Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Sản Xuất Chao Bằng Bacillus Subtilis

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG
*********

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ
TRÌNH SẢN XUẤT CHAO BẰNG BACILLUS SUBTILIS

Giảng viên hướng dẫn: Ths. BÙI ANH VÕ

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2009


TÓM TẮT
Chao là một thực phẩm được sản xuất từ đậu hũ. Ở Việt Nam, chao là một thực
phẩm rất quen thuộc. Chao không những giúp ta ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa mà còn là
một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng. Quy trình sản xuất chao đang sử dụng phổ biến
hiện nay có thời gian sản xuất một đợt sản phẩm là từ 4-6 tháng, thời gian này kéo dài
do đặc điểm của hệ enzyme của nấm mốc. Bằng cách thay thế vai trò của nấm mốc
bằng vi khuẩn Bacillus subtilis ta có khả năng rút ngắn thời gian và chi phí sản xuất,
vì thế tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của B.
subtilis trong giai đoạn cấy giống và ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự thay đổi cấu
trúc của đậu hủ trong giai đoạn làm chín, nhằm cung cấp thông tin xây dựng một quy
trình sản xuất chao bằng B. subtilis.
Những kết quả đạt được:
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự sinh trưởng và hoạt tính
enzyme proteae của Bacillus subtilis. Dựa vào kết quả mật độ vi khuẩn và hoạt tính
enzyme protease của các mẫu đậu hủ (có pH từ 6 - 9) đã cấy giống và được ủ ở nhiệt
độ không đổi (từ nhiệt độ phòng đến 51oC) trong 3 ngày ta xác định được pH của đậu
hủ thích hợp sản xuất là tử 6-7 và nhiệt độ thích hợp sản xuất là nhiệt độ phòng

(khoảng 30oC)
- Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch ngâm đến thời gian làm chín chao. Dựa
vào kết quả quan sát những thay đổi về cấu trúc và đánh giá cảm quan của mẫu đậu hủ
ngâm trong dung dịch muối có nồng độ từ 2 tới 11% ta xác định được mẫu nhâm trong
dung dịch muối nồng độ 5% có thời gian ủ ngắn nhất là 18-23 ngày (nhỏ so với thời
gian phổ biến là 4-6 tháng)
- Xác định thời gian bảo quản của thành phẩm. Dựa vào giá trị pH và đánh giá
cảm quan của các mẫu chao được đặt ở nhiệt độ phòng ta xác định được thời gian mẫu
chao bị biến chất không thể sử dụng là 22 ngày.

iii


MỤC LỤC
CHƯƠNG
Trạng tựa

TRANG

Lời cảm tạ .............................................................................................................. i
Tóm tắt .................................................................................................................. ii
Mục lục ................................................................................................................. iii
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... v
Danh sách các hình ................................................................................................ vi
Danh sách các bảng ............................................................................................... vii
1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................. 1
1.2. Mục đích ............................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu................................................................................................. 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3

2.1. Giới thiệu vể chao ................................................................................. 3
2.1.1. Phân loại.................................................................................. 3
2.1.2. Thành phần hóa học................................................................. 5
2.1.3. Hệ vi sinh vật........................................................................... 5
2.2. Phương pháp sản xuất chao ................................................................... 7
2.2.1. Nguyên liệu ............................................................................. 7
2.2.2. Quy trình sản xuất đậu hủ ........................................................ 10
2.2.3. Quy trình sản xuất chao ........................................................... 14
2.3. Vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 18
2.3.1. Phân loại.................................................................................. 18
2.3.2. Đặc điểm ................................................................................. 18
2.4. Enzyme Protease .................................................................................. 20
2.4.1. Phân loại.................................................................................. 20
2.4.2. Protease từ vi khuẩn B. subtilis ................................................ 20
2.4.3 Ứng dụng của subtilisin từ vi khuẩn B. subtilis ........................ 22

iv


3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................................... 23
3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................ 23
3.2. Vật liệu ................................................................................................ 23
3.3. Phương pháp ........................................................................................ 27
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................. 36
4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự tăng trưởng của B. subtilis ....... 36
4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính protease của B. subtilis ... 40
4.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch muối lên thời gian làm chín chao .... 42
4.4. Kiểm nghiệm vi sinh mẫu chao ............................................................. 45
4.5. Xác định thời gian bảo quản của chao ................................................... 46
.....................................................................................................................

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 47
5.1. Kết luận................................................................................................. 47
5.2. Kiến nghị .............................................................................................. 47

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis

Bacillus subtilis

E. coli

Escherichia coli

CFU

Colony Forming Unit

CDU

Casein Digestion Unit

CDU/ml

đơn vị đo hoạt tính enzyme protease

mg

miligram

tphòng

nhiệt độ phòng (khoảng 30oC)

