PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

52(4): 89 - 93 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009

1

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
(Glycine max (L.) Merill) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN

Nguyễn Thị Thuý Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu (Đại học Thái Nguyên)
Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (Viện Công nghệ Sinh học)


Tóm tắt

Hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 đã được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro từ đốt lá
mầm. Hạt đậu tương sau khi thu hoạch được nuôi cấy trên môi trường GM: 3052mg/l muối B
5
; 10ml MS IV;
30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,8; 6,5g/l agar, vitamin B
5
1X. Sau 3 ngày hạt nảy mầm có màu xanh cắt
bỏ phần trụ rễ, tách đôi lá mầm thành hai mẫu riêng biệt cấy chuyển sang môi trường tạo cảm ứng chồi (môi
trường SIM): 3052mg/l muối B
5
; 10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6; 6,5g/l agar, vitamin B
5

1X; BAP (1mg/l, 1,5mg/l, 1,67mg/l).
Sau 4 tuần cấy chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi (môi trường SEM): 3052mg/l muối B
5
;
10ml MS IV; 30g/l sucrose; 0,6369 g/l MES, pH 5,6, 6,5g/l agar; GA

3
0,5ml/l (stock 1), zeatin riboside (ZR):
1mg/l, L – asparagine: 50mg/l, L- pyro glutamic acid: 100mg/l; vitamin B
5
1X, IAA: 0,1mg/l. Khi các chồi
dài 5 – 7cm tách riêng từng chồi cấy chuyển sang môi trường ra rễ (môi trường RM): 1,58g/l MS; 20g/l
sucrose; 0,58g/l MES; 1mg/l IBA, pH 5,6; agar: 6,5g/l, vitamin B
5
1X. Khi cây có rễ hoàn chỉnh (lá xanh và
bộ rễ phát triển) được ra bầu và đưa ra trồng ở nhà lưới. Trong quá trình nghiên cứu hệ thống tái sinh cây in
vitro từ đốt lá mầm của hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84, đã cho thấy cả hai giống đều có khả năng tạo đa
chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Khi tạo cảm ứng đa chồi thì nồng độ BAP thích hợp là 1mg/l và khi gây tổn
thương có khả năng tạo đa chồi cao.
Từ khóa: Đa chồi, đậu tương, Glycine max, in vitro, đốt lá mầm, hệ thống tái sinh.

I. MỞ ĐẦU
Cây đậu tương là cây công nghiệp ngắn ngày
có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao. Hạt đậu tương
chứa 40-50% protein, 18-25% lipit, 36-40%
hydratcacbon và các loại axit amin cần thiết cho
cơ thể con người như: xitstein, lizin, triptophan,
lơxin, metionin. Ngoài ra trong hạt đậu tương còn
chứa nhiều loại vitamin cần thiết cho cơ thể người
và động vật.
Tạo giống đậu tương mới có năng suất cao,
kháng bệnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất
lợi luôn được các nhà tạo giống quan tâm. Bên
cạnh các phương pháp truyền thống đã và đang
được sử dụng, phương pháp tạo giống mới bằng kỹ
thuật gen di truyền cũng đang là phương pháp

mang lại hiệu quả cao trong công tác tạo giống đậu
tương với các tính trạng mong muốn (Krishnan,
2005) [2]. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương
đã được thực hiện nhờ vi khuẩn Agrobacterium với
Ti-plasmid qua đốt lá mầm (Chee và cs, 1989;
Donaldson and Simmonds, 2000) [1], [6] hoặc phôi
xoma (Yoichi Kita, 2007) [8]... và cho đến nay
theo thống kê của USDA, diện tích trồng cây đậu
tương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ chiếm 81%
ở Mỹ; 99,1% ở Argentina và 34% ở Brazil
(Letster, 2004) [3]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, tạo
giống đậu tương mới bằng kỹ thuật chuyển gen
mới chỉ bắt đầu được quan tâm nghiên cứu.
Đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực
hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô
sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây. Tái sinh in vitro
ở cây đậu tương có thể được thực hiện từ phôi
xoma, phôi non và đốt lá mầm [1], [6], [8]. Kỹ
thuật tái sinh từ đốt lá mầm có ưu điểm về khả
năng tái sinh và cho ra chồi cao, thời gian từ khi
bắt đầu cho đến khi ra cây được rút ngắn đáng kể
còn khoảng 3 tháng (Olhoft và cs, 2003) [5].
Thành công của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực
vật phụ thuộc nhiều vào sự lựa chọn môi trường
dinh dưỡng, tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng và
52(4): 82 - 88 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009
2

