Kiểm Tra Khả Năng Sinh Tổng Hợp Phytase Tái Tổ Hợp Của Nấm Men Pichia Pastoris GS115-Phyai

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Phospho là nguyên tố thiết yếu cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của
động vật. Tuy nhiên, có khoảng 60-75% phospho trong ngũ cốc và hạt dầu trong thức
ăn của động vật tìm thấy ở dạng phytate (inositol hexaphosphat) hoặc acid phytic
(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphoric acid). Động vật dạ dày một ngăn như gia
cầm, lợn và cá không thể hấp thụ phospho trong phytate vì chúng không có enzyme
phytase trong đường ruột. Do đó, phospho vô cơ được thêm vào thức ăn để đáp ứng
yêu cầu. Ngoài ra, phospho ở dạng phytate trong thức ăn không được động vật hấp thu
sẽ bị đào thải trong phân và phospho dư thừa trong phân bị rửa trôi theo luồng nước
thải gây ra sự phát triển nhanh chóng của tảo và có thể ảnh hưởng đến lượng oxy trong
nước, làm cho cá chết.
Phytase là một enzyme acid phosphohydrolase, xúc tác thủy phân acid phytic
thành phosphate vô cơ và những dẫn xuất myo-inositol phosphate. Hoạt tính phytase
trong vi sinh vật thường được tìm thấy nhiều nhất ở nấm mốc.
Phytase được quan tâm cho những ứng dụng công nghệ sinh học, đặc biệt giảm
phytate trong thức ăn và nguyên liệu. Bổ sung phytase vào nguyên liệu thức ăn chăn
nuôi sẽ làm tăng giá trị sinh học của phosphate, giảm ô nhiễm phospho trong những
vùng chăn nuôi tập trung. Sự thủy phân acid phytic bằng enzyme sẽ không sinh ra
những sản phẩm có độc tố. Như vậy, khai thác enzyme trong công nghiệp sẽ thân thiện
với môi trường và sẽ hỗ trợ trong sự phát triển của những công nghệ mới.
Tuy nhiên, khả năng ứng dụng enzyme này để thương mại hóa không được khả
thi trong nhiều năm, do hoạt tính thấp và giá thành cao khi sản xuất phytase theo
phương pháp lên men truyền thống. Để tạo ra một lượng lớn phytase có hoạt tính cao,
ổn định, không gây độc tố, có khả năng áp dụng trong sản xuất công nghiệp, các nhà
nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu tạo dòng gen phytase từ vi sinh vật vào vector
biểu hiện và biến nạp vào hệ thống biểu hiện chủ.
Trong những hệ thống biểu hiện thì Pichia pastoris được xem là có nhiều ưu thế
trong việc biểu hiện enzyme phytase tái tổ hợp với năng suất cao và có khả năng chịu
nhiệt tốt. Do vậy, chúng tôi tiến hành đề tài với mục đích tối ưu hóa các điều kiện sinh
1

tổng hợp phytase từ chủng nấm men Pichia pastoris GS115 tái tổ hợp mang gen phyAI
mã hóa cho enzyme phytase của Aspergillus ficuum.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:


Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp của nấm men Pichia

pastoris GS115-phyAI.


Tối ưu hóa các điều kiện lên men cho quá trình sản xuất phytase tái tổ hợp:
 Khảo sát môi trường sản xuất phytase thích hợp cho Pichia pastoris
GS115.
 Khảo sát tỉ lệ giống và thời gian sản xuất tối ưu cho quá trình sản xuất
phytase.
 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung khoáng vào môi trường sản xuất
phytase.
 Khảo sát nguồn cacbon và nồng độ glucose thích hợp.
 Khảo sát nguồn nitơ thích hợp.
 So sánh khả năng lên men sản xuất phytase của nấm men Pichia pastoris
GS115 theo phương pháp nuôi cấy trên máy lắc và trong bình lên men có
cánh khuấy.
 Định lượng protein theo phương pháp Bradford.
 Điện di SDS-PAGE của sản phẩm enzyme thu nhận.

2


CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. ACID PHYTIC
2.1.1. Giới thiệu
Acid phytic là một acid hữu cơ có danh pháp quốc tế là myo-inositol
(1,2,3,4,5,6) hexakisphosphoric acid. Muối của acid phytic đuợc gọi là phytate và
được tìm thấy trong thực vật, động vật và đất. Phytate thường tìm thấy trong các loại
hạt, ngũ cốc và đậu chiếm khoảng 0,5-5% khối lượng hạt. Nó thường được tìm thấy
trong hạt dưới dạng muối Ca và Mg không tan (được gọi là phytin). Ở ngũ cốc và hạt
có dầu, phytate là dạng dự trữ phospho và inositol, nó chiếm 80% tổng lượng các
hợp chất có chứa phospho trong hạt.
Với cấu trúc ổn định, ở điều kiện thường acid phytic dễ dàng liên kết với Ca2+,
Mg2+, Fe2+ và Zn 2+. Ngoài ra, acid phytic cũng có khả năng liên kết và hình thành
các phức chất với các acid amin và protein, điều này gây cản trở và làm giảm khả
năng hấp thụ các chất dinh dưỡng của người và động vật. 1, 4

Hình 2.1. Acid phytic phức hợp tồn tại trong thực vật (Thompson, 1986 và

Kies, 1998)

2.1.2. Nguồn gốc trong tự nhiên
Phytic acid có thể được tìm thấy trong hầu hết các loại hạt, ngũ cốc và đậu.
Những nguồn giàu acid phytic nhất là cám lúa mì và hạt lanh (3%).
Phân bố của phytate trong hạt thay đổi tuỳ loài. Khoảng 90% phytate trong hạt
bắp nằm trong phần nhân của hạt. Trong khi đó, ở lúa gạo và lúa mì, hầu hết phytate
ở lớp vỏ cám bên ngoài. Trong hạt cây lấy dầu và hạt cây họ đậu, phytate thường ở
3


dạng kết hợp với các protein và được chứa trong các túi nhỏ nằm rải rác trong nhân
hạt. Ngược lại thì ở đậu nành, phytate không tập trung phân bố ở một vị trí nhất định.
Bên cạnh đó, hàm lượng phospho có trong đất cũng ảnh hưởng đến hàm lượng

phytate có trong hạt. Đất càng giàu phospho thì hàm lượng phytate trong hạt càng
cao.
Bảng 2.1. Hàm lượng phospho và phytate trong một số cây trồng 17
Tỷ lệ % phospho

Hàm lượng

Hàm lượng

phospho tổng

phospho trong

số (%)

phytate (%)

Đậu hà lan

0,48

0,24

50

Đậu nành

0,61-0,65

0,39

60-61

Hạt cải

1,18

0,70

59

Hạt hướng dương

1,16

0,89

77

Bắp

0,26-0,33

0,24

66-72

Lúa mạch

0,34-0,42

0,27

56-64

0,35

0,27

77

Nguồn

Gạo

trong phytate so
với hàm lượng
phospho tổng

Ở động vật, phytate có trong các mô, các cơ quan. Trong cơ thể con người acid
phytic giữ chức năng dự trữ phosphate. Nó đuợc phân giải bằng phytase tạo thành
phosphate và myo-inositol và được cơ thể hấp thụ. 1, 4, 18
2.1.3. Cấu trúc và tính chất hoá học
2.1.3.1. Cấu trúc
Phytic acid có công thức tống quát là C6H18O24P6. Nó tồn tại ở 2 dạng lập thể
khác nhau được xác định bằng thực nghiệm.