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của chao .................................................................. 5
Bảng 2.2. Thành phần hóa học của hạt đậu nành ................................................. 7
Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong đậu nành.................................................. 8
Bảng 2.4. Thành phần hydrat cacbon trong đậu nành........................................... 8
Bảng 2.5. Thành phần chất khoáng trong hạt đậu nành........................................ 9
Bảng 2.6. Thành phần vitamin trong hạt đậu nành............................................... 9
Bảng 3.1. Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển . 27
của B. subtilis trên môi trường đậu hũ
Bảng 3.2. Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển ...... 31
của B. subtilis trên môi trường đậu hũ
Bảng 3.3. Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung dịch muối đến 32
thời gian làm chín chao
Bảng 3.4. Các nghiệm thức thời gian bảo quản chao ....................................... 35
Bảng 4.1. Số lượng khuẩn lạc đếm được thí nghiệm 1..................................... 36
Bảng 4.2. Giá trị mật độ vi khuẩn (CFU/ml) thí nghiệm 1 ............................... 37
Bảng 4.3. Số lượng khuẩn lạc đếm được thí nghiệm 2..................................... 38
Bảng 4.4. Giá trị mật độ vi khuẩn (CFU/ml) thí nghiệm 2 ............................... 39
Bảng 4.5. Độ hấp thụ quang của dung dịch thử thật ở 275nm.......................... 40
Bảng 4.7. Thời gian làm chín chao(ngày)........................................................ 41

Bảng 4.8. Số lượng khuẩn lạc đếm được thí nghiệm 3..................................... 45
Bảng 4.9. Giá trị mật độ vi khuẩn (CFU/ml) thí nghiệm 3 ............................... 45
Bảng 4.10. Thời gian bảo quản chao(ngày) ..................................................... 46

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 1: Chao đỏ .................................................................................................. 4
Hình 2: Chao trắng .............................................................................................. 4
Hình 3: Chao nâu ................................................................................................ 4
Hình 4: Cọng mang bọc bào tử với 1 bọc bào tử nấm Mucor ............................... 6
Hình 5: B. subtilis nhuộm gram ......................................................................... 19
Hình 6: Đậu hủ 2 ngày say khi cấy giống ......................................................... 41
Hình 7: Đậu hủ 7 ngày say khi cấy giống .......................................................... 41
Hình 8 và 9: Chao sau 20 ngày làm chín ........................................................... 44

viii


Chương 1: Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề
Chao là một sản phẩm được sản xuất từ đậu hũ. Ở Việt Nam, chao là một thực
phẩm rất quen thuộc. Chao thường được sử dụng trong ăn chay và đánh nhuyễn thành
nước chấm dùng trong một số món nướng... Chao không những giúp ta ăn ngon
miệng, dễ tiêu hóa mà còn là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng vì thành phần chính
là các acid amin, peptit, các este chất béo…Đặc biệt chao là nguồn cung cấp vitamin
B12 quan trọng cho những người ăn chay hòan toàn không ăn thực phẩm có nguồn gốc
từ động vật.

Các quy trình sản xuất chao phổ biến hiện nay sử dụng giống vi sinh vật là nấm
mốc. Nấm mốc có hoạt tính enzyme ngoại bào không cao do phần lớn enzyme được
liên kết với màng của sợi nấm, để giải phóng các enzyme này cần có các phân tử muối
trong dung dịch ngâm làm yếu các liên kết giữa enzyme và màng sợi nấm. Mà nồng độ
muối của dung dịch ngâm có ảnh hưởng lớn đến quá trình thay đổi cấu trúc và quá
trình thủy phân phân lipid và protein của đậu hũ.
Nồng độ muối càng cao thì độ cứng và độ đàn hồi của đậu hũ càng cao (BeiZhong Han,2003) do đó thời gian làm chín càng dài, chi phí dùng trong sản xuất cũng
tăng lên. Nồng độ muối còn ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Nồng độ muối quá
cao (>14%) thì hoạt tính enzyme bắt đầu giảm làm tăng thời gian thực hiện quá trình
thùy phân lipid và protein. Do đó để giảm thời gian sản xuất nồng độ muối càng thấp
càng tốt. Nhưng nồng độ muối thấp (<8%) thì quá trình thủy phân xảy ra không đồng
đều và gây ra vị đắng cho chao. Nồng độ muối quá thấp (<5%) thì vi sinh vật có hại sẽ
phát triển và làm chao có vị chua và mùi hôi không tạo ra sản phẩm.
Hai vấn đề trên xảy ra là do vi sinh vật hiện được sử dụng trong quá trình sản
xuất chao là các họ nấm mốc. Phần lớn enzyme của nấm mốc liên kết với màng của
sợi nấm cần có các phân tử muối làm yếu liên kết và giải phóng vào trong dung dịch
hơn nửa nấm mốc không có khả năng phát triển trong môi trường muối nên các vi sinh
vật gây hại không bị cạnh tranh sinh trưởng.
Do đó có thể nói thởi gian làm chín kéo dài là do đặc điểm của hệ enzyme nấm
mốc. Bằng cách sử dụng B. subtilis thay thế vai trò nấm mốc ta có thể rút ngắn thời
gian sản xuất do B. subtilis là vi sinh vật có các đặc điểm như không có khả năng sinh
1


độc tố cho người, trong điều kiện khống chế tốt quá trình lên men sẽ không sinh ra mùi
hôi và vị lạ, hoạt tính protease ngoại bào mạnh (L. Korsten1, 2008).

