NUÔI CẤY INVITRO TỪ MÔ SẸO

SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

MỞ ĐẦU
Ngành CNSH đã và đang ngày càng tỏ ra thực sự có ý nghĩa lớn đối
với đời sống con người, hiện đã được Chính phủ ưu tiên đầu tư cho
những nghiên cứuvà những kế hoạch mang tính ứng dụng cao. CNSH
được xem là cánh tay đắc lực trong lĩnh vực nông nghiệp kỹ thuật cao
và các nước phát triển trên thế giới đã và đang ứng dụng hiệu quả
như Mỹ, Nhật, Thái Lan,...Ngành này không chỉ bó hẹp ở lĩnh vực
nông nghiệp mà còn là ngành học của sức khỏe, khoa học thực phẩm
và bảo vệ môi trường.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, CNSH hiện đại sẽ mang lại những đột
phá về nhân giống, lai tạo giống cây trồng, vật nuôi, nuôi cấy mô thực
vật và “cao cấp” hơn là sinh vật chuyển gene. Những giống cây trồng
cho năng suất cao, kháng sâu bệnh, chịu được thuốc diệt cỏ, chịu
được sự khắc nghiệt của môi trường sống, có khả năng loại bỏ chất ô
nhiễm là những kết quả mà công nghệ sinh học nông nghiệp mang
đến. Với xu thế phát triển nông nghiệp công nghệ cao thì triển vọng
của ngành này là rất lớn.
Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như
nhân giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo ,... người ta có thể tạo ra
được những giống cây trồng không những có năng suất cao mà còn
chống chịu được với sâu bệnh, thích nghi tốt với thời tiết…

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [1] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Đối với các loại cây quí hiếm, có giá trị thương mại lớn, kĩ thuật nhân
giống in vitro bằng cách tạo mô sẹo đã đem lại những hiệu quả kinh tế

hết sức rõ rệt.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nuôi cấy tế bào thực vật
1.1.1 Khái niệm mô sẹo
- Khi các phần bị cắt hay bị tổn thương của thân, rễ, lá … được đặt vào môi
trường thích hợp sau một thời gian tại đó sẽ xuất hiện những phần mô lồi ra
có màu trắng nhạt hoặc vàng nhạt mô này gọi là mô sẹo hay callus.
11.2 Đặc tính của mô sẹo
-

Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có thể có khả năng biệt hóa
thành rễ, chồi và phôi để hình thành cấy hoàn chỉnh.

1.1.1 Ứng dụng của mô sẹo
Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là
nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [2] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi
cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…
•

Nhân giống in vitro các loài thực vật bằng phương pháp nhân giống

đỉnh sinh trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện hơn nuôi cấy mô sẹo.

•

Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.

•

Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế

bào.
•

Thu nhận các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao.

•

Nuôi cấy huyền phù tế bào.

Nhân giống invitro bằng cách tạo mô sẹo ứng dụng để nhân nhanh giống cây
có năng xuất cao, chất lượng tốt, thích nghi với điều kiện sống và duy trì ưu
thế lai.
Khả năng sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công tác giống cây trồng
với mô sẹo có mục đích tạo phôi vô tính, nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào
trần, tạo cây có biến dị soma ( tạo nhiều biến dị nhất trong nuôi cấy mô), tạo
lượng chồi rất lớn( lớn hơn phương pháp đỉnh sinh trưởng).
Nhân giống invitro bằng cách tạo mô sẹo còn giúp bảo tồn các giống quý
hiếm.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [3] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật

SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

1.1.4 Sự tạo chồi từ mô sẹo
Theo Thomas và Davey (1975) sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích
bởi:
- Các chất sinh trưởng
- Các chất được sản sinh trong nuôi cấy mô sẹo
- Các chất chứa sẵn trong mẫu cấy
Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào:
- Số lần cấy chuyền ( các chất trong mẫu cấy có khả năng tổng hợp trong thời
gian dài)
- Sự hình thành tế bào xốp
1.1.2 Cảm ứng tạo mô sẹo
Sự hình thành mô sẹo có thể chia ra làm 3 thời kỳ:
- Thời kỳ cảm ứng tế bào chuyên hóa của mẫu cấy chuyển ngược trạng thái
phát triển, biến đổi hình thái và chức năng theo hướng tế bào phân sinh.
- Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào phân hóa của mô sẹo có tần suất phân
chia tương đối nhanh
- Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinh trưởng giảm đi cho tới khi
dừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [4] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Tác nhân chủ yếu gây cảm ứng mô sẹo là chất điều hòa sinh trưởng. Không
phải tất cả các thực vật đều cảm ứng tạo mô sẹo bởi các chất sinh trưởng thực
vật. Tùy thuộc vào chủng loại mẫu cấy mà có sự khác biệt về loại và hàm
lượng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng

mô sẹo.
Tùy mục đích nghiêng cứu thực nghiệm mà chọn loại và hàm lượng chất điều
hòa sinh trưởng thực vật khi cảm ứng mô sẹo.
1.2 Pháp nuôi cấy mô sẹo
1.2.1 Nguyên tắc nuôi cấy mô sẹo
Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật
lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực
vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn
thương đó. Những tế bào mới được hình thành đó là tế bào mô sẹo.
Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các
giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng
tượng tầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc
của đoạn cắt tạo thành. Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng
hoặc nâu nhạt. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong
điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [5] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả
năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật
có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi
nhũ, tế bào diệp lục, lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính
giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc
cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy
Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan,
nhất là trong sự tạo rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây
trưởng thành dễ tạo mô sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành

không có khả năng tạo mô sẹo. Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi
trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D) thích hợp.
Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:
- Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc
và libe, nhu mô vỏ hay lõi.
- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của
phần lớn cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin
đỉnh sinh trưởng.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ)

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [6] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác
nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng,
nâu hay trắng xanh…
Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu
tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo. Thường mô sẹo được
hình thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp
với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tùy từng loại cây.
Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong
mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo. Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc
lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự
phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy. Với một
số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây chịu ảnh
hưởng rất lớn.
1.2.2 Đặc điểm của quá trình nuôi cấy mô sẹo
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào

không phân hóa, được gọi là callus.
Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên
môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [7] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa
lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng thực
vật.
Đánh giá chính xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng
hoặc chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu
quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến
nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối
lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng.
Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng soma
trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên
được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong
nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là
dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp
lại trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy .
Bouque và cộng sự (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau
từ các loài của chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có
khoảng 90% số dòng callus sinh trưởng ổn định. Fett-Neto và cs (1994) nuôi
cấy tế bào cây Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng
sau 2 năm cấy chuyển.
1.2.3 Nhân giống thông qua giai đoạn callus

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [8] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Trong nhân giống in vitro nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ
mẫu vật nuôi cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các
cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên, nhiều trường hợp mô
nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối callus. Tế bào
callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh
tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ
cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua
giai đoạn callus còn có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp
của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [9] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Hình 4.2. Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo
A. Mô sẹo cây tỏi sau 2 tuần nuôi cấy
B. Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy
C. Tạo chồi từ mô sẹo
D. Cây tái sinh từ mô sẹo
E. Củ tỏi thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo

Sơ đồ 4.2. Mẫu mô phát sinh callus, callus tạo chồi và phát triển cây hoàn
chỉnh (thông qua phương thức phát sinh chồi bất định).

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [10] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Sơ đồ 4.3. Mẫu mô phát sinh callus, callus phát sinh phôi soma (hoặc nuôi
cấy dịch huyền phù tế bào phát sinh phôi soma) và từ phôi thu được cây hoàn
chỉnh.