Dạng cấu trúc tripyrophosphate bất đối xứng.



Dạng cấu trúc hexa-orthophosphate đối xứng. 1

4


Hình 2.2. Acid phytic 21
2.1.3.2. Tính chất hoá học
Acid phytic có cấu trúc hoá học khá ổn định. Do mang nhiều nhóm acid
phosphoric nên nó tích điện âm cao và tồn tại trong phổ pH rộng.
Vì tích điện âm nên acid phytic có thể gắn chặt với các cation kim loại như:
Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Fe2+, K+,...tạo thành các muối không tan. Một cation kim
loại có thể gắn với một hoặc nhiều nhóm phosphate có trong một phân tử phytate
hoặc gắn với nhóm phosphate thuộc nhiều phân tử khác nhau.
Muối phytate có thể tồn tại dưới dạng không liên kết với kim loại hoặc tạo
phức hợp với kim loại tùy thuộc vào pH và nồng độ ion của dung dịch. Ở pH thấp,
phytate có khả năng hòa tan tốt hơn khi ở pH cao. Lý do là vì ở pH acid, phytate ở
dạng không liên kết với ion kim loại do sự proton hoá của các nhóm acid phosphoric
trong phân tử phytate. Ngược lại ở pH trung tính, các nhóm phosphate của phytate bị
khử proton nên tăng ái lực với các cation kim loại hoá trị hai. Do đó, phytate hình
thành phức hợp với các cation kim loại hoá trị hai, chủ yếu là Mg2+ và Ca2+.
Các nhóm acid phosphoric của phytate còn có khả năng kết hợp với các nhóm
mang điện tích dương của protein, amino acid, tinh bột, lipid....
Tương tác của phytate với các protein phụ thuộc vào pH. Ở giá trị pH dưới
điểm đẳng điện của protein, các nhóm phosphate tích điện âm của phytate sẽ gắn
chặt với các nhóm tích điện dương trên protein tạo phức hợp không tan. Những phức
hợp phytate-protein có thể bị phá vỡ do tác động cạnh tranh của các cation kim loại
hoá trị 2 và 3.
Ở giá trị pH nằm trên điểm đẳng điện của phytate và protein, cả protein và

phytate đều tích điện âm. Nhưng khi có sự hiện diện của các cation kim loại đa hoá
trị, những phức hợp tan protein-cation kim loại-phytate có thể được tạo thành.
Những phức hợp này có thể bị phá vỡ bởi lực ion mạnh, pH cao (>10). 1, 18
5


2.1.4. Chức năng
2.1.4.1. Chức năng sinh lý
Trong các loại hạt, acid phytic đóng vai trò như:


Nguồn dự trữ phospho.



Nguồn dự trữ năng luợng.



Nguồn cation.



Nguồn myo-inositol.



Chất khởi động quá trình nảy mầm của hạt.

Trong cơ thể người và động vật, acid phytic giúp tăng cường quá trình điều hoà

trao đổi chất, kích thích tạo máu, tăng vận chuyển hemoglobin oxygen và hỗ trợ quá
trình hình thành mô xương. 1
2.1.4.2. Tác động kháng dưỡng
Nhiều nghiên cứu cho thấy phytic acid trong thức ăn gia súc có ảnh hưởng
kháng dưỡng mạnh vì một số lý do sau:


Động vật dạ dày một ngăn thiếu enzyme phân giải phytate vì thế không thể

sử dụng phospho có trong phytate.


Vì nhóm acid phosphoric mang điện tích âm nên có thể gắn chặt với các

cation như: Ca2+, Mg2+, Zn 2+, Mn2+, Fe2+, K+,...tạo thành các muối không tan làm ảnh
hưởng đến khả năng hấp thụ và tiêu hóa các chất khoáng này của động vật và làm
giảm đi nguồn cung cấp sinh học các khoáng này.


Nhóm acid phosphoric của phytate cũng có thể gắn kết với các nhóm protein,

amino acid, tinh bột và lipid có trong thức ăn làm giảm khả năng hoà tan của các
chất này và ảnh hưởng lên khả năng tiêu hoá các chất này.


Các nhóm acid phosphoric cũng có thể gắn với các protein trong cơ thể như:

amylase, pepsin, trypsin và acid phosphorylase để làm giảm hoạt tính của các
enzyme này ảnh hưởng lên khả năng sử dụng chất dinh dưỡng. 1, 4, 18
2.1.5. Các biện pháp giảm thiểu những tác động bất lợi của phytic acid

Để giải quyết những bất lợi gây ra bởi phytate trong chăn nuôi, nhiều phương
pháp đã đề nghị:


Ngâm hạt ngũ cốc trong nước trước khi cho ăn. Đây là một biện pháp đơn

giản và vẫn được một số nông dân áp dụng. Việc ngâm thức ăn trong nước sẽ giúp
hoạt hoá phytase, một số enzyme tự nhiên có trong hạt. Enzyme này sẽ phân giải
6


phytate, giải phóng phospho vô cơ. Phương pháp này tương tự với phương pháp
ngâm hạt giống để kích thích việc nảy mầm của hạt dùng trong nông nghiệp.Tuy
nhiên phương pháp này tỏ ra không đáng tin cậy và không khả thi khi thực hiện trong
qui mô chăn nuôi lớn.


Tạo dòng các loại ngũ cốc có hàm lượng enzyme phytase cao. Phương pháp

này được xem là có nhiều hứa hẹn. Tuy nhiên còn đòi hỏi nhiều thời gian nghiên cứu
thêm.


Tạo dòng các loại ngũ cốc có hàm lượng acid phytic thấp nhờ đó giảm thiểu

các tác động lên môi trường. Tuy nhiên lại cần phải bổ sung thêm phospho vào trong
thức ăn của vật nuôi. Bên cạnh đó, hạt giống cần có acid phytic để nảy mầm và phát
triển khỏe mạnh. Nghiên cứu ở bắp cho thấy những hạt có hàm lượng acid phytic
bằng 75% trung bình sẽ phát triển kém và cho năng suất chỉ bằng từ 5-15% sản
lượng trung bình.



Tạo dòng các gia súc, gia cầm có khả năng tự tổng hợp phytase. Một số nhà

nghiên cứu ở Canada đã tạo giống lợn biến đổi gen Enviro có khả năng tự tổng hợp
enzyme phytase ở tuyến nuớc bọt. Giống lợn Enviro này có mang gen mã hoá cho
phytase được tạo dòng từ chủng E.coli không gây bệnh. Thí nghiệm cho thấy lượng
phytate trong chất thải của lợn giảm đi 75% so với lợn bình thường. Tuy nhiên việc
đưa giống lợn này ra ứng dụng trong sản xuất vẫn còn nhiều khó khăn.