1.2. Mục đích
Do có sự khác nhau về đặc điểm sinh trưởng và phát triển nên quy trình sản
xuất chao bằng B. subtilis. có nhiều thay đổi đặc biệt là ở giai đoạn cấy giống. Hai yếu

tố được xem xét ở đây là nhiệt độ và pH, chúng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của
vi sinh vật đồng thời dễ dàng điều khiển.
Kiểm chứng giả thuyết về khả năng sử dụng dung dịch muối nồng độ thấp trong
sản xuất (Bei-Zhong Han,2003) bằng cách làm một số mẫu chao bằng phương pháp
thủ công. Nếu có thể cho ra thành phẩm thì xác định thời gian bảo quản của chao.
Trên cơ sở kết quả thu được xác định khả năng sản xuất thực tế và những thay
đổi cần thiết để gia tăng quy mô sản xuất.

1.3. Yêu cầu
- Xác định nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của B.subtilis trên môi trường đậu
hũ.
- Xác định pH tối ưu cho sự phát triển của B.subtilis trên môi trường đậu hũ.
- Xác định nồng độ dung dịch muối có thể sử dụng để làm chín chao.
- Đánh giá độ an toàn vệ sinh thực phẩm.
- Xác định thời gian bảo quản của thành phẩm.

2


Chương 2: Tổng quan tài liệu
2.1. Giới thiệu về chao
Chao là một sản phẩm được sản xuất từ đậu hũ. Ở Việt Nam, chao là một thực
phẩm rất quen thuộc. Chao thường được sử dụng trong ăn chay và đánh nhuyễn thành
nước chấm dùng trong một số món nướng... Chao không những giúp ta ăn ngon
miệng, dễ tiêu hóa mà còn là một thực phẩm bổ, giàu dinh dưỡng vì thành phần chính
là các acid amin, peptit, các este chất béo…Đặc biệt chao là nguồn cung cấp vitamin
B12 quan trọng cho những người ăn chay hòan toàn không ăn thực phẩm có nguồn gốc
từ động vật.

2.1.1. Phân loại

Do đã có lịch sử tồn tại lâu đời, chao ngày càng phổ biến và lan rộng nên cũng
hình thành rất nhiều loại khác nhau.
Phân loại theo phương pháp chế biến:
- Lên men tự nhiên: sử dụng một hỗn hợp nấm mốc và vi khuẩn hoang dại, thực
hiện quá trình sản xuất ở điều kiện tự nhiên.
- Lên men bằng nấm mốc: sử dụng một số hoặc một giống nấm mốc thuần
chủng (Actinomucor elegans và Rhizopus oligosporus) có kiểm soát một số yếu tố như
độ ẩm, nhiệt độ, pH …
- Lên men bằng vi khuẩn: sử dụng một giống vi khuẩn thuần chủng (vi khuẩn
lactic, Bacillus ) có kiểm soát một số yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ, pH …
- Lên men bằng enzyme: thu nhận enzyme từ nấm mốc sau đó sử dụng trực tiếp
trên dậy hủ không cần cấy giống.
Dựa vào màu sắc của chao có thể chia làm 3 loại:
- Chao đỏ: Chao được ngâm trong rượu, có thêm gạo đỏ. Gạo đỏ được chế tạo
bằng cách lên men gạo trắng với hồng khúc (Monascus purpureus – có tác dụng giảm
lượng cholesterol trong máu), sau đó gạo đỏ được nghiền nát và cho vào nước ngâm.
Chao có hàm lượng glutamic acid và aspartic acid cao (30% tổng amino acid) tạo nên
mùi thơm đặc trưng.
- Chao trắng: là loại chao phổ biến nhất có hàm lượng muối ít nhất, nếu trong
dung dịch ngâm có rượu thì gọi là chao trắng lên men ngâm rượu ngược lại gọi là chao

3


ngâm nước muối. Trong dung dịch ngâm còn có gia vị (ớt. mè, ngũ vị hương …) để
tạo mùi vị khác nhau tùy theo tì lệ giữa các gia vị.
- Chao nâu: dung dịch ngâm có chứa whey đậu nành, hàm lượng cystine and
methionine thấp do sự phân hủy và tham gia tạo thành các hợp chất khác tạo nên mùi
hắc, nồng.
Ngoài ra còn có thể phân loại theo kích thước (lớn, nhỏ ,…), hình dạng (vuông ,

tròn …) và cấu trúc (chao nước, chao bánh, chao bột, …).

4


2.1.2. Thành phần hóa học
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của chao [Nguyễn Đức Lượng, 2008]
Các loại sản phẩm của chao
Thành phần

Chao nước
Phần cái (%)

Độ

73 – 75

Đạm toàn phần

2 – 2,9

Đạm formol

0,70 – 0,85

Đạm amoniac

0,3 – 0,4

Muối ăn

4,5 – 5

Chất béo

8 – 8,5

Độ chua

110,0 – 120

Chao bánh (%)

Phần nước (%)
65 – 70
12,5 – 13
7,5 – 7,8
2,5 – 3
6,0 – 6,2

2,3 – 2.6
0,8 – 0,9
0,3 – 0,4
6,0 – 6,5
9,0 – 10

Các axit amin không
thay thế (g/kg)