các yếu tố khác. Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh
trưởng tối ưu ở các loài và giữa các bộ phận cơ thể

không giống nhau (Murashige và Skoog, 1962; Vũ
Văn Vụ, 1999) [4], [7]. Môi trường dinh dưỡng cơ
bản bao gồm muối vô cơ (NO
-
3
, NH
4
+
....), nguồn cac
bon (đường sacarose, mantose, glucose, galactose...),
vitamin (B
1
, B
5
...), và các chất điều hoà sinh trưởng.
Ngoài ra, người ta có thể bổ sung các thành phần
khác như hợp chất nitơ hữu cơ, axit hữu cơ và dịch
chiết từ thực vật tuỳ theo mục đích nuôi cấy.
II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
1.Nguyên liệu
Hai giống đậu tương ĐT12 và ĐT84 do Trung
tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện Khoa
học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, hai giống
này có thể trồng 3 vụ trong năm, có nhiều ưu điểm,
thời gian sinh trưởng ngắn, độ thuần khá, năng suất
đạt 2-2,3 tấn/ha, có thể trồng đại trà.
Nuôi cấy in vitro được thực hiện trong điều
kiện dưới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấy
với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24
giờ, nhiệt độ phòng nuôi 25

0
C ± 1
0
C.
2.Phƣơng pháp nghiên cứu
Tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro : hạt của các
giống đậu tương thu nhập được gieo trồng . Theo
dõi thời gian sinh trưởng, ra hoa kết quả của các
giống, khi hạt chín thu cắt quả chín (qua các thí
nghiệm chúng tôi nhận thấy các hạt khi vừa đến lúc
thu hoạch làm thí nghiệm cho tỷ lệ nảy mầm là
100%).
Khử trùng hạt: Bóc vỏ, chọn những hạt to, mẩy
không bị nứt vỏ đem tráng nước vô trùng hai lần
sau đó rửa cồn trong vòng 1 phút, làm lại hai lần,
sau đó tráng sạch hạt bằng nước vô trùng, lắc hạt
với dung dịch Javen trong vòng 20 phút, đảo, lắc
thật đều, tráng sạch hạt bằng nước vô trùng nhiều
lần (thí nghiệm với nồng độ cồn và Javen khác
nhau, thời gian khử trùng khác nhau).
Môi trường nảy mầm hạt (GM): Ngâm hạt trong
nước cất 2 giờ sau đó cấy vào bình tam giác trong
môi trường GM : Muối B5 + 30g/l sucrose + 6,5g/l
aga, PH = 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm hạt sau
0, 1, 2, 3, 4, 5 ngày. Sau thời gian khoảng 2-3 ngày
khi hạt đã nảy mầm chuyển sang mầu xanh theo
dõi tỷ lệ nảy mầm.
Môi trường cảm ứng tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy
mầm dùng dao giải phẫu cắt bỏ phần lớn trụ rễ,
chừa lại khoảng 3-5 mm cách từ nốt lá mầm xuống,