Một phương pháp khác là thêm enzyme phytase tái tổ hợp vào thức ăn. Đây

được xem là phương pháp phổ biến nhất hiện nay. Việc bổ sung phytase vào thức ăn
sẽ giúp giải phóng phospho khỏi phytic acid, loại bỏ những ảnh hưởng kháng dưỡng
của acid phytic, nhờ đó kích thích sự tăng trưởng của vật nuôi và không cần bổ sung
thêm phospho vào thức ăn. Giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất và giải quyết những
tác động có hại lên môi trường. Phytase thương mại thường được sản xuất nhờ lên
men các chủng Aspergillus niger, A.ficuum và A.oryzae. Hiện nay nhiều nghiên cứu
đang tập trung vào việc biểu hiện phytase bởi hệ thống biểu hiện Pichia pastoris và
đã thu được những thành công đáng kể. 1, 15

7


2.2. ENZYME PHYTASE
2.2.1. Khái quát
Phytase (myo-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisphosphate phosphohydrolase) là một
enzyme phosphatase đặc hiệu cho phytate, xúc tác cho phản ứng thủy giải liên kết
monophosphoester của acid phytic hoặc muối phytate, giải phóng acid phosphoric,

myo-inositol và các dẫn xuất của nó.
Hiện nay, các nghiên cứu tập trung vào việc tạo dòng, sản xuất enzyme này ở
mức độ thương mại, đặc biệt là các phytase có nguồn gốc vi sinh vật thích hợp cho
sản xuất quy mô công nghiệp. 1
2.2.2. Lịch sử các nghiên cứu về phytase
1903 – Posternak: mô tả về acid phytic.
1907 – Suzuki và cộng sự: mô tả và tách chiết phytase từ cám gạo.
1911 – Dox và Golden: tìm được phytase trong Aspergilli.
1913 – Plimmer và Anderson: xác định được các phức hợp phospho hữu cơ
trong nguyên liệu thực vật.
1914 – Anderson: xác định được cấu trúc của acid phytic.
1959 – Casida: tìm ra được 20 chủng nấm mốc từ đất có hoạt tính phytase.
1962-1971: Tổ chức Khoáng sản và hóa học quốc tế, bước đầu thử nghiệm
thương mại hóa phytase.
1967 – Ware và Shieh: nhận bằng phát minh về acid phytic.
1968 – Ware và Shieh: phân lập được hơn 2000 chủng có hoạt tính phytase.
Phân lập Aspergilluc niger NRRL 3135 và A.ficuum và đã thu nhận gen phyA và
phyB có hiệu suất cao nhất so với các báo cáo trước đó, trong chủng có biến đổi
không phải do di truyền.
1971 – Nelson và cộng sự: cho ăn bổ sung trực tiếp phytase từ A.niger NRRL
3135 đối với gà trong các bữa ăn thử nghiệm và có hàm lượng nhất định.
1984 – Dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của Trung tâm nghiên cứu phía nam,
bộ phận nông nghiệp Hoa Kỳ, bắt đầu nghiên cứu cơ bản về phytase.
1988 – Ullah: tinh sạch, mô tả và xác định thành phần, trình tự amino acid của
gen phyA thu nhận từ A. niger NRRL 3135.
1990 – Simons và cộng sự: chứng minh hiệu quả của phytase đối với gà và heo.

8

1993 – Ehrlich và cộng sự: tạo dòng gen phyB, mã hóa cho enzyme acid
phosphatase pH 6,0, từ A.niger NRRL 3135.
1993 – Pen và cộng sự: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho
phytase, vào trong tobacco.
1994 – Ullah và cộng sự: tạo dòng gen, từ A.niger NRRL 3135, mã hóa cho
enzyme acid phosphatase pH 6,0.
1993 – Beudeker và Pen: cho biểu hiện gen phyA từ nấm mốc, mã hóa cho
phytase, vào trong Canoda (Brassica napus). 1
2.2.3. Phân loại
2.2.3.1. Dựa trên vị trí nhóm phospho đầu tiên bị enzyme tác động
Theo tổ chức Sinh hóa và Sinh học phân tử quốc tế (IUBMB), tổ chức định
danh sinh hóa (JCBN), enzyme phytase được phân thành hai nhóm chính dựa vào vị
trí nhóm phospho đầu tiên bị enzyme tác động:
 EC 3.1.3.8
Tên thường gọi: 3-phytase
Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 3-phosphohydrolase
Các tên khác: Phytase, phytate 3-phosphatase
Enzyme này phân giải nhóm phosphate của myo-inositol-hexakisphosphate ở vị
trí D-3 trước tiên tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate và
phosphate tự do.
Phytase có nguồn gốc từ nấm và vi khuẩn thường thuộc nhóm này.
 EC 3.1.3.26
Tên thường gọi: 6-phytase
Tên hệ thống: Myo-inositol-hexakisphosphate 6-phosphohydrolase
Các tên khác: Phytase, phytate 6-phosphatase, 4-phytase
Enzyme này phân giải nhóm phosphate ở vị trí L-6 trước tiên tạo sản phẩm 1Lmyo-inositol 1,2,3,4,5-pentakisphosphate và phosphate tự do, hoặc cũng có thể tác
động vào nối monophosphoester ở vị trí D-4 tạo sản phẩm 1D-myo-inositol 1,2,3,5,6pentakisphosphate. Do vậy enzyme này còn có tên gọi khác là 4-phytase.
6-phytase có nguồn gốc từ thực vật. 1, 5, 17

9

2.2.3.2. Dựa trên pH tối ưu
Phytase được chia làm 2 loại:


Acid phytase: chủ yếu là các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật với pH tối ưu

trong khoảng 4,5-6,0.


Alkaline phytase: chủ yếu là các enzyme có nguồn gốc thực vật như ở hạt,

phấn hoa, và enzyme ruột chuột với khoảng pH tối ưu trên 6,5. 5,16
2.2.4. Đặc điểm sinh lý và sinh hoá của enzyme phytase
2.2.4.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử
Hầu hết phytase được xác định là các enzyme đơn phân tử, như phytase từ vi
nấm, E.coli, Bacillus subtilis. Tuy nhiên, phytase của một số động vật và thực vật
gồm nhiều tiểu đơn vị. Như phytase được hình thành trong quá trình nảy mầm của
hạt bắp được xem là một enzyme gồm hai tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa,
phytase được tinh sạch từ ruột chuột có hai loại phytase kích thuớc 70 và 90 kDa.
Hầu hết phytase của vi khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của nấm.
Theo kết quả nghiên cứu thực nghiệm, phytase của nấm có trọng lượng phân tử
khoảng 62-128 kDa. Ở Aspergillus ficuum, phyA và phyAI có trọng lượng phân tử
nằm trong khoảng 85-100 kDa và phyB có trọng lượng phân tử khoảng 62-68 kDa.
1, 6, 17
2.2.4.2. Nhiệt độ
Hầu hết phytase có nhiệt độ tối ưu dao động trong khoảng 45-60oC. Tuy nhiên
phytase của vi khuẩn có khoảng nhiệt độ rộng hơn (35-63oC). Phytase của
Aspergillus ficuum có hoạt tính tối ưu ở 55oC và có thể chịu được nhiệt độ 70oC

trong 15-30 giây. Một số phytase có khả năng chịu được nhiệt 100 oC trong 20 phút
mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu.
Trong chế biến thức ăn gia súc, phytase cần phải có nhiệt độ tối ưu cao vì quá
trình kết vón thực phẩm được thực hiện ở 80-100 oC trong một vài giây.
Một vài nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để làm tăng tính ổn
nhiệt của phytase như thay thế proline và tạo cầu disulfite hoặc có thể dùng kỹ thuật
sinh học phân tử để tạo dòng các phytase chịu nhiệt từ các nấm chịu nhiệt như
M.thermophila và T.thermophilus. 1, 5, 6