2,84 – 2,9

Lizin

3,3 – 3,5

Treonin

1,70 – 1,75

Valin

0,15 – 0,20

Tryptophan

1,55 – 1,60

Fenilalannin

1,55 – 1,6

Lơxin

1,80 – 1,90

5,3 – 5,5

2,8 – 2,9

0,4 – 0,45

1,5 – 1,6

2,5 – 2,7

0,8 – 0,9

2.1.3. Hệ vi sinh vật [5]
Vi sinh vật được sử dụng để làm chao chủ yếu là các loại nấm mốc thuộc họ
Mucoraceae. Những loài nấm thuộc họ này có những đặc tính chung là vỏ tế bào chứa
chitin, chitosan, nấm có túi bào tử lớn chứa cuống và bào tử tiếp hợp hiện diện hầu hết
các loài trong họ, Hesseltine và Ellis (1973) chia họ Mucoraceae thành 20 giống trong
đó chi Rhizopus và chi Mucor là quan trọng nhất.
- Chi Rhizopus: giống này có ít nhất 120 loài. Hầu hết những loài Rhizopus là
những loài sống hoại sinh, chúng phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài của cơ
chất (ví dụ như bánh mì), khuẩn ty của có màu trắng, phân nhánh, đa nhân và không
có vách ngăn ngang . Hầu hết các sợi khuẩn ty có dạng như sợi bông vải khi còn non ,

5


sau đó phát triển sâu vào cơ chất thì phân chia thành 3 dạng khuẩn ty : khuẩn căn,
khuẩn ngang và cọng mang túi bào tử.
- Chi Mucor: là nhóm nấm hoại sinh trên xác bã hữu cơ đặc biệt trong dạ dày
của ngựa và trâu bò (Mucor mucedo), nhiều loài phát tán trong đất như Mucor
racemosus và Mucor spinosus, nấm này cũng có mặt trên bánh mì củ, thịt, phó mát,
nước trái cây... nhiều loài gây ra bệnh mycormycosis trên người và gia súc; Tuy nhiên
nhiều loài nấm cũng có ích như Mucor rouxii phân hủy tinh bột thành đường; Đặc tính
phát triển của Mucor giống như Rhizopus, ví dụ như chúng phát triển khuẩn ty trên
bánh mì trong 24 giờ.

Đối với sản xuất bằng giống thuần chủng thì 2 giống thuộc chi Mucor là
Actinomucor elegant và Actinomucor taiwanecis được sử dụng phổ biến nhất.

Hình 4 Cọng mang bọc bào tử với 1 bọc bào tử nấm Mucor

Ngoài ra trong chao còn có sự hiện diện một số loài vi khuẩn. Những vi khuẩn
này có nguồn gốc chủ yếu từ đậu hũ dùng làm nguyên liệu như: E.coli, Bacillus
spp,…. Trong môi trường muối nồng độ >8%, các vi khuẩn Bacillus spp bị ức chế tồn
tại dưới dạng bào tử số lượng không có sự thay đổi nhiều theo thời gian ít có khả năng
gây ngộ độc hoặc hư hỏng chao. Các vi khuẩn thuộc nhóm lactic cũng bị ức chế sinh
trưởng nhưng số lượng tăng nhanh theo thời gian, là nguyên nhân chủ yếu gây hỏng
chao làm chao bị chua và có mùi hôi.

6


2.2. Quy trình sản xuất chao [1]
2.2.1. Nguyên liệu
Đậu nành là một loại hạt rất giàu protein. Đậu nành có nhiều màu sắc khác
nhau. Trong đó đậu nành màu vàng là loại tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều.
Hạt đậu nành gồm 3 bộ phận:
- Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt.
- Phôi chiếm 2%.
- Tử diệp chiếm 90%.
Bảng 2.2 : Thành phần hóa học của hạt đậu nành.
Thành phần

Tỷ lệ (%)

Protein (%)

Dầu (%)

Tro (%)

Hydratcacbon (%)

Hạt đậu

100

40,0

21,0

4,9

34,0

Tử diệp

90,3

43,0

13,0

5,0

29,0

Vỏ hạt

8

8,8

1,0

4,3

86,0

Phôi

2,4

41,1

11,0

4,4

43,0

Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ
lượng rất lớn. Thành phần axit amin trong protein của đậu nành ngoài methionin và
tryptophan còn có các axit amin khác với số lượng khá cao tương đương lượng axit
amin có trong thịt.
Trong protein đậu nành glubolin chiếm 85-95% ngoài ra còn có 1 lượng như

albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin.
Bảng 2.3 Thành phần axit amin trong đậu nành
Axit amin
Izolơxin
Lơxin
Lyzin
Methionin
Xystin
Phenilalanin
Treonin
Triptophan
Valin
Histidin

Hàm lượng (%)
1,1
7,7
5,9
1,6
1,3
5,0
4,3
1,3
5,4
2,6

7


Bảng 2.4 Thành phần hydrat cacbon trong đậu nành

Hydratcacbon

Hàm lượng (%)

Xenluloza

4,0

Hemixenluloza

15,4

Stachyoza

3,8

Rafinoaza

1,1

Sacaroza

5,0

Loại đường khác

5,1

Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành. Phần hydratcacbon có thể chia
làm hai loại: loại tan và không tan trong nước. Loại tan trong nước chỉ chiếm khoảng