Chương 2 : SƠ LƯỢC VỀ LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TẾ BÀO THỰC VẬT
- Năm 1938-1939 học thuyết hiện đại về tế bào học được công bố do hai nhà
khoa học M.J.Scleiden( nhà nghiên cứu thực vật) và T.Schwann( nhà
nghiên cứu động vật) đề xuất. Học thuyết này khẳng định: “ mọi cơ thể
sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành. Các tế
bào đã phân hóa đều mang các thông tin có trong tế bào đầu tiên và là
những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể.”

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [11] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- Năm 1902 nhà khoa học Haberlandt lần đầu tiên đưa các giả thuyết của
Scleiden và Schwann vào thực nghiệm. Haberlandt cho rằng: có thể tạo cá
thể hoàn chỉnh từ việc nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, Haberland đã không
thành công trong việc nuôi cấy tế bào thực vật. những hạn chế về phương
tiện kỹ thuật, kiến thức khoa học thời bấy giờ đã không đưa ông đến thành
công như mong đợi.
- Năm 1922, Kotte nhà khoa học Mỹ lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với
đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ loại cây họ hòa thảo. Trong môi trường

lỏng có chứa dinh dưỡng khoáng và đường glucose, đầu rễ sinh trưởng rất
mạnh tạo thánh một hệ rễ bao gồm cả rễ phụ. Tuy vậy, sinh trưởng của
mẫu tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại, mặc dù tác giả đã
chuyển qua môi trường mới.
- 1924 Hình thành callus từ rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic.
Blumenthal F. and Meyer P. Z. Krebsforsch
- Năm 1934, giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật . Whitenhà khoa học Mỹ, nuôi cấy thành công tên cây cà chua với môi trường
lỏng chứa dinh dưỡng khoáng, đường và các dịch nấm men. Sau đó White
chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại
vitamin nhóm B: Thiamine (B1), pyridoxine (B6) và nicotinic acid. Từ
đây, việc nuôi đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Đồng thời,
Gautheret tiến hành các nghiên cứu và thành công nuôi cấy mô phân
sinh(tượng tầng) một số cây thân gỗ. Went & Thimann phát hiện chất điều
hòa sinh trưởng (homon) đầu tiên- acid B- indolacetic (IAA). Gautheret

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [12] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

xác nhận tác dụng của chất kích thích sinh trưởng trên mô sẹo của IAA và
3 nhóm vitamin do White khởi xướng. Cùng với Nobercourrt (1939)
Gautheret thành công trong việc duy trì sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trên
môi trường rắn có chứa thạch agar.
- Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời
nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng
(cambium) ở cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.
- Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh
trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ cà.
- Năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt.

Sau đó nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã
được nghiên cứu và tổng hợp thành công. Hợp chất NAA và chất 2,4(Dichloro pheloxy acetic acid) được bắt đầu sử dụng ở nồng độ cao để trừ
cỏ trong sản xuất nông nghiệp.
- Nhiều báo cáo cho thấy cùng với nước dừa 2,4D và NAA giúp cho quá
trình hình thành mô sẹo, tăng khả năng phân chia thế bào trong quá trình
tạo cây hoàn chỉnh trng nuôi cấy invitro.
- 1954 Muir và cộng sự lần đầu tiên tạo được mô sẹo từ mô nuôi dưỡng
(nurse culture).
- Năm 1955, nhà khoa học Hoch Skoog phát hiện thấy vai trò của một hợp
chất có tác dụng kích thích phân bào, và đặt tên là Kinetin.
- Sau này, các nhà khoa học nghiên cứu tỷ mỷ hơn vai trò của Kinetin và
xếp vào nhóm cytokinin.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [13] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- Việc phát hiện và xác định được vai trò của IAA, 2,4D, kinetin cùng xác
định được vai trò của các vitamine, nước dừa được coi là bước tiến quan
trọng trong gia đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô thực vật, đây là
những tiền đề kỹ thuật cho xác lập môi trường nuôi cấy cho nhiều loài
thực vật.
- Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiêng cứu về ảnh hưởng
của tỷ lệ kinetin/auxin đối với sự hình thành mô sẹo cây thuốc lá. Khi
giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có xu hướng tạo rễ, ngược lại nếu tỷ
lệ kinetin/auxin tăng lên, mô sẽ phát sinh chồi. hiện tượng này xác nhận có
kết quả giống nhau trên nhiều laoij cây trồng. Kết quả nghiêng cứu gps
phần quan trọng trong việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật
trong nuôi cấy invitro.