10


2.2.4.3. pH
pH tối ưu của các loại phytase dao động từ 2,2-8
Hầu hết các phytase vi sinh vật thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5, đặc biệt đối
với phytase từ nấm mốc. Tuy nhiên phytase từ nấm mốc A.fumigatus có phổ pH khá
rộng, từ 4,0-7,3.
Phytase vi khuẩn có pH tối ưu tại 6,5-7,5, đặc biệt đối với giống Bacillus.
Hầu hết các phytase từ nấm men có pH tối ưu trong khoảng 4-5. Tuy nhiên, giá
trị pH tối ưu của các phytase nấm men còn tùy thuộc vào nhiệt độ.
Các phytase nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0-7,5, đa số trong
khoảng 4,0-5,6.
Để ứng dụng được trong công nghiệp thức ăn gia súc, phytase phải có hoạt tính
cao ở pH trong hệ thống tiêu hoá. Các nhà khoa học đã tạo được đột biến điểm định
hướng bằng cách thay thế Gly-277 và Tyr-282 của phytase chủng hoang dại
A.fumigatus bằng các gốc tương đương của phytase A.niger (Lys và His) tạo được
một phytase có sức chịu pH tốt hơn, tối ưu tại 2,8-3,4. 1, 5, 6
2.2.4.4. Cơ chất
Phytase có cơ chất đặc trưng rộng: acid phytic, phytate và các chất có cấu trúc
tương tự như ADP, ATP, p-nitrophenyl phosphate, phenylphosphate, fructose-1,6bisphosphate, glucose-6-phosphate, α và β-glycerolphosphate, 3-phosphoglycerate.

Chỉ một vài phytase có tính đặc hiệu cao đối với acid phytic như phytase Bacillus
(Powar và Jagannathan, 1982, Shimizu, 1992) và alkaline phytase từ phấn hoa lily
(Barrientos và cộng sự, 1994). 1
Dựa trên cơ chất đặc trưng, phytase phân thành hai lớp, phytase với dãy cơ chất
đặc trưng rộng (ví dụ như A.fumigatus, M.thermophila, E.nidulans) và phytase chỉ
đặc hiệu với acid phytic (như A.niger, A.terrus, E.coli).
Phytase có cơ chất rộng có hoạt độ đối với acid phytic thấp (23 tới 43 U/mg).
Ngược lại, phytase có cơ chất đặc hiệu là acid phytic có hoạt độ cao hơn, 103-811
U/mg.
Phytase có cơ chất rộng phân giải acid phytic thành myo-inositol monophosphat
và myo-inositol. Trái lại, phytase có cơ chất hẹp đặc hiệu với myo-inositol
phosphate, có hoạt tính thấp đối với myo-inositol-1-monophosphate, do vậy nó chỉ
tạo thành sản phẩm myo-inositol tri hay bisphosphate. 1, 5, 6
11


2.2.4.5. Đặc điểm xúc tác của enzyme phytase
Trung tâm hoạt động
Các enzyme nói chung khi xúc tác phản ứng, không phải toàn bộ enzyme tham
gia mà chỉ có một bộ phận nhỏ của enzyme chịu trách nhiệm tham gia xúc tác phản
ứng. Bộ phận này là nơi tập trung của một số nhóm chức được gọi là trung tâm hoạt
động của enzyme. Hoạt tính của phytase cũng do trung tâm hoạt động của nó quyết
định.
Trung tâm hoạt động của phytase (histidin acid phosphatase) là một đoạn trình
tự acid amin được ký hiệu là: RHGXRXP ( gần đầu N-terminus), trong đó:[24]
R: Arginine
H: Histidin
G: Glycin
P: Prolin
X: acid amin bất kỳ.

Trình tự này được bảo tồn trong phytase của nấm mốc và vi khuẩn E.coli. Phân
tử của phytase nấm mốc và E.coli còn có một vùng bảo tồn gần đầu C, motif HD (H:
histidin, D: acid aspartic). Phytase có cả hai vùng này thường có khối lượng phân tử
lớn.
Phytase tấn công vào nhóm phosphate đầu tiên và phân giải liên kết
monophosphoester, giải phóng phospho vô cơ và myo-inositol-pentakisphosphate.
Sau đó, năm nhóm phosphate còn lại tiếp tục được giải phóng khỏi phytate nhờ
phytase hoặc những enzyme phosphatase không đặc hiệu khác vốn hiện diện với số
lượng lớn trong đường tiêu hóa. 1,5

12


Hình 2.3. Cơ chế xúc tác của phytase 19

+

3-phytase
+ H2O

Myo-inositol-

1D-myo-inositol 1,2,4,5,6-

hexakisphosphate

phosphate

pentakisphosphate

4-phytase
+ H2O

+

Myo-inositol-

1D-myo-inositol 1,2,3,5,6,-

hexakisphosphate

pentakisphosphate

phosphate

Hình 2.4. Sự thủy phân acid phytic của 3-phytase và 4-phytase 19, 20

13


2.2.4.6. Khả năng chịu nhiệt
Enzyme thường được dùng như nguồn bổ sung vào thức ăn gia súc nên thường
phải chịu được nhiệt độ từ 80-100 oC, đây là nhiệt độ có thể đạt tới trong suốt quá
trình kết vón thực phẩm.
Phytase là một enzyme ổn nhiệt và có thể hoạt động trên nhiều cơ chất khác
nhau. Phytase từ A.fumigatus có khả năng ổn nhiệt rất cao, có thể chịu được nhiệt độ
lên đến 100 oC trong 20 phút mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu.
Khả năng hồi tính sau khi bị biến tính bởi nhiệt của các loại phytase cũng khác
nhau. Sau khi bị biến tính ở 90 oC, phytase từ A.fumigatus phục hồi lại nguyên vẹn
cấu trúc ban đầu và phục hồi hoàn toàn hoạt tính. Trong khi đó, phytase từ A.niger bị

biến đổi cấu trúc một cách không thuận nghịch, khi ủ ở 55-90oC thì mất 70-80% hoạt
tính. 1, 5, 6
2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính phytase
2.2.5.1. Ion kim loại
Các kim loại được xem là các tác nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ
phytase. Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ của enzyme phải xem xét trên từng
đối tượng cụ thể. Một ion kim loại có thể là các tác nhân làm giảm hoạt độ đối với
enzyme phytase này nhưng có thể là yếu tố tăng hoạt độ đối với enzyme phytase
khác. Các ion kim loại Zn 2+, Cu 2+ và Al3+ được chứng minh là có khả năng ức chế
hoạt động phytase của Enterobacter sp. Trong khi đó Zn 2+ và Fe2+ được xem là có
tác dụng làm tăng hoạt độ enzyme phytase ở chuột. 1, 5
2.2.5.2. Nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất cao, sự tích tụ nhóm phosphate có thể ảnh hưởng vào trung
tâm xúc tác của enzyme. Điều này làm ức chế sự chuyển đổi phức hợp enzyme-cơ
chất thành enzyme và sản phẩm.
Nồng độ cơ chất khoảng 300 mol ức chế các enzyme của Paramecium.
Phytase của Rhizopus cũng bị ức chế bởi nồng độ cơ chất cao. Phytase nấm mốc bị
ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá 1 mM. 1, 6