10% tổng lượng hydratcacbon. Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khô
của hạt đậu nành. Trong đó đáng chú ý nhất là Ca, P, Mn, Zn và Fe. Ngoài ra, đậu
nành còn chứa rất nhiều vitamin khác nhau trừ vitamin C và D.
Bảng 2.5 Thành phần chất khoáng trong hạt đậu nành
Chất khoáng

Hàm lượng (%)

Ca

0,16 - 0,47

P

0,41 - 0,82

Mn

0,22 - 0,24

Zn

37 mg/kg

Fe

90 – 150 mg/kg

Bảng 2.6 Thành phần vitamin trong hạt đậu nành
Các vitamin

Thiamin
Riboflavin
Niaxin
Pirydoxin
Biotin
Axit tantothenic
Axit folic
Inoxiton
Vitamin A
Vitamin E
Vitamin K

Hàm lượng (mg/kg)
11,0 - 17,5
3,4 - 3,6
21,4 - 23,0
7,1 - 12,0
0,8
13,0 - 21,5
1,9
2300
0,18 - 2,43
1,4
1,9

8


Đậu nành là loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipit, gluxit, muối
khoáng và vitamin. Chính vì thế, đậu nành là 1 nguồn thực phẩm quan trọng và được

trồng rộng rãi ở Trung Quốc, Mỹ, Braxin. Ở Việt Nam, đậu nành được trồng nhiều ở
các tỉnh phía Bắc và Nam. Trong công nghiệp thực phẩm đậu nành được coi là một
nguyên liệu quan trọng, để sản xuất dầu thực vật và sản xuất các loại sản phẩm lên
men.
Trước khi sản xuất chao ta cần nguyên liệu là đậu hũ. Đậu hũ là một sản phẩm
được sản xuất từ đậu nành. Đậu hũ có nhiều dạng khác nhau , chính vì thế mà cũng có
tên gọi khác nhau, nhưng nói chung chia làm 3 loại: mềm, cứng và lụa. Trong đó đậu
hũ mềm được sản xuất nhiều ở nước ta. Trung Quốc sản xuất cả 3 loại, Nhật sản xuất
nhiều loại đậu hũ lụa.

2.2.2. Quy trình công nghệ sản xuất đậu hũ [1]
Quy trình công nghệ phương pháp xay ướt

9


Giải thích quy trình công nghệ.

2.2.2.1. Giai đoạn ngâm hạt
Trong phương pháp xay ướt, hạt đậu phải qua giai đoạn ngâm. Ngâm hạt nhằm
mục đích làm hạt đậu hút nước và trương lên. Khi đó các phân tử nước có tính lưỡng
cực sẽ tác động lên các phân tử protein, lipit, gluxit. Quá trình này xảy ra qua 2 giai
đoạn:
10


- Giai đoạn đầu xảy ra quá trình solvat hóa, ở giai đoạn này các liên kết trong
hạt đậu chưa bị phá vỡ.
- Giai đoạn 2 xảy ra khi các phân tử nước tiếp tục tác động và phá vỡ liên kết
các phân tửtrong hạt đậu và chuyển chúng sang trạng thái dịch thể keo linh động nằm

trong các tế bào hạt đậu.
Có 3 yếu tố ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình ngâm là thời gian ngâm, lượng
nước ngâm và nhiệt độ ngâm.
- Thời gian ngâm: nhiệt độ ngoài trời từ 15 – 25oC ngâm trong 5 – 6 giờ, nếu
nhiệt độ 25 -30oC thì ngâm trong 3-4 giờ. Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm
hạt đậu đạt 55 – 65% là tốt nhất.
- Nhiệt độ ngâm: nếu ngâm ở nhiệt độ cao, tốc độ trương của hạt nhanh nhưng
độ trương của hạt nhỏ. Nếu độ trương nhỏ thì các thành phần trong hạt đậu chỉ ở trạng
thái keo đông, không phải dịch thể keo do đó khó hòa tan. Nhiệt độ nước dùng để
ngâm đậu tốt nhất là từ 20 – 25oC.
- Lượng nước ngâm thường được sử dụng Đậu/Nước = 1/2,5 lượng nước ngâm
này sẽ giúp độ trương của hạt đậu đạt tương đối cao, độ chua thấp (khoảng 2,23 g axit
acetic / 100 g đậu) và sự hao tổn chất khô nhỏ (0,6 g/100 g đậu).

2.2.2.2. Xay
Xay là một quá trình cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipit và
gluxit … Nhờ có nước hòa tan các chất này và chuyển chúng sang dạng huyền phù.
Yếu tố quan trọng nhất trong giai đoạn này là lượng nước cần thiết cho vào trong khi
xay. Nếu ít nước thì việc hòa tan các chất sẽ kém và tạo ma sát mạnh gây nên hiện
tượng tăng nhiệt làm protein biến tính, do đó khả năng tan của protein sẽ kém đi. Nếu
quá nhiều nước sẽ làm tang lượng hòa tan các chất nhưng lại khó khăn trong các giai
đoạn chế biến sau.
Lượng nước dùng để xay bột tốt nhất nên theo tỷ lệ: Đậu/Nước = 1/6.
Trong khi xay phải cho nước chảy vào liên tục. trong quá trình xay, saponin sẽ
tạo bọt vì vậy phải cho chất phá bọt, chất phá bọt thường dùng với tỉ lệ 0,05% so với
lượng đậu từ máng dẫn vào.