tách đôi lá mầm thành hai mẫu cấy riêng biệt, cắt
bỏ phần lá mầm, theo dõi tạo đa chồi qua quá trình
không gây thương tổn, gây thương tổn bằng dao và
gây thương tổn bằng đầu điện. Các mảnh cấy được
cấy lên môi trường cảm ứng chồi (SIM) với các
nồng độ BAP khác nhau (Bảng 1). Làm thí nghiệm
với cấy mầm trên bề mặt môi trường SIM và thí
nghiệm cấy nghiêng 45
0
C trong môi trường SIM.
Nuôi dưới đèn neon trong phòng nuôi cấy với
cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ,
nhiệt độ phòng nuôi là 25
0
C ± 1
0
C. Đánh giá tỷ lệ
nảy chồi/ mảnh cấy và số chồi/ 1 mảnh cấy.
Môi trường cảm ứng kéo dài chồi: Sau 4 tuần
chuyển sang môi trường kéo dài chồi (SEM)
(Bảng 1). MS: 4,3 g/l; 3052mg/l muối B5, 10ml/l
MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES, pH5,6;
6,5g/l agar + GA
3 :
0,5 ml/l ( stock 1); Zeatin
riboside (ZR) :1mg/l L-asparagine : 50mg/l; L-
pyroglutamic acid : 100mg/l ; IAA : 0,1 mg/l;
Vitamin B5: 1X.
Môi trường ra rễ: Sau khi các chồi có kích thước
khoảng 5 – 7cm thì chuyển sang môi trường ra rễ

(RM) gồm có: 1,58g/l : MS; 20g/l sucrose; 0,59g/l
MES; 1mg/l: IBA; pH = 5,6; agar: 6,5 g/l +
Vitamin B5 : 1X.
Tái sinh cây hoàn chỉnh: Cây tái sinh hoàn chỉnh
được ra bầu và đưa ra trồng ở nhà lưới.






52(4): 82 - 88 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009
3

Bảng 1. Thành phần các môi trường nuôi cấy dùng cho tái sinh cây từ đốt lá mầm
Loại môi trường Ký hiệu Thành phần cơ bản
Cảm ứng tạo chồi GM
3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, pH5.8; 6,5g/l agar
+ vitamin B5 1X



Cảm ứng tạo đa chồi
SIM 1
3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES,
pH5.6; 6,5g/l agar + 1mg/l BAP + vitamin B5 1X
SIM 1,5
3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES,
pH5.6; 6,5g/l agar + 1,5 mg/l BAP + vitamin B5
SIM 1,67

3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369 g/l MES,
pH5.6; 6,5g/l agar + 1,67mg/l BAP + vitamin B5 1X
Cảm ứng kéo dài chồi SEM
MS:4,3 g/l; 3052mg/l muối B5, 10ml/l MSIV, 30g/l sucrose, 0,6369
g/l MES, pH5.6; 6,5g/l agar + GA
3 :
0,5 ml/l ( stock 1); Zeatin
riboside (ZR) :1mg/l L-asparagine : 50mg/l; L-pyroglutamic acid :
100mg/l ; IAA : 0,1 mg/l; vitamin B5: 1X
Cảm ứng ra rễ RM
1,58g/l : MS; 20g/l succro; 0,59g/l MES; IBA(1mg/l, 1,5mg/l,
2mg/l); pH = 5,6; agar: 6,5 g/l + vitamin B5 : 1X
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn và javen đến khả
năng khử trùng hạt đậu tƣơng
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với cồn trong
thời gian một phút và javen trong thời gian 20 phút
với các nồng độ của cồn và javen đều là: 50%,
60%, 70%, 80%. Kết quả nghiên cứu chúng tôi
thấy cồn ở nồng độ 70% và giaven với nồng độ
60% thích hợp nhất cho khử trùng hạt đậu tương,
vừa đảm bảo tỷ lệ nảy mầm cao (98% – 100%) và tỷ
lệ nhiễm thấp. Trong thực tế hạt đậu tương là đối
tượng rất khó khử trùng, nếu khử trùng bằng cồn và
nước javen với nồng độ quá cao và thời gian quá dài
thì hạt bị tổn thương và không nảy mầm được.
Ngược lại, nếu nồng độ cồn và javen quá thấp và
thời gian ngắn thì không đủ khử nhiễm nên tỷ lệ
nhiễm cao sau khi cấy.
2. Môi trƣờng nảy mầm của hạt