14


2.2.5.3. Cạnh tranh bởi các chất có cấu tạo tương tự cơ chất
Một số chất có cấu tạo tương tự cơ chất có thể trở thành tác nhân ức chế. Ví dụ
myo-inositol hexasulfate có khả năng ức chế enzyme phytase của Aspergillus ficuum
do có cấu trúc tương tự phytate. 1, 5
2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase
2.2.6.1. Các yếu tố vật lý
Các tham số vật lý có ảnh hưởng mạnh nhất đến sự tăng trưởng và sự tổng hợp
các sản phẩm biến dưỡng của các vi sinh vật là pH, nhiệt độ, sự khuấy trộn, lượng

oxy hoà tan và áp suất.
Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp phytase đối với hầu hết các vi sinh vật nằm
trong khoảng từ 25-37 oC.
Giá trị pH có ý nghĩa lớn đối với quá trình sản xuất phytase. Giá trị pH tối ưu
cho hầu hết các vi khuẩn và nấm mốc nằm trong khoảng giữa 5,0 đến 7,0.
Trong lên men chìm, sự khuấy trộn và thông khí rất quan trọng để giữ các
thành phần môi trường, tế bào vi sinh vật và hàm lượng oxy phân bố đồng đều.
2.2.6.2. Các yếu tố dinh dưỡng
a) Nguồn cacbon
Các nguồn cacbon rất quan trọng trong sản xuất phytase, nồng độ cacbon trong
môi trường có tác động khác nhau lên quá trình sản xuất phytase.
Glucose là nguồn cacbon thích hợp nhất trong sản xuất phytase, các chủng vi
sinh vật khác nhau có nồng độ glucose tối thích khác nhau. Glucose 1% là nồng độ
tối ưu cho Lactobacillus amylovorus. Sản xuất phytase từ Bacillus subtilis dùng
glucose 2%.
Bột mì là một nguồn cacbon lý tưởng cho sản xuất phytase. Tuy nhiên cũng có
chủng dùng myo-inositol như nguồn cacbon duy nhất, ví dụ điển hình là các chủng
Pseudomonas.
Sodium phytate cũng có thể được dùng như nguồn cacbon duy nhất cho sản
xuất phytase, ví dụ chủng Klebsiella aerogenes, Arxula adeninivorans. 2
b) Nguồn nitơ
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy là một yếu tố dinh dưỡng quan trọng
khác ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sản xuất enzyme. Nguồn nitơ dưới dạng hữu
cơ như pepton đã được ứng dụng nhiều trong sản xuất phytase.
15


Các chủng vi sinh vật đều có nguốn nitơ ưa thích khác nhau. Chủng Aerobacter
aerogenes dùng pepton (1%), chủng K.oxytoca dùng dịch chiết nấm men (1%). 2
c) Các nguyên tố vi lượng và vitamin

Bên cạnh các nguồn C và N, một vài vi sinh vật cần các nguyên tố vi lượng và
các vitamin để tăng trưởng và sản xuất enzyme. Đối với sản xuất phytase bởi nấm
men, môi trường nuôi cấy cần các vitamin và nguyên tố vi lượng. Tuy nhiên một số
nấm như A.niger, A.ficuum không cần nguyên tố vi lượng trong lên men sản xuất
phytase. 2
2.2.7. Nguồn thu enzyme phytase
2.2.7.1. Phytase từ thực vật
Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo và từ
các loại đậu như đậu nành, đậu xanh, đậu trắng…. Phytase cũng được tìm thấy trong
mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina và phấn hoa huệ tây. Trong hạt đang nảy
mầm hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin.
Nhiệt độ tối ưu của phytase nguồn gốc thực vật vào khoảng 45-60oC. Phytase
thực vật có thể mất hoàn toàn hoạt tính khi gia nhiệt ở nhiệt độ cao. Vì thế tính bền
nhiệt của phytase thực vật không cao. 5, 15
2.2.7.2. Phytase từ động vật
Phytase đã được phát hiện từ thận và máu dê. Phytase cũng được phát hiện
trong máu các động vật có xương sống bậc thấp hơn như chim, bò sát, cá, rùa biển.
Vì phytate hoạt động như một nhân tố kháng dưỡng trong cơ thể động vật nên các
nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát sự hiện diện của phytase trong đường tiêu hoá
của nhiều loài động vật. Phytase được tìm thấy trong đường ruột của chuột, heo, cừu,
bò. Tuy nhiên, phytase trong hệ ruột động vật không đóng vai trò quan trọng trong
việc tiêu hoá phytate.
Phytase từ ruột người có hoạt tính thấp hơn 30 lần so với phytase từ ruột chuột
và cũng không có ý nghĩa trong việc tiêu hoá phytate. Phytate được tiêu hoá trong hệ
ruột của người nhờ lượng phytase có trong thực phẩm.
Động vật nhai lại tiêu hoá được phytate nhờ hoạt động của phytase được sản
xuất bởi hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Lượng photphate vô cơ giải phóng ra nhờ hoạt

16

động của phytase lên phytate được cả hệ vi sinh vật đường ruột và vật chủ sử dụng.
5, 15
2.2.7.3. Phytase từ vi sinh vật
Đối với vi khuẩn, phytase được tổng hợp cả ở vi khuẩn gram dương và gram
âm. Phytase từ các vi khuẩn gram âm là các protein nội bào, trong khi phytase từ các
vi khuẩn gram dương là các protein ngoại bào.
Đối với nấm mốc, hầu hết các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergillus,
Penicillium, Rhizopus đều sản xuất phytase ngoại bào có hoạt tính.Trong đó
Aspergillus ficuum được xem là một trong những chủng có khả năng sản xuất
phytase có hoạt tính cao.
Đối với nấm men, phytase ngoại bào được tìm thấy trong Schwanniomyces
castellii, Arxula adeniivorans, Saccharomyces cerevisae, Candida tropicalis,
Torulopsis

candida,

Debaryomyces

castelii,

Debaryomyces

occidentalic,

Kluyveromyces fragilis.
Chủng nấm men Arxula adeniivorans được xem là một trong những chủng nấm
men hiếm có vì khả năng đồng hoá phytate như là nguồn cacbon và photphate duy
nhất. Phytase từ nấm men có sự đặc hiệu cơ chất rộng, ổn nhiệt và bền trong acid.
So với phytase thực vật, phytase vi sinh vật có hoạt tính cao hơn. Hoạt tính