2.2.2.3. Lọc
Sau khi xay ta có một dung dịch huyền phù gồm có dung dịch keo và những
chất rắn không tan trong nước.

11


Trong quá trình tách dung dịch keo khỏi các chất rắn xảy ra hiện tượng các chất
rắn sẽ giữ trên bề mặt nó những tiểu phần keo vì vậy phải dùng nước rửa lại phần bã.
Lượng nước rửa bã không nên quá nhiều. Trong giai đoạn lọc nên qua 2 bước: lọc tinh
và lọc thô. Sữa khi lọc tinh xong cần phải đạt tiêu chuẩn sau: Nồng độ sữa 0,4 –
0,5oBe; pH = 6 – 6,5; lượng nước sữa thu được từ 1 kg đậu là 9 lít.
Thành phần hóa học của dịch sữa: đạm tổng số 27 – 30 g/l; lipit 13 – 16 g/l;
gluxit 3,2 – 4,5 g/l; chất khô 4,5 – 5 g/l.
Sữa sau khi lọc xong thường có 15.000 – 20.000 vi khuẩn lactic/cm3. nếu để lau
sữa sẽ có phản ứng hóa học xảy ra như sau:
C6H12O6 = CH3COCHO + 2H2O
2 CH3COCHO + H2O = 2 CH3CHOHCOOH
Lượng axit lactic tạo thành sẽ làm thay đổi pH dịch sữa. Sự thay đổi pH sẽ làm
thay đổi căn bản tính chất protein. Khi pH dịch sữa tới gần điểm đẳng điện của protein
đậu nành thì khôi sữa sẽ đông vón lại gây khó khăn cho quá trình ép sau này. Do đó
sữa kể từ khi xay đến khi lọc xong không nên kéo dài quá 30 phút về mùa hè và 50
phút về mùa đông.
Bã lọc là phẩn rắn sau khi lọc có thành phần hóa học như sau: protein 3 – 4%;
lipit 1-2%; gluxit 5 – 6%; độ ẩm 80 – 90. Bã lọc là thức ăn gia súc rất tốt, dễ gây thối,
vì thế bã phải được sử dụng ngay.

2.2.2.4. Gia nhiệt, kết tủa
Dịch sữa sau khi lọc xong phải đem gia nhiệt ngay. Gia nhiệt nhằm phá vỡ
enzyme kháng trypxin và độc tố aflatoxin, diệt vi sinh vật, khử mùi tanh của đậu nành,
phá vỡ lớp solvat (lớp nước bao quanh) tạo điều kiện cho các phần tử sữa gần nhau
hơn và dễ keo tụ hơn.
Thời gian gia nhiệt càng nhanh càng tốt. Thời gian đun sôi 100 lít sữa trong 5 –
10 phút là tốt nhất, trong quá trình đun sôi khuấy đảo liên tục tránh cháy khét dung

dịch sữa.
Sau khi đun sữa phải kết tủa sữa ngay. Sự kết tủa protein có nhiều nguyên nhân
như do sự tác dụng của nhiệt, sự thay đổi pH về vùng đẳng điện, tác dụng của muối.
Trong quá trình kết tủa, ta đun sữa đến 95 – 100oC để gây biến tính nhiệt và
dùng tác dụng gây kết tủa protein. Tác nhân gây kết tủa có nhiều loại như nước chua
tự nhiên, CaCl2, CaSO4, axit axetic, axit lactic, clohydric,… Trong các loại kết tủa
12


trên, nước chua tự nhiên thích hợp nhất, nhưng đòi hỏi người công nhân phải có kinh
nghiệm nhiều.
Điều kiện kết tủa sữa như sau:
- Nhiệt độ sữa khi kết tủa > 95oC.
- pH của dịch sữa khi kết tủa >6.
- pH của nước chua 4 -4,5.
pH của nước chua có ý nghĩa rất lớn trong việc kết tủa, nếu pH cao thì lượng
nước chua phải sử dụng nhiều, nếp pH thấp thì hiệu suất thu hồi đạm thấp. Khi dịch
sữa đạt 95oC ta cho nước chua vào từ từ. Quá trình này được chia làm 3 giai đoạn.
Giai đoạn đầu nên dùng ½ lượng nước chua cần dùng sau 3 phút cho ½ lượng
nước chua còn lại. Thường lượng nước chua đem kết quả chiếm 20-22% lượng sữa cần
kết tủa.