- Năm 1958, Kerint và Sterwward tạo được phôi và cây hoàng chỉnh từ tế
bào thượng tâng cây cà rốt.
- 1960 Morelddax thành công trong nhân giống invitro lòa lan Cymbidium
từ mẫu nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng. Nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng hình
thành dạng cụm chồi gọi là các protocom. Khi tách các protocom tiếp tục
nuôi cấy trên môi trường phù hợp, mẫu sẽ hình thành các protocom mới.
Điều chỉnh môi trường phù hợp, mâu nuôi cấy có thể phát triển thành cây
hoàn chỉnh.
- Năm 1960, nhà khoa học Cooking lần đầu tiên dùng enyme phân hủy
thành tế bào và tạo ra số lượng lớn tế bào trần trên nhiều loại cấy trồng
khác nhau.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [14] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- 1962 Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật- môi trường MS.
- Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy tạo cây đơn bội ở
cà độc dược từ bao phấn.
- Năm 1967-1968 lần lượt Nichko Nakaro và cộng sự tạo được cấy đơn bội
từ bao phấn thuốc lá.
- Năm 1971, takebe tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần.
- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma hai
loài khác nhau, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của hai loài thuốc la
Nicoriana glauca và N langsdorfi.
- 1975 Gengenbach và Green chọn lọc dòng tế bào kháng bệnh nấm
Helminthosporium maydis trong nuôi cấy mô sẹo ngô.
- Năm 1980-1992 nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực

vật.
Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đang ở giai đoạn thứ 4, nuôi cấy mô
được ứng dụng khá phổ biến trong nhân giống cây trồng, chọn tạo giống, tạo
đột biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học….
các ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng và công nghệ tế bào
thực vật nói chung đang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra sản
phẩm đặc thù phục vụ con người.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [15] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Chương 3: QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO BẰNG CÁCH TẠO
MÔ SẸO
3.1 Sơ đồ

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [16] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

3.2 Thuyết minh
Cách tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị cây mẹ, lựa chọn mẫu cấy
- Cây mẹ phải sạch bệnh và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất.
- Khi lựa chọn mô cấy như tế bào soma ( chồi, rễ, thân, lá) cần lưu ý đến
tuổi sinh lí của cơ quan đó, vụ mùa lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu
đó.
Bước 2: Khử trùng mẫu cấy:

- Mẫu cấy sau khi được chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử
trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride ,
clorua thủy ngân, …
- Khử trùng mẫu cấy bên ngoài tủ cấy vô trùng.
- Khử trùng mẫu cấy bên trong tủ cấy vô trùng.
Bước 3: Tạo thể nhân giống in vitro và tăng sinh mô

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [17] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- Tạo thể nhân giống:
+ Mẫu được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo để tạo mô sẹo, , sau đó
biệt hóa thành các mô khác nhau để tạo thể nhân giống in vitro
- Các phương pháp tăng sinh mô
+ Tạo phôi soma
+ Tăng cường sự phát triển chồi bên
+ Sự phát triển chồi bất định
-

Nhân giống in vitro:
+ Vật liêu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống
môi trường tạo thể chồi. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá
trình tăng sinh diễn nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa
và được duy trì trong thời gian dài.
Bước 4: Ra rễ in vitro và tái sinh cây hoàn chỉnh:

- Ra rễ in vitro và điều kiên ra rễ
+ Sau khi nhân giống đủ số lượng chồi cần thiết điều quan trọng là cần

chuyển chồi sang môi trường ra rễ để tái sinh cây hoàn chỉnh. Cần bổ
sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa lượng, vi
lượng, vitamin, chất làm đặc môi trường, ngoài ra còn bổ sung thêm

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [18] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

các chất hữu cơ, nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thích hợp, các
chồi sẽ ra rễ để tạo cây con hoàn chỉnh.
- Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh
+ Là giai đoạn cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân , lá , rễ để chuẩn bị
chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống
khi ra môi trường bình thường.
Bước 5: Chuyển cây con ra vườn ươm:
- Cây con được chuyển ra vườn ươm, được lấy khỏi ống nghiệm, bình
nuôi cấy,… rửa sạch thạch, môi trường dinh dưỡng bám vào cây và
được đặt trong rổ có lót giấy báo, phun thuốc diệt nấm, sau đó đặt nơi
có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,…
- Trong 1 số trường hợp cây con dễ dàng ra rễ thì chuyển cây ra ngoài và
tiến hành ra rễ ex vitro.
3.3 Vật liệu và môi trường nuôi cấy
3.3.1 Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy
3.3.1.1

Khoáng đa lượng

- Nitrat canxi
- Nitrat kali

- Nitrat natric

Ca(OH)2.4H2O
KNO3
NaNO3

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [19] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- Nitrat amon

NH4NO3

- Sunphat amon

(NH4)2SO4

- Phot phat natri monobasic NaH3PO4.8H2O
- Phot phat kali monobasic KH2PO4
- Clorua kali KCl
- Clorua canxi CaCl2.4H2O
- Sunphat magie MgSO4.7H2O
- Ethylendiamintetra acetatdinatri (ETDA)
- Sunphat sắt II FeSO4.7H2O
- Sunphat sắt III Fe2(SO4)3
3.3.1.2

Khoáng vi lượng

- Sunphat mangan MnSO4.4H2O
- Acid boric H3BO5
- Kẽm sunphat ZnSO4.7H2O
- Magie sunphat MgSO4.7H2O
- Molydat amon (NH4)6Mo7O24.4H2O
- Molydat Natri NaMoO4
- Clorua coban CoCl2.6H2O
- Iodua kali KI
3.3.1.3

Vitamine

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [20] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- Myo- inositol
- Acid nicotinic
- Pyroidyxin HCl
- Thiamin HCl
- Panthothenate caxi
- Riboflavine
- Biotin
- Acid folic
3.3.1.4

Các chất điều hòa sinh trưởng

- Acid 2,4 dichloro phenol acetic (2,4D)
- IAA,NAA,Kinetin,BAP,TZN,GA,…
3.3.1.5

Các chất hữu cơ khác

- Dịch chiết nấm men
- Dịch thủy phân casein ( casein hydrolysate)
- Nước dừa
- Khoai tây, cà rốt
- Agar, đường
3.3.2 Môi trường nuôi cấy

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [21] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Thành phần nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài, bộ phận và mục đích
nuôi cấy vì vậy thành phần môi trường là khác nhau. Thành phần môi trường
còn thay đổi theo các giai đoạn phát triển, phân hóa khác nhau của mẫu cấy
và mục đích nuôi cấy như: duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm
hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh.
Thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy gồm:
- Đường làm nguồn cung cấp cacbon
- Khoáng đa lượng
- Khoáng vi lượng
- Các vitamine
- Chất điều hòa sinh trưởng
- Ngoài ra, tùy thuộc vào mục đích cấy có thể thêm một vài chất hữu cơ có

thành phần xác định ( acid amin) hoặc không xác định ( nước dừa, dịch
chiết nấm men) hoặc chất độn như thạch.
3.3.2.1

Đường

- Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, đường cung cấp nguồn cacbon để tế
bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh
khối khi tế bào chưa có khả năng quang hợp hoăc chưa đảm nhận hoàn
toàn chức năng quang hợp. hai dạng đường hay sử dụng nhất là sucrose và
glucose, nhưng hiện nay đường sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Tùy

