện môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thích hợp.
2.2.3.3

Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy

lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào
đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng để tăng sinh
khối. Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường, tế bào có khả
năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài
trong môi trường lỏng, tế bào đơn được trải trên môi trường agar. Khi môi trường
thạch được bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm mô sẹo. Khi môi
trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây
hoàn chỉnh.
2.2.3.4

Nuôi cấy tế bào trần – chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức

sống và duy trì chức năng sẵn có. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có
khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp
với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép tạo giống cây trồng mới. Quá trình
dung hợp có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài.
2.2.4

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy

2.2.4.1

Ảnh hưởng của mẫu cấy lên khả năng phát sinh hình thái của cây[11]
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng và phát triển in vitro. Những ảnh hưởng có thể được tóm tắt như sau:
Kiểu gen
Khả năng tái sinh trong giới thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm
thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó
tái sinh (trừ khi chúng còn non). Trong số các cây hai lá mầm: Solanaceae,
16


Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Crucferae là những loài dễ tái sinh nhất.
Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên (các giống lai
Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in
vitro. Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe
farinaceae hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có

thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều
hòa sinh trưởng.
Tuổi của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao, do đó ở Ngũ cốc người ta
thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng tái sinh
của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây con dễ tái sinh hơn như trong
trường hợp cây bụi. Một vài ví dụ cụ thể chỉ sự khác nhau về khả năng tái sinh và
phân chia tế bào giữa cây già và cây in vitro: Hedera helix, Lunaria annua và
Anthurium andreanum. Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì
chúng vẫn giữ được những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều
kiện ban đầu. Đôi khi qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được
trẻ hóa do gia tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được Hackett
(1985) chứng minh trên những đối tượng như: Pinus vinifera, Malus sylvestris,
Cryptomeria japonoca. Sự hình thành chồi bất định là một trong những phương
pháp giúp trẻ hóa.
Tình trạng sinh lý
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế
bào in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái
sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây Huệ tây ở giai đoạn
sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản. Các chồi của cây
trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của
những cây đã trải qua giai đoạn ngủ đông.
Tình trạng sức khỏe
Vào thời điểm tiến hành nuôi cấy in vitro, nếu sử dụng các bộ phận của
cây trong tình trạng khỏe mạnh thì khả năng nuôi cấy thành công cao hơn. Do đó,
nên chọn mẫu từ những cây khỏe mạnh và sinh trưởng bình thường nhất làm thí

17

nghiệm vì điều này ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm và khả năng tái sinh của mẫu sau khi
được tách khỏi cây mẹ.
Điều kiện phát triển
Các mẫu cấy từ nguồn mẫu trong tự nhiên phản ứng khác với các mẫu
cấy từ nguồn mẫu trong nhà kính. Nhìn chung, những mẫu cấy ban đầu có nguồn
gốc từ nhà kính thường ít bị bệnh, dễ tái sinh hơn vật liệu bên ngoài ví dụ như cây
Rhododendron. Điều kiện phát triển của những cây nở hoa vào mùa đông như
Begonia có ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành chồi và rễ bất định trong nuôi cấy in
vitro.
Vị trí của mẫu cấy trên cây
Các mẫu cấy được lấy từ thân chính hoặc các chồi bên ở một số cây thân
gỗ sẽ giữ nguyên đặc tính di truyền này đối với cây con nuôi cấy mô nghĩa là đối
với các mẫu lấy từ thân chính thì cây cấy mô sẽ phát triển thành cây trưởng thành và
tạo nhiều cành ngang, ngược lại nếu mẫu cấy được lấy từ các cành ngang thì cây
cấy mô cũng chỉ phát triển ở dạng cành ngang, không tạo được thân chính như cây
gieo hạt. Sự bảo lưu đặc điểm di truyền này thể hiện rất rõ ở các cây giâm cành.
Hiện tượng bảo lưu di truyền ở cây Pseudotsuga menziesii đã được nghiên cứu,
những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi
trường in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành
chồi bất định của các mẫu cấy lan Dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành
tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily. Điều đáng lưu ý là
những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của
cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.
Kích thước mẫu cấy
Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để
tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi
cây tự nó cung cấp dự trữ chất dinh dưỡng và hormon, do đó mẫu cấy có kích thước
càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh
dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn
những cơ quan ít dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, tỷ lệ bề mặt dễ bị tổn thương

cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh
của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk chứng minh vào năm 1984.
18