phytase thực vật giảm đáng kể ở pH vượt khỏi khoảng từ 4,0-7,5, trong khi phần lớn
các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật chịu được ở pH trên 8,0 và dưới 3,0. 5, 15
2.2.8. Tổng quan về chuyển gen mã hóa phytase
Mặc dù tác dụng phân giải phytate của phytase đã được phát hiện cách đây
khoảng 30 năm (Nelson và cs., 1971), nhưng khả năng ứng dụng thương mại hóa
phytase không được khả thi trong nhiều năm, do hiệu quả hoạt tính thấp và giá thành
cao khi áp dụng sản xuất phytase theo phương pháp lên men cổ truyền. Với sự phát
triển của kĩ thuật DNA tái tổ hợp, thông qua hệ thống biểu hiện protein ngoại lai của
các chủng vi sinh vật khác nhau đã tạo ra một lượng lớn enzyme phytase có hoạt tính
cao, do đó giảm giá thành sản xuất, mang lại rất nhiều lợi ích và tính năng vượt trội
so với việc thu nhận từ các nguồn vi sinh vật ban đầu. Đồng thời, việc áp dụng công
nghệ mới này có thể dễ dàng kiểm soát mức độ sinh enzyme phytase, không sinh độc
tố tạo thực phẩm an toàn cho động vật. Nhiều vi sinh vật khác nhau được nghiên cứu

17


sử dụng làm chủng chủ biểu hiện gen phytase bao gồm cả vi khuẩn, nấm mốc, nấm
men, tế bào động vật. 2
2.2.8.1. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong vi khuẩn
Gen mã hóa phytase được biểu hiện trong nhiều chủng vi khuẩn như: Bacillus
subtilis, B.alkalophilus, B.amyloliquefaciens, B.coagulans, B.circulans, B.Lautus,
B.Thuringiensis, E.coli, Lactobacillus plantarum,...
a) Trong vi khuẩn E. coli
Gen phyC biểu hiện trong chủng E.coli XL-Blue MRS (vector biểu hiện pBsm)
sinh phytase nội bào do hình thành thể bao ngoài. Đồng thời trình tự peptid tín hiệu
phyC tự nhiên không có chức năng tiết phytase trực tiếp vào môi trường nuôi E.coli
XL-Blue MRS. Để giải quyết vấn đề này, một chiến lược được tạo dòng khác đã
được lựa chọn. Một đoạn gen mã hóa phytase không có trình tự tiết tự nhiên được
tạo dòng sau trình tự tín hiệu phân giải pectate từ Erwinia carotoyora dưới sự điều

khiển của promoter tac. Cấu trúc này có khả năng biểu hiện phytase có hoạt tính
trong môi trường nuôi E. coli RV308 ở nồng độ khoảng 80 mg/l. Tuy nhiên, E.coli là
một prokaryote và thiếu các bào quan nội bào hiện diện trong tế bào eukaryote như:
ti thể, bộ máy golgi, lưới nội chất, ..., những bào quan này giữ chức năng biến đổi
protein thành sản phẩm có chức năng. Đồng thời vì E.coli có khả năng sản xuất
nhiều enzyme khác nhau nên khó thu hồi và tinh sạch enzyme phyatse. 2
b) Trong Lactobacillus plantarum
Gen mã hóa phytase được biểu hiện trong chủng Lactobacillus plantarum 755.
Gen phyC không chứa trình tự tín hiệu của nó được tạo dòng trong plasmid pLPM11
để thu được vector biểu hiện phytase pLPM/phyC. Tuy nhiên, một số thí nghiệm đã
chỉ ra rằng phytase tái tổ hợp được tiết ở mức độ thấp so với protein tiết tự nhiên ở
Lactobacillus plantarum 755 (2 mg/l). Hơn nữa, sự acid hóa của môi trường do kết
quả của sự lên men acid lactic sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme phytase. 2
2.2.8.2. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong nấm mốc
Gen phyA mã hóa phytase ngoại bào từ nấm mốc chịu nhiệt Thermomyces
lanuginosus được gắn chèn và biểu hiện trong vector dưới sự điều khiển phiên mã
của promoter gen mã hóa trypsin của Fusarium oxysporum và sử dụng để biến nạp
vào chủng tái tổ hợp Fusarium venenatum. Phytase tái tổ hợp của Thermomyces có
18


hoạt tính chịu nhiệt ở 75oC và hiệu quả phân giải cao hơn phyatse của nấm mốc ở
65oC (Berka và cs., 1998). Gen phyA mã hóa cho phytase chịu nhiệt từ A.fumigatus
được tạo dòng và biểu hiện vượt mức trong nấm mốc A.niger (Pasamontes và cs.,
1997).
Tuy nhiên, do nấm mốc có nhiều nguy cơ sinh độc tố mycotocin như: aflatoxin,
trichothecenes, deoxynivalenol, vomitoxin, ochratoxin,... Các loại độc tố này có thể
gây ngộ độc do tác động đến hệ thần kinh, hệ tiêu hóa làm rối loạn chức năng, đặc
biệt gây ung thư gan, nguy hiểm cho vật nuôi và con người, nên nhiều nghiên cứu đã
tiến hành biểu hiện gen mã hóa phytase trên các chủng vi sinh vật an toàn cho thực

phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc. 2
2.2.8.3. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong nấm men
Gen mã hóa enzyme phytase của A.fumigatus được biểu hiện hiệu quả trong
Pichia pastoris. Đoạn DNA 1,4 kb có chứa vùng gen mã hóa gen phytase được gắn
chèn vào vector biểu hiện pPICZαA và biểu hiện trong Pichia pastoris như một
phytase ngoại bào hoạt động . Enzyme này có nhiệt độ, pH tối ưu, trọng lượng phân
tử và khả năng gắn nhóm đường tương tự như phytase từ chủng A.fumigatus. Điều
đó kết luận rằng Pichia pastoris là một chủng chủ có tiềm năng biểu hiện phytase
A.fumigatus ở mức độ cao (Rodrigues và cs., 2000). Chủng tái tổ hợp Hansenula
polymorpha sinh phytase hiệu quả vì so với quá trình sử dụng glycerol, sử dụng
glucose sẽ dẫn đến giảm 80% giá thành. Thêm vào đó, nồng độ đặc biệt cao của
enzyme có hoạt tính (> 13,5 g/l) thu được từ môi trường, với lượng enzyme phytase
thu nhận trên 97% so với lượng tổng protein thu nhận (Mayer và cs., 1999). 2
2.2.8.4. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong thực vật
Phytase cũng được phát triển sản xuất trong công nghệ sinh học thực vật, sử
dụng kĩ thuật chuyển gen ở thực vật để ứng dụng trong lĩnh vực y dược và sản xuất
enzyme trong công nghiệp. Tạo thực vật chuyển gen với việc tăng cường mức độ
biểu hiện của 3-phytase bằng cách sử dụng vector biểu hiện chứa gen mã hóa
phytase từ nấm được biến nạp vào thực vật chủ. Tốt nhất là thu nhận gen mã hóa
phytase từ A.niger, A.awamorii, và A.nidulans, A.ficuum (Brocades, 1991). Gen
phyA từ A.ficuum mã hóa phytase có chiều dài 441 amino acid được biểu hiện trong
lá của cây thuốc lá Nicotiana tabacum (Ullah và cs., 1999).