Hạt đã khử trùng ngâm trong nước cất hai tiếng
sau đó cấy trên môi trường GM. Ở giai đoạn nảy
mầm, hạt chủ yếu sử dụng chất dinh dưỡng có sẵn
trong hạt nên môi trường chỉ cần cung cấp những
chất cơ bản và chưa cần cung cấp nhóm kích thích
sinh trưởng. Ở cả hai giống ĐT12 và ĐT84 đều sau
1 ngày hạt bắt đầu nứt vỏ và sau 3 ngày hạt nảy
mầm hoàn chỉnh và bắt đầu chuyển sang màu xanh,
tỷ lệ nảy mầm đạt 98% – 100%.
3. Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi
Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo
cảm ứng chồi
Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan
trọng trong quá trình phát triển chồi từ nách lá
mầm. Môi trường cảm ứng tạo chồi ở đa số các loài
thực vật cần sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng
thuộc nhóm auxin và xytokinin như IAA, IBA,
BAP...Trong đó BAP thuộc nhóm kích thích sinh
trưởng xytokinin được sử dụng phổ biến để tạo
cảm ứng chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau. Vì
việc sử dụng nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng
thích hợp có ý nghĩa
quan trọng đối với từng giai đoạn phát triển của
cây. Đây là nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế
bào (Vũ Văn Vụ, 1999) [7].
Khả năng tạo cảm ứng chồi và số lượng chồi/
một mảnh lá mầm là những thông số dùng để đánh
giá tính thích ứng của giống trong hệ thống nuôi
cấy in vitro nhằm sử dụng cho mục đích chuyển
gen sau này. Kết quả ở bảng 2 cho thấy khả năng

tạo cảm ứng chồi và số lượng chồi/ 1 mảnh lá mầm
nuôi cấy ở các nồng độ BAP khác nhau trên 2
giống đậu tương ĐT12 và ĐT84.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cả hai giống có
khả năng tạo cảm ứng chồi ở môi trường có bổ
sung 1,5mg/l BAP với tỷ lệ tạo chồi như sau:

giống ĐT12 sau 2 tuần tỷ lệ tạo chồi đạt 89,5%,
sau 4 tuần tỷ lệ tạo chồi đạt 91,2% và số chồi TB/ 1
mảnh lá mầm là 1,8. Giống ĐT84 sau 2 tuần tỷ lệ
52(4): 82 - 88 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009
4

tạo chồi đạt 91,6%, sau 4 tuần tỷ lệ tạo chồi đạt
92,1%, số chồi trung bình trên một mảnh lá mầm là
1,9.








Hình 1. Hạt giống ĐT12 nuôi cấy trên môi trường GM sau 3 ngày

Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tạo cảm ứng chồi
Giống đậu
tương
Nồng độ BAP

(mg/l)
Mẫu TN
Số mảnh cấy
Tỷ lệ tạo chồi
sau 2 tuần
Tỷ lệ tạo chồi
sau 4 tuần
Số chồi TB/ 1
mảnh lá
Chất lượng
chồi

ĐT12
1.0 100 17,5 19,8 1,1 -
1.5 100 89,5 91,2 2,3 +
1.67 100 35,7 30,5 1,2 -

ĐT84
1.0 100 19,7 18,6 1,2 -
1.5 100 91,6 92,1 2,2 +
1.67 100 27,9 23,8 1,3 -
Ghi chú: Chất lượng chồi: (-) : Chồi yếu, có màu vàng hoặc trắng; (+): Chồi khỏe, có màu xanh



A B
Hình 2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo cảm ứng chồi (A: Giống ĐT12, B: Giống ĐT84)

Sau 1 tuần Sau 2 tuần Sau 4 tuần
Hình 3. Hình ảnh giống ĐT12 sau 1 tuần, 2 tuần, 4 tuần nuôi cấy trên môi trường SIM