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [22] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sucrose biến đổi từ 1-6% thông dụng
nhất là 2-3%.
3.3.2.2

Các khoáng đa lượng

- Nguyên tố khoáng đa lượng gồm N,P,K,S,Mg và Ca sử dụng với nồng độ
30mg/1 môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô thực
vật.
- Nguồn Nitơ (N): mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các
dạng nitơ loãng như amon và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng
hữu cơ như acid amin. Tỷ lệ giữ nitơ dạng amon và nitrat thích hợp tùy
loại cây và trạng thái phát triển mô.

Nitrat được cung cap duoi dạng muối canxi nitrat Ca(NO3)2.4H2O, kali
nitrat KNO3, natri nitrat NaNO3, hoặc amon nitrat NH4NO3. Amon cung cấp
dưới dạng muối amon suphat (NH4)2SO4 hoặc NH4NO3. Trong một số trường
hợp có thể cung cấp dưới dạng ure. Tổng nồng độ của NO3- và NH4+ trong
môi trường thay đổi từ 3 đến 6µM, thông thường khoảng 20µM.
- Nguồn photpho (P): hai dạng phopho thường dùng nhất là NaH2PO4.7H2O
và KH2PO4 với nồng độ môi trường từ 0,15-4 µM.
- Nguồn kali (K): cung cấp cho môi trường nuôi cấy dạng kali nitrat KNO3,
kali clorua KCl, kali photphat (KH2PO4). Nồng độ K+ trong môi trường từ
2 dến 25 µM.

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [23] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

- Nguồn canxi (Ca): canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat
Ca(NO3)2.4H2O, canxi clorua CaCl2.6H2O. Nồng độ Ca2+ trong môi trường
từ 1 đến 3,5µM.
- Nguồn magiê (Mg): magiê được cung cấp dưới dạng magiê sunphat
MgSO4.7H2O với nồng độ trong môi trường từ 0,5-3µM.
- Nguồn sắt (Fe): các môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng clorua
sắt FeCl2, FeCl3, sunphat sắt FeSO4.7H2O, Fe(SO4)3. Hiện nay hầu hết các
phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na-etylendiamin-tetra-acetat (Na2ETDA).
3.3.2.3

Các khoáng vi lượng

Tên vi lượng
Mangan( Mn)

Bo (B)
Kẽm ( Zn)
Đồng ( Cu)
Molypden ( Mo)

Dang sử dụng
MnSO4.4H2O
H2BO2
Zn(SO4).H2O
CuSO4.5H2O
(NH4)2Mo7O.4H2O

Nồng độ µM
15 - 100
6 - 100
15 - 30
0,04 - 0,08
0,007 – 1,0

NaMoO4.2H2O

0,1 – 0,4

Coban (Co)

COCl2.6H2O

2,5 – 20

Iốt (I)

KI

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [24] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật


SVTH: Phạm Như Ngọc 2015-2016

Bảng 3.1: Các dạng sử dụng và nồng độ của các nguyên tố vi lượng sử dụng
trong nuôi cấy
- Các nguyên tố khoáng vi lượng được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30mg/lít
môi trường, các nguyên tố thường sử dụng là : Fe, B, Mn, Mo, Zn, Cu, Ni,
Co. các nguyên tố này đóng vai trò trong các hoạt động enzyme.
3.3.2.4

Các vitamine

- Các loại mô tế bào và thực vật nuôi cấy có khả năng tổng hợp được hầu
hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng, do đó phải bổ sung thêm
viatmin vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các vitamin nhóm B như : B1,
B2, B3, B5, B6. .. các vitamin đặc biệt quan trọng như Myo – inositol…
đóng vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào và thường được sử dụng với
hàm lượng lớn từ 50 – 100mg/l

GVHD: Th.S Nguyễn Thị Thu Hương [25] Đồ Án Công Nghệ Sinh Học Thực Vật