19


Các ứng dụng khác của công nghệ sinh học trong thực vật để giảm sự cần thiết
của phytase bởi lượng phytate thấp có trong cây ngũ cốc hay thức ăn. Giống bắp với
hàm lượng thấp acid phytic cũng đã được sản xuất. Đậu nành chuyển gen mã hóa
phytase từ nấm mốc và do đó sẽ loại bỏ hay giảm sự cần thiết bổ sung thức ăn với

phytase. Các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu thành công biểu hiện gen mã hóa phytase
từ A.niger NRRL 3135 trong đậu nành. Phytase tái tổ hợp có trọng lượng phân tử
thấp hơn phytase của nấm, nhưng khả năng chịu nhiệt và pH tối ưu hầu như không
thay đổi. 2
2.2.8.5. Biểu hiện gen mã hóa phytase trong động vật
Trong tương lai, gia cầm và lợn chuyển gen có thể sản xuất phytase trong
đường tiêu hóa của chúng. Một vài nghiên cứu đã tiến hành biến nạp và biểu hiện
gen mã hóa phytase từ nấm mốc trong động vật (Mullaney và cs., 2000). Hiện nay
chuột chuyển gen cũng đã được phát triển biểu hiện gen phytase appA từ E.coli điều
hòa biểu hiện trong tuyến nước bọt. Sự biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt của
động vật làm giảm 11% lượng photpho trong phân (Golovan và cs., 2001). 2
2.2.9. Một số ứng dụng của enzyme phytase
2.2.9.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Thức ăn gia súc thường có nguồn gốc thực vật. Khoảng 2/3 hàm lượng photpho
trong thức ăn gia súc có nguồn gốc thực vật là acid phytic hiện diện dưới dạng
phytate. Phytate liên kết với các ion có giá trị dinh dưỡng cao, vì thế hạn chế giá trị
dinh dưỡng của các ion này.
Động vật nhai lại tiêu hoá phytate thông qua hoạt động của enzyme phytase tiết
ra từ hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Phosphate vô cơ được giải phóng từ phytate bởi
phytase được cả hệ vi sinh vật dạ cỏ và động vật chủ sử dụng. Tuy nhiên, các động
vật có dạ dày một ngăn như lợn, gia cầm và cá lại không thể biến dưỡng acid phytic
vì chúng thiếu phytase ở hệ ruột và dạ dày. Do đó, người ta thêm phosphate vô cơ,
bột đậu nành và các loại bột có hàm lượng phospho tổng cao vào thức ăn gia súc để
đáp ứng nhu cầu phosphate của cơ thể động vật. Việc này làm tăng chi phí cho các
nhà chăn nuôi gia súc và tăng ô nhiễm phospho cho môi trường. Các vấn đề này có
thể giải quyết bằng cách bổ sung phytase vi sinh vật vào thức ăn gia súc hoặc dùng
các loại ngũ cốc có hàm lượng phytase cao làm thức ăn gia súc.

20

Wodzinski và Ullah (1996) đã đưa ra con số thống kê rằng nếu dùng phytase để
bổ sung vào thức ăn gia súc của tất cả vật nuôi ở Mỹ thì lượng phospho được giải
phóng ra sẽ tương ứng với 168 triệu USD và sẽ giảm được 8,23x104 tấn phospho thải
ra môi trường mỗi năm. Cục Quản Lý Thuốc và Thực Phẩm (FDA-The Food and
Drug Administration) đã công nhận chế phẩm phytase đạt tiêu chuẩn GRAS
(Generally Regarded As Safe). 1, 7, 9, 15
2.2.9.2. Trong công nghiệp thực phẩm
Ngũ cốc, hạt có dầu và các loại đậu là các loại nguyên liệu phổ biến trong chế
biến thực phẩm. Điều này dẫn đến một lượng lớn phytate được tiêu thụ vào trong cơ
thể con người. Phytate trong hệ ruột không được tiêu hoá sẽ tác động xấu đến sự hấp
thụ kẽm, canxi, magiê và sắt. Hơn nữa, nó còn ức chế hoạt động của các enzyme tiêu
hoá. Do đó, việc bổ sung phytase vào nguyên liệu trước khi chế biến có một ý nghĩa
lớn.
Phytase đã được bổ sung vào quá trình chế biến bột mì để làm giảm lượng acid
phytic trong các loại bánh dùng bột mì. Phytase thích hợp cho quá trình này cần có
pH tối ưu ở 4,5-5, nhiệt độ tối ưu 30 oC. 1, 7, 9, 15
2.2.9.3. Trong tổng hợp myo-inositol phosphate
Trong ngũ cốc và rau đậu, những thực phẩm bổ sung cơ bản, acid phytic ngăn
chặn sự hấp thu sắt, gây ra sự thiếu hụt sắt phổ biến ở trẻ em của những nước đang
phát triển, phụ nữ tuổi dậy thì hay những người ăn chay. Trong nghiên cứu, Svàberg
(1999) cho thấy inositol hexakisphosphate (IP6) cũng như pentakisphosphate (IP5)
có tác động làm kìm hãm sự hấp thu sắt. Thêm 10 mg phospho như IP5 làm giảm sự
hấp thu sắt đến 39%. IP3 và IP4 cũng góp phần tác động tiêu cực khi chúng được
cho cùng với IP5 và IP6. Như vậy, để cải thiện sự hấp thu sắt từ ngũ cốc và rau đậu,
nên phân hủy phosphate inositol để tạo ra dạng phosphoryl hóa ít hơn IP3.
Mặt khác, các ester myo- inositol có ít phospho (mono, bis, tris, và
tetrakisphosphates) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển trên màng
các tín hiệu và huy động canxi dự trữ bên trong tế bào ở mô động vật và thực vật
(Michell, 1975, Berridge và Irvine, 1984, Samanta, 1993, Dasgupta, 1996,

Krystofova, 1994). 1

21


Các phosphate inositol có thể tổng hợp hóa học hoặc tổng hợp bằng enzyme.
Tuy nhiên, cơ chế tổng hợp hóa học của inositol phosphate (Billington, 1993) phức
tạp, đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao. Trái lại, tổng hợp bằng enzyme phytase thực
hiện trong điều kiện ôn hòa, có hiệu quả lớn trong việc sản xuất. Siren (1986) sản
xuất thành công D-myo-inositol 1,2,6 trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5
trisphosphate, L-myo-1,3,4 trisphosphate, và myo-inositol-1,2,3 trisphosphate với sự
trợ giúp của phytase có nguồn gốc từ S.cerevisiae. Tương tự, phytase phân lập từ A.
niger phân giải IP6 thành các dẫn xuất có mức phospho hóa thấp từ IP5 đến IP2 phụ
thuộc vào lượng enzyme (Dvorakova, 2000). 7, 9, 15
2.2.9.4. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong chế biến giấy và bột giấy, các nguyên liệu được dùng có nguồn gốc từ
thực vật có hàm lượng acid phytic khá cao, do đó góp phần làm tăng ô nhiễm
phospho cho môi trường. Các phytase chịu nhiệt được dùng để phân hủy acid phytic
trong nguyên liệu giúp tránh được việc tạo các sản phẩm phụ độc hại, có khả năng
gây ung thư và là một biện pháp “thân thiện môi trường”.  9, 15
2.3. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS
2.3.1. Giới thiệu chung về nấm men Pichia pastoris
Được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 1970, ban đầu những nghiên cứu về
Pichia pastoris cũng như một số chủng nấm men sử dụng methanol khác chủ yếu tập
trung vào lĩnh vực sản xuất protein đơn bào từ các chủng nấm men sử dụng methanol
này đã không được đưa vào thực tiễn.
Cho đến đầu những năm 1980, Pichia pastoris được phát triển thành một hệ
thống nhằm biểu hiện protein tái tổ hợp. Từ đó, những nghiên cứu về việc biểu hiện
các protein tái tổ hợp sử dụng hệ thống Pichia pastoris gia tăng nhanh chóng.
Về mặt phân loại học, Pichia pastoris có hệ thống phân loại như sau:

22


Giới

: Nấm

Ngành

: Ascomycota

Ngành phụ: Saccharomycotina
Lớp

: Saccharomycetes

Bộ

: Saccharomycetales

Họ

: Saccharomycetaceae

Chi

: Pichia

Loài

: Pichia pastoris

Hình 2.5. Tế bào nấm men Pichia
pastoris 21

Hệ thống Pichia pastoris đã được biến đổi thông qua kĩ thuật di truyền, nó đã
trở thành hệ thống biểu hiện chủ thành công cho việc sản xuất đa dạng các protein tái
tổ hợp trong tự nhiên. 11, 14
2.3.2. Những ưu điểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris
Những yếu tố góp phần giúp cho hệ thống biểu hiên bằng Pichia pastoris ngày
càng được ứng dụng rộng rãi gồm có:


Các thao tác kĩ thuật sinh học phân tử đơn giản, tương tự như các bước tiến

hành đối với S.cerevisiae. Thêm vào đó, phân loại di truyền sử dụng cho
Saccharomyces cũng được áp dụng cho Pichia pastoris. Hơn nữa, nếu như tế bào
S.cerevisiae ở dạng đơn bội không ổn định, nhanh chóng giao phối để trở thành dạng
lưỡng bội, thì tế bào Pichia pastoris hầu hết ổn định ở trạng thái đơn bội, đó là một
thuận lợi lớn trong việc phân lập kiểu hình đột biến.


Mật độ sinh khối tế bào Pichia pastoris cao, có thể cao gấp 10 lần so với

S.cerevisiae, môi trường nuôi không đòi hỏi bổ sung nhân tố tăng trưởng gây tốn
kém và khó tinh sạch protein, mức độ biểu hiện tăng gấp 10-100 lần so với
S.cerevisiae.

23

Saccharomyces
cerevisiae

Pichia pastoris

Hình 2.6. So sánh khả năng tạo sinh khối giữa Pichia pastoris và
Saccharomyces cerevisiae. 14


Hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris cũng được xem là nhanh, dễ thực

hiện, có mức độ biểu hiện cao và không quá tốn kém như các hệ thống biểu hiện
bằng nuôi cấy tế bào côn trùng và động vật có vú.


Pichia pastoris bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó. Do đó,

nếu đưa gen lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ dàng tinh sạch. Pichia pastoris
đã được chứng minh là sinh vật an toàn, hầu như không tạo ra độc tố.


Ngoài ra hệ thống biểu hiện bằng Pichia pastoris còn có promoter mạnh như

là AOX1. Gen được điều khiển bởi các promoter này khi được kết hợp vào bộ gen
của Pichia pastoris sẽ tạo lên một chủng có khả năng biểu hiện protein ở mức cao
với hàm lượng lên đến vài g/l. Trong đó promoter AOX1 được đặc biệt quan tâm vì
khả năng cảm ứng bằng methanol.


Pichia pastoris có nhiều ưu điểm của hệ thống biểu hiện eukaryote bậc cao

khác như khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như: xử lý phân cắt protein,
gấp cuộn, tạo cầu nối disulfide và gắn gốc đường để tạo protein hoạt động. Đây là
một đặc điểm nổi trội mà những hệ thống biểu hiện bằng prokaryote không có được.
Hiện nay đã có hơn 300 protein từ rất nhiều nguồn khác nhau được biểu hiện
thành công ở Pichia pastoris. Bên cạnh đó, các nghiên cứu về biểu hiện protein tái tổ
hợp khác bằng hệ thống Pichia pastoris cũng tăng lên từng ngày. 1, 14

24


Bảng 2.2. Một số protein đã biểu hiện thành công ở Pichia pastoris 11
Mức độ biểu

Kiểu hình chủng

hiện (g/l)

biểu hiện

0,4

Muts

Nội bào

Invertase

2,3

Mut+

Tiết ra môi trường

Albumin của người

4,0

Mut+, Muts

Tiết ra môi trường

0,006

Mut+

Tiết ra môi trường

Carboxypeptidase B

0,8

Mut+, Muts

Tiết ra môi trường

α-Amylase

2,5

Muts

Tiết ra môi trường

Protein
Kháng nguyên bề mặt
virus viêm gan B

Enterokinase

Dạng biểu hiện

2.3.3. Cơ chế cảm ứng bằng methanol
Pichia pastoris là một trong khoảng 12 loài nấm men thuộc 4 giống có khả
năng chuyển hoá methanol. Các giống khác là Candida, Hansenula, Torulopsis.
Pichia pastoris có khả năng sử dụng methanol như một nguồn cacbon và năng
lượng duy nhất. Những nghiên cứu sinh hóa cho thấy việc sử dụng methanol cần một
con đường chuyển hóa liên quan đến một vài enzyme. Alcohol oxidase (AOX) là
enzyme đầu tiên và là enzyme chính trong con đường biến dưỡng methanol, có vai
trò xúc tác sự oxy hóa methanol tạo formaldehyde và hydrogen peroxide (H2O2).
Catalase hiện diện trong peroxisome cùng với AOX sẽ chuyển hóa hydrogen
peroxide thành O2 và H2O. Một phần formaldehyde sinh ra bởi AOX rời peroxisome
vào tế bào chất và bị oxy hóa thành acid formic và CO2 nhờ formaldehyde
dehydrogenase và formate hydrogenase. Những phản ứng này là cơ sở sinh hóa biến
dưỡng methanol tạo năng lượng cho tế bào phát triển.
Theo con đường đồng hóa, formaldehyde còn lại trong peroxisome sẽ phản ứng
với xylulose-5-phosphate, được xúc tác bởi dihydroxyacetone synthase (DAS), tạo ra
hai phân tử là dihydroxyacetone và glyceraldehyde-3-phosphat. Những hợp chất này

sau đó được chuyển hóa trong tế bào chất, tái tạo xylulose-5-phosphate. Trong số
này, 1/3 số phân tử glyceraldehyde-3-phosphate sinh ra được chuyển hóa và tạo sinh
khối tế bào.
Pichia pastoris có 2 gen mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2, trong
đó gen AOX1 chịu trách nhiệm cho phần lớn hoạt tính alcohol oxidase trong tế bào.
25