52(4): 82 - 88 Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 4 - 2009
5

Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả
năng tạo cảm ứng chồi
Sau khi hạt đậu tương nảy mầm 3 – 5 ngày cắt
bỏ trụ rễ để lại 3- 5mm, tách đôi lá mầm thành 2
mẫu cấy riêng biệt. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm
cấy các mẫu mảnh lá mầm không gây thương tổn
và gây thương tổn bằng dao giải phẫu, kết quả
nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.
Gây thương tổn là một trong những tác động
tạo chồi. Kết quả ở bảng 3 cho thấy khi không gây
thương tổn từ lá mầm thường chỉ phát triển một
chồi, nhưng khi gây thương tổn bằng dao giải phẫu
thì số chồi tạo thành tăng lên rõ rệt (2 – 4 chồi)/ 1
mảnh lá mầm. Như vậy, tỷ lệ tạo đa chồi khi gây
thương tổn bằng dao giải phẫu lớn gấp 2 lần so với
những mẫu thí nghịêm không gây thương tổn. Và ở
cả hai giống đậu tương có sự chênh lệch không đáng
kể dưới ảnh hưởng của tác động gây thương tổn.

Bảng 3. Ảnh hưởng của tác động gây thương tổn đến khả năng tạo chồi
Giống ĐT12 ĐT84

Số chồi/ mẫu 1 2 3 4 Số chồi TB/
mẫu
1 2 3 4 Số chồi TB/ Mẫu
Không thương tổn
(200 mẫu)
188 12 0 0 1,06 192 8 0 0 1,04
Thương tổn
(200 mẫu)
6 145 30 19 2,31 11 153 28 8 2,18






A B C D E F
Hình 4. Các mẫu ĐT84 sau khi gây thương tổn tạo chồi (A, B, C, D, E) và không gây thương tổn (F)

Khả năng kéo dài chồi của hai giống đậu tương
ĐT12 và ĐT 84
Sau khoảng thời gian 2 tuần khi chồi được hình
thành cấy chuyển sang môi trường SEM có bổ sung
các chất dinh dưỡng khác nhau tạo thuận lợi cho sự
phát triển của chồi và chuẩn bị cho cây ra rễ.
Trong đó có bổ sung hai chất kích thích sinh trưởng
đó là GA
3
và IAA, trong đó IAA thuộc nhóm kích
thích sinh trưởng auxin và là dạng auxin chủ yếu và
quan trọng nhất của tất cả các thực vật kể cả thực

vật bậc thấp và thực vật bậc cao. Còn GA
3
thuộc
nhóm kích thích sinh trưởng gibberellin, hiệu quả
sinh lý rõ nhất của GA
3
là kích thích mạnh mẽ sự
sinh trưởng kéo dài của thân do GA
3
kích thích lên
pha giãn của tế bào theo chiều dọc. Chính vì vậy nó
có tác dụng kéo dài chồi (Vũ Văn Vụ, 1999) [7].

Kết quả sau 3 tuần cả hai giống ĐT12 và ĐT84
đều cho chồi có kích thước đạt 5 – 7cm.
Khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh
Trong môi trường ra rễ chúng tôi có bổ sung IAB
với các nồng độ 1mg/l, 1,5mg/l, 2mg/l. IBA thuộc
nhóm kích thích sinh trưởng auxin có khả năng kích
thích rễ phát triển. Tuy nhiên khi sử dụng IAB trong
giai đoạn sinh trưởng của rễ thì cần nồng độ IAB
thấp, nếu dùng nhiều có khả năng gây ức chế.
Kết quả nghiên cứu cho thấy IBA ở nồng độ
1mg/l thích hợp cho sự ra rễ của cả hai giống đậu
tương. Giống đậu tương ĐT12 tỷ lệ ra rễ đạt 98%,
tỷ lệ ra rễ của giống ĐT84 đạt 97%. Nồng độ IBA
không tỷ lệ thuận với tỷ lệ ra rễ vì khi nồng độ IBA
tăng thì khả năng ra rễ lại giảm.