2.2.2.5. Ép định hình bánh đậu và ngâm nước
Sau khi kết tủa và chắt bã nước trong, ta có óc đậu, hay hoa đậu. Đưa hoa đậu
vào khuôn ép. Nhiệt độ của hoa đậu đem ép tốt nhất là 70 – 80oC. Nếu nhiệt độ dưới
60oC thì hoa đậu sẽ không kết dính được, bánh đậu bở và không định hình được. Thời
gian ép thường là 10 phút.
Đối với phương pháp xay khô ta có một số công đoạn riêng như sau:
- Vo đậu và hong khô: phương pháp ngâm khô không qua giai đoạn ngâm, mà
chỉ vo cho sạch loại bỏ các chất như rơm, rác sạn, cát … Quá trình vo này cũng nhằm

làm cho hạt đậu ngấm một ít nước trở lại, sau đó hong khô ngoài không khí khoảng 30
phút. Sau khi hong khô vỏ đậu sẽ nhăn nheo. Sau đó đem hạt đậu đi nghiền.
Ta có thể nghiền bột đậu bằng nhiều loại máy nghiền khác nhau. Bột nghiền
xong phải có độ mịn qua rây có 64 lỗ/cm2. Bột nghiền xong phải sử dụng ngay không
để quá 1 giờ, vì trong quá trình nghiền nhiệt độ sẽ tăng và sẽ làm tăng quá trình lên
men. Từ đó dẫn đến sự biến tính protein dẫn đến tổn thất sau này.
- Hòa bột vào dung dịch NaOH.
Đem bột đã nghiền ở trên hòa tan vào dung dịch NaOHcó pH=11-12, với tỷ lệ 1
đậu 7 nước ở nhiệt độ 65 – 68oC. Khi cho bột vào pH sẽ giảm xuống 7 – 7,5 do tác
dụng của các phần tự protein và các axit béo có trong hạt đậu với NaOH.

13


Mục đích của quá trình này để hòa tan protein và các chất có trong hạt đậu vào
nước. Tử đó, tiến hành lọc tách dung dịch protein ra khỏi phần không hòa tan. Sau đó
kết tủa và ép thành bánh.

2.2.3. Quy trình sản xuất chao [1]

Giải thích quy trình

2.2.3.1. Định hình bánh đậu làm chao
Trong sản xuất chao người ta sử dụng CaSO4 làm tác nhân đông tụ sữa. CaSO4
có khả năng giúp ta thu hồi protein cao nhất.
14


Tiêu chuẩn bánh đậu dùng để sản xuất chao có thành phần như sau:
- Hàm lượng nước 68 – 72%.

- pH = 6 -6,5.
- Không chứa vi sinh vật tạp và vi sinh kỵ khí. Để đảm bảo 1 số chỉ tiêu trên,
sữa phải được đun sôi ngay và giữ nhiệt độ trong 5 phút.
Đem 1kg CaSO4 hòa trong 15 lít nước, lọc bỏ rác cặn, đun sôi dung dịch này.
Khi cho dung dịch CaSO4 vào phải tiến hành khuấy đều để tránh hiện tượng
xảy ra những phản ứng cục bộ. Đế lắng khoảng 2-3 phút. Sau đó chắt bỏ phần nước.
Kết tủa đem đi ép và ta sẽ được bánh đậu hũ dùng để sản xuất chao. Bánh đậu được
coi có chất lượng tốt là bánh đậu sau khi ép xong phải rắn chắc, lấy dao cắt để lại vết
cắt mịn, không có lỗ rỗng.

2.2.3.2. Sản xuất giống vi sinh vật
Giống ống thạch
Môi trường thạch có thành phần sau:
- Agar: 18 – 20g.
- Đường 20g.
- Nước giá đậu 1000ml.
Rửa sạch 300g giá đậu, cho vào 1000ml nước, đun sôi nửa giờ, chắt lấy nước,
bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml, cho thêm agar, đun sôi, lọc. Điều chỉnh pH đến 4,5
– 5 bằng acid acetic hoặc acid citric. Cân các thành phần ghi ở trên và tiến hành đun
sôi, phân phối vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng.
Giống trung gian
Môi trường được dùng có thành phần như sau:
- Bã đậu hũ 1kg
- Bột mì 0,5kg
Dùng nước đều chỉnh độ ẩm sao cho đạt 70 – 72%, pH của môi trường được
điều chỉnh 5,5 – 6,0 bằng acid acetic hoặc acid citric. Môi trường được phân phối vào
các bình tam giác từ 50 – 60g. Hấp 45 phút ở áp suất hơi 1,2kg/cm2.
Làm nguội và cấy giống từ ống giống sang. Nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC khoảng
18–24 giờ thấy xuất hiện khuẩn ty trắng. Nuôi tiếp 3 – 4 ngày có giống trung gian.

15


Giống bào tử
Cho giống trung gian vào bột mì đã rang chín với tỷ lệ một bột mì, một giống
trung gian. Dùng tay trộn đều, ray qua để lấy bột có bào tử và khuẩn ty. Như vậy, ta có
bột bào tử giống dùng trong sản xuất.

2.2.3.3. Nuôi mốc
Nuôi mốc là giai đoạn quan trọng nhất trong quy trình sản xuất chao. Sự phát
triển của mốc có ý nghĩa rất lớn trong sự chuyển hóa protein và làm cứng bánh chao.
Bánh đậu trước khi cấy mốc vào cần phải được dần qua nước sôi để tiêu diệt
các vi sinh vật tạp nhiễm. Mốc chao ở dạng bào tử cấy trực tiếp vào bánh chao không
thêm chất dinh dưỡng nào khác. Lượng giống mốc cho vào tỷ lệ 100kg bánh đậu cần
dùng 0,5 kg giống mốc bào tử, 500kg bánh đậu hũ cần 1 kg và 100kg ta dùng 1,2kg.
Sau khi cấy mốc xong phải đảm bảo nuôi ở nhiệt độ 28 – 30oC hàm ẩm không
khí là 90% ở những giờ đầu. Sau 14-16 giớ nuôi trên bề mặt đậu xuất hiện những
khuẩn ty màu trắng ta phải đưa hàm ẩm lên 95%. ở những giờ cuối nuôi mốc cần phải
làm giảm hàm ẩm xuống để hạn chế sự phát triển của nấm mốc. Khi thấy mốc chuyển
từ màu trắng sang màu hung nâu là kết thúc giai đoạn nuôi mốc. Lúc này khuẩn ty của
mốc có thể đạt đến 2cm.
Để việc nuôi mốc tốt cần lưu ý phòng nuôi mốc phải có thiết bị điều chỉnh nhiệt
độ, giữ được ẩm và nền phòng phải có khả năng thoát nước. Thông thường đối với
phòng thông gió tự nhiên 100kg bánh đậu dùng để nuôi mốc cần có dung tích 6-7m3
khí trên diện tích 2m3.

2.2.3.4. Ướp muối
Lượng muối thích hợp để ngâm là 130 – 150 g/kg bánh đậu sau lên men, muối
dùng để ướp phải sạch.. Thời gian ướp muối là 24 giờ. Khi ướp muối nên xếp 1 lượt
bánh đậu đã lên men một lớp muối. Cứ như vậy cho đến lớp đậu cuối cùng thì phủ một

lớp muối kín bề mặt đậu
Ngoài ra còn có phương pháp nhúng muối. Chuẩn bị dung dịch muối có nồng
độ 200 – 220 g/l và nhúng bánh đậu đã lên men liên tục 6 – 7 giờ thì nhấc lên để khô
24 giờ cho vào thiềt bị lên men.

16


2.2.3.4. Làm chín
Sau nuôi mốc, lên men là giai đoạn rất quan trọng, nó quyết định chất lượng sản
phẩm, trong giai đoạn này các enzyme của mốc sẽ tham gia hàng loạt các phản ứng
sinh hóa tạo ra chao.
Để tạo điều kiện cho các enzyme hoạt động, ta phải tạo điều kiện tối ưu cho
chúng hoạt động. Trong đó có độ ẩm, nhiệt độ và pH môi trường. Chính vì thế sau khi
ướp muối xong phải rũ sạch muối ở bánh đậu. Cho bánh đậu vào các dụng cụ lên men
có rượu 12oV theo tỷ lệ 1kg bánh đậu cho 0,5 – 0,6l, sao cho dung dịch ngập bánh đậu
là vừa. Đậy nắp kín cho vào phòng lên men.
Nhiệt độ lên men khoảng 35 – 36oC, ở bánh đậu và 37 – 38oC ở phòng. Nếu
nhiệt độ lên men lớn hơn 40oC thì thời gian lên men rút ngắn, sản phẩm rất dễ bị hư.
Nhiệt độ lên men nhỏ hơn 35oC thì thời gian lên men kéo dài tốn kém thiết bị và diện
tích phòng lên men. Thời gian lên men khoảng 9 -10 ngày.
Sau đó còn có giai đoạn lên men phụ đây là giai đoạn ổn định sản phẩm. Nhiệt
độ lên men thích hợp là 25 – 30oC.

2.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtilis
2.3.1 Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis

17


2.3.2 Đặc điểm

Hình 5: B. subtilis nhuộm gram
Bacillus subtilis là vi khuẩn có hình que (trực khuẩn), gam dương và catalase
dương tính phân bố rộng rãi trong đất, nhiệt độ sinh trưởng là từ 25 – 35oC, cò màng
cấu tạo từ peptidoglycan, hiếu khí tùy ý, có khả năng sinh bào tử.
B. subtilis có một DNA mạch có kích thước 4,2 Mbs, có 4200 gen quy định
tổng hợp protein trong đó có 79 gen quy định các protein thiết yếu tham gia vào quá
trình biến dưỡng. Một nửa số gen quy định các protein tham gia vào quá trình chuyển
tải thông tin, một phần năm chịu trách nhiệm tổng hợp vách tế vào và phân chia tế bào,
một phần mười tham gia quá trình trao đổi chất..
Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt về nhiệt độ, pH, thiếu chất dinh dưỡng
B. subtilis có khả năng hình thành bào tử có khả năng tồn tại trong môi trường khắc
nghiệt trong thời gian dài, một số bào tử có tiêm mao có khả năng di động.
B. subtiilis là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện. Trong điều kiện hiếu khí, B. subtilis
dùng O2 làm chất nhận điện tử cuối cùng. Trong điều kiện kỵ khí, B. subtilis có thể sử
dụng nitrite hoặc nitrate làm chất nhận điện tử cuối cùng.
B. subtilis có chứa enzyme catalse KatA và MrgA, là enzyme xúc tác cho phản
ứng phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành nước (H2O) và oxygen [